Universidade Federal de Gois

Escola de Veterinria e Zootecnia

Programa de Ps-Graduao em Cincia Animal



Disciplina: SEMINRIOS APLICADOS






ASPECTOS BIOLGICOS, EPIDEMIOLGICOS, CLNICOS E DE
DIAGNSTICO DO Toxoplasma gondii






Nome:
Rebeka Cristine de Bastos Costa


Orientadora:
Valria de S Jayme



GOINIA
2013
ii
REBEKA CRISTINE DE BASTOS COSTA


ASPECTOS BIOLGICOS, EPIDEMIOLGICOS, CLNICOS E DE
DIAGNSTICO DO Toxoplasma gondii

Seminrio apresentado junto Disciplina
de Seminrios aplicados do Programa de
Ps-graduao em Cincia Animal da
Escola de Veterinria e Zootecnia da
Universidade Federal de Gois.
Nvel: Mestrado

rea de Concentrao:
Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia de Alimentos


Linha de Pesquisa:
Enfermidades de importncia em sade pblica

Orientadora:
Prof. Dr. Valria de S Jayme


Comit de orientao
Prof. Dr. Guido Fontgalland Coelho Linhares
Prof. Dr. Andra Caetano da Silva


GOINIA
2013
iii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Morfologia geral da forma taquizota do Toxoplasma gondii,
protozorio do Filo Apicomplexa, o qual possui as estruturas caractersticas do
complexo apical, como rptrias, micronemas, anis polares. ..................................... 3

FIGURA 2 - Ciclo biolgico do Toxoplasma gondii e suas trs fases de vida:
taquizotos, bradizotos (cistos tissulares) e esporozotos (oocistos), com os
diferentes tipos de hospedeiros intermedirios (mamferos e aves) e o hospedeiro
definitivo, felino. .................................................................................................................. 4

FIGURA 3 - Corte de crebro de paciente com neurotoxoplasmose, mostrando
duas leses necrticas extensas (setas). ....................................................................... 6

FIGURA 4 - Recm-nascidos com as formas clnicas da toxoplasmose congnita.
A. Hidrocefalia; B. Microcefalia. ........................................................................................ 7

FIGURA 5 - Cisto tecidual de Toxoplasma gondii identificado no material cerebral
de camundongo, inoculado com material cerebral de ovino. Ampliao de 400x. .. 8

FIGURA 6 - Esquema demonstrativo das trs etapas da PCR convencional: A. No
primeiro passo, ocorre a desnaturao, ento a dupla fita de DNA separa-se, a
uma temperatura de 94C por um minuto, dando origem a duas fitas simples de
DNA. B. A uma temperatura de 30 a 60C por cerca de um minuto, ocorre o
segundo passo e tem-se o anelamento dos primers em cada uma das fitas
simples, em posies especficas. C. O terceiro passo ou extenso d-se pela
ao da DNA polimerase, a uma temperatura de 72C por dois minutos, a qual
realiza o processo de extenso da sequncia a ser amplificada. ............................ 11

FIGURA 7 Amplificao da sequncia de 529 pb (pares de base) e deteco
pela PCR do DNA de Toxoplasma gondii em gua contaminada
experimentalmente. .......................................................................................................... 12

FIGURA 8 - Oocistos no esporulados de Isospora felis (A), Isospora rivolta (B), e
Toxoplasma gondii (C), em comparao com esporocisto esporulado de
Sarcocystis muris (D). Ampliao de 1600 x. .............................................................. 17

FIGURA 9 - Mapa do Brasil demonstrando a distribuio dos isolados do
Toxoplasma gondii: Par, linhagem BrI, em frangos; Esprito Santo, tipo BrI em
frangos; So Paulo, BrI, BrII e BrIII em ces e gatos e tipo II, em ovinos; Paran,
tipos BrI, BrII e BrIII, em ces e gatos; Rio Grande do Sul, tipos BrIII e BrIV, em
frangos. ............................................................................................................................... 19


SUMRIO

1 INTRODUO .................................................................................................... 1
2 REVISO DE LITERATURA ............................................................................... 2
2.1 Toxoplasma gondii ........................................................................................... 2
2.2 Mtodos de diagnstico e caracterizao molecular ....................................... 9
2.2.1 Reao em cadeia da polimerase ................................................................. 9
2.2.2 Teste de polimorfismo de comprimento de fragmentos de DNA gerados por
enzimas de restrio sobre produtos amplificados pela reao em cadeia da
polimerase ............................................................................................................ 13
2.3 Diagnstico e caracterizao molecular do Toxoplasma gondii ..................... 14
2.3.1 Diagnstico molecular ................................................................................. 14
2.3.2 Caracterizao molecular ............................................................................ 17
3 CONSIDERAES FINAIS .............................................................................. 22
4 REFERNCIAS ................................................................................................. 23


1 INTRODUO

Apesar dos avanos no conhecimento e na prtica mdica, as
doenas parasitrias continuam a ser um importante problema de sade global
(VASOO & PRITT, 2013). Entre as principais enfermidades de importncia
mundial, esto includas as causadas por protozorios, os quais podem atingir
tanto os seres humanos como os animais (THEKISOE & INOUE, 2011), um
exemplo o caso do Toxoplasma gondii, o qual capaz de infectar mamferos
e aves (SILVEIRA, 2009).
O desenvolvimento de mtodos simples, rpidos e sensveis para a
deteco e identificao desse protozorio importante para o
aperfeioamento dos diagnsticos e dos estudos epidemiolgicos da
toxoplasmose (SU et al., 2010). Assim, com o crescimento da biologia
molecular foram desenvolvidas ferramentas baseadas na amplificao do DNA,
as quais aprimoraram e aperfeioaram o diagnstico do parasita em questo
(WAAL, 2012).
Inicialmente, a aplicao de tcnicas moleculares para o diagnstico
do T. gondii foram concentradas na deteco do mesmo. Porm, com o
desenvolvimento de mtodos baseados em uma variedade de marcadores
genticos para as populaes deste protozorio proporcionou a identificao
de diferentes linhagens genotpicas, o que aprimorou as informaes j
conhecidas, em relao epidemiologia e patogenicidade para a
toxoplasmose (SU et al., 2010).
Por ser um potencial causador de zoonose e de distribuio
cosmopolita, o T. gondii tem sido um dos protozorios mais amplamente
estudados. Os recentes desenvolvimentos na rea da biologia molecular
forneceram ferramentas, as quais foram utilizadas para o aprofundamento do
conhecimento dessa espcie, de elevada importncia na clnica mdica e
veterinria. Diante disto, objetivou-se com esta reviso de literatura, abordar a
biologia do T. gondii e a aplicao dos mtodos moleculares utilizados para a
deteco e caracterizao das diferentes linhagens genotpicas do T. gondii.

2
2 REVISO DE LITERATURA

2.1 Toxoplasma gondii

Os protozorios pertencem ao Reino Protista, sub-reino Protozoa
(grego, protos=primeiro e zoon=animal) e so classificados em sete filos,
destacando-se o Apicomplexa, o qual representa um dos maiores grupos de
protozorios parasitas, compreendendo muitas espcies de importncia
veterinria e mdica (TENTER et al., 2002).
Esse filo composto por parasitas intracelulares obrigatrios que se
caracterizam por possurem, em determinadas fases de sua vida, uma
estrutura chamada de complexo apical, o qual composto por organelas
secretrias especializadas, entre elas as rptrias, os micronemas e os
elementos do citoesqueleto, como os anis apicais (Figura 1) (MONTEIRO,
2006). Este conjunto de organelas est localizado na regio anterior da clula
parasitria, pois possui como funo principal facilitar a entrada dos parasitas
nas clulas hospedeiras (TENTER et al., 2002).
Dentro do Filo Apicomplexa destaca-se a famlia Sarcocystidae por
conter cerca de 200 espcies. Ainda, essa se subdivide em subfamlias, sendo
uma delas a Toxoplasmatinae, na qual esto alocados vrios gneros e entre
eles, o Toxoplasma, no qual se tem uma nica espcie: o T. gondii
(SERCONDES, 2010).

Famlia Sarcocystidae (Poche,1913)
Subfamlia Toxoplasmatinae (Biocca de 1957)
Gnero Besnoitia (Henry, 1913)
Gnero Hammondia (Frenkel, 1974)
Gnero Neospora (Dubey et al., 1988)
Gnero Toxoplasma (Nicolle & Manceaux, 1909)
Toxoplasma gondii (Nicolle & Manceaux, 1909)

3
O T. gondii foi descrito pela primeira vez em roedores, em 1908, na
Tunsia, frica. Seu nome derivou-se da sua morfologia: toxo = arco, plasma =
forma, e do seu hospedeiro: gondii, por ter sido descoberto em um roedor da
regio do Gundi. Tambm em 1908, foi encontrado o mesmo parasita em So
Paulo, Brasil (DUBEY, 2008).
A primeira descrio desse protozorio em humanos ocorreu
somente em 1923. No Brasil, em 1927, foi relatado um caso humano no Rio de
Janeiro (DUBEY et al., 2012). Em 1942, a toxoplasmose foi detectada em gatos
e, em 1967, foi demonstrado que o protozorio em questo pode ser contrado
pela ingesto de oocistos eliminados nas fezes dos felinos. A descoberta dos
felinos, como hospedeiros definitivos, em 1970, levou elucidao do ciclo
biolgico completo do T. gondii (DUBEY, 2008).


FIGURA 1 - Morfologia geral da forma taquizota do Toxoplasma
gondii, protozorio do Filo Apicomplexa, o qual possui
as estruturas caractersticas do complexo apical,
como rptrias, micronemas, anis polares.
Adaptado de http://www.infoescola.com.
Complexo apical
4
Segundo DUBEY (2008), em seu ciclo de vida o T. gondii,
desenvolve organelas caractersticas do Filo Apicomplexa, apresentando o
complexo apical e as organelas mencionadas anteriormente, porm o nico
que apresenta o conide, como demonstrado na Figura 1.
Tal protozorio possui trs fases distintas: taquizotos, bradizotos
(cistos tissulares) e esporozotos (oocistos). Ainda, possui ciclo de vida
heteroxeno (Figura 2), sendo que todos os animais de sangue quente
(mamferos e aves) podem participar do ciclo como hospedeiros intermedirios
e os felinos so seus hospedeiros definitivos (TENTER et al., 2000).

FIGURA 2 - Ciclo biolgico do Toxoplasma gondii e suas trs fases de vida:
taquizotos, bradizotos (cistos tissulares) e esporozotos (oocistos),
com os diferentes tipos de hospedeiros intermedirios (mamferos e
aves) e o hospedeiro definitivo, felino.
Fonte: http://www.icb.ufmg.br/biq/prodap/2000/toxo/ciclo.gif.
Todas as fases de desenvolvimento so infecciosas para ambos
hospedeiros e estes podem adquirir a toxoplasmose por diferentes vias, como
a horizontal, por ingesto oral de oocistos esporulados no ambiente (Figura 2)
e por ingesto de cistos tissulares na carne crua ou mal cozida (Figura 2); ou
verticalmente, pela transmisso transplacentria de taquizotos (Figura 2).
5
Estes tambm podem ser transmitidos pelo leite, da me para o filho, ou por
transplante de sangue ou rgos (TENTER et al., 2000).
Os gatos podem eliminar oocistos no ambiente (Figura 2) aps a
ingesto de qualquer um dos estgios de desenvolvimento do T. gondii, mas,
somente 30% dos felinos eliminam essa fase no ambiente aps ingerir
taquizotos ou oocistos, enquanto, praticamente todos os gatos que ingerem
bradizotos eliminam-nos (DUBEY et al., 1998).
O contato com o protozorio promove a formao de anticorpos
contra o parasita em questo, sendo que TENTER et al. (2000) verificaram que
74% da populao de gatos adultos, dependendo do tipo de alimentao e
acesso rua ou no, apresentam anticorpos contra o T. gondii.
Como o homem pode participar do ciclo, sendo um hospedeiro, a
toxoplasmose considerada uma zoonose, a qual se destaca na medicina
veterinria e humana, pois pode causar aborto ou doena congnita em seus
hospedeiros intermedirios (TENTER et al., 2000).
Tal enfermidade apresenta distribuio cosmopolita e estima-se que
um tero, ou mais, da populao mundial esteja cronicamente infectada,
apresentando anticorpos para o parasita (MONTOYA & LIESENFELD, 2004),
chegando a ndices de soropositividade variando de 23 a 83%, dependendo de
fatores climticos, socioeconmicos e culturais (FIALHO et al., 2009). No
Brasil, a infeco pelo T. gondii est amplamente prevalente em humanos,
sendo que 50% das crianas e 80% das mulheres em idade frtil tm
anticorpos para esse protozorio (DUBEY et al., 2012).
Infeces primrias em adultos so geralmente assintomticas, mas
linfadenopatia ou toxoplasmose ocular podem ocorrer em alguns pacientes (SU
et al., 2010). J para os imunossuprimidos a toxoplasmose apresenta-se de
forma aguda, podendo em alguns casos levar a encefalite fatal, ou
neurotoxoplasmose, e provocar leses necrticas no crebro (MONTOYA &
LIESENFELD, 2004), como demonstrado na Figura 3.
6

FIGURA 3 - Corte de crebro de paciente com
neurotoxoplasmose, mostrando duas leses
necrticas extensas (setas).
Fonte: http://www.icb.usp.br/~livropar/img/capitulo3/2.html.


Quando ocorre a transmisso vertical, a enfermidade conhecida
como toxoplasmose congnita (SU et al., 2010). Porm, se a infeco materna
for adquirida antes da gestao, aquela representa pouco ou nenhum risco
para o feto. Mas quando mulheres, j gestantes, so infectas pela primeira vez
pelo T. gondii, a chance do filho desenvolver a toxoplasmose congnita clnica
aumentada. J a infeco subclnica dessa enfermidade, em recm-nascidos,
pode passar despercebida ou o beb desenvolver a hidrocefalia ou
microcefalia (MONTOYA & LIESENFELD, 2004), como demonstrado na
Figura4.
Da mesma forma que ocorre nos homens, a infeco pelo T. gondii
est amplamente difundida em animais em todo o mundo. Inquritos
epidemiolgicos relevam que 90% dos animais domsticos e silvestres
possuem anticorpos para aquele protozorio. Desta forma, ressalta-se a
importncia da toxoplasmose, pois animais de produo, como sunos, ovinos
e caprinos podem apresentar sorologia positiva para o T. gondii (DUBEY et al.,
2012).
No Brasil, a maioria dos sunos apresenta-se sorologicamente
positiva para o protozorio em questo, e de forma semelhante, este est
largamente distribudo entre ovinos, destacando-se ainda que as aves possam
7
apresentar-se positivas diante de um exame sorolgico para a toxoplasmose
(DUBEY et al., 2012). Tais condies representam riscos sade pblica, pois
uma das formas de infeco mais recorrente a horizontal, pela ingesto de
bradizotos viveis presentes nas vsceras dos animais infectados (DUBEY et
al., 2007b).

A B
FIGURA 4 - Recm-nascidos com as formas clnicas da toxoplasmose congnita. A.
Hidrocefalia; B. Microcefalia.
Fonte: hassan344.tripod.com/Protozoa/Tox-gondii.html e asorridente.blogspot.com.br/2011/05/toxoplasmose.html

Diante disto, o diagnstico laboratorial da toxoplasmose representa
elevada importncia para vigilncia epidemiolgica e sade pblica. Para
diagnostic-la, inicialmente utilizada a sorologia, que busca demonstrar nveis
de anticorpos especficos ao T. gondii, sendo que, os ttulos mantm-se
elevados durante meses at anos (MONTOYA, 2002). Porm, os testes
sorolgicos disponveis, indicam somente o contato do hospedeiro com o
protozorio em algum momento no passado e no a presena de protozorio
vivel infeco. Deste modo, so associados ao exame sorolgico outros
mtodos de diagnstico (DUBEY, 2010).
Dentre esses, inclui-se a biopsia ou autpsia, que permite a
constatao de taquizotos, indicando infeco ativa; ou achados de cistos
teciduais, os quais so as formas encontradas na infeco latente (Figura 5).
Porm, pequena a chance de encontrar o protozorio, pois este pode
parasitar qualquer clula nucleada e os organismos encontrados nas leses, na
maioria das vezes, esto em estado de degenerao, o que dificulta sua
deteco (DUBEY, 2010).
8




FIGURA 5 - Cisto tecidual de Toxoplasma gondii identificado no material
cerebral de camundongo, inoculado com material cerebral
de ovino. Ampliao de 400x.
Fonte: SILVA, 2009.

Ainda, para diagnosticar a toxoplasmose pode ser associado, aos
exames sorolgicos, o diagnstico molecular, o qual busca detectar o DNA do
T. gondii, em amostras biolgicas. Como exemplo, pode ser associada
sorologia, a tcnica de reao em cadeia da polimerase (PCR) (CARNEIRO,
2011), pois pode identificar o DNA de agentes parasitrios em tecidos e
secrees de animais, o que promove a obteno de informaes no
fornecidas pelos testes imunolgicos ou morfolgicos (SINGH, 1997).
Contudo, como limitao da tcnica molecular, a positividade no
determina se o DNA amplificado de parasitas viveis ou de fragmentos do
parasita. Devido a isso, o bioensaio em animais susceptveis utilizado para
indicar a viabilidade do parasita nos tecidos animais (SILVEIRA, 2009).



9
2.2 Mtodos de diagnstico e caracterizao molecular

O diagnstico molecular baseado na deteco, identificao e
quantificao de cidos nucleicos, auxiliando no diagnstico e no prognstico
de enfermidades (BARRA et al., 2011). Ainda, possui a capacidade de
diferenciar agentes parasitrios taxonomicamente muito prximos
(THOMPSON et al., 1998), o que facilita estudos das populaes de parasitas,
bem como a identificao de possveis relaes entre um determinado gentipo
e sua virulncia (YERA et al., 2003).
Os mtodos caracterizados como moleculares dependem da reao
em cadeia da polimerase (PCR) para a deteco especfica ou a anlise de
DNA do T. gondii (SU et al., 2010).
Tais mtodos podem ser divididos em dois grupos: no primeiro grupo
esto as tcnicas capazes de detectar especificamente o DNA em amostras
biolgicas, como a PCR convencional (cn-PCR) e a nested-PCR (n-PCR). J
no segundo, tem-se o teste de polimorfismo de comprimento de fragmentos de
DNA gerados por enzimas de restrio sobre produtos amplificados pela PCR
(PCR-RFLP), o qual capaz de identificar os fragmentos do DNA do T. gondii,
realizando assim, a caracterizao genotpica do protozorio (SU et al., 2010).


2.2.1 Reao em cadeia da polimerase

Para conseguir uma boa sensibilidade na deteco do DNA do
parasita, o resultado depende do mtodo utilizado, como tambm, da tcnica
realizada para extrao do DNA (SILVA et al., 1999). Tradicionalmente, no
laboratrio clnico, os cidos nucleicos so extrados de amostras como sangue
total, soro, lquido amnitico e restos placentrios (BARRA et al., 2011).
Para realizar a extrao do DNA, na maioria das vezes so
utilizados kits comerciais, os quais facilitam o manuseio das amostras. Ainda,
possibilitam a remoo de possveis inibidores de PCR, como por exemplo, o
grupo heme do sangue e a heparina, que frequentemente utilizada na coleta
10
sangunea. No caso de amostras fecais, os kits devem extrair o DNA do
parasita a partir dos oocistos, evitar adsoro do material obtido pelos
constituintes das fezes e remover os inibidores da PCR (SILVA et al., 1999).
Aps a extrao do DNA, iniciada a cn-PCR e para a realizao
desta, so necessrios trs segmentos de cidos nuclicos: a dupla fita de
DNA, a qual servir de molde para amplificao e dois oligonucleotdeos
especficos, tambm conhecidos como primers ou iniciadores. Alm destes,
so necessrios: DNA polimerase, dNTPs (trifosfatos desoxinucletidos),
tampo e sais de cloreto de magnsio (LIMA, 2008).
A DNA polimerase necessita do magnsio para realizar sua
atividade e este geralmente fornecido sob a forma de cloreto de magnsio.
Os dNTPs so de quatro tipos de nucleotdeos, os quais so utilizados pela
polimerase para estender o iniciador anelado e o tampo garante adequado
ambiente ao da polimerase (STEPHENSON & ABILOCK, 2012). J os
primers so pequenas sequncias de nucleotdeos que se anelam no incio da
sequncia alvo, sendo ento complementares fita de DNA (LIMA, 2008).
Assim, o mtodo padro requer um modelo de DNA, que contenha a
regio a ser amplificada pelos dois primers e para realizar a amplificao
utilizada a Taq DNA polimerase. Ao reconhecer os iniciadores, a polimerase
sintetiza uma cpia complementar, obedecendo informao contida na
sequncia de DNA que ser replicada (LIMA, 2008). Com a ao da Taq DNA
polimerase, ocorre a sntese da nova fita complementar e as regies
especficas do DNA de interesse, so amplificadas enzimaticamente, em
sucessivos ciclos (MONIS & ANDREWS, 1998).
Cada ciclo da PCR repetido por cerca de 30 vezes e deve ser
realizado em trs etapas (Figura 6): desnaturao, anelamento e extenso.
Cada uma das trs etapas realizada em temperaturas diferentes, sendo que
geralmente na desnaturao a etapa ocorre a 94C (Figura 6 A), j no segundo
passo, ou anelamento, a temperatura pode variar de acordo com o tamanho e
constituio dos primers, podendo variar de 30 a 60C (Figura 6 B) e a
extenso ocorre a 72C (Figura 6 C), sendo que essas diferenas na
temperatura so conseguidas com uso do termociclador (LIMA, 2008).
11



FIGURA 6 - Esquema demonstrativo das trs etapas da PCR convencional: A. No primeiro
passo, ocorre a desnaturao, ento a dupla fita de DNA separa-se, a uma
temperatura de 94C por um minuto, dando origem a duas fitas simples de DNA. B.
A uma temperatura de 30 a 60C por cerca de um minuto, ocorre o segundo passo e
tem-se o anelamento dos primers em cada uma das fitas simples, em posies
especficas. C. O terceiro passo ou extenso d-se pela ao da DNA polimerase, a
uma temperatura de 72C por dois minutos, a qual realiza o processo de extenso
da sequncia a ser amplificada.
Adaptado de http://genetica.ufcspa.edu.br/FerramentasMolecular.htm

Durante cada ciclo, as fitas complementares de DNA so copiadas
pela extenso dos primers que se anelam em posies opostas. Desta forma,
cada fita recm-amplificada usada como molde no ciclo seguinte, resultando
no acmulo exponencial do fragmento de DNA flanqueado pelos dois
iniciadores (LIMA, 2008). Ento, cada ciclo da PCR duplica a quantidade de
DNA especfico, resultando numa amplificao de um milho de vezes da
sequncia alvo (SINGH, 1997).
Uma vez que o produto da PCR produzido aps a amplificao,
esse pode ser detectado utilizando a eletroforese em gel de agarose (SINGH,
2 Passo
Anelamento: Anelamento
dos primers em posies
especficas (30-60C/1min).
C
B
A
3 Passo
Extenso: Extenso da
sequncia a ser amplificada
pela ao da DNA
polimerase (72C/2min).
1 Passo
Desnaturao: separao
da dupla fita de DNA pelo
calor (94C/1min).
12
1997). A agarose utilizada no gel um polissacardeo que forma uma rede e
permite regular a velocidade da migrao das molculas durante a separao.
Esta tcnica faz uso da diferena de potencial eltrico, sendo que as molculas
de menor massa migram mais rapidamente (LIMA, 2008).
Aps a separao dos produtos, ocorre a adio de corante
fluorescente (brometo de etdio) que se intercala entre as bases do DNA e o
uso de radiao ultravioleta permite a visualizao dos produtos gerados
(LIMA, 2008), como demonstrado na Figura 7.


FIGURA 7 Amplificao da sequncia de 529 pb (pares de base) e deteco
pela PCR do DNA de Toxoplasma gondii em gua contaminada
experimentalmente.
Legenda: 1) 10
6
taquizotos/ mL de gua; 2) 10
5
taquizotos/ mL de gua;
3) 10
4
taquizotos/mL de gua; 4) 10
3
taquizotos/mL de gua; 5) 10
2

taquizotos/mL de gua; 6) 10
1
taquizotos/ mL de gua; 7) 10
0
taquizotos
/mL de gua; 8) gua ultrapura (controle negativo da extrao); 9) controle
positivo; 10) gua ultrapura (controle negativo da extrao); 11) gua
ultrapura (controle negativo da PCR); (PM) padro de peso molecular 100
pb.

Fonte: SILVA (2009).

13
De acordo com ALMEIDA (2004, vem ocorrendo o desenvolvimento
de tcnicas baseadas no princpio da cn-PCR e uma delas a conhecida n-
PCR, esta um mtodo sensvel, no qual o produto amplificado submetido a
um segundo processo de amplificao, para isso, so utilizados um conjunto de
iniciadores homlogos s sequncias internas do segmento j amplificado.
Este procedimento torna a reao da polimerase mais especfica e sensvel.
Geralmente, na primeira PCR utilizado um iniciador gnero-especfico e, na
segunda, um iniciador espcie-especfico do parasita em estudo.



2.2.2 Teste de polimorfismo de comprimento de fragmentos de DNA
gerados por enzimas de restrio sobre produtos amplificados pela
reao em cadeia da polimerase

Como mencionado anteriormente, a PCR realizada para a
amplificao de uma regio de um gene de interesse que contm uma ou
mltiplas substituies de bases. Quando o produto de tal tcnica submetido
digesto por uma ou mais enzimas de restrio, ocorre ento o PCR-RFLP,
este um mtodo que detecta variaes na regio do fragmento alvo que foi
amplificado, sendo que uma nica substituio de bases pode originar ou
extinguir um stio capaz de ser digerido pela enzima de restrio de
endonuclease (ALMEIDA, 2004).
Para isso, tal mtodo busca os marcadores moleculares e baseia-se
na capacidade de que as endonucleases de restrio reconhecem o
polimorfismo do nucleotdeo nico dos produtos obtidos pela PCR e
posteriormente, exibe as regies distintas do fragmento em padro de bandas
pelo mtodo de eletroforese em gel de agarose (SU et al., 2010).




14
2.3 Diagnstico e caracterizao molecular do Toxoplasma gondii

2.3.1 Diagnstico molecular

O T. gondii, eucarioto intracelular obrigatrio, foi detectado por meio
de tcnicas moleculares em vrios tecidos vivos e clulas nucleadas alm de
ter sido encontrado em lquidos orgnicos como sangue, linfa, saliva, leite
(colostro), exsudatos, esperma e lquido peritoneal, sendo ainda capaz de se
dividir e multiplicar-se em cultura de clulas de peixes (SILVEIRA, 2009).
Desta forma, os mtodos de diagnsticos moleculares promovem a
deteco do parasito, pois possuem alta sensibilidade e especificidade,
proporcionando a identificao do DNA do protozorio em diferentes amostras,
como fezes e fluidos corpreos (GONALVES, 2010).
Para alcanar elevada sensibilidade pela PCR, deve-se ter
conhecimento prvio da sequncia alvo do DNA que se deseja detectar. A
partir disto, dois primers j desenhados so utilizados para amplificar a
sequncia desejada (SU et al., 2010).
Cada par de iniciador especfico para um dos marcadores
genticos existentes para o T. gondii, os quais so frequentemente
pesquisados nas amostras biolgicas (SU et al., 2010), exemplo: o gene B1,
inicialmente descrito por BURG et al. (1989); o fragmento de 529 pb (HOMAN
et al., 2000), o espaado interno transcrito (ITS -1) (SLAPETA et al.,2002),
entre outros.
O gene B1 um marcador gentico com peso molecular de 2,2 Kb
(kilobase) (CARNEIRO, 2011), tal marcador um dos mais utilizados, pois est
repetido em 35 cpias no genoma do T. gondii, ainda demonstra alta
sensibilidade, sendo capaz de detectar at um parasita em cerca de 100 mil
clulas hospedeiras. Para a deteco do gene B1 so utilizados os pares de
primers: 5'-GGA ACT GCA TCC GTT CAT GAG-3' e 5'-TCT TTA AAG CGT
TCG TGG TC-3' (BURG et al., 1989).
SPALDING et al. (2002) por meio da cn-PCR utilizou os dois pares
de primers referidos anteriormente, direcionados ao gene B1 do T. gondii e
15
avaliou amostras sanguneas e placentrias coletadas de mulheres no
momento do parto e a reao foi sensvel e especfica; evidenciando a
presena de um a dez taquizotos, no material amostrado.
O marcador gentico de 529 pb repete-se 300 vezes no genoma do
parasita em questo, assim, apresenta elevada sensibilidade para a deteco
de tal protozorio e para a amplificao deste marcador podem ser utilizados
os pares de primers: 5-CGC TGC AGG GAG GAA GAC GAA AGT TG-3 e 5-
CGC TGC AGA CAC AGT GCA TCT GGA TT-3 (HOMAN et al., 2000).
Assim, SILVA (2009) pesquisou a presena de DNA de T. gondii em
amostras de vsceras (crebro, pulmo e msculo) de ovinos sorologicamente
positivos para toxoplasmose. Para isso, utilizou a cn-PCR direcionada ao
fragmento de 529 pb e obteve que 100% dos animais positivos na PCR
convencional tambm foram positivos na sorologia, como demonstrado na
Tabela 1, o que denota a adequao da tcnica molecular utilizada para o
diagnstico do T. gondii.

TABELA 1 - Frequncia de animais positivos sorologia em
relao a PCR de amostras viscerais de ovinos.
PCR
Sorologia
Negativo (%) Positivo (%) Total (%)
Negativo 20 (30,8) 45 (69,2) 65 (75,6)
Positivo 0 (0,00) 21 (100) 21 (24,4)
Total 20 (23,3) 66 (76,7) 86 (100)

Fonte: SILVA, 2009.

J o ITS-1 uma sequncia-alvo bastante utilizada como marcador
molecular em estudos envolvendo protozorios toxoplasmatneos, pois trata-se
de uma regio menos conservada e que possui diferenas marcantes entre as
espcies dessa subfamlia (SLAPETA et al.,2002). Portanto, aquele tem ampla
utilizao para diagnstico molecular em estudos filogenticos (GONALVES,
2010). Para a amplificao desta poro do gene podem ser utilizados os
16
primers: 5CGA AAT GGG AAG TTT TGT GAA C3 e 5-CAG CAG CTA CAT
ACG TAG A-3 (SLAPETA et al.,2002).
GONALVES (2010), a fim de detectar parasitas da subfamlia
Toxoplasmatinea, presentes em amostras viscerais de galinhas, utilizou dois
pares de primers, para amplificar a poro ITS-1, por meio da n-PCR e foi
observado que 42% das amostras apresentaram resultado com bandas com
cerca de 400pb, equivalentes ao DNA desta subfamlia.
O autor realizou ainda a cn-PCR para o T. gondii, sendo que para o
primeiro foi amplificado o gene B1 e obteve que 66% de amostras positivas na
n-PCR tambm foram positivas para a cn-PCR direcionada ao T. gondii, o que
demonstra que as aves apresentam-se como hospedeiros intermedirios
eficientes deste protozorio.
Em geral, a PCR muito sensvel, pois pode detectar o DNA de
apenas um taquizoto, proporcionando um diagnstico rpido, e o uso de tal
mtodo adequado para espcimes clnicos, porm amostras fecais
apresentam inibidores, os quais podem diminuir a sensibilidade da PCR. No
entanto, do ponto de vista da sade pblica, necessrio distinguir os oocistos
de T. gondii dos oocistos de outros protozorios, como Isospora felis. I. rivolta,
Sarcocystis muris (Figura 8), os quais tambm podem estar presentes nas
fezes do gato, porm aqueles no parasitam o homem (DUBEY, 2010).
Diante disto, foi desenvolvida uma tcnica baseada na cn-PCR,
conhecida como copro-CPR na qual procedesse a concentrao dos oocistos e
o rompimento da parede desses, antes da extrao do DNA. Tal tcnica foi
direcionada sequncia de 529 pb e permitiu a deteco de DNA de T. gondii,
a partir de amostras fecais de gatos (SALANT et al., 2010).

17

FIGURA 8 - Oocistos no esporulados de Isospora felis (A), Isospora
rivolta (B), e Toxoplasma gondii (C), em comparao com
esporocisto esporulado de Sarcocystis muris (D).
Ampliao de 1600 x.
Fonte: DUBEY, 2010.


2.3.2 Caracterizao molecular

Apesar de sua grande distribuio mundial, ampla gama de
hospedeiros e da presena de uma fase sexual no seu ciclo biolgico, o T.
gondii apresenta uma baixa variao gentica. A estrutura populacional deste
protozorio foi definida com auxlio de um sistema de tipificao baseado na
tcnica de PCR-RFLP, a qual foi capaz de revelar uma estrutura populacional
clonal do gnero Toxoplasma. Esta clonalidade manifesta- se pelo isolamento
repetitivo do mesmo gentipo em amostras no relacionadas (YAI, 2007).
As amostras atualmente conhecidas de T. gondii possuem
similaridades antignicas, morfolgicas e semelhanas na capacidade de
infectar vrios hospedeiros. Porm, apesar do gnero em questo ser
considerado monoespecfico (SILVEIRA, 2009), tem sido realizada a
caracterizao genotpica de diferentes isolados deste protozorio por meio de
mtodos moleculares (YAI, 2007).
18
Para a realizao da genotipagem dos isolados de T. gondii pode
ser utilizada a PCR-RFLP, a qual direcionada a vrios marcadores
moleculares, como por exemplo: SAG1, SAG2, SAG3. O que proporciona a
deteco do polimorfismo gentico e possibilita a caracterizao genotpica em
diferentes isolados, originados de material humano e animal, demonstrando a
existncia de diversidade gentica no gnero, ao qual pertence tal protozorio
(CARNEIRO, 2011).
Assim, com a utilizao da tcnica mencionada foi possvel
descrever a subpopulao do T. gondii em vrias regies geogrficas do
mundo. Desta forma, a maioria dos isolados deste protozorio, de humanos e
animais, na Amrica do Norte, Europa e frica foram agrupadas em uma da
trs linhagens clonais conhecidas: tipo I, II e III (SU et al., 2010).
Em humanos, a linhagem clonal de T. gondii classificada como tipo I
normalmente associada a casos de toxoplasmose aguda, podendo provocar
leses oculares (VALLOCHI et al., 2005). J o gentipo tipo II predominante
encontrado em pacientes imunossuprimidos e em casos de toxoplasmose
congnita e a do tipo III comumente encontrada em animais (CARNEIRO,
2011).
Assim, de acordo com DUBEY et al. (2004), por meio da PCR-RFLP
e a partir de amostras viscerais de gatos sorologicamente positivos para o T.
gondii, da regio do Paran, Brasil, foram isoladas somente as linhagens tipo I
e tipo III. Outro estudo, com isolados de vsceras de ces, tambm positivos
para toxoplasmose, provenientes do estado de So Paulo, confirmou somente
a presena da linhagem tipo III (DUBEY et al., 2007a).
J DUBEY et al. (2007b), demonstraram a partir de amostras
viscerais de galinhas caipiras, sorologicamente positivas para toxoplasmose e
provenientes da regio do Par e Rio grande do Sul, que os gentipos isolados
eram diferentes dos j descritos anteriormente, porm intimamente
relacionados com as linhagens clonais tipos I ou III.
PENA et al. (2008) avaliaram os resultados obtidos por DUBEY et al.
(2004), DUBEY et al. (2007a), DUBEY et al. (2007b) e diante da alta
diversidade gentica dos isolados, determinaram, por meio da PCR-RFLP,
19
utilizando os marcadores moleculares: SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6,
C22-8, C29-2, L358, PK1 e Apico, que as linhagens encontrados no Brasil so
de quatro tipos (BrI, BrII, BrIII e BrIV) (Figura 9). Assim determinaram que o T.
gondii tem uma estrutura populacional epidmica no Brasil e as principais
linhagens tm diferenas entre as anteriormente mencionadas.
Outro estudo realizado com isolados de galinhas, da Regio do
Esprito Santo, demonstrou que o tipo BrI o gentipo encontrado com mais
frequncia nesse estado (Figura 9) e nenhum dos tipos I, II ou II foram
encontrados (PENA et al., 2013).

FIGURA 9 - Mapa do Brasil demonstrando a distribuio dos isolados do
Toxoplasma gondii: Par, linhagem BrI, em frangos; Esprito
Santo, tipo BrI em frangos; So Paulo, BrI, BrII e BrIII em ces
e gatos e tipo II, em ovinos; Paran, tipos BrI, BrII e BrIII, em
ces e gatos; Rio Grande do Sul, tipos BrIII e BrIV, em
frangos.

Adaptado de PENA et al., 2008.

Esprito Santo
Isolados do tipo BrI, em frangos
Isolados do tipo BrI, BrII e BrIII em
ces e gatos
Isolados do tipo BrIII e BrIV, em frangos
Isolados do tipo II, em ovinos
20
Porm, SILVA et al. (2011) pesquisaram a taxa de infeco por T.
gondii em ovinos de frigorficos do estado de So Paulo e os que foram
positivos sorologicamente para toxoplasmose, tiveram suas amostras viscerais
avaliadas pela cn-PCR e PCR-RFLP, sendo que para esta utilizaram 11
marcadores: SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, C22-8, C29-2, L358, PK1,
Apico e CS3.
A partir disto, os pesquisadores demonstraram que o gentipo tipo II,
anteriormente no encontrado no Brasil, estava presente nas amostras
viscerais de ovinos provenientes do estado de So Paulo. Tais resultados
confirmaram a elevada diversidade de gentipos do protozorio em questo no
territrio brasileiro (SILVA et al., 2011).
A infeco pelo T. gondii, bem como o desenvolvimento da
toxoplasmose, tem sido detectada com maior sensibilidade atravs dos
mtodos moleculares. Contudo, como limitao da tcnica, a positividade no
discrimina se o DNA amplificado provm de parasitas viveis ou de fragmentos
do parasita. Devido a isso, o isolamento em animais susceptveis reproduz a
infeco quando h parasitas viveis nos tecidos animais, refletindo a presena
ativa dos mesmos (SILVEIRA, 2009).
Dentre os animais sensveis inoculao, citam-se hamsters,
cobaias, camundongos e coelhos. Destes, os camundongos so os melhores
por serem os mais susceptveis infeco experimental, podendo, fornecer
milhes de taquizotos em apenas trs dias depois da infeco experimental
(SILVEIRA, 2009).
Para o isolamento do T. gondii podem ser utilizados camundongos
heterozigotos imunocompetentes, os quais so naturalmente susceptveis
infeco pelo parasito; a via de inoculao comumente utilizada a via
intraperitoneal, que se mostra mais efetiva do que outras vias, como via oral ou
intracerebral (GONALVES, 2010).
Os camundongos so inoculados com taquizotos ou bradizotos, e
dependendo da linhagem inoculada, se virulenta o animal pode desenvolver
infeco aguda, com a formao de ascite, apresentar taquizotos no lquido
peritoneal, formar cistos teciduais e desenvolver encefalite, o que causa a
21
sintomatologia neurolgica observada em alguns animais (GONALVES,
2010), ou quando a linhagem no-virulenta a infeco pode apresentar de
forma crnica, no desenvolvendo sintomas (YAI, 2007).
Considerando que a patogenicidade do T. gondii est estreitamente
relacionada virulncia da cepa e espcie hospedeira (YAI, 2007), PENA et
al. (2008) realizaram o isolamento e o bioensaio em camundongos das
linhagens encontradas no Brasil (BrI, BrII, BrIII e BrIV) e constrataram que o
isolado do tipo BrI pode ser considerado virulento, o tipo BrIII no-virulento, e
os tipos BrII e BrIV so considerados virulentos intermedirios. J o tipo II,
encontrado em ovinos no estado de So Paulo, no foi virulento ao bioensaio
em camundongos (SILVA et al., 2011).
Os resultados apresentados demonstram a diferena da distribuio
e das linhagens genotpicas apresentadas no Brasil em relao s
demonstradas anteriormente para a Amrica do Norte, pois nesta so relatadas
apenas a presena de trs linhagens: tipo I, II e III (DUBEY et al., 2004).
Diante do que foi exposto, de extrema importncia investigar a
relao do gentipo e as manifestaes clnicas da toxoplasmose em animais,
pois estas podem ser relacionadas s linhagens patognicas aos seres
humanos (SU et al., 2006).

22
3 CONSIDERAES FINAIS
Os protozorios so parasitas causadores de doenas de
importncia mdica e veterinria, destacando-se o T. gondii por ser agente
causador de zoonose apresentar distribuio cosmopolita.
O diagnstico da toxoplasmose baseia-se no exame sorolgico, o
qual capaz de demonstrar o contato com o parasita. Porm, quando a
infeco toma a sua forma crnica, a tcnica mencionada, no indica a
presena de parasita vivel. O que importante, por exemplo, quando se
investiga a forma de contaminao: a horizontal, pela presena de bradizotos
em vsceras, ou a forma vertical, pela deteco de taquizotos em anexos
placentrios.
Para obter tais resultados, as tcnicas baseadas no diagnstico
molecular, especificamente a PCR, so utilizadas juntamente com os mtodos
sorolgicos, objetivando-se a deteco do T. gondii. Assim, as tcnicas
moleculares so ferramentas eficientes, pois podem detectar o DNA do
protozorio em diversos materiais biolgicos, o que demonstra a presena do
mesmo, no material analisado.
Porm, somente a identificao do material gentico do T. gondii,
no indica a sua viabilidade, desta forma requisitado o bioensaio, pois este
capaz de reproduzir a infeco em animais, como por exemplo, em
camundongos. Tal tcnica capaz de demonstrar a presena de parasitas
viveis e assim, ser definido que o T. gondii, na amostra analisada, possui
potencial infeccioso.
Ainda, o estudo da diversidade gentica de tal protozorio, por meio
da PCR-RFLP, importante, pois pode esclarecer dvidas quanto
distribuio epidemiolgica nos hospedeiros intermedirios, pois estes podem
ser importantes fontes de contaminao horizontal. E juntamente com o
bioensaio, as tcnicas baseadas na PCR, fornecem subsdios para avaliao
das caractersticas biolgicas, como a virulncia e patogenicidade da linhagem.
Alm de elucidar aspectos das distintas manifestaes clnicas da doena, o
que resulta em obteno ou ampliao de conhecimentos importantes para o
controle, diagnstico e tratamento da toxoplasmose.
23
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