Antracnosis de Guanabana

DINMICA DE LAS FUENTES DE INCULO E IDENTIFICACIN DEL AGENTE
CAUSAL DE LA ANTRACNOSIS (Colletotrichum sp) EN GUANBANA (Annona

muricata L.)

ADRIANA PAOLA LIZARAZO CARRILLO

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTADER
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE
PLAN DE ESTUDIOS DE INGENIERIA DE PRODUCCION BIOTECNOLOGICA
SAN JOSE DE CUCUTA
2005

muricata L.)

ADRIANA PAOLA LIZARAZO CARRILLO

Proyecto de grado presentado como requisito para optar al ttulo de
Ingeniero de Produccin Biotecnolgica

Director
JAIRO ANTONIO OSORIO CARDONA
PhD. Fitopatoliga

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTADER
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE
PLAN DE ESTUDIOS DE INGENIERIA DE PRODUCCION BIOTECNOLOGICA
SAN JOSE DE CUCUTA
2005

A mis abuelos, Ruperto y Ana Celia, que los amo con todo mi corazn.
Adriana Paola

AGRADECIMIENTOS
La autora del presente proyecto de grado, expresa sus agradecimientos:
A la Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria, CORPOICA Tibaitat.
Al doctor Jairo Osorio, Coordinador Nacional del Programa Manejo Integrado de Plagas,
por su carisma, enseanza y colaboracin, durante el desarrollo de este proyecto.
A mi primo y amigo, doctor Fernando Rodrguez, investigador del Programa Fisiologa y
Nutricin Animal, por su sabidura, amor, apoyo y paciencia.
Al doctor Jorge Argelles, Coordinador Nacional del Programa de Biometra, por la
asesora en el anlisis estadstico.
A la seora Luca Huertas de Castao, por permitir la ejecucin del proyecto en la Finca,
Lomitas de Calaima.
A Juan Clmaco Ho, por la contribucin en todas las actividades del proyecto.
A Jorge Rodrguez, por toda la dedicacin, enseanza y paciencia.
A mi amiga, Mara Fernanda Torres, por su amistad, asesora y colaboracin durante todo
el desarrollo del proyecto.
A mi amigo, Oscar Fuentes, por compartir sus conocimientos, experiencias, por ser siempre
un motivo de alegra y por todos los momentos geniales que vivimos.
A mi amiga, Jeni Garca, por estar siempre a mi lado, apoyndome en todas mis decisiones.
A mis compaeras y amigas de laboratorio, Erika, Yuri y Ginna, a quienes quiero mucho,
por ayudarme en las actividades de esta investigacin y compartir todas las experiencias en
este ao.
A Fabiola Monroy, por su inters en la consecucin de todo el material bibliogrfico
necesario para este proyecto.
A mi amiga Fabiola Gmez, por todo el apoyo emocional durante este tiempo.
A Juan Manuel y Giovanna Crdenas por brindarme su amor y cario.
A los abues y a mis hermanos, Juanga y Linda, por hacerme sentir muy cerca de ellos.
A mis paps, Bernardo y Rita, por recordarme siempre lo importante que soy en sus vidas.
A Tatiana Garca y Alexander Ramrez por ayudarme en todo lo que fue necesario.

RESUMEN EJECUTIVO
El presente trabajo se propuso determinar las caractersticas de distribucin de la fuente de
inculo y la identificacin del agente causal de la antracnosis en guanbana. Se realizaron
muestreos mensuales de hojas asintomticas de forma estratificada de acuerdo con la edad,
orientacin y profundidad, las cuales fueron tratadas con paraquat y establecidas en
cmaras hmedas a fin detectar las infecciones latentes (acrvulos). Fue necesario el diseo
de una escala con 5 niveles para cuantificar la presencia de los acrvulos y as determinar la
dinmica de la fuente de inculo en la copa del rbol de guanbana. La coleccin de estudio
del patgeno (Colletotrichum sp.) se conform con 20 cultivos monoconidiales, los cuales
se obtuvieron a partir de aislamientos de acrvulos y de tejido vegetal con sntomas
iniciales de diferentes rganos como hojas, botones florales y frutos. A cada colonia se le
realiz caracterizacin morfolgica como: color de la colonia, tipo de micelio, forma y
tamao de los conidios, velocidad de crecimiento y sensibilidad al benomyl. Dieciocho (18)
colonias se identificaron molecularmente con el uso de primers especficos tipo ITS, CaInt2
para Colletotrichum acutatum y CgInt para Colletotrichum gloeosporioides, los cuales
fueron acoplados con el primer universal ITS4. La coleccin de estudio se conserv en
papel filtro y glicerol al 10% a 20C.

CONTENIDO
Pg
INTRODUCCION 7
1. PROBLEMA 9
1.1 TTULO 9
1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 9
1.3 FORMULACIN DEL PROBLEMA 10
1.4 OBJETIVOS 10
1.4.1 Objetivo general 10
1.4.2 Objetivos especficos 10
1.5 JUSTIFICACIN 11
2. MARCO REFERENCIAL 12
2.1 ANTECEDENTES 12
2.2 MARCO TERICO 13
2.2.1 Generalidades de la guanbana 13
2.2.2 La Antracnosis 15
2.2.3 El patgeno 18
2.3 MARCO CONCEPTUAL 22
2.4 MARCO CONTEXTUAL 23
2.5 MARCO LEGAL 24
3. DISEO METODOLOGICO 25
3.1 TIPO DE INVESTIGACIN 25
3.2 POBLACIN Y MUESTRA 25
3.2.1 Poblacin 25
3.2.2 Muestra 25
3.3 HIPTESIS 25
3.4 VARIABLES 25
3.5 FASES DE LA INVESTIGACIN 26
3.5.1 Localizacin 26
3.5.2 Estandarizacin de envejecimiento foliar para deteccin de infecciones latentes 26
3.5.3 Establecimiento del follaje envejecido en cmaras hmedas 27
3.5.4 Evaluacin de los tratamientos para determinar la presencia de infecciones latentes
en follaje 28
3.5.5 Diseo de una escala para la cuantificacin de acrvulos sobre la lmina foliar 28
3.5.6 Diseo de muestreo de la copa del rbol de guanbana 29
3.5.7 Procesamiento de material vegetal 30
3.5.8 Identificacin y evaluacin de infecciones latentes sobre hojas asintomticas 32
3.5.9 Aislamiento de Colletotrichum sp. a partir de infecciones latentes en hojas 32
3.5.10 Aislamiento de Colletotrichum sp. a partir de sntomas de antracnosis en frutos,
botones florales y hojas 32
3.5.11 Purificacin de los aislamientos de Colletotrichum sp. 33
3.5.12 Conformacin de una coleccin de estudio a partir de cultivos monoconidiales de
Colletotrichum sp. 34
3.5.13 Conservacin de la coleccin de estudio en glicerol y papel 35
3.5.14 Reactivacin de cultivos puros de Colletotrichum sp. 36
3.5.15 Caracterizacin biolgica de la coleccin de estudio de Colletotrichum sp. 36
3.5.16 Caracterizacin molecular de Colletotrichum sp. 37
3.6 INSTRUMENTOS PARA LA RECOLECCIN DE INFORMACIN 38
3.7 TCNICAS DE RECOLECCIN Y ANLISIS DE DATOS 39
3.7.1 Evaluacin de presencia de acrvulos en el follaje 39
3.7.2 Evaluacin del crecimiento de Colletotrichum sp. en diferentes medios de cultivo 39
4. RESULTADOS 40
4.1 ESTANDARIZACIN DE ENVEJECIMIENTO FOLIAR PARA DETECCIN DE
INFECCIONES LATENTES EN GUANBANA 40
4.2 DETECCIN DE INFECCIONES LATENTES MEDIANTE LA PRESENCIA DE
ACRVULOS DE Colletotrichum sp. 41
4.3 CUANTIFICACIN CON ESCALA DE LAS INFECCIONES LATENTES EN
HOJAS ASINTOMTICAS DE GUANBANA 41
4.4 ANLISIS DE LA DISTRIBUCIN ESPACIAL DE Colletotrichum sp. EN LA
COPA DE Annona muricata L. 43
4.5 IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE SNTOMAS DE ANTRACNOSIS
EN DIFERENTES RGANOS DE Annona muricata L. 46
4.6 COLECCIN DE ESTUDIO DE Colletotrichum sp. 47
4.7 CARACTERIZACIN BIOLGICA DE LOS AISLAMIENTOS DE LA
COLECCIN DE Colletotrichum sp. 53
4.8 CARACTERIZACIN MORFOLGICA DE LOS AISLAMIENTOS DE LA
COLECCIN 56
4.9 CARACTERIZACIN MOLECULAR DE LOS AISLAMIENTOS DE LA
COLECCIN 58
5. DISCUSIONES 62
6. CONCLUSIONES 69
7. RECOMENDACIONES 70
BIBLIOGRAFIA 71

LISTA DE FIGURAS
Pg.
Figura 1. Sntomas de la antracnosis en hojas de guanbana 17
Figura 2. Sntomas tpicos de antracnosis en botones florales de guanbana, lesiones
iniciales 17
Figura 3. Lesin avanzada de antracnosis en fruto de guanbana con esporulacin de
Colletotrichum sp. 18
Figura 4. Colletotrichum gloeosporioides en medio PDA, 14 das de cultivo 21
Figura 5. Latencia y ciclo corto de infeccin de Colletotrichum sp 22
Figura 6. Diagrama de la lmina foliar de guanbana con los 5 niveles de cubrimiento
de infecciones latentes (acrvulos) 29
Figura 7. Establecimiento de hojas senescentes de guanbana en cmaras hmedas para
deteccin de infecciones latentes 31
Figura 8. rbol de guanbana (Annona muricata L.) 31
Figura 9. Sntomas de la antracnosis vistos en campo y bajo estereoscopio 33
Figura 10. Aislamientos de la coleccin de Colletotrichum sp. conservados en papel
filtro 36
Figura 11. Acrvulos caractersticos de Colletotrichum sp. observados sobre el envs de
hojas de guanbana 42
Figura 12. Envs de hoja de guanbana con ms del 80% de infecciones latentes
(presencia de acrvulos) despus del tratamiento con paraquat al 4%. Valor ubicado en
la divisin 5 de la escala 42
Figura 13. Medicin de conidios de Colletotrichum sp. teidos con azul de lactofenol 48
Figura 14. Secuencia de sntomas de la antracnosis en la lmina foliar de guanabana 48
Figura 15. Estados iniciales de la antracnosis en el borde de la lmina foliar de
guanabana 49
Figura 16. Secuencia de sntomas de la antracnosis en la nervadura de la lmina foliar
de guanabana 49
Figura 17. Comparacin del dimetro de crecimiento de la colonia SHO3 en medio
selectivo para Colletotrichum sp 53
Figura 18. Comparacin del crecimiento de la colonia SB04 en diferentes medios de
cultivo 57
Figura 19. Colonias de Colletotrichum sp. de coloracin blanco, gris y naranja de la
coleccin de estudio 57
Figura 20. Amplificacin de fragmentos especficos de DNA de los aislamientos
seleccionados de Colletotrichum sp. utilizando los primers CgInt, CaInt2 e ITS4 59
seleccionados de Colletotrichum sp. utilizando los primers CgInt, CaInt2 e ITS4 59
seleccionados de Colletotrichum sp. utilizando los primers CgInt, CaInt e ITS4 60

LISTA DE CUADROS
pg.
Cuadro 1. Diseo experimental para la estandarizacin de envejecimiento foliar con
paraquat a diferentes concentraciones y periodos de tiempo 27
Cuadro 2. Escala de cuantificacin de infecciones latentes de Colletotrichum sp.
sobre la lmina foliar de guanbana 28
Cuadro 3. Muestreo estratificado de la copa para el estudio de la dinmica de
Colletotrichum sp. en guanbana 30
Cuadro 4. Solucin mster mix para 41 reacciones de PC 37
Cuadro 5. Programa del termociclador COLLE01 utilizado para PCR 38
Cuadro 6. Evaluacin bajo estereoscopio del follaje tratado con paraquat 40
Cuadro 7. Porcentaje de infecciones latentes 43
Cuadro 8. Modelo del formato para la toma de datos de infecciones latentes 43
Cuadro 9. Caracterizacin morfolgica macroscpica de la coleccin de estudio de
Colletotrichum sp 50
Cuadro 10. Caracterizacin microscpica de la coleccin de estudio de
Colletotrichum sp 52
Cuadro 11. Comparacin de dimetros de crecimiento de los aislamientos de la
coleccin en medio PDA y selectivo para Colletotrichum sp despus de 72 horas de
incubacin 54
Cuadro 12. Medicin de dimetros de crecimiento de los aislamientos de la coleccin
en medio PDA con benomyl a las 48 horas de incubacin 55
Cuadro 13. Grupos de aislamientos de guanbana caracterizados como
Colletotrichum gloeosporioides y Colletotrichum acutatum 58
Cuadro 14. Caracterizacin morfolgica y molecular de los 20 aislamientos de la
coleccin 61

LISTA DE GRFICAS
pg.
Grfica 1. Porcentaje de aislamientos de la coleccin de estudio que presentaron una
coloracin blanco y gris, blanco, naranja y gris en medio PDA 51
Grfica 2. Porcentaje de los aislamientos de la coleccin que produjeron masas de
conidias en dos coloraciones naranja y rosado 51
Grfica 3. Porcentaje de los aislamientos que mostraron mayor y menor velocidad de
crecimiento en medio selectivo para Colletotrichum sp 53
Grfica 4. Porcentaje de aislamientos resistentes y sensibles al benomyl (2g/ml)
luego de 48 horas de incubacin 55

INTRODUCCION
La guanbana (Annona muricata), es una fruta de gran importancia para los pases
tropicales y subtropicales debido a su amplia aceptacin en el mercado. En Colombia se ha
convertido en una de las frutas predilectas dentro de la canasta frutcola familiar; esta fruta
no slo es preferida por su agradable sabor sino tambin por su valor nutritivo y
nutracutico. La guanbana tiene buenas perspectivas en los mercados internacionales, es
apreciada por su tamao, forma y calidad, su demanda se ha ido incrementando
paulatinamente y a medida que se desarrolla la tecnologa para su cultivo el rea dedicada
aumenta. Hoy por hoy, se emplea en la industria de helados, jugos, lcteos, consumo fresco,
enlatados y concentrados.
La guanbana es originaria de las regiones tropicales de Amrica del sur, actualmente se
cultiva en Amrica tropical, el sudeste asitico y en las Islas Filipinas. La fruta es conocida
como anona, zapote agrio, soursop (ingls), corossel (francs) y zuurzak (holands).
Los mayores productores por rea cultivada a nivel mundial se encuentran en el Caribe:
Bermuda, Bahamas, Cuba y Repblica Dominicana; Centroamrica: sur de Mxico y Costa
Rica; y Suramrica: Colombia y Brasil. En Colombia existen aproximadamente 1.441
hectreas cultivadas de las cuales se producen 9600 toneladas anuales. Los principales
departamentos son: Tolima con el 40% de la produccin, Valle del Cauca con el 37.5%,
Huila 7.3% y Crdoba con el 6.8%. Sus principales destinos son Japn, Holanda, Espaa y
Canad.
Dentro de las limitantes de crecimiento y produccin, la antracnosis es la enfermedad que
ms incide en el cultivo, causada por el hongo Colletotrichum sp., que ataca desde las
plantas tiernas en semillero hasta las ramas, flores y frutos.
El hongo se dispersa por el contacto de gotas de agua con superficies donde se encuentra el
inculo, la entrada de los conidios en stas, el salpique y el movimiento a otros rganos del
hospederos. La mayor forma de dispersin de Colletotrichum sp. ocurre a partir de tejido
muerto o senescente sobre el cual se producen abundantes acrvulos, los cuales son
dispersados por accin del viento o el salpique despus de las lluvias.
Al inicio de la enfermedad, los sntomas que se pueden apreciar son manchas amarillentas
en las flores, la coloracin cambia de verde amarillento a pardo, ennegrecen, finalmente
caen al suelo y en algunos casos, quedan momificadas en las ramas. Cuando el hongo
aparece en perodo de floracin, la infeccin se presenta en los ptalos, con manchas que se
alargan paulatinamente hasta cubrir toda la flor, la cual toma una coloracin negruzca y cae
posteriormente.
Aun en la ausencia de sntomas visibles, los conidios de Colletotrichum sp. pueden
germinar sobre la superficie de hojas y/o frutos donde persisten como microscpicas
infecciones latentes que consisten en un apresorio con desarrollo limitado de hifas
infectivas. En condiciones favorables, el hongo puede crecer rpidamente dentro de la
planta y causar sntomas severos, pero en otras circunstancias Colletotrichum sp. podra
estar latente en los tejidos del hospedero por un tiempo, en algunos casos slo llega a ser
aparente despus de la cosecha. Una vez el hongo est desarrollado en el interior de la
planta, se producen cuerpos fructferos oscuros que causan sntomas tpicos de antracnosis.
El control efectivo de la antracnosis usualmente involucra el uso de uno o ms mtodos,
como por ejemplo: variedades resistentes, control cultural, control qumico y control
biolgico, mediante el uso de antagonistas; la aplicabilidad de las estrategias de control
depende en su mayora de las caractersticas del cultivo. La opcin de control con
variedades resistentes en cultivos de frutas es complicada, debido a la habilidad de la
mayora de especies de Colletotrichum para formar infecciones latentes. El control cultural
se refiere a tcticas dirigidas a evitar la antracnosis a travs de la fitosanitizacin,
manipulacin de patrones de cultivo, tcnicas apropiadas de sanidad durante la cosecha,
transporte, empaque y almacenamiento.
El control qumico de la enfermedad se lleva a cabo mediante la aplicacin de compuestos
de cobre, ditiocarbamatos, benzimidazoles, triazoles y otros funguicidas, como clorotalonil,
imazalil y procloraz, los cuales son altamente efectivos contra especies del gnero
Colletotrichum. Sin embargo, el problema de la tolerancia a los fungicidas podra
incremetarse aun ms en el patgeno, gracias a las aplicaciones continuas que puedan
ejercer una presin de seleccin en el hongo.
El principal inconveniente en el manejo de la antracnosis en el cultivo de guanbana, es el
desconocimiento de varios factores: identidad del agente causal, ciclo de la enfermedad,
forma de distribucin del patgeno en el rbol y otras caractersticas de la fuente de
inculo. La importancia de este trabajo radica en la generacin de informacin eficaz y
eficiente sobre la enfermedad, conocer los factores anteriormente mencionados para
redisear las prcticas de control de la enfermedad con el fin de garantizar una produccin
con incidencia mnima posible de antracnosis, lo cual permitira disminuir la aplicacin de
productos qumicos, mayor efectividad de las prcticas de control, reduccin de costos de
manejo, evitar el desarrollo de la resistencia en el patgeno, y minimizar la contaminacin
del medio ambiente.

1. PROBLEMA
1.1 TTULO
muricata L.)
1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La enfermedad ms importante que incide en el cultivo de la guanbana es la antracnosis, la
cual se caracteriza por atacar hojas, botones florales, frutos y tallos. El agente responsable
es un hongo patgeno del gnero Colletotrichum sp., que ocasiona grandes prdidas
econmicas en frutales en climas templados, subtropicales y tropicales. Su impacto
econmico ha conducido a estudios extensos sobre diversos aspectos de su biologa como
especificidad del hospedero, biologa celular de los procesos de infeccin, interaccin
planta patgeno, diversidad gentica y epidemiologa
Existen dos tipos diferentes de enfermedades causadas por Colletotrichum, que afectan
frutos, las que ocasionan daos sobre los frutos inmaduros y en desarrollo (pre-cosecha) y,
las que afectan frutos maduros ya cosechados y durante el almacenamiento (post-cosecha).
Esto se debe a la habilidad de muchas especies de Colletotrichum para causar infecciones
latentes, en las cuales el hongo infecta frutos inmaduros en campo y despus de un tiempo,
reanuda su crecimiento y ocasiona el dao en el fruto maduro. Este es un fenmeno donde
la infeccin toma lugar en estados tempranos del desarrollo del fruto, pero la enfermedad
aparece despus, en la etapa madura o muy cercana a sta.
Los sntomas de la antracnosis en la guanbana se presentan en las hojas, lo que se conoce
como antracnosis foliar; en el fruto, donde ocasiona momificacin o pudricin seca y, en
los botones florales. En las hojas se manifiesta como lesiones o manchas necrticas de
coloracin caf o marrn oscuro, casi negro y de borde definido. En los botones florales se
presentan lesiones definidas de forma variable, hundidas, de color marrn claro u oscuro,
especialmente hacia la base de los spalos y ptalos. En el fruto, los sntomas iniciales son
manchas de forma irregular o redondeadas de tamao variable, de color marrn oscuro y
deprimidas o hundidas formando especies de chancros.

De acuerdo con evaluaciones realizadas en el Valle del Cauca, durante un perodo de ocho
meses, se determin que la antracnosis foliar es la enfermedad ms prevalente, con una
incidencia del 72% y una severidad del 45.2%. La incidencia de la antracnosis del fruto fue
del 41% y la pudricin parda de ste de 43%, mientras que la severidad de estas dos
enfermedades fue, en su orden, del 22.7 y 35.2% respectivamente.
La presencia, incidencia y severidad de esta enfermedad, estn ligadas con el manejo del
cultivo, sin embargo, en Colombia, la nica forma de controlar la antracnosis es con el uso
de fungicidas preventivos y curativos con aplicaciones hasta tres veces por mes, segn el
nivel de afeccin, condiciones ambientales y estado de desarrollo de los rboles. A pesar de
esto, el manejo actual de la enfermedad no tiene xito debido al desconocimiento del ciclo
de la enfermedad y por ende, la aplicacin de los fungicidas con respecto al lugar, en el
rbol, fecha y cantidad, no es efectiva.
1.3 FORMULACIN DEL PROBLEMA
Cul es y cmo se distribuye el agente causal de la antracnosis en la copa del rbol de
guanbana (Annona muricata L.)?
1.4 OBJETIVOS
1.4.1 Objetivo general. Determinar las caractersticas de distribucin de la fuente de
inculo en el rbol de guanbana.
1.4.2 Objetivos especficos. Realizar muestreos de campo con el propsito de obtener
aislamientos del patgeno en guanbana.
Identificar mediante tcnicas convencionales y moleculares, las especies relacionadas con
la antracnosis en guanbana.
Disear y estandarizar metodologas para la determinacin de infecciones latentes en el
follaje.
Analizar mediante muestreos peridicos, la distribucin de infecciones latentes en rboles
de guanbana.
1.5 JUSTIFICACIN
La guanbana se encuentra dentro del grupo de frutas que se comercializan a buen precio
en los mercados nacional e internacional. En Colombia, algunas veces la produccin es
escasa, porque el cultivo todava tiene serios limitantes de produccin; una de ellas es el
manejo de las enfermedades propias del rbol, como la antracnosis producida por C.
gloeosporioides.
Se estima que existen aproximadamente 750 especies del gnero Colletotrichum (Bailey y
Jeger, 1992) y cada una de ellas est ligada a un hospedero diferente; en algunos casos no
es slo una especie la que ocasiona la enfermedad lo que hace an ms complejo su
estudio. Colletotrichum gloeosporioides y C. acutatum son las especies que estn
comnmente asociadas a la podredumbre de las frutas por antracnosis; estas dos especies
son parecidas morfolgicamente y, debido a la coincidencia en el rango de hospederos y a
la gran variabilidad que sus aislamientos presentan en cultivo, ha sido muy difcil
identificarlos de forma independiente, por mtodos taxonmicos convencionales. Por estas
razones es necesario utilizar tcnicas de biologa molecular que contribuyan a confirmar la
identidad del patgeno.
Colletotrichum sp. se caracteriza por tener la capacidad de desarrollar infecciones latentes;
esto lo define como un hongo agresivo, ya que inicialmente sobrevive en la planta de forma
asintomtica y cuando se activa, ocasiona dao en el tejido. En esta ltima etapa la
aplicacin de fungicidas preventivos no tiene efecto sobre el patgeno y por esto es
necesario utilizar fungicidas curativos, en dosis cada vez ms altas, lo que representa mayor
inversin para el control de la antracnosis, mayor contaminacin del medio ambiente y,
aumento de tolerancia por parte del patgeno, a los funguicidas ms usados.
Actualmente existen pocos estudios sobre aspectos claves de la enfermedad en guanbana,
no hay certeza de la identidad del agente causal de la antracnosis, se desconoce su ciclo de
vida, la fuente del inculo y, su distribucin a travs del tiempo. Es por ello que esta
investigacin persigue aportar nuevos conocimientos para el manejo de la enfermedad a fin
de: disminuir la aplicacin de los funguicidas y la contaminacin ambiental, evitar
fitotoxicidad, reducir los costos de control de antracnosis, lograr que la combinacin de
tipos de control sea eficiente y, aumentar la produccin de guanbana en el pas.

2. MARCO REFERENCIAL
2.1 ANTECEDENTES
Binyamini (1972) report uno de los primeros estudios sobre la antracnosis en aguacate y
determin la presencia de infecciones latentes por Colletotrichum gloeosporioides. Debido
a la importancia que tom la enfermedad alrededor del mundo, diferentes investigadores
enfocaron sus trabajos en el conocimiento, tanto del agente causal como la interaccin de
ste con su husped, por ejemplo, Brown (1975) y Fagan (1979) estudiaron el Postbloom
fruit drop (cada de los frutos), como una nueva enfermedad en ctricos ocasionada por
Colletotrichum gloeosporioides.
Adikaram y Brown (1981) realizaron investigaciones sobre infecciones latentes en frutos de
Capsicum originadas por Colletotrichum capsici. En 1990, Jeffries public la biologa y el
control de especies de Colletotrichum en cultivos de frutas tropicales, Agostini y Timmer
(1992) investigaron la dinmica de poblacin, caractersticas morfolgicas y patolgicas de
Colletotrichum gloeosporioides, as como la etiologa y epidemiologa de la enfermedad en
ctricos y Bailey, en el mismo ao public las estrategias de infeccin de especies de
Colletotrichum.
Sreenivasaprasad (1996) revel, mediante anlisis de la secuencia de ADN ribosomal,
nuevos grupos de especies del gnero Colletotrichum; Freeman y colaboradores (1996)
identificaron y caracterizaron especies de Colletotrichum como agentes causales de
antracnosis en fresa, aguacate y almendra, mediante pruebas moleculares y de
patogenicidad.
Beno-Moualem y Prusky (2000), reportaron los eventos tempranos durante el desarrollo de
la infeccin latente por Colletotrichum gloeosporioides en frutos inmaduros de aguacate y,
Freeman (2000) realiz anlisis moleculares de especies de Colletotrichum en almendra y
otras frutas. Akinwunmi (2001) public el perfil patognico de Colletotrichum y, Urea-
Padilla, investig la supervivencia del inculo de Colletotrichum en fresa, despus del
verano.
Urea-Padilla (2001) public la etiologa y gentica de la poblacin de Colletotrichum sp.
en Fresa. Talhinhas (2002), llev a cabo la caracterizacin gentica y morfolgica de
Colletotrichum acutatum como agente causal de antracnosis en Lupinos y, Peres (2004),
report la sensibilidad y tolerancia al benomyl de aislamientos de Colletotrichum acutatum
y C. gloeosporioides de ctricos.
En Colombia existen pocos estudios sobre la antracnosis, sin embargo, dentro de los que
han sido publicados se encuentra la caracterizacin de aislamientos de Colletotrichum de
tomate de rbol, maracuy y mango realizado por Afanador-Kafuri y Freeman en el 2004.
Torres (2005) estudi la presencia de infecciones latentes a partir del follaje asintomtico
en el Tomate de rbol e identific el agente causal de la enfermedad.
Hasta el momento no se conocen investigaciones sobre antracnosis en guanbana (Annona
muricata L), pero Villanueva y colaboradores (2005), reportaron la caracterizacin e
identificacin del agente causal de la antracnosis en frutos de Chirimoya (Annona
cherimola Mill).
2.2 MARCO TERICO
2.2.1 Generalidades de la guanbana. Dentro de la familia de las Annonceas, la
guanbana constituye una de las especies de mayor demanda, por su agradable sabor, ya
que se utiliza comercialmente en la elaboracin de jugos, helados, mermeladas, postres y
concentrados; adems, tiene propiedades medicinales, alimenticias e insecticidas. Esta fruta
se caracteriza por ser de alto potencial econmico; en los ltimos aos se ha incrementado
su consumo y, se considera como una de las ms apetecidas en el mercado nacional e
internacional.
El rbol de guanbana requiere para su buen crecimiento y desarrollo, una altitud entre 500
y 1250 m.s.n.m., una temperatura media entre 25 y 28 C; no resiste condiciones de fro y,
cuando este es severo, causa defoliacin y daos fisiolgicos. Es abundante la
productividad en regiones con precipitaciones anuales entre 800 y 1000 mm, humedad
relativa entre el 60 y el 80% y, pH entre 5.5 y 6.5.
Origen y distribucin. No se conoce con certeza su centro de origen, aunque se presume
que sea Colombia o Brasil. La guanbana fue uno de los primeros frutales llevados desde
Amrica hasta los trpicos del mundo oriental, ya que en algunos textos antiguos, (1526),
como Historia Natural de las Indias, Gonzalo Hernndez de Oviedo hace alusin a la
abundancia en la zona norte de Suramrica y Las Antillas.
En la actualidad, la guanbana se encuentra de forma silvestre y cultivada, desde el sur de
Mxico hasta Brasil, islas del Pacfico y Las Antillas. Se cultiva tambin en los Cayos y en
el extremo del sur de la Florida, as como desde el sureste de China hasta Australia y en las
tierras bajas y calientes del este y oeste del Africa.
Clasificacin taxonmica:
Reino: Vegetal
Divisin: Spermatophyta
Subdivisin: Angiosperma o latifolada
Clase: Dicotilednea
Subclase: Archylamudeae
Orden: Ranales
Familia. Annonceas
Grupo: Guanbani
Seccin: Euannona
Gnero: Annona
Especie: Annona muricata L.
Problemas fitosanitarios. Una alta incidencia de plagas y enfermedades se presenta en
todas las zonas donde se cultiva la guanbana; las prdidas son muy variables y en
ocasiones, hacen incosteable el cultivo, limitando su expansin. Los problemas
fitosanitarios ms importantes son: la antracnosis foliar, la antracnosis o pudricin seca del
fruto, la pudricin parda del fruto, la mancha blanca del follaje y, las pudriciones
secundarias del fruto. Entre las plagas que revisten importancia econmica estn: el chinche
de encaje, el caro de la erinosis, los perforadores del fruto y semilla, como la polilla y la
avispa. De acuerdo con los resultados obtenidos en evaluaciones realizadas durante un
perodo de 8 meses, se encontr que la antracnosis es la enfermedad ms importante del
cultivo de guanbana. Se estima que las prdidas en produccin por el complejo de
problemas fitosanitarios en guanbana, pueden situarse alrededor del 44.1%.
2.2.2 La Antracnosis
Epidemiologa. El patgeno se disemina por el agua y por el viento y es probable que los
insectos participen en dicha accin. La enfermedad es favorecida por condiciones
ambientales de alta humedad o lluvias peridicas o, perodos secos y lluviosos alternos, por
rboles en mal estado nutricional, distancias de siembra inadecuadas y por la
susceptibilidad gentica de los cultivares. Las conidias empiezan a germinar quince horas
despus de estar en contacto con una lmina de agua, logrando la mxima actividad a las 48
horas y, el ciclo de la enfermedad dura entre 7 y 10 das. La penetracin del hongo en los
tejidos ocurre directamente, por medio de los apresorios, por aberturas naturales o por
heridas.
C. gloeosporioides forma sus conidias en masas mucilaginosas, razn por la que necesita de
lluvia seguida de alta humedad relativa y, de una capa de agua que persista sobre el follaje
y sobre los frutos para la produccin, diseminacin y penetracin del patgeno. Estas
condiciones unidas a la posibilidad del patgeno para penetrar directamente, sin necesidad
de heridas, o facilitado por stas, hace ms difcil su prevencin y control.
Los propgulos de muchos patgenos de plantas son dispersados a partir de huspedes
infectados por el contacto con la lluvia. La dispersin ocurre por el impacto de las gotas de
agua sobre una superficie que contiene el inculo, la ubicacin de las esporas en las gotitas
que se dispersan y, el movimiento de stas a nuevos sitios.
Sintomatologa
Sntomas en hojas. La enfermedad se manifiesta como lesiones o manchas necrticas en
las hojas. Estas manchas son de color marrn oscuro casi negro y, de borde definido, en
ocasiones rodeadas de un tenue halo clortico (Vase la Figura 1). Las lesiones se ubican
en cualquier parte de la lmina foliar, siendo redondeadas u ovaladas y con dimetro hasta
los 15 mm. Pueden presentarse aisladas en los bordes y pices de las hojas; cuando se
ubican en las nervaduras son irregulares e inducen deformacin foliar, por lo cual la hoja
tiende a romperse. Cuando las lesiones se necrosan rompen el tejido y pueden dejar
perforaciones. Las lesiones en la nervadura avanzan rpidamente induciendo la cada
prematura de la hoja.
Sntomas en botones florales. En estas estructuras, la antracnosis presenta lesiones
definidas de forma variable, hundidas, de color marrn claro u oscuro, especialmente hacia
la base de ptalos y spalos (Vase la Figura 2). A medida que la lesin progresa, avanza
hacia el interior del botn floral, crece en dimetro y llega a cubrir gran parte o todo el
botn floral, causando la cada del mismo. Al separar los ptalos de los spalos en pocas
hmedas, se puede observar a simple vista un crecimiento micelial filamentoso de
coloracin gris-blanquecina y, las masas de conidias (esporas) del hongo.
Sntomas en el fruto. La antracnosis del fruto o pudricin seca, nombre dado a la
enfermedad cuando ataca el fruto y debido a las caractersticas de las lesiones que induce,
se manifiesta con manchas de forma irregular o redondeadas, de tamao variable (pudiendo
alcanzar 7 a 9 cm de dimetro), de color marrn oscuro y hundidas, formando chancros.
Varias lesiones se pueden unir afectando gran parte del fruto.
Las lesiones tienen borde definido y necrtico, mostrando el tejido con aspecto seco, duro,
compacto y generalmente el rea necrosada se rompe (Vase la Figura 3). La enfermedad
avanza hacia el interior del fruto, destruyendo la pulpa y llegando hasta las semillas y el eje
central del fruto. Se ha comprobado que la pudricin seca del fruto est relacionada con la
incidencia de antracnosis foliar, ya que en rboles afectados por esta ltima, la pudricin
seca se presenta en forma acentuada.
La pudricin seca del fruto, ataca a ste en cualquier estado de desarrollo, pudiendo llegar a
inducir grandes prdidas. Cuando el ataque se presenta en frutos jvenes, la enfermedad
induce momificacin del fruto, el cual toma una coloracin oscura, casi negra y se
desprende fcilmente del rbol. Las prdidas tienden a disminuir a medida que el ataque es
ms tardo, lo que puede permitir en ciertos casos utilizar parte del fruto afectado. La
enfermedad tambin se suele presentar cuando hay heridas y perforaciones de los insectos
que atacan el fruto, como es el caso de la polilla perforadora del fruto Cerconota anonella.
Estrategias de control. El control de la antracnosis se lleva a cabo bajo cuatro tipos
convencionales que son: control cultural, biolgico, qumico y uso de resistencia intrnseca.
La aplicabilidad de estrategias de control, depende en su mayor parte de las caractersticas
del cultivo y de la zona de produccin.
Control cultural. Se refiere al rango de mtodos utilizados en agronoma de cultivos para
controlar enfermedades, la mayora direccionados a evitar la enfermedad a travs de
tcnicas de fitosanidad, podas, implementacin de patrones de manejo de cultivos o
incremento de resistencia y evitar predisposicin. La ubicuidad de las fuentes de inculo de
Colletotrichum y el desarrollo rpido de la enfermedad bajo condiciones favorables, reduce
la efectividad de muchas prcticas generales fitosanitarias.
En guanbana se considera que la presencia, incidencia y severidad de esta enfermedad
estn ligados con el manejo del cultivo. El manejo preventivo se inicia con la localizacin
del huerto, prefirindose zonas de baja humedad relativa y precipitacin moderada. Se
recomienda la recoleccin y eliminacin de frutos afectados, la aplicacin de prcticas de
control de plagas, desinfeccin de herramientas, el riego adecuado y la nutricin ptima de
los rboles.
Figura 1. Sntomas de la antracnosis en hojas de guanbana

Se puede observar: A) Sntomas iniciales de antracnosis en la nervadura B) Lesin tpica de
antracnosis en el pice de la hoja C) Lesin avanzada
Figura 2. Sntomas tpicos de antracnosis en botones florales de guanbana, lesiones
iniciales

Figura 3. Lesin avanzada de antracnosis en fruto de guanbana con esporulacin de
Colletotrichum sp

Control qumico. Las enfermedades producidas por Colletotrichum pueden ser controladas
por un amplio rango de productos qumicos a base de cobre como ditiocarbamatos,
benzimidazoles y triazoles; otros funguicidas, como clorotalonil, imazalil, y procloraz son
efectivos para combatir a Colletotrichum. Los fungicidas sistmicos son particularmente
efectivos, debido a la habilidad para penetrar el tejido del husped y erradicar las
infecciones latentes. Sin embargo, el problema de la tolerancia a los funguicidas,
rpidamente se incrementa cuando los benzimidazoles son utilizados de forma frecuente
para controlar esta enfermedad.
En el cultivo de guanbana se recomienda hacer aplicaciones de los siguientes fungicidas:
Benomil, Carbendazim, Mancozeb, Maneb y Clorotalonil (Palomino y Rentera, 1986). El
Benomil y el Carbendazim se emplean como curativos (el hongo ya se encuentra
establecido a niveles medios o altos) y los dems fungicidas como preventivos, es decir,
cuando la enfermedad no ha empezado, se ha iniciado el ataque o los niveles son bajos.
2.2.3 El patgeno. Colletotrichum y su teleomorfo Glomerella han sido reconocidos como
los responsables de diferentes enfermedades en plantas por todo el mundo, generalmente
las que se denominan como antracnosis, pero especialmente como la causa de los
problemas de pre y post cosecha en los trpicos. Colletotrichum gloeosporioides (Penz.)
causa antracnosis en diferentes frutos incluyendo los de anonceas (Vase la Figura 4).
Colletotrichum es un gnero notoriamente variable, acerca del cual se han formulado
muchas preguntas acerca de su taxonoma, evolucin, origen de variacin, especificidad del
hospedero y mecanismos de patogenicidad y, que todava no han sido respondidas. La
variacin morfolgica in vitro de este hongo, dificulta su correcta identificacin por va
convencional (Vase la Figura 4).
Las especies del gnero Colletotrichum estn entre los hongos fitopatgenos ms
importantes y atacan un rango extremadamente amplio de plantas, que crecen en ambientes
templados y tropicales. Estos patgenos causan daos en varias partes de la planta como:
races, tallos, hojas, flores y frutos, pero algunas veces son muy especficos para algn tipo
de tejido en particular; muchos de ellos tambin son especficos para especies de plantas o
cultivos.
En Colombia, C. gloeosporioides se ha asociado con la antracnosis en guanbana, de
acuerdo con estudios realizados a partir de aislamientos de frutos, con sntomas de la
enfermedad, provenientes del Valle del Cauca. En Mxico se identific como el
responsable de la antracnosis en frutos de Chirimoya (Annona cherimola Mill) a
Colletotrichum fragariae.
Fuentes de inculo. Las lesiones ocasionadas por Colletotrichum, se presentan en ms de
una parte de la planta. La antracnosis en mango es probablemente el ejemplo fundamental
de lo anterior, donde la enfermedad se presenta en hojas, flores y frutos, en donde el
inculo de una fuente infecta el otro rgano.
Las principales fuentes de inculo son las conidias producidas en acrvulos. En los
acrvulos ms jvenes, las conidias estn encerradas en un material hmedo, mucilaginoso
e hidroflico, algunas veces referido a una matriz de esporas. Este es un complejo mixto
compuesto en su mayora por polisacridos y glicoprotenas, con varios componentes
menores que incluyen algunas enzimas. Cuando estas estructuras reproductivas maduran
bajo condiciones de sequa, la matriz forma un depsito de corteza dura, el cual rene
muchas esporas. La diseminacin de las esporas a partir de acrvulos jvenes ocurre en
pequeas gotas de agua, mientras que el viento, a su vez, puede distribuir masas de esporas
secas de acrvulos viejos.
Infecciones latentes. El trmino infeccin latente, describe una relacin parastica
dormante o latente que despus de un tiempo cambia a estado activo. La etapa de desarrollo
en la cual el hongo llega a estar de forma latente puede ser al inicio de la germinacin,
elongacin del tubo germinal, formacin del apresorio, penetracin o colonizacin. La
aparicin y mantenimiento de la latencia del patgeno sobre o dentro del hospedero, indica
un equilibrio dinmico entre el mismo hospedero, el patgeno y el ambiente, sin sntomas
visibles (Vase la Figura 5).
Inicialmente la infeccin se presenta en el campo sobre frutos inmaduros, la cual resulta en
la formacin de un apresorio resistente de pared gruesa, con una clavija de infeccin que
penetra la cutcula del hospedero y la pared celular, con la ayuda de enzimas cutinolticas y
celulolticas. Bajo ciertas condiciones, usualmente asociadas con la maduracin o afeccin
por heridas de los frutos, estas infecciones latentes se desarrollan en lesiones necrticas
oscuras, las cuales muestran acrvulos mucilaginosos de coloracin naranja.
La antracnosis en banano, causada por Colletotrichum musae, se presenta comnmente
sobre frutos maduros; las infecciones latentes pueden permanecer de forma dormante hasta
por cinco meses. Sntomas similares se presentan sobre aguacate cosechado y frutos de
papaya, debido a infecciones latentes que ocurren sobre frutos en desarrollo, a partir de
fuentes de inculo como hojas y ramas en el dosel del rbol.
Hojas, ramas, inflorescencias y frutos en estado senescente junto con el dosel del rbol, son
las mayores fuentes de inculo para el comienzo de la presencia de enfermedades. La
existencia del patgeno como un componente de la microflora del filoplano o, como
infecciones latentes de tejidos aparentemente saludables del hospedero, tambin proveen
fuentes de inculo a partir de las cuales la enfermedad puede desarrollarse, an cuando las
ms obvias fuentes de saprofticos hayan sido removidas.
Reciente evidencia para C. gloeosporioides en aguacate y mango, sugieren que la latencia
podra ocurrir como una hifa de estructura subcuticular, cuyo crecimiento es inhibido en el
interior del tejido del hospedero. El mecanismo para la latencia de Colletotrichum sp. sobre
otros frutos, podra diferir dependiendo de la combinacin del hospedero patgeno. La
probable explicacin para la latencia involucra cambios post-infeccionales y no
caractersticas de pre-infeccin.
Los cambios post-infeccionales podran involucrar la sntesis/degradacin de sustancias
fungitxicas en el interior del tejido del hospedero, en respuesta a la presencia del patgeno
o a la maduracin del fruto. Para frutos de aguacate, la produccin de estructuras de
latencia parece ser dependiente de la dinmica de los componentes preformados. La
resistencia al desarrollo fngico dentro de los tejidos del hospedero, ha sido correlacionada
con cambios en la concentracin de inhibidores preformados y al nivel de epicatequina, la
cual previene la degradacin natural del componente inhibitorio durante la maduracin del
fruto.
Caracterizacin biolgica y molecular de Colletotrichum sp. Colletotrichum
gloeosporioides y Colletotrichum acutatum, son los dos miembros del gnero que estn
comnmente asociados con la antracnosis en diversos cultivos de frutales. Colletotrichum
gloeosporioides es patgeno de almendra, manzana, aguacate, ctricos, mango y fresa. C.
acutatum ha sido reportado en aguacate, caf, guayaba, olivo, papaya, tomate y tamarillo.
Estas dos especies son morfolgicamente muy similares y debido a su amplio rango de
hospederos y la extensa variabilidad que sus aislamientos muestran en cultivo, ha sido muy
difcil separarlas por mtodos taxonmicos tradicionales. Sin embargo, Colletotrichum
acutatum y Colletotrichum gloeosporioides, han sido caracterizadas con base en morfologa
de la colonia, forma y tamao de las conidias y rango de hospedero. Estas tcnicas tienen
que ser utilizadas con precaucin ya que son poco confiables.
Otros parmetros para la caracterizacin del patgeno han sido tiles como por ejemplo
tasa de crecimiento (lenta para C. acutatum y rpida para C. gloeosporioides), temperatura
ptima de crecimiento (25 C en C. acutatum vs. 30 C en C. gloeosporioides) y
sensibilidad al benomil.
Figura 4. Colletotrichum gloeosporioides en medio PDA, 14 das de cultivo

Existe un medio semi-selectivo para el gnero Colletotrichum, compuesto por PDA e
hidrxido de cobre, con el cual se compara la velocidad de crecimiento de los aislamientos
objeto de estudio; en este medio, C. gloeosporioides crece ms rpido en este medio que C.
acutatum. De esta forma, esta prueba se convierte en un mtodo de caracterizacin
biolgica.
Un mtodo complementario para la identificacin de especies, es el uso de tcnicas
moleculares, como las que amplifican por la reaccin en cadena de la polimerasa, las
regiones intergnicas ribosomales.
Figura 5. Latencia y ciclo corto de infeccin de Colletotrichum sp

Fuente
Tejido maduro
(Latencia y
Componente del filoplano)
Tejido muerto - saprfito

Esporulacin/Dispersin
Dependiente - Agua
Infeccin
Apresorio
resistente
Tejido joven
Susceptible
Tejido Adulto
Corto
Latencia
Largo
Tejido
Maduro

Fuente: BAILEY, J. y JEGER, A. Colletotrichum: biology, pathology and control. Wallingford:
CAB International, 1992.
El diseo de primers especie-especficos, utilizando secuencias de la regin del rDNA
ITS1, es una herramienta til para la identificacin de las especies de Colletotrichum sp.
que afectan a los diferentes frutales. Con el uso de estos primers se confirm a C. acutatum
como el agente causal de la antracnosis de la almendra en California (Frster and
Adaskaveg, 1999) y, se reclasific la cepa SGO, responsable del PFD en los ctricos, como
C. acutatum (Brown et al. 1996).
2.3 MARCO CONCEPTUAL
Acrvulo. Cuerpo fructfero asexual que contiene conidios. Colchn de hifas con forma de
plato abierto sobre el cual se levantan los conidios.
Antracnosis. Es una lesin necrtica similar a una lcera profunda, que puede generarse en
diferentes rganos de las plantas hospederas.
Apresorio. Tambin conocido como clula madre haustorial por su asociacin con ste,
puede ser simple o compuesto, de pared delgada y, hialina o gruesa y oscura. Es
responsable de la fijacin a la pared celular, penetracin y fisiologa de la enfermedad.
Conidio. Espora de origen asexual que no se encuentra en el himenio.
Esclerocio. Cuerpo perdurante duro, resistente a las condiciones desfavorables, germinando
despus de mucho tiempo, en condiciones favorables.
Haustorio. Clula u rgano especializado que se forma dentro de la clula del hospedero
como ramificacin de una hifa, a fin de lograr un contacto ntimo con el citoplasma; tiene
forma de bolsa y realiza la absorcin de alimentos.
Hialina. Transparente como el vidrio o parecido a l.
Himenio. Membrana donde estn localizados los elementos frtiles, productores de esporas
en los hongos.
Infeccin latente. Relacin parastica latente que despus de un tiempo se activa.
ITS. Secuencias de las regiones intergnicas.
PCR. Reaccin en cadena de la polimerasa, tcnica de biologa molecular que permite
amplificar el ADN.
Peritecio. Ascocarpo cerrado por una pared propia y un poro en el extremo, que constituye
un verdadero ostolo.
2.4 MARCO CONTEXTUAL
El proyecto se desarroll en el Laboratorio de Fitopatologa de CORPOICA, Corporacin
Colombiana de Investigacin Agropecuaria, Sede Tibaitat, ubicada en el Km 14 va a
Mosquera. CORPOICA es una entidad de participacin mixta, de carcter cientfico y
tcnico, sin fines de lucro, creada en 1993. Su objeto es el desarrollo y ejecucin de
investigacin y transferencia de tecnologa agropecuarias y la promocin de procesos de
innovacin tecnolgica. La misin es generar y transferir conocimientos cientficos y
tecnolgicos en agricultura, con nfasis en las condiciones del trpico.
La poblacin que recibir influencia de esta investigacin, est relacionada con todos los
cultivos de guanbana que existan en el pas; especficamente, aquel que fue objeto de
estudio, ubicado en La Mesa, Cundinamarca.
2.5 MARCO LEGAL
La legislacin que avala jurdicamente el desarrollo de esta investigacin, est comprendida
por la Ley 29 de Febrero de 1990, ley marco de Ciencia y tecnologa, por la cual se dictan
disposiciones para el fomento de la investigacin cientfica y el desarrollo tecnolgico y se
otorgan facultades extraordinarias y tambin, por el Decreto 393 de 1991, por el cual se
dictan normas sobre asociacin para actividades cientficas y tecnolgicas, proyectos de
investigacin y creacin de tecnologas.

3. DISEO METODOLOGICO
3.1 TIPO DE INVESTIGACIN
El presente trabajo busca la adquisicin de conocimiento en la dinmica de las fuentes de
inculo de la antracnosis en guanbana y, el agente causal de la misma, con el fin de que
los resultados contribuyan a un diseo de manejo de la enfermedad ms eficiente. La
investigacin es de tipo descriptiva, porque se expresan las caractersticas de un grupo de
rboles de guanbana midiendo la cantidad de inculo en follaje asintomtico, de acuerdo a
las variables establecidas en el diseo, como: edad, orientacin y profundidad de las hojas.
La investigacin, segn la estrategia es de tipo experimental, ya que se realizaron estudios
de laboratorio y campo. Se plante una hiptesis de trabajo, que est relacionada con las
variables establecidas.
3.2 POBLACIN Y MUESTRA
3.2.1 Poblacin. Est conformada por un cultivo de 3000 rboles de guanbana
provenientes de la finca Lomitas de Calaima, ubicada en La Mesa, departamento de
Cundinamarca.
3.2.2 Muestra. La integran 10 rboles seleccionados, 5 en el lote nmero 1 y los 5 restantes
en el lote nmero 3.
3.3 HIPTESIS
La fuente de inculo del agente causal de la antracnosis en guanbana, reside en forma de
infecciones latentes en el follaje asintomtico.
El agente causal de la antracnosis en guanbana es Colletotrichum gloeosporioides.
3.4 VARIABLES
La variable dependiente en el presente trabajo de investigacin es la cantidad de acrvulos
del patgeno, estimada mediante porcentaje, sobre el follaje asintomtico de guanbana.
Las variables independientes del estudio son: orientacin, profundidad y edad de las hojas,
lote y rbol.
Dentro de las variables intervinientes estn: precipitacin, humedad, temperatura, podas y
uso de fungicidas.
3.5 FASES DE LA INVESTIGACIN
3.5.1 Localizacin. El estudio se llev a cabo en la finca Lomitas de Calaima,
perteneciente a la vereda Doima, inspeccin de polica de La Esperanza, municipio de La
Mesa, departamento de Cundinamarca.
El cultivo est ubicado en la parte oriental del valle del ro Apulo, en las estribaciones
occidentales de la cordillera oriental a una altura de 1.180 metros sobre el nivel del mar,
con 4.42 latitud norte y 74.20 longitud occidental. Presenta una humedad relativa del
64%, temperatura mnima de 22C y mxima de 25C, brillo solar de 4.48 horas luz y
radiacin de 462.1 caloras /cm
2
.
El cultivo ocupa un rea aproximada de once hectreas, sembradas con 3000 rboles, 1000
en produccin plena y 2000 de dos aos de edad. Se determin muestrear dos lotes, cinco
rboles de cada uno durante siete meses, desde febrero a agosto de 2005.
3.5.2 Estandarizacin de envejecimiento foliar para deteccin de infecciones latentes.
Se recolectaron al azar 60 hojas jvenes y viejas de guanbana que no presentaran ningn
sntoma visible de antracnosis, las cuales fueron empacadas en bolsas de papel y stas, a su
vez, se introdujeron en una nevera de icopor.
De acuerdo con la metodologa planteada por Biggs (1995) y utilizada por Torres (2005), se
realizaron cuatro tratamientos con el herbicida paraquat a dos concentraciones, por dos
perodos de tiempo (Vase el Cuadro 1) y, dos tratamientos con choque trmico.
Todas las hojas fueron previamente lavadas con agua destilada durante 15 minutos y se
permiti el secado de las mismas a temperatura ambiente.
Cuadro 1. Diseo experimental para la estandarizacin de envejecimiento foliar con
paraquat a diferentes concentraciones y periodos de tiempo

Hojas jvenes

Hojas viejas

Concentracin de
Paraquat (%)

Tiempo de
Exposicin
5 5 2 15 minutos
5 5 2 30 minutos
5 5 4 15 minutos
5 5 4 30 minutos
5 5 6 15 minutos
5 5 6 30 minutos

Para cada tratamiento fue necesario preparar un litro de cada concentracin de paraquat,
mediante la frmula de concentracin y volumen siguiente:
C
1
*V
1
= C
2
*V
2

Donde:
C
1
= La concentracin inicial del paraquat en la presentacin comercial
V
1
= Volumen desconocido de paraquat
C
2
= Concentracin para cada tratamiento (2%, 4% 6%)
V
2
= Volumen deseado de paraquat (1000 ml, 2000 ml, etc.)
El tratamiento con choque trmico se bas en la metodologa utilizada por Torres (2005), la
cual consisti en someter grupos de 10 hojas (jvenes y viejas) previamente desinfectadas y
empacadas en bolsas de papel, a dos temperaturas diferentes (-5 y 10 C), durante dos
perodos de tiempo (30 y 60 minutos).
3.5.3 Establecimiento del follaje envejecido en cmaras hmedas. Luego de haber
sometido las hojas a cada tratamiento, se introdujeron en cmaras hmedas, previamente
lavadas con detergente y desinfectadas con hipoclorito al 2% y alcohol al 70% sin
enjuague, las cuales consistan en recipientes plsticos con tapa y con las siguientes
dimensiones: 15 cm de altura x 30 cm de ancho y 40 cm de largo (multicaja cristal de
ESTRA
TM
). En su interior contenan una malla plstica (escurridor individual de Vanyplas
TM
) que debe desinfectarse de la misma forma que los recipientes, sobre la que se coloc
una servilleta ligeramente humedecida con agua destilada estril. Cada recipiente se llen
con 500 ml de agua destilada, se tap debidamente y se sell con vinilpel (Vase la Figura
7). Todos los recipientes se ubicaron de la misma forma durante 7 das, en un sitio con poca
luminosidad.
La humedad que se crea en los recipientes plsticos le permite al patgeno pasar de estado
latente a un estado activo en las hojas senescentes, lo cual se puede comprobar mediante la
aparicin de estructuras reproductivas de Colletotrichum sp. sobre la lmina foliar, luego de
7 das de incubacin, para hojas de guanbana.
3.5.4 Evaluacin de los tratamientos para determinar la presencia de infecciones
latentes en follaje Luego de haber establecido en cmaras hmedas durante 7 das las
hojas sometidas a los distintos tratamientos, se procedi a evaluar la cantidad de estructuras
reproductivas de Colletotrichum sp. sobre cada lmina foliar, con el uso de un
estereoscopio (Wild M3Z
TM
). Se determin la presencia de los cuerpos fructferos
(acrvulos) y de acuerdo con esta evaluacin, se seleccion el mejor tratamiento.
3.5.5 Diseo de una escala para la cuantificacin de acrvulos sobre la lmina foliar.
Para evaluar la presencia de acrvulos de Colletotrichum sp. sobre la lmina foliar fue
necesario elaborar una escala con seis niveles (Vase la Figura 6); cada uno de ellos est
determinado por un rango de porcentaje que refleja la cantidad de acrvulos propios de
Colletotrichum sp, ya que pueden existir otro tipo de estructuras pertenecientes a otros
hongos que tambin crecen sobre la hoja y tienden a confundirse con stos. Se observaron
aproximadamente 350 hojas, para determinar la precisin del uso de la escala. Esta
metodologa permite la cuantificacin de infecciones latentes a partir de follaje envejecido
de forma rpida (Vase el Cuadro 2).
Cuadro 2. Escala de cuantificacin de infecciones latentes de Colletotrichum sp. sobre
la lmina foliar de guanbana
Nivel

Porcentaje de
Infecciones Latentes
0 0
1 1-20
2 21-40
3 41-60
4 61-80
5 81-100
Figura 6. Diagrama de la lmina foliar de guanbana con los 5 niveles de cubrimiento
de infecciones latentes (acrvulos)

Se puede observar: A) 0% B) (1-20)% C) (21-40)% D) (41-60) E) (61-80)% F) (81-100)%
3.5.6 Diseo de muestreo de la copa del rbol de guanbana. Se seleccionaron dos lotes
contrastantes con respecto a la incidencia de la enfermedad; el primero de ellos
caracterizado por tener baja incidencia y el segundo, con alta incidencia de antracnosis. De
cada lote se eligieron cinco rboles ubicados en diferentes puntos del terreno, los cuales
fueron marcados con bandas plsticas de colores, con el objeto de identificarlos con
facilidad y evitar confundirlos en los muestreos siguientes (Vase la Figura 8).
Con el objetivo de determinar la distribucin espacial del inculo en la copa del rbol de
guanbana, fue necesario muestrear las hojas de forma estratificada de acuerdo con la
orientacin, profundidad y edad; por cada rbol se trabajaron ocho estratos y en cada uno se
recolectaron dos lminas foliares. Para el primer y segundo estrato se recolectaron dos
hojas viejas internas de la parte oriental y dos hojas viejas internas de la zona occidental
respectivamente; para el tercer y cuarto estrato se tomaron dos hojas viejas externas del
oriente y dos hojas viejas externas del occidente (Vase el Cuadro 3).
Para el quinto y sexto estrato se muestrearon dos hojas jvenes internas del oriente y dos
hojas jvenes internas de la parte occidental y finalmente, para el sptimo y octavo estrato,
se recolectaron dos hojas externas de la zona oriental y dos hojas jvenes de la occidental,
de forma respectiva. En total, se estim muestrear 16 hojas de cada rbol, las cuales fueron
empacadas en bolsas de papel debidamente marcadas; estas a su vez fueron introducidas en
una nevera de icopor hasta la llegada al sitio de procesamiento. Estos muestreos se
realizaron cada 30 das durante siete meses consecutivos, en los cuales se llev un registro
de condiciones climticas como temperatura y precipitacin, estado fenolgico de la planta
y manejo general del cultivo.
Cuadro 3. Muestreo estratificado de la copa para el estudio de la dinmica de
Colletotrichum sp. en guanbana

3.5.7 Procesamiento de material vegetal. Las hojas fueron mantenidas en bolsas de papel,
marcadas con el estrato, nmero de rbol y lote, dentro de una nevera de icopor, hasta la
llegada al sitio de trabajo. El procesamiento de las mismas se llev a cabo en las
instalaciones del laboratorio de Fitopatologa del Programa Manejo Integrado de Plagas de
Corpoica, Tibaitat. Las muestras se lavaron con agua destilada durante 15 minutos,
teniendo en cuenta el estrato correspondiente, luego se dejaron secar a temperatura
ambiente. Seguidamente se procedi a la inmersin de las hojas en paraquat a una
Estrato
N de Hojas
Edad Profundidad Orientacin
2 Vieja Interna Oriente
2 Vieja Interna Occidente
2 Vieja Externa Oriente
2 Vieja Externa Occidente
2 Joven Interna Oriente
2 Joven Interna Occidente
2 Joven Externa Oriente
2 Joven Externa Occidente
concentracin del 4% durante un perodo de 30 minutos y por ltimo, se permiti su
secado.
Una vez inducido el envejecimiento del follaje recolectado con el uso del herbicida
paraquat, se procedi a colocar las hojas en las cmaras hmedas, mediante la metodologa
descrita anteriormente, para ser incubadas durante 7 das.
Figura 7. Establecimiento de hojas senescentes de guanbana en cmaras hmedas
para deteccin de infecciones latentes

Figura 8. rbol de guanbana (Annona muricata L)

3.5.8 Identificacin y evaluacin de infecciones latentes sobre hojas asintomticas.
Transcurrido el perodo de incubacin establecido de las cmaras hmedas, se evalu la
cantidad de acrvulos de Colletotrichum sp. en cada una de las hojas correspondientes a
cada estrato, con el uso de la escala de cuantificacin de acrvulos, para confirmar la
presencia de infecciones latentes en el follaje asintomtico de guanbana. La evaluacin de
la lmina foliar se realiz con un estereoscopio (Wild M3Z
TM
), a partir de la identificacin
de acrvulos cremosos color salmn caractersticos de Colletotrichum acutatum y,
acrvulos secos de coloracin gris propios de Colletotrichum gloeosporioides.
Se elabor un formato para la toma de datos, en el cual se consignaron la fecha de
evaluacin, el lote al que corresponda cada rbol, el nmero del rbol, la edad de las hojas,
la profundidad y orientacin en la que fueron muestreadas y, por ltimo, el nivel de la
escala correspondiente al cubrimiento de infecciones latentes o presencia de acrvulos
sobre cada lmina foliar. Estos datos se analizaron mediante ANAVA y, para discriminar
entre las evaluaciones de cada estrato, se utiliz la Prueba de Tukey.
3.5.9 Aislamiento de Colletotrichum sp. a partir de infecciones latentes en hojas. Luego
de haber evaluado las hojas que fueron sometidas al tratamiento de envejecimiento con
paraquat, durante todos los meses se llev a cabo el aislamiento de Colletotrichum sp. a
partir de la recuperacin de cada una de las masas de conidios (acrvulos), con ayuda de un
asa estril en agar PDA (62.5 g/L de papa, 10 g/L de glucosa, 10 g/L de agar-agar, 8 g/L de
gelatina industrial), con pH entre 5 y 6. Para la seleccin de los acrvulos se tuvieron en
cuenta las caractersticas que identifican a Colletotrichum acutatum como: masas de
conidios cremosos de coloracin salmn o naranja, no presentan setas y pueden estar
acompaados de micelio blanco.
Una vez identificados como acrvulos de Colletotrichum acutatum, se sembraron en cajas
de petri con agar PDA, las cuales se marcaron respectivamente y fueron incubadas durante
7 das a 25 C, bajo condiciones de oscuridad.
3.5.10 Aislamiento de Colletotrichum sp. a partir de sntomas de antracnosis en frutos,
botones florales y hojas. Con el objeto de conformar una coleccin de estudio para
comparar el agente causal de infecciones latentes en follaje asintomtico y, de sntomas en
hojas, botones florales y frutos, se procedi a muestrear estos rganos para aislar el
patgeno. Se seleccionaron frutos, botones florales y hojas con sntomas muy iniciales de la
enfermedad, los cuales fueron cortados con tijeras para poda, luego se empacaron en bolsas
de papel que se introdujeron en una nevera de icopor con hielo seco para evitar el desarrollo
normal del hongo, de esta forma se frena su crecimiento y facilita el aislamiento in vitro
(Vase la Figura 9).
Una vez las muestras fueron recolectadas, se procesaron en el menor tiempo posible.
Inicialmente se realiz la descripcin de los sntomas propios de cada rgano muestreado;
luego se llev a cabo corte de cuadros pequeos de manera que dentro del rea
seleccionada estuviera el tejido sintomtico rodeado de tejido sano. A su vez, estos
cuadrados fueron cortados en forma diagonal (tringulo). Los cortes vegetales fueron
ubicados con pinzas previamente flameadas en el interior de cajas de petri estriles,
debidamente marcadas con el rgano correspondiente del cual se cortaron. Despus, los
cortes fueron transferidos a una solucin de hipoclorito de sodio al 2% durante 1 minuto y,
se realizaron tres enjuagues con agua destilada estril, luego se sumergieron 3 veces en
alcohol al 70% durante 10 segundos y nuevamente se hicieron tres enjuagues con agua
destilada estril, para terminar de remover los desinfectantes.
Los cortes del tejido vegetal, ya desinfectados, se ubicaron sobre servilletas estriles
marcadas con el rgano correspondiente del cual fueron obtenidos. Cada uno de ellos se
sembr en cajas de petri con agar PDA (39g/L de agar papa-dextrosa-agar, MERCK
), de
tal forma que el tejido afectado estuviera en contacto directo con la superficie del medio.
Las cajas se sellaron con vinilpel y se incubaron a 25 C, durante 5 das en oscuridad.
Figura 9. Sntomas de la antracnosis vistos en campo y bajo estereoscopio

Se puede observar: A) sntoma inicial apropiado para el aislamiento de Colletotrichum sp.
B) lesin en estado avanzado
3.5.11 Purificacin de los aislamientos de Colletotrichum sp. Transcurrido el tiempo de
incubacin, se verific el crecimiento de Colletotrichum sp. mediante el reconocimiento de
caractersticas macroscpicas propias de este gnero, como: color de la colonia (naranja o
gris), presencia de anillos concntricos, masas de conidios color naranja, aspecto ralo de la
colonia y microscpicas como forma y tamao de los conidios (extremos redondeados o
acusados). La medicin de los conidios se realiz con un micrmetro (Olympus
) 100
veces y se promedi el resultado. Con ayuda de una aguja de diseccin se hizo un corte de
la colonia de Colletotrichum sp. y se sembr en agar PDA (39g/L de agar papa-dextrosa-
agar, MERCK
) acidificado con cido lctico, para ajustar el pH entre 5 y 6. Las cajas de

petri fueron marcadas y selladas con vinilpel durante 7 das e incubadas a una temperatura
de 25C, bajo condiciones de oscuridad. Se realizaron varios pases de estos aislamientos
hasta obtener cultivos puros.
3.5.12 Conformacin de una coleccin de estudio a partir de cultivos monoconidiales
de Colletotrichum sp. De todos los aislamientos de Colletotrichum sp. obtenidos a partir de
infecciones latentes, sntomas en hojas, botones y frutos, se seleccionaron 20, 5
correspondientes a cada rgano de origen. Segn la metodologa propuesta por Wang-
Ching y Wen-Hsiung en 1997 y modificada por Torres en el 2004, se procedi a realizar
cultivos monoconidiales con el fin de obtener un individuo de la colonia pura.
Para lo anterior fue necesario esterilizar a 15 lbp y 115C durante 15 minutos 80 tubos de
vidrio taparosca, con dimetro de 1.8 cm y 6.5 cm de altura, los cuales se llenaron
previamente con 1 ml de agua destilada y se almacenaron a 4C hasta el momento en que
fueron utilizados. Simultneamente, se prepar agar agua (13 g/L de agar-agar, MERCK
)
para la germinacin de los conidios y agar PDA (39g/L de agar papa-dextrosa-agar,
MERCK
) para el aislamiento de los mismos.

De cada aislamiento se tom una muestra pequea con un asa estril, se diluy en cada tubo
con 1 ml de agua destilada estril y se homogeniz con un vrtex. Se calcul la
concentracin de la solucin en una cmara de Neubauer mediante recuento de conidios en
los 64 cuadrados de los 4 extremos y aplicando la frmula de la cmara.
Conidios/ml = (recuento de conidios)*(16x10
4
)/64
Luego de conocer la concentracin de conidios de los tubos correspondientes a cada
aislamiento, se procedi a ajustar a una concentracin de 1 conidio/l en un volumen final
de la solucin de 1 ml, aplicando la frmula de concentracin y volumen dada de la
siguiente manera:
C1*V1 = C2* V2
Donde:
C1 = Conidios/1000 l
V1 = X (l)
C2 = 1 conidio/l
V2 = 1000 l
Una vez conocidos los microlitros correspondientes al volumen de la solucin inicial de
conidios, con ayuda de una micropipeta (Finnpipette ), esta cantidad se le rest a los 1000
l de agua destilada estril contenidos en el tubo taparosca y luego se complet con el
volumen hallado de la solucin de conidios, para obtener finalmente una concentracin de
1conidio/l y un volumen final de 1000 l.
Germinacin de los conidios de Colletotrichum sp. sobre agar agua. De la nueva
solucin de conidios (C2 = 1conidio/l), se tom con la micropipeta un volumen igual a
1l. Para ubicar de forma correcta este volumen, fue indispensable dibujar con marcador
permanente 10 crculos de 0.5 cm de dimetro por el reverso de las cajas de petri que
contenan agar agua, donde en cada espacio gua sealado se colocaba cada l, con el
objetivo de ubicar de forma fcil y rpida cada conidio al momento de evaluar la
germinacin de los mismos. Cada caja de petri fue marcada de acuerdo al rgano del cual
se aisl Colletotrichum sp., se sell con papel Parafilm y se incub a 25C durante 6 a 8
horas en la oscuridad.
Cumplido el tiempo de incubacin, se confirm con el uso de un microscopio la
germinacin de los conidios. La superficie del medio agar agua se observ a 10X,
exactamente se enfoc el rea delimitada por los crculos dibujados, y se buscaron conidios
propios del gnero Colletotrichum sp. que tuvieran tubo germinal. El rea de agar agua que
tena el conidio en germinacin, fue cortada con un asa caliente y se sembr en medio PDA
acidificado (39g/L de papa-dextrosa-agar, MERCK ; 100 l de cido lctico y 300 mg/L
de sulfato de estreptomicina). Las cajas con los cultivos monoconidiales fueron incubadas a
25C en la oscuridad durante 5 das y adicionalmente, se le asign a cada una un cdigo
escrito as: para infecciones latentes (IL01, IL02 hasta IL05) y para sntomas, en botn
(SB01-SB05), en fruto (SF01-SF05) y finalmente sntomas en hojas (SH01-SH05).
3.5.13 Conservacin de la coleccin de estudio en glicerol y papel. Cada colonia
obtenida con la metodologa de cultivos monoconidiales, representa un individuo del
gnero Colletotrichum sp. y por ende, garantiza la pureza de la misma. Para conservar estos
cultivos se utilizaron 100 tubos eppendorf nuevos y estriles de 1 ml con glicerol al 20%
(20g/100ml de glicerol), el cual fue autoclavado en alcuotas a 15 lbp - 115C por 15
minutos y servido en cada tubo, bajo condiciones estriles.
Se hicieron cortes circulares de cada cultivo con un asa estril y se transfirieron 3 de ellos
para cada tubo eppendorf con glicerol, sobre la tapa del tubo se marc con el cdigo
correspondiente al cultivo origen, se colocaron en una gradilla, se envolvi en papel
vinilpel y se almacenaron a 10C.
Para la conservacin en papel, fue necesario tener colonias con un dimetro de crecimiento
de 2 cm aproximadamente, sobre las que se colocaron tringulos estriles de papel filtro,
con el fin de que Colletotrichum sp. colonizara el papel (Vase la Figura 10). Las cajas de
petri fueron selladas con vinilpel, marcadas con el cdigo asignado e incubadas a 25C en
oscuridad hasta que el papel estuvo cubierto de acrvulos y micelio de Colletotrichum sp.
Luego se retir el papel con pinzas flameadas y se coloc dentro de cajas de petri estriles
marcadas, las cuales se ubicaron en un horno a una temperatura no mayor a 27C; pasados
2 das se voltearon los tringulos colonizados, para permitir el completo secado de los
mismos por otro perodo de 2 das. Finalmente, los trozos de papel se colocaron dentro de
bolsas de pergamino estriles marcadas con el cdigo correspondiente y conservadas a
10C.
Figura 10. Aislamientos de la coleccin de Colletotrichum sp. conservados en papel
filtro

3.5.14 Reactivacin de cultivos puros de Colletotrichum sp. Se seleccionaron 20 colonias
conservadas en tubos eppendorf y se dejaron descongelar a temperatura ambiente; con el
uso de un asa estril se pas cada trozo de la colonia a cajas de petri con medio PDA
acidificado (39g/L de papa-dextrosa-agar, MERCK ; 100 l de cido lctico, pH 5-6). Las
cajas se marcaron con cada cdigo y se incubaron a 25C en la oscuridad, durante 5 das.
3.5.15 Caracterizacin biolgica de la coleccin de estudio de Colletotrichum sp. De
acuerdo a la metodologa propuesta por Timmer (1998) y utilizada por Torres (2005), se
prepar un medio selectivo para el gnero Colletotrichum compuesto de la siguiente
manera: PDA, hidrxido de cobre (42mg Cu/L) y estreptomicina (300mg/l) con el cual se
evalaron morfologa y color de la colonia.
Con el fin de evaluar la sensibilidad a un fungicida, se eligi Benomyl, por ser uno de los
ms utilizados para el control de la enfermedad; en la prueba, los 20 cultivos se sometieron
a crecimiento en medio PDA con Benomil propuesto por Bernstein en 1995 (39g/L de
papa-dextrosa-agar, MERCK ; 100 l de cido lctico, pH 5-6; 2ul/ml de Benomil) y se
compar la velocidad del crecimiento con respecto a medio PDA acidificado ((39g/L de
papa-dextrosa-agar, MERCK ; 100 l de cido lctico, pH 5-6).
3.5.16 Caracterizacin molecular de Colletotrichum sp. A partir de la coleccin de
estudio conformada por los 20 cultivos monoconidiales de Colletotrichum sp., se tom con
un asa estril una muestra representativa de acrvulos de cada colonia y se diluy en 1 ml
de agua desionizada destilada estril contenida en un tubo eppendorf. Los 20 tubos se
conservaron durante 24 horas en un freezer a 20C. La extraccin del ADN de
Colletotrichum sp. se hizo con el kit Ultraclean DNA Soil de MOBIO.
Para realizar la amplificacin del ADN de Colletotrichum sp. se utilizaron dos primers
especficos tipo ITS1 del ADN ribosomal (Invitrogen) para el gnero objeto de estudio,
tomando como referencia las secuencias publicadas por Mills en 1994, los cuales se
emparejaron con el primer universal ITS4. El primero de ellos es el primer CaInt2
especfico para Colletotrichum acutatum (5- GGGGAAGCCTCTCGCGG-3) y el
segundo es el primer CgInt, especfico para Colletotrichum gloeosporioides (5-
GGCCTCCCGCCTCCGGGCGG-3).
Se prepar una solucin master mix para 41 reacciones, 20 de ellas con el primer CgInt y
las 21 restantes con el primer especfico para C. acutatum CaInt2. A cada tubo para PCR
que contena la solucin mster se le adicionaron 2 l de la solucin con DNA, extrado a
partir de conidios de Colletotrichum sp. (Vase el Cuadro 4)
Cuadro 4. Solucin mster mix para 41 reacciones de PCR
Reactivo 1 Reaccin 41 reacciones
H
2
O (grado molecular) 19l 779l
Buffer + MgCl2 2.5l 102.5l
dNTPs 0.5l 20.5l
Primer ITS4 1 l 41l
Taq polymerasa 0.3l 24.6
Primer CaInt2/CgInt 1l 1 l

Se realiz la PCR con el uso del termociclador SynGen de Biotech y el programa
COLLEO1 propuesto por Torres (2005). (Vase el Cuadro 5)
Cuadro 5. Programa del termociclador COLLE01 utilizado para PCR
Pasos Temperatura Tiempo
Denaturacin inicial 94 C 2 min
Denaturacin por ciclo 94 C 30 seg
Anillamiento 57 C 30 seg
Extensin 72 C 30 seg
Amplificacin Paso 2 al 4 30 ciclos
Extensin final 72 C 4 min
Finalizacin 4 C Necesario

Con el fin de visualizar los productos amplificados, se llev a cabo la electroforesis de
cidos nucleicos mediante la preparacin de un gel de agarosa al 1.5% (45 mg de agarosa,
30 ml de buffer TBE 0.5X). Se utilizaron 5l de un marcador de 100 pb de Bioline, el
cual fue servido en el primer pozo del gel. En cada uno de los siguentes pozos se pusieron
10l de una solucin compuesta por: 2 l de buffer de carga (BIORAD) y 8l de producto
de PCR. Los geles se sometieron a una carga elctrica de 100 voltios durante 30 minutos en
una cmara horizontal de BIORAD. Finalmente, se tieron bromuro de etidio (10 g/ml,
SIGMA) por 30 minutos y se lavaron 2 veces con agua destilada desionizada durante 15
minutos. Como control positivo, se sembr en uno de los pozos el producto de PCR del
aislamiento de Colletotrichum acutatum de tomate de rbol y, como control negativo, se
utiliz agua grado molecular.
Las bandas se visualizaron en un transiluminador (Transiluminator UVP) a una longitud de
onda de 254 nm y se analiz cada gel con el uso del software SynGen de Biotech.
3.6 INSTRUMENTOS
Los instrumentos utilizados para el desarrollo del presente proyecto son los siguientes:
Balanza Analtica
Calibrador
Micropipetas de 10, 100 y 1000 l
Cmara de Neubauer
Microscopio
Estereoscopio
Cmara Digital
Termociclador
Cmara Horizontal de Electroforesis
Transiluminador UV
3.7 TCNICAS DE RECOLECCIN Y ANLISIS DE DATOS
3.7.1 Evaluacin de presencia de acrvulos en el follaje. Se tomaron datos de presencia
de acrvulos sobre el follaje asintomtico de guanbana, durante siete meses de muestreo.
Para la toma de estos datos se dise una escala de seis niveles, la cual va desde cero hasta
cinco, siendo cero ausencia y, cinco, 100% de colonizacin. Los datos fueron analizados
mediante el programa SAS con anlisis de varianza tipo GLM.
3.7.2 Evaluacin del crecimiento de Colletotrichum sp. en diferentes medios de cultivo.
Las mediciones del dimetro de crecimiento de las colonias se realizaron con un calibrador
durante siete das. Se sembr cada colonia en medio PDA industrial y medio selectivo para
Colletotrichum sp., el dimetro de crecimiento se midi a partir de las 72 horas. Para
determinar la sensibilidad al fungicida benomyl, fue necesario comparar el crecimiento en
agar PDA y este mismo medio, suplementado con el fungicida. Se midi el dimetro de
crecimiento de cada colonia a partir de las 48 horas.

4. RESULTADOS
4.1 ESTANDARIZACIN DE ENVEJECIMIENTO FOLIAR PARA DETECCIN
DE INFECCIONES LATENTES EN GUANBANA
La deteccin de infecciones latentes mediante el envejecimiento de las hojas de guanbana,
se bas en el protocolo propuesto por Biggs (1990), el cual fue modificado inicialmente por
Torres (2005), para las condiciones especficas de las hojas de tomate de rbol.
Para la estandarizacin en guanbana inicialmente se sumergieron las hojas en diferentes
soluciones del fungicida paraquat (2, 4 y 6 %) tanto hojas jvenes como hojas viejas,
durante 30 minutos. Transcurrido dicho tiempo las hojas se retiraron de la solucin y se
secaron a temperatura ambiente (17 ms o menos 2), las hojas se establecieron en las
cmaras hmedas durante 5 das. La presencia de cuerpos fructferos (acrvulos) se evalu
bajo estereoscopio durante tres das (Vase el Cuadro 6).
Cuadro 6. Evaluacin bajo estereoscopio del follaje tratado con paraquat
% de
Concentracin
Paraquat
Hojas Evaluacin
Da 5
Evaluacin
Da 6
Evaluacin
Da 7
2 Joven No se observ necrosis.
Crecimiento nulo de
Colletotrichum sp.

Indicios de necrosis
0% crecimiento de
Colletotrichum sp.
20% de Necrosis
0% crecimiento de
Colletotrichum sp.
2 Vieja Necrosis mnima
0% crecimiento de
Colletotrichum sp.
Necrosis media.
Crecimiento de micelio
blanco
40% de Necrosis
Presencia de micelio
blanco
4 Joven Inicio de necrosis
blanco
Necrosis media
Presencia de pocos
acrvulos
Necrosis total
Acrvulos en gran
cantidad
4 Vieja Necrosis media
blanco
Necrosis media
Micelio grisceo y
acrvulos
Necrosis total
Micelio grisceo y gran
cantidad de acrvulos
6 Joven Necrosis total

Necrosis total Necrosis total
Ninguna estructura
visible
6 Vieja 100% de necrosis 100% de necrosis 100% de necrosis
Ninguna estructura
visible

Conforme a los resultados obtenidos a partir de los tratamientos planteados, se concluy
que el tratamiento de las hojas asintomticas de guanbana con paraquat a una
concentracin de 4% y un perodo de incubacin en cmaras hmedas de 7 das, fue la
combinacin ms indicada, pues se observ el necrosamiento total de la lmina foliar y el
crecimiento de acrvulos caractersticos de Colletotrichum sp. De esta forma, se eligi este
tratamiento como la mejor alternativa para la deteccin de infecciones latentes en el follaje
de guanbana.
Los tratamientos por choque trmico no dieron ningn resultado satisfactorio para el
envejecimiento del follaje y por ende no se observ la presencia de acrvulos; slo se
confirm el crecimiento de microorganismos saprfitos como Penicillium sp, Aspergillus
sp., entre otros, por lo cual se descart esta metodologa.
4.2 DETECCIN DE INFECCIONES LATENTES MEDIANTE LA PRESENCIA
DE ACRVULOS DE Colletotrichum sp.
Luego de haber elegido el mejor tratamiento con paraquat al 4% durante 30 minutos e
incubacin por 7 das en cmaras hmedas, con el objetivo de inducir envejecimiento para
detectar infecciones latentes, se procedi a evaluar la presencia de acrvulos propios de
Colletotrichum sp., sobre cada una de las hojas, con ayuda de un estereoscopio.
Para lo anterior se tom como referencia la descripcin morfolgica realizada por Sutton
(1992), en la cual afirma que acrvulos color rosado, salmn-rosado a naranja sin setas, son
caractersticos de Colletotrichum acutatum y, acrvulos grises o algunas veces naranja
plido con setas, de Colletotrichum gloeosporioides. Ambos tipos de acrvulos fueron
observados sobre el envs de la lmina foliar, en mayor cantidad los que correspondan a
Colletotrichum acutatum. Se realiz un montaje de cada acrvulo en un portaobjetos y fue
observado bajo microscopio, para verificar los conidios de C. acutatum o C.
gloeosporioides (Vase la Figura 10).
4.3 CUANTIFICACIN CON ESCALA DE LAS INFECCIONES LATENTES EN
HOJAS ASINTOMTICAS DE GUANBANA
De acuerdo con la escala planteada para la evaluacin de infecciones latentes en hojas no
sintomticas de guanbana, se cuantific en porcentaje la presencia de masas de conidios
agrupados en acrvulos y se ubic este valor dentro de una de las divisiones (Vanse la
Figura 11 y el Cuadro 7)
Se evaluaron 160 hojas mensualmente y, los datos correspondientes a cada estrato se
tomaron y organizaron de acuerdo a un formato para el anlisis de la distribucin espacial
de Colletotrichum sp. sobre el follaje de guanbana mediante anlisis de varianza y prueba
de Tukey (Vase el Cuadro 8).
Figura 10. Acrvulos caractersticos de Colletotrichum sp. observados sobre el envs
de hojas de guanbana

Se pueden observar: A) Acrvulos con masas de conidios color naranja B) Masas de
conidios color salmn C) Conidios en masas con coloracin rosada
Figura 11. Envs de hoja de guanbana con ms del 80% de infecciones latentes
(presencia de acrvulos) despus del tratamiento con paraquat al 4%. Valor ubicado
en la divisin 5 de la escala

Cuadro 7. Porcentaje de infecciones latentes
Divisin % de Infecciones
latentes
0 0
1 1-20
2 21-40
3 41-60
4 61-80
5 81-100

Cuadro 8. Modelo del formato para la toma de datos de infecciones latentes
FECHA LOTE ARBOL EDAD PROFUND. ORIENTA HOJA NIVEL
Feb-05 1 1 V E E 1 1
Feb-05 1 1 V E E 2 1
Feb-05 1 1 V E W 1 3
Feb-05 1 1 V E W 2 3
Feb-05 1 1 V I W 1 2
Feb-05 1 1 V I W 2 2
Feb-05 1 1 V I E 1 1
Feb-05 1 1 V I E 2 1
Feb-05 1 1 J E E 1 0
Feb-05 1 1 J E E 2 0
Feb-05 1 1 J E W 1 0
Feb-05 1 1 J E W 2 0
Feb-05 1 1 J I W 1 0
Feb-05 1 1 J I W 2 0
Feb-05 1 1 J I E 1 0
Feb-05 1 1 J I E 2 0

4.4 ANLISIS DE LA DISTRIBUCIN ESPACIAL DE Colletotrichum sp. EN EL
COPA DE Annona muricata L.
Desde febrero hasta agosto se realizaron 7 evaluaciones del porcentaje de infecciones
latentes en las hojas asintomticas de guanbana, teniendo en cuenta los estratos
seleccionados para los muestreos.
Febrero. De acuerdo al anlisis de varianza no se encontraron diferencias significativas de
la cantidad de infecciones latentes entre lotes, edad de las hojas o profundidad. Hubo
diferencias significativas entre rboles en cuanto a la presencia de acrvulos con un F de
0.0417, menor que el (0.05) planteado.
Al evaluar durante este mes el porcentaje de infecciones latentes, de acuerdo con la
orientacin de las hojas muestreadas, estos resultados mostraron diferencias altamente
significativas (0.0057) en cuanto a la ubicacin de Colletotrichum sp. entre oriente y
occidente, siendo sta ltima la parte del copa donde se encontraron ms acrvulos del
patgeno, lo cual se confirm mediante la prueba de Tukey (P<0.05).
Marzo. Se observaron de nuevo diferencias altamente significativas (< 0.001) entre los
rboles muestreados por cada lote; cada uno de ellos present un porcentaje diferente de
infecciones latentes. Durante este mes, los resultados entre lote, edad u orientacin no
mostraron diferencias. Por el contrario, s se encontraron diferencias significativas (0.0249)
a nivel de profundidad, entre la parte interna y externa; segn la prueba de Tukey la
ubicacin de las infecciones latentes en la zona externa de la copa fue ms representativa.
No se observ interaccin entre las fuentes de variacin durante marzo.
Abril. Los anlisis realizados para los datos registrados de este mes muestran diferencias
altamente significativas de forma sucesiva a nivel de los lotes (< 0.001) y entre los rboles
muestreados (< 0.001). Segn la prueba de Tukey, la mayor presencia del patgeno en
forma de infecciones latentes durante este mes, corresponde al lote 2.
Simultneamente se observaron diferencias significativas (0.0193) entre las hojas jvenes y
viejas, estrato que corresponde a la edad, de tal manera que de acuerdo a la prueba de
Tukey la mayor cantidad de acrvulos durante el mes de Abril se encontr en las hojas
jvenes.
Se encontr interaccin entre lote y edad de las hojas muestreadas con diferencias muy
significativas (0.0051).
Mayo. Los datos analizados mostraron nuevamente un comportamiento similar a los dos
meses anteriores a nivel de lotes, en el cual, la presencia del patgeno en forma de
infecciones latentes fue ms evidente en el lote 2; por consiguiente hubo diferencias
altamente significativas (0.0005). Los resultados de la prueba de Tukey relacionados con el
estrato edad, mostraron que la presencia de acrvulos como evidencia de infecciones
latentes, fue superior en las hojas jvenes que en las viejas (P< 0.001).
Segn el anlisis de varianza, se encontr interaccin entre los lotes y las edades de las
hojas muestreadas por cada uno; los resultados mostraron diferencias altamente
significativas (0.0054).
Junio. El anlisis estadstico de los datos mostr un comportamiento similar al mes de
febrero, en el cual hubo diferencias muy significativas (0.0002) entre los rboles, lo que
indica que la presencia de cuerpos fructferos de Colletotrichum sp. (acrvulos), fue
diferente para cada uno.
En el estrato orientacin, los resultados observados tuvieron diferencias altamente
significativas (< 0.001); la parte occidental del rbol, segn Tukey, fue la zona con la
mayor presencia de infecciones latentes. Durante este mes no hubo interaccin entre los
estratos edad, orientacin y profundidad.
Julio. Segn los datos analizados para el mes de julio, a nivel de lotes se encontraron una
vez ms diferencias significativas (0.0376), el lote 2 present el mayor porcentaje de
infecciones latentes en las hojas, segn los anlisis de la prueba de Tukey.
Los resultados obtenidos del ANAVA y de la prueba de Tukey, mostraron diferencias muy
significativas entre rboles de cada lote (P< 0.001) y tambin en el estrato edad (P< 0.001).
En este ltimo, la mayor cantidad de acrvulos del patgeno se hall en las hojas jvenes.
En el estrato orientacin se presentaron diferencias altamente significativas (P< 0.001)
entre las zonas occidental y oriental de la copa. La parte correspondiente a occidente result
el lugar donde se encontraron ms infecciones latentes de Colletotrichum sp. confirmadas
por la presencia de acrvulos.
Durante este mes se present interaccin entre el estrato correspondiente a la orientacin
(zona occidental y oriental de la copa) y los lotes muestreados (1 y 3) con diferencias
significativas (0.0120) entre estas dos fuentes de variacin.
Agosto. De acuerdo con el anlisis estadstico para los datos correspondientes a Agosto, se
observaron diferencias significativas (0.0113), al igual que en los meses anteriores, a nivel
de lotes. El lote 2 result con la mayor presencia de infecciones latentes. por consiguiente,
diferencias altamente significativas (0.0021) fueron notables entre cada uno de los rboles.
Los datos analizados por medio de la prueba de Tukey para el estrato edad (hojas jvenes y
viejas), mostraron diferencias muy significativas (P< 0.001); en las hojas jvenes se
encontr la mayor cantidad de acrvulos de Colletotrichum sp. Igualmente, la orientacin
tambin tuvo un comportamiento con diferencias estadsticamente muy significativas (P<
0.001); el occidente fue la zona con la cantidad de cuerpos fructferos (acrvulos) ms
representativa.
Hubo interaccin entre los datos analizados a nivel de lotes y la edad de las hojas con
diferencias significativas (0.0308); el lote 2 y las hojas jvenes tuvieron la mayor cantidad
de presencia de infecciones latentes. Se observ interaccin entre lote y profundidad, las
diferencias fueron muy significativas (0.0028), el segundo lote y la zona externa tuvieron
alta presencia de acrvulos de Colletotrichum sp.
De nuevo hubo interaccin entre lote y edad de las hojas, se encontraron diferencias
altamente significativas (0.0028) para los datos analizados; las hojas jvenes del lote 2
mostraron el mayo porcentaje de infecciones latentes.
4.5 IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE SNTOMAS DE
ANTRACNOSIS EN DIFERENTES RGANOS DE Annona muricata L.
Sntomas en hojas. Para llevar a cabo los aislamientos de Colletotrichum sp. a partir de
rganos sintomticos de antracnosis, fue necesario realizar un muestreo de cada uno, con la
metodologa correspondiente.
La lmina foliar y la nervadura de la hoja de guanbano presentaron 4 estados de sntomas
que se pueden diferenciar. El primero de ellos se caracteriz por tener una lesin muy
pequea de borde definido, con un tamao de 0.5 a 3.0 mm, acircular, de coloracin caf
oscuro, consistencia seca, textura lisa y con hundimiento (Vase la Figura 13). Cuando el
sntoma se present sobre la nervadura, tuvo una coloracin ms oscura con las dems
caractersticas similares a las de la lmina foliar (Vase la Figura 15). En este estado no se
present clorosis, fue ms frecuente su aparicin en los bordes de la lmina y result
ptimo para la recuperacin de Colletotrichum sp (Vase la Figura 14).
En el segundo estado, la lesin mostr una coloracin caf menos oscuro, ovalada y no fue
uniforme; en el centro el tejido colaps, fue seco, liso y con mayor hundimiento; el borde
estuvo ms pronunciado y fue ms oscuro que en la parte central. El tamao de la lesin
oscil entre 0.5 y 1.0 cm. No se observ clorosis pero s una proyeccin de la lesin a lo
largo y ancho de la lmina, lo cual indic el estado inicial de la maduracin del sntoma.
El estado tres se caracteriz por ser una lesin adulta, madura, se observ una mancha de
color marrn claro con el tejido completamente seco y roto en el centro. Cuando la lesin
se encontr en el borde se apreci enroscamiento de la lmina. El tamao de la mancha
estuvo entre 1.0 y 2.0 cm, y fue de forma ovalada y con borde definido. Se observaron
algunos acrvulos sobre la lesin lo cual indic la aparicin de los primeros signos de la
enfermedad. Cuando el sntoma se present en la nervadura, se pudo identificar una
mancha de color pardo claro, con hundimiento, de forma ovalada, clorosis alrededor, la
cual se pronunci hacia la lmina, el tamao alcanz hasta 3.0 cm de longitud (Vase la
Figura 15).
El cuarto estado de la lesin en la lmina present una coloracin caf ms clara que en los
estados anteriores, madura, tejido muy seco, el cual colaps completamente y por esta
razn se pudo observar rompimiento del mismo en la parte del centro, el tamao fue mayor
de 2.0 cm. Se observ una gran cantidad de acrvulos sobre toda la lesin y algunas veces
se agruparon en anillos concntricos
Sntomas en botones y frutos. Los sntomas que se presentaron en estos rganos tuvieron
los cuatro estados similares a los de las hojas. En los botones, las lesiones siempre
presentaron borde definido y fueron ms frecuentes hacia la base de los ptalos y spalos y
algunas veces se unieron varias lesiones acelerando la pudricin de la flor; a medida que la
lesin fue madurando se adentr en el botn, cubri la mayor parte de ste. En los ltimos
estados, al igual que en hojas, se pudieron verificar los signos de Colletotrichum sp., con la
aparicin de masas de esporas sobre el tejido que colaps completamente.
En el fruto, se presentaron tambin los estados anteriores; las lesiones se observaron como
manchas de borde definido, color caf oscuro, hundidas, similar a un chancro;
posteriormente, el tejido tom una apariencia seca y se rompi. En los dos ltimos estados
se afect el interior del fruto y ocasion dao en la pulpa; igualmente, en la corteza se
observaron los cuerpos fructferos del patgeno.
4.6 COLECCIN DE ESTUDIO DE Colletotrichum sp.
Con el objeto de conformar la coleccin de estudio, todos los aislamientos fueron
caracterizados a nivel macroscpico mediante descripcin morfolgica. Para lo anterior, se
tuvo en cuenta que cada aislamiento presentara caractersticas propias del gnero
Colletotrichum sp. como: color de la colonia naranja o gris, colonias ralas o con micelio
areo, presencia de halos concntricos, alto nivel de esporulacin, cantidad de acrvulos y
velocidad de crecimiento en medio PDA (39g/L de PDA, MERCK
). Se observaron los
conidios de todos los aislamientos de Colletotrichum sp. bajo microscopio (Vase la Figura
12), se midi 100 veces el tamao (largo y ancho) de cada uno y se promedi. Se tuvo en
cuenta para la seleccin de los aislamientos, la forma de los extremos de los conidios,
acusados, redondos o, la combinacin de ambos.
De todos los aislamientos obtenidos a partir de acrvulos naranjas presentes sobre las
lminas foliares y de sntomas iniciales en hojas, botones y frutos, los cuales fueron
identificados como Colletotrichum sp., se seleccionaron 5 de cada rgano de origen, para
conformar una coleccin de estudio de 20 aislamientos del patgeno.
Una vez purificados, se realiz cultivo monoconidial a todos los aislamientos, con el fin de
tener un individuo y a cada uno se le registraron las caractersticas macro y microscpicas
(Vanse los Cuadros 9 y 10). Adicionalmente, se le asign el cdigo de acuerdo al rgano
del cual se obtuvo el aislamiento y al nmero, por ejemplo: IL05, SF02, SB01, SH03, etc.
Figura 12. Medicin de conidios de Colletotrichum sp. teidos con azul de lactofenol

Figura 13. Secuencia de sntomas de la antracnosis en la lmina foliar de guanabana

Se pueden observar: A) Lesin en estado inicial sobre la hoja a 10X B) Lesin
caracterstica en estado intermedio C) Sntoma tpico en estado avanzado
Figura 14. Estados iniciales de la antracnosis en el borde de la lmina foliar de
guanabana

Se pueden observar: D) Estado inicial del sntoma en el borde de la hoja a 10X E) Sntoma
caracterizado por lesin madura del borde a 10X.
Figura 15. Secuencia de sntomas de la antracnosis en la nervadura de la lmina foliar
de guanabana

Se pueden observar: F) Lesin inicial sobre la nervadura a 10X G) Sntoma sobre nervadura
en estado intermedio H) Lesin avanzada, el tejido ha colapsado.
Cuadro 9. Caracterizacin morfolgica macroscpica de la coleccin de estudio de
Colletotrichum sp
Cepa

Color
Colonia
Anillos
Concntricos
Tipo de
Micelio

Aspecto de la
Colonia
Nivel de
Esporulacin
Color de las masas
de conidios
SB01

Blanco y
gris
Presentes Esponjoso Elevado con
borde definido
Medio Rosados y negro
SB02 Blanco y
gris
Presentes Esponjoso de
color gris
Elevado sin
borde definido
Alto Rosados y negro
SB03 Blanco Ausentes Algodonoso Plana de borde
definido
Alto Naranja
SB04 Blanco y
gris
Presentes Algodonoso Plana sin borde
definido
Bajo Rosados
SB05 Blanco Presentes Poco
algodonoso
Plana de borde
definido
Medio Naranja
SF01 Naranja Presentes Mnimo de
color blanco
Plana de borde
definido
Alto Naranja
SF02 Blanco Presentes Esponjoso gris
verdoso
Elevado de
borde definido
Alto Naranja
SF03 Naranja Presentes Poco esponjoso Plana de borde
definido
Alto Naranja
SF04 Gris Presentes No tiene Plana de borde
definido
Alto Naranja
SF05 Blanco Presentes Esponjoso Elevado sin
borde definido
Alto Naranja
SH01 Blanco y
gris
Presentes Esponjoso en
gran cantidad
Elevado con
borde definido
Alto Rosados
SH02 Blanco y
gris
Ausentes Esponjoso
grisceo
Elevado sin
borde definido
Bajo Naranja
SH03 Blanco y
gris
gran cantidad
Elevado con
borde definido
Alto Rosados
SH04 Blanco Ausentes Esponjoso
grisceo
Elevado sin
borde definido
Bajo Naranja
SH05 Blanco y
gris
gran cantidad
Elevado con
borde definido
Alto Naranja
IL01 Blanco y
gris
Ausentes Esponjoso Plana de borde
definido
Alto Naranja
IL02 Naranja Presentes Poco
algodonoso
Plana de borde
definido
Alto Naranja
IL03 Blanco y
gris
Presentes Esponjoso y
abundante
Plana de borde
definido
IL04 Blanco y
gris
Ausentes Esponjoso Plana de borde
definido
IL05 Naranja Presentes Poco esponjoso Plana de borde
definido
Alto Naranja

De acuerdo al estudio de la morfologa de los cultivos de la coleccin de Colletotrichum sp.
fue posible identificar cuatro tipos de colonia con respecto al color: colonias blancas con
gris, blancas, naranja y gris (Vase la Grfica 1).
Grfica 1. Porcentaje de aislamientos de la coleccin de estudio que presentaron una
coloracin blanco y gris, blanco, naranja y gris en medio PDA
50%
25%
20%
5%
Blanco y gris Blanco Naranja Gris

Con relacin al color de las masas de los conidios de cada uno de los aislamientos, se
observaron dos colores que permiten agrupar las colonias: colonias con masas de conidios
rosadas y masas de conidios naranjas. El 65% de los asilamientos de la coleccin, present
colonias con masas naranjas y el 25% restante fueron masas rosadas (Vase la Grfica 2).
Grfica 2. Porcentaje de los aislamientos de la coleccin que produjeron masas de
conidias en dos coloraciones naranja y rosado
35%
65%
0
10
20
30
40
50
60
70
Naranjas Rosados

Cuadro 10. Caracterizacin microscpica de la coleccin de estudio de Colletotrichum
sp
Tamao de los
Conidios
Cepa

Largo
(m)

Ancho
(m)

Forma de los
Conidios
SB01

16.80 4.50 Ovaladas con un extremo ms angosto que
otro. Ambos extremos redondeados
SB02 16.20 4.20 Totalmente ovaladas con extremos
redondeados
SB03 16.35 4.05 Ovaladas un poco disminuidas en cada
extremo
SB04 16.60 4.35 Ovaladas y estrechas en el centro. Extremos
redondos
SB05 15.95 4.80 Ovaladas con extremos acusados

SF01 14.45 2.80

Fusiformes y estrechas con un extremo ms
angosto.
SF02 14.50 2.95

Ovaladas y estrechas en el centro con uno
de los extremos acusados
SF03 15.38 3.65

Fusiformes con ambos extremos acusados
SF04 14.55 3.95

Totalmente ovaladas con extremos
redondeados
SF05 15.40 4.00

Ovaladas con un extremo acusado, rectas
SH01 16.35 4.75 Cilndricas y alargadas con extremos
redondeados
SH02 17.05 5.85 Cilndricas y grandes, la mayora con
extremos redondeados
SH03 16.95 5.80 Cilndricas con ambos extremos
redondeados
SH04 16.20 5.95 Fusiformes y muy grandes, la mayora con
uno de los extremos acusados
SH05 13.35 3.70 Alargadas con extremos acusados

IL01 13.55 3.40 Rectas y pequeas con ambos extremos
acusados
IL02 13.70 3.50 Fusiformes con ambos extremos acusados

IL03 16.50 3.55 Ovaladas y estrechas con extremos
redondos

IL04 16.85 3.85 Ovaladas un poco disminuidas en uno de
los extremos
IL05 13.75 3.45 Rectas y pequeas con ambos extremos
acusados

4.7 CARACTERIZACIN BIOLGICA DE LOS AISLAMIENTOS DE LA
COLECCIN DE Colletotrichum sp
Se compar la tasa diaria de crecimiento de cada aislamiento en agar PDA y PDA
suplementado con hidrxido de cobre, medio selectivo para Colletotrichum sp. propuesto
por Timmer (1998). Las mediciones del dimetro de la colonia se hicieron durante 7 das y
se tom como referencia la evaluacin a las 72 horas, para hacer la comparacin entre la
velocidad de crecimiento en agar PDA y en el medio con hidrxido de cobre (Vase la
Figura 16 y el Cuadro 11). De acuerdo a estos resultados, 9 de los 20 aislamientos
presentaron mayor crecimiento a las 72 horas en medio selectivo para el gnero
Colletotrichum sp. (PDA e hidrxido de cobre); este resultado corresponde al 45% del total
de la coleccin (Vase la Grfica 3).
Figura 16. Comparacin del dimetro de crecimiento de la colonia SHO3 en medio
selectivo para Colletotrichum sp

Se pueden observar: A) Colonia SH03 con menor dimetro de crecimiento despus de 72
horas B) Colonia SH03 que present mayor velocidad de crecimiento.
Grfica 3. Porcentaje de los aislamientos que mostraron mayor y menor velocidad de
crecimiento en medio selectivo para Colletotrichum sp
Mayor
45%
Menor
55%

Cuadro 11. Comparacin de dimetros de crecimiento de los aislamientos de la
coleccin en medio PDA y selectivo para Colletotrichum sp despus de 72 horas de
incubacin
Dimetro de
Crecimiento
Aislamiento
PDA
(cm)
PDA + Cu(OH)
(cm)
SB01 4.40 5.05*
SB02 4.90 5.25*
SB03 3.50 3.20
SB04 4.50 5.50*
SB05 3.35 3.05
SF01 3.75 3.40
SF02 3.80 3.35
SF03 3.55 3.30
SF04 5.05 5.50*
SF05 4.45 2.70
SH01 1.80 3.50*
SH02 4.65 5.15*
SH03 2.95 3.85*
SH04 5.00 4.50
SH05 5.75 4.80
IL01 4.95 4.10
IL02 3.7 3.10
IL03 3.65 5.45*
IL04 4.15 5.50*
IL05 3.30 3.05
* Aislamientos con mayor dimetro de crecimiento en medio selectivo (PDA con Hidrxido de
Cobre) que en PDA a las 72 horas

Simultneamente, se evalu la sensibilidad al fungicida benomyl, cada uno de los 20
aislamientos de la coleccin se sembr en medio PDA con dos concentraciones de benomyl
(1 g/ml y 2g/ml) y se evalu el crecimiento en este medio durante 7 das de incubacin,
pero se tom como referencia el registro del dimetro de crecimiento correspondiente a las
48 horas (Vase el Cuadro 12).
De los resultados anteriores, 9 aislamientos de la coleccin fueron sensibles al fungicida, ya
que su dimetro de crecimiento en medio PDA con benomyl (2g/ml ) no fue mayor a 0.5
cm despus de 48 horas de incubacin (Vase la Grfica 4). Por el contrario, los 11
aislamientos restantes tienden a ser resistentes debido a que el dimetro de crecimiento a la
misma concentracin fue mayor de 0.8 cm y alcanz en algunas colonias una longitud de
1.4 cm. Como se puede verficar en el Cuadro 12, todos los aislamientos son resistentes al
fungicida benomyl a una concentracin de 1g/ml.
Cuadro 12. Medicin de dimetros de crecimiento de los aislamientos de la coleccin
en medio PDA con benomyl a las 48 horas de incubacin
Dimetro de crecimiento

Cepa
PDA
(cm)
Benomil
(1 g/ml)
(cm)
Benomil
(2 g/ml)
(cm)
SB01 2.80 1.65 0.20*
SB02 3.50 1.25 0.50*
SB03 2.70 2.1 1.35
SB04 3.30 1.25 0.20*
SB05 2.15 2.4 1.45
SF01 2.55 2.6 1.40
SF02 2.90 2.65 1.50
SF03 2.95 1.9 1.00
SF04 4.00 1.2 0.5*
SF05 3.95 1.55 1.05
SH01 1.05 1.35 0.40*
SH02 3.95 1.3 0.35*
SH03 2.00 1.55 0.50*
SH04 3.80 1.95 0.90
SH05 4.65 1.80 0.85
IL01 4.15 1.7 1.20
IL02 3.05 1.9 1.05
IL03 2.85 1.50 0.45*
IL04 4.00 1.35 0.55*
IL05 2.20 1.85

1.35
* Aislamientos que presentaron sensibilidad al benomyl a una concentracin de 2g/ml,
despus de 48 horas de incubacin

Grfica 4. Porcentaje de aislamientos resistentes y sensibles al benomyl (2g/ml )
luego de 48 horas de incubacin
45%
55% Resistentes
Sensibles

4.8 CARACTERIZACIN MORFOLGICA DE LOS AISLAMIENTOS DE LA
COLECCIN
Colonias color blanco y gris El 50% de las colonias de la coleccin exhibi, en medio de
cultivo PDA, una coloracin blanco y gris. Los 10 aislamientos correspondientes son: 3 de
sntomas en botones (SB01, SB02 y SB04), 4 de sntomas en hojas (SH01, SH02, SH03 y
SH05) y 3 de infecciones latentes (IL01, IL03 y IL04). Ninguna colonia de Colletotrichum
sp. de sntomas en fruto mostr esta coloracin. 8 de estos aislamientos presentan una
caracterstica que predomina en la forma de los conidios y es que stos tiene los extremos
redondos. De forma general, la descripcin realizada es que son alargados, grandes,
cilndricos. La longitud de los conidios est entre 16.20 y 17.35 m y el ancho va desde 3.5
y 5.8 m. Los 2 aislamientos restantes corresponden a la colonia SH05 y IL01, los cuales
tienen una longitud y ancho diferente a los dems. El largo est entre 13.35 y 13.55 m, el
ancho desde 3.40 a 3.70m. la coloracin de las masas de conidios siempre fue rosada.
Con relacin al crecimiento en agar selectivo para Colletotrichum sp., 8 aislamientos
(SB01, SB02, SB04, SH01, SH02, SH03, IL03 y IL04) mostraron una alta velocidad de
crecimiento despus de 72 horas cuando se compar el dimetro diario de la colonia en
medio que contena hidrxido de cobre con el crecimiento en PDA. Igualmente, estos
aislamientos fueron sensibles al benomyl, ya que su dimetro de crecimiento a las 48 horas
no sobrepas los 0.5 cm. Contrario a los 2 aislamientos que fueron atpicos dentro de este
grupo de colonias color blanco y gris, las cuales tuvieron conidios en masas de color
naranja, fueron resistentes al fungicida y tuvieron un crecimiento lento en medio selectivo
para el gnero Colletotrichum sp (Vase la Figura 17).
Colonias blancas. Dentro de este grupo estn 2 aislamientos de sntomas en botn (SB03 y
SB05), 2 aislamientos de sntomas en frutos (SF02 y SF05) y 1 colonia de sntomas en
hojas (SH 04). Estas colonias tuvieron una baja velocidad de crecimiento en agar PDA con
hidrxido de cobre y fueron resistentes al benomyl. Los grupos de conidios exhibieron una
coloracin naranja. La medicin del largo de estos conidios estuvo entre 14.50 y 17.20 m
y el ancho de 2.95 a 5.95 m, la forma de estos se caracteriz por tener por lo menos uno
de los extremos acusados.
Colonias naranja y colonias grises. Cuatro aislamientos presentaron una coloracin
naranja al igual que las masas de los conidios. Estas colonias tuvieron una baja velocidad
de crecimiento en medio selectivo (PDA + Cu (OH)) y fueron resistentes al benomyl. El
largo de los conidios estuvo entre 13.70 y 15.38 m y el ancho fue de 2.8 a 3.5 m. La
forma de la mayora de los conidios estuvo caracterizada por tener ambos extremos
acusados. Solo un aislamiento mostr una coloracin gris, las masas de los conidios fue
naranja, tuvo una alta velocidad de crecimiento en medio selectivo para Colletotrichum sp.
y fue resistente al benomyl. Los conidios tenan forma ovalada con ambos extremos
redondos, el largo de stos fue de 14.55m y el ancho de 3.95 m (Vase la Figura 18).
Figura 17. Comparacin del crecimiento de la colonia SB04 en diferentes medios de
cultivo

Aislamiento SB04 en a) medio PDA b) medio selectivo para Colletotrichum sp. c) PDA
con Benomyl 1g/ml d) PDA con Benomyl 2 g/ml (colonia sensible), despus de 7 das
de incubacin.
Figura 18. Colonias de Colletotrichum sp. de coloracin blanco, gris y naranja de la
coleccin de estudio

A B
Izquierda: Colonia con coloracin blanco y gris, masas de conidios rosadas en medio PDA
y derecha: Colonia color naranja en medio PDA.
4.9 CARACTERIZACIN MOLECULAR DE LOS AISLAMIENTOS DE LA
COLECCIN
La extraccin del ADN de cada uno de los 20 aislamientos se llev a cabo con el kit
UltraClean DNA Soil (MoBio). Para comprobar la existencia del ADN extrado fue
necesario hacer una electroforesis de slo cidos nuclicos, la cual mostr la eficiencia del
kit.
La amplificacin de los cidos nuclicos de los aislamientos de Colletotrichum sp. se
realiz mediante PCR convencional, utilizando primers especficos tipo ITS para este
gnero, acoplados con el primer universal ITS4. La identificacin de Colletotrichum
gloeosporioides se logr con el primer CgInt y la de Colletotrichum acutatum con el
CaInt2.
El ADN de 9 aislamientos de Colletotrichum sp. fue amplificado con el primer especfico
para Colletotrichum gloeosporioides (CgInt) y el primer universal ITS4; mediante
electroforesis se visualiz un fragmento aproximadamente de 450 pares de bases.
El primer especfico CaInt2 para Colletotrichum acutatum conjuntamente con el primer
universal ITS4 amplific un fragmento de 490 pares de bases de DNA de los 9 asilamientos
restantes de la coleccin.
Cuadro 13. Grupos de aislamientos de guanbana caracterizados como Colletotrichum
gloeosporioides y Colletotrichum acutatum
Colletotrichum gloeosporioides Colletotrichum acutatum

SB01 SF04 SH03 SB03 SF03 SH05
SB02 SH01 IL03 SF01 SF05 IL02
SB04 SH02 IL04 SF02 SH04 IL05

De los 20 aislamientos no fue posible caracterizar molecularmente 2 colonias: SB05 y
IL01.
seleccionados de Colletotrichum sp. utilizando los primers CgInt, CaInt2 e ITS4

Amplificacin de fragmentos especficos de DNA de los aislamientos seleccionados de
Colletotrichum sp. utilizando los primers CaInt2 e ITS4 (1 y 7) y los primers CgInt e ITS4
(4,6,10,12 y 14).
seleccionados de Colletotrichum sp. utilizando los primers CgInt, CaInt2 e ITS4

Colletotrichum sp. utilizando los primers CaInt2 e ITS4 (1, 7, 10 y 14) y los primers CgInt
e ITS4 (4, 6 y 13).
seleccionados de Colletotrichum sp. utilizando los primers CaInt2, CgInt e ITS4

Colletotrichum sp. utilizando los primers CaInt2 e ITS4 (2, 8 Y 13) y los primers CgInt e
ITS4 (1, 5, 7 Y 12).

C
u
a
d
r
o

1
4
.

C
a
r
a
c
t
e
r
i
z
a
c
i
n

m
o
r
f
o
l
g
i
c
a

y

m
o
l
e
c
u
l
a
r

d
e

l
o
s

2
0

a
i
s
l
a
m
i
e
n
t
o
s

d
e

l
a

c
o
l
e
c
c
i
n

A
i
s
l
a
m
i
e
n
t
o

C
o
l
o
r

P
D
A

C
o
l
o
r

P
D
A
+
C
u

D
i
m
e
t
r
o

C
o
l
o
n
i
a

e
n

C
u

R
e
a
c
c
i
n

B
e
n
o
m
y
l

T
a
m
a
o

c
o
n
i
d
i
o
s

E
x
t
r
e
m
o
s

C
o
n
i
d
i
o
s

P
C
R

L
a
r
g
o

(
m
)

A
n
c
h
o

(
m
)

C
a
I
n
t
2

C
g
I
n
t

S
B
0
1

B
l
a
n
c
o

y

g
r
i
s

G
r
i
s

5
.
0
5
*

S
e
n
s
i
b
l
e

1
6
.
8
0

4
.
5
0

R
e
d
o
n
d
o
s

-

+

S
B
0
2

B
l
a
n
c
o

y

g
r
i
s

G
r
i
s

5
.
2
5
*

S
e
n
s
i
b
l
e

1
6
.
2
0

4
.
2
0

R
e
d
o
n
d
o
s

-

+

S
B
0
3

B
l
a
n
c
o

G
r
i
s

o
p
a
c
o

3
.
2
0

T
o
l
e
r
a
n
t
e

1
6
.
3
5

4
.
0
5

A
c
u
s
a
d
o
s

+

-

S
B
0
4

B
l
a
n
c
o

y

g
r
i
s

G
r
i
s

5
.
5
0
*

S
e
n
s
i
b
l
e

1
6
.
6
0

4
.
3
5

R
e
d
o
n
d
o
s

-

+

S
B
0
5

B
l
a
n
c
o

G
r
i
s

o
p
a
c
o

3
.
0
5

T
o
l
e
r
a
n
t
e

1
5
.
9
5

4
.
8
0

A
c
u
s
a
d
o
s

+

-

S
F
0
1

N
a
r
a
n
j
a

M
a
r
r
n

3
.
4
0

T
o
l
e
r
a
n
t
e

1
4
.
4
5

2
.
8
0

F
u
s
i
f
o
r
m
e
s

-

-

S
F
0
2

B
l
a
n
c
o

G
r
i
s

o
p
a
c
o

3
.
3
5

T
o
l
e
r
a
n
t
e

1
4
.
5
0

2
.
9
5

E
x
t
r
e
m
o

a
c
u
s
a
d
o

+

-

S
F
0
3

N
a
r
a
n
j
a

M
a
r
r
n

3
.
3
0

T
o
l
e
r
a
n
t
e

1
5
.
3
8

3
.
6
5

A
c
u
s
a
d
o
s

+

-

S
F
0
4

G
r
i
s

V
e
r
d
e

5
.
5
0
*

S
e
n
s
i
b
l
e

1
4
.
5
5

3
.
9
5

R
e
d
o
n
d
o
s

-

+

S
F
0
5

B
l
a
n
c
o

G
r
i
s

o
p
a
c
o

2
.
7
0

T
o
l
e
r
a
n
t
e

1
5
.
4
0

4
.
0
0

E
x
t
r
e
m
o

a
c
u
s
a
d
o

+

-

S
H
0
1

B
l
a
n
c
o

y

g
r
i
s

G
r
i
s

3
.
5
0
*

S
e
n
s
i
b
l
e

1
6
.
3
5

4
.
7
5

R
e
d
o
n
d
o
s

-

+

S
H
0
2

B
l
a
n
c
o

y

g
r
i
s

G
r
i
s

5
.
1
5
*

S
e
n
s
i
b
l
e

1
7
.
0
5

5
.
8
5

R
e
d
o
n
d
o
s

-

+

B
l
a
n
c
o

y

g
r
i
s

G
r
i
s

3
.
8
5
*

S
e
n
s
i
b
l
e

1
6
.
9
5

5
.
8
0

R
e
d
o
n
d
o
s

-

+

S
H
0
3

S
H
0
4

B
l
a
n
c
o

G
r
i
s

o
p
a
c
o

4
.
5
0

T
o
l
e
r
a
n
t
e

1
6
.
2
0

5
.
9
5

F
u
s
i
f
o
r
m
e
s

+

-

S
H
0
5

B
l
a
n
c
o

y

g
r
i
s

G
r
i
s

4
.
8
0

T
o
l
e
r
a
n
t
e

1
3
.
3
5

3
.
7
0

A
c
u
s
a
d
o
s

+

-

I
L
0
1

B
l
a
n
c
o

y

g
r
i
s

G
r
i
s

4
.
1
0

T
o
l
e
r
a
n
t
e

1
3
.
5
5

3
.
4
0

A
c
u
s
a
d
o
s

-

-

I
L
0
2

N
a
r
a
n
j
a

M
a
r
r
n

3
.
1
0

T
o
l
e
r
a
n
t
e

1
3
.
7
0

3
.
5
0

F
u
s
i
f
o
r
m
e
s

+

-

I
L
0
3

B
l
a
n
c
o

y

g
r
i
s

G
r
i
s

5
.
4
5
*

S
e
n
s
i
b
l
e

1
6
.
5
0

3
.
5
5

R
e
d
o
n
d
o
s

-

+

I
L
0
4

B
l
a
n
c
o

y

g
r
i
s

G
r
i
s

5
.
5
0
*

S
e
n
s
i
b
l
e

1
6
.
8
5

3
.
8
5

R
e
d
o
n
d
o
s

-

+

I
L
0
5

N
a
r
a
n
j
a

M
a
r
r
n

3
.
0
5

T
o
l
e
r
a
n
t
e

1
3
.
7
5

3
.
4
5

A
c
u
s
a
d
o
s

+

-

*

C
o
l
o
n
i
a
s

c
o
n

m
a
y
o
r

d
i
m
e
t
r
o

d
e

c
r
e
c
i
m
i
e
n
t
o

e
n

m
e
d
i
o

s
e
l
e
c
t
i
v
o

p
a
r
a

C
o
l
l
e
t
o
t
r
i
c
h
u
m

s
p
.

A
i
s
l
a
m
i
e
n
t
o
s

n
e
g
a
t
i
v
o
s

p
a
r
a

l
a
s

p
r
u
e
b
a
s

m
o
l
e
c
u
l
a
r
e
s

5. DISCUSIONES
Las infecciones latentes producidas por patgenos en plantas, han sido previamente
reportadas (Verhoeff, 1974; Prusky, 1996; Peres, et al., 2005) y son consideradas de los
ms altos niveles de parasitismo, desde que el parsito y el hospedero coexisten sin dao a
este ltimo. Verhoeff afirma que una verdadera infeccin latente debe involucrar una
relacin parastica que eventualmente induce sntomas. De acuerdo con los resultados en
guanbana, se encontr que Colletotrichum gloeosporioides y C. acutatum producen
infecciones latentes, ya que fue evidente la presencia de estructuras reproductivas, mediante
la estimulacin de envejecimiento del follaje asintomtico con paraquat.
Biggs (1995) detect la presencia de infecciones latentes en frutos asintomticos de
manzana con paraquat y, determin el uso potencial de este herbicida como medida rpida
para cuantificacin del patgeno; aproximadamente el 13% de las manzanas tratadas con
paraquat desarrollaron acrvulos de Colletotrichum acutatum. Torres (2005) encontr
infecciones latentes en el follaje asintomtico del tomate de rbol, a partir de la
metodologa propuesta por Biggs (1995), las cuales se confirmaron por el crecimiento de
cuerpos fructferos sobre la lmina foliar de Solanum betacea, luego de haber sido tratadas
con paraquat e incubadas en cmaras hmedas durante una semana. Asmismo, el gnero
Colletotrichum sp. es conocido por ocasionar infecciones latentes en mango (Dods et al.,
1991) y en otros cultivos (Cerkauskas, 1988).
Mertely y Legard (2004) tambin utilizaron paraquat y choque trmico para el
envejecimiento de pecolos de fresa, los cuales fueron incubados durante 5 y 7 das
respectivamente bajo condiciones de temperatura (23 a 25C) y luz permanente; la
presencia de acrvulos se verific por la aparicin de masas de conidias color naranja. La
observacin de acrvulos de Colletotrichum sp. sobre la lmina foliar de guanbana
confirm la presencia de infecciones latentes en follaje asintomtico despus de que fuera
sometido a contacto con paraquat y posteriormente ubicado en cmaras hmedas durante 7
das de incubacin. En soya, Hartam et al (1986) tambin detect infecciones latentes en
hojas despus de que fueron tratadas con paraquat, las cuales se evidenciaron por la
aparicin de grupos de acrvulos caractersticos del gnero Colletotrichum sp. Sinclair
(1991) determin que despus de un perodo de incubacin apropiado el crecimiento del
hongo se puede examinar, usualmente bajo estereoscopio, por la presencia de estructuras
fructferas (acrvulos) de Colletotrichum sp.
Aunque la mayora de los estudios sobre infecciones latentes causadas por Colletotrichum
sp., se han llevado a cabo en frutos, en este, se plante la hiptesis sobre la presencia de las
infecciones latentes en follaje asintomtico de guanbana y se confirm. Referente a las
investigaciones de este tipo de infecciones, en aguacate por ejemplo, se ha descrito el rol
que desempean los componentes preformados en la latencia y resistencia (Prusky et al.,
1982, 1985, 1988). Se identific inicialmente un dieno antifngico (cis, cis-1-acetoxy-2-
hixroxy-4-oxo-heneicosa-12, 15-dieno) en la corteza de frutos inmaduros de aguacate en
concentraciones altas, las cuales fueron requeridas in vitro para inhibir el crecimiento de C.
gloeosporioides y luego stas concentraciones se redujeron cuando el fruto madur. Esto
puede sugerir el hecho de que existan componentes en los tejidos de guanbana que
permitan, en un determinado momento, retardar el desarrollo del patgeno y producir las
infecciones latentes.
Con relacin a la evaluacin de presencia de infecciones latentes en los rboles de
guanbana durante los siete meses de muestreo, a nivel de los dos lotes no hubo diferencias
significativas. Los resultados mostraron tres meses con los ms altos porcentajes. El primer
mes de muestreo (Febrero), tuvo un porcentaje de 63.75% de presencia de infecciones
latentes sobre follaje asintomtico de guanbana; se supone que este resultado tiene
relacin con el estado climatolgico que prevaleci en el sitio de estudio, debido a que al
inicio del ao existe una notable disminucin de la precipitacin. Esto permite una
humedad relativa muy baja y por lo que se ha reportado, los conidios de Colletotrichum sp.
requieren un microclima adecuado para su germinacin, dado por alta humedad relativa y
altas temperaturas (King et al., 1997). Se presume que las condiciones ambientales durante
este mes no fueron propicias para que la antracnosis incidiera en el cultivo, por lo tanto,
Colletotrichum sp. permaneci de forma latente en el follaje, sin presentar sntomas
visibles.
Los dos meses restantes en los que los rboles tuvieron alta presencia de infecciones
latentes, fueron Junio con 71.25% y Julio con 65%. Estos dos meses corresponden a un
perodo de completa sequa en el sitio de estudio y por ende, se presenta dficit hdrico; los
intervalos de temperatura durante estos meses fueron: temperatura mnima de 22C,
mxima de 29C y humedad relativa de 64%. Se sospecha que una de estas condiciones no
es favorable para la germinacin de Colletotrichum sp, por lo que probablemente haya
permanecido como infeccin latente. Zrate (1988) afirma que la incidencia de la
antracnosis en guanbana se ve favorecida por condiciones ambientales de alta humedad
relativa (> 80%) y lluvias peridicas, lo cual podra insinuar que estas condiciones
favorecen la germinacin de los conidios, el establecimiento de Colletotrichum sp. y,
finalmente, el desarrollo de la enfermedad.
De los siete meses de muestreo, Marzo, Abril, Mayo y Agosto, todos los rboles mostraron
baja presencia de infecciones latentes; los porcentajes respectivos fueron 49.5%, 53.8%,
30.7 y 53.8%. Marzo es el inicio del primer perodo de lluvia en la zona de La Mesa y
finaliza a comienzos de Junio, en el que se alcanza una humedad relativa mayor del 80%,
condicin ptima para la germinacin de los conidios de Colletotrichum sp. y, la activacin
de infecciones latentes. Durante este mes se observ una alta incidencia de la antracnosis en
el cultivo de guanbana; frutos, botones florales y hojas, presentaron sntomas tpicos de la
enfermedad. Se podra afirmar que bajo estas condiciones ambientales, las infecciones
latentes son mnimas por la activacin de la antracnosis. El porcentaje ms bajo de
infecciones latentes se present durante Mayo con un 30.7%, este mes se caracteriz por
tener precipitaciones continuas durante todos los das, temperaturas altas despus de
medioda y una humedad relativa superior al 85%. A partir de lo anterior, se podra sugerir
que estas condiciones climticas favorecieron la incidencia de la enfermedad y tal vez sea
la razn de la baja presencia de acrvulos en las hojas evaluadas durante este mes.
Gonzlez (1977) afirma que Colletotrichum sp. forma sus conidios en masas
mucilaginosas, razn por la que necesita de lluvia seguida de alta humedad relativa y de
una capa de agua que persista sobre el follaje y sobre los frutos, para la produccin,
diseminacin y penetracin del patgeno. Los resultados obtenidos en las evaluaciones de
estos meses, sugieren que las condiciones anteriormente descritas propiciaron la
germinacin de los conidios, activaron las infecciones que despus fueron evidentes por la
aparicin de sntomas y, finalmente, la presencia de acrvulos en las lminas foliares
analizadas fue muy baja.
La presencia de infecciones latentes en el follaje asintomtico de guanbana fue evidente
tanto en hojas maduras como en jvenes, de acuerdo con las evaluaciones realizadas
durante los siete meses de muestreo. En ctricos, el apresorio es esencial sobre tejidos
maduros para la supervivencia del patgeno; Colletotrichum sp. sobrevive como
infecciones latentes sobre hojas maduras, debido a que las flores son los rganos ms
susceptibles a la enfermedad y slo aparecen temporalmente. (Agostini, et al., 1992). Con
relacin a estudios realizados en almendra (Adaskaveg y Frster, 2000), los conidios se
dispersan a tejidos maduros, los cuales no son susceptibles a la infeccin. As que se
sospecha que el inculo de Colletotrichum sp. se encuentra en las hojas maduras de
guanbana, ya que se evidenciaron infecciones latentes en stas durante todos los meses
evaluados.
No obstante, la mayor cantidad de infecciones latentes en guanbana se present en hojas
jvenes; stas podran estar dadas por la induccin de la senescencia de las hojas mediante
el uso del paraquat, que estimulara la activacin de la germinacin de los conidios, es
decir, se incitara al inicio del ciclo de la enfermedad sin que necesariamente fueran
verdaderas infecciones latentes. Se podra pensar que tanto hojas jvenes como maduras
seran fuentes de inculo. Por el estado avanzado de desarrollo de las hojas maduras, stas
podran ser ms fcilmente colonizadas y luego mostraran signos de la enfermedad, como
por ejemplo acrvulos, los cuales por accin del viento o del agua, seran diseminados a
otras hojas. Peres et al (2005) afirma que las infecciones latentes pueden desarrollarse,
resultar luego en colonizacin del tejido de la hoja una vez que sta envejece y finalmente,
se origina la produccin de acrvulos.
De acuerdo con el anlisis de varianza, hubo diferencias significativas en cuanto a la
orientacin de las hojas que fueron muestreadas y posteriormente tratadas, para detectar
infecciones latentes. Se encontr en 4 de los 7 meses evaluados, la mayor cantidad de estas
infecciones en la parte occidental de la copa. En esta zona, la humedad relativa es ms baja,
la temperatura es un poco ms alta que en el oriente y hay mayor desecamiento. Torres
(2005) afirma, que el estado de latencia de los microorganismos se debe a tres razones:
prevenir el desecamiento, proteccin de los rayos ultravioleta y de otros microorganismos.
De acuerdo a lo anterior, se sospecha que en la zona occidental del rbol las condiciones de
temperatura y humedad no son las adecuadas para la germinacin de los conidios de
Colletotrichum sp. y tal vez sea la causa del establecimiento del patgeno como infeccin
latente.
Los resultados obtenidos en el estudio de la dinmica de la fuente de inculo en el rbol de
guanbana, demostraron que Colletotrichum sp. reside como infeccin latente tanto en el
follaje joven y madur,o sin presentar sntomas visibles de la antracnosis, adems, este tipo
de infecciones fue ms frecuentes, en la zona occidental de la copa del rbol. Lo anterior
sugiere que si se presentan las condiciones ambientales apropiadas, todas las hojas de la
zona occidental de la copa del rbol, sin importar el estado desarrollo, seran la potencial
fuente de inculo de Colletotrichum sp.
Las infecciones latentes sobre el follaje asintomtico de Annona muricata L. y los rganos
con sntomas de la enfermedad, permitieron recuperar el patgeno a partir del aislamiento
de los acrvulos que emergieron sobre la lmina foliar. Zulfiqar et al (1996), afirma que
cuando los tejidos se vuelven senescentes, Colletotrichum sp. coloniza el tejido y produce
abundantes acrvulos bajo condiciones de humedad. Como medida de evaluacin de los
acrvulos aislados, se requiri una observacin microscpica detallada de cada uno y se
pudo confirmar que de acuerdo con la descripcin de Sutton (1992), la estructura
correspondiente a Colletotrichum gloeosporioides tiene un aspecto seco, con setas y los
conidios estn agrupadas en masas, aunque no siempre son de coloracin salmn plido.
Los acrvulos de Colletotrichum acutatum se observaron como estructuras de aspecto
cremoso, no presentaron setas y las agrupaciones de conidios tenan coloracin naranja.
Teniendo en cuenta la descripcin morfolgica de los acrvulos, fue posible aislar, en
teora, acrvulos de ambas especies.
Inicialmente se plante en varias investigaciones, que una caracterstica casi definitiva de
identificacin de C. acutatum, era la forma de los conidios fusiformes y con uno a ambos
extremos acusados. Peres et al (2005), afirma que los conidios de C. acutatum usualmente
son elipsoides y fusiformes, por lo menos en uno de los dos extremos, algunas veces es
tpico que tengan ambos extremos redondos como C. gloeosporioides. En todos los
acrvulos evaluados del follaje de guanbana, que se presuman eran de C. acutatum, los
conidios tenan uno o ambos extremos acusados. Agostini (1992) tambin encontr que
para los conidios de C. acutatum, todos tenan por lo menos uno de los dos extremos
fusiformes.
Timmer (1994) plantea que los conidios de C. gloeosporioides generalmente tienen tanto el
pice como la base redondos. Igualmente, Agostini (1992) tambin not que el 90% de los
conidios de C. gloeosporioides tenan los pices redondos. Las observaciones de los
probables conidios de C. gloeosporioides obtenidos de los acrvulos en hojas de
guanbana, permitieron concluir que en la mayora la descripcin reportada concord con
lo que se apreci bajo el microscopio. Esta no es una caracterstica definitiva de
diferenciacin entre las dos especies. Wharton y Diguez-Uribeondo (2004) afiman que
tanto C. gloeosporioides como C. acutatum son morfolgicamente muy similares y,
muestran caractersticas microscpicas casi idnticas.
A partir de las infecciones latentes, sntomas en botones florales, flores y hojas, se
estableci la coleccin de estudio del patgeno. Los aislamientos de Colletotrichum sp. de
sntomas en cada uno de los rganos muestreados presentaron diferentes caractersticas
morfolgicas; a simple vista no se pudo afirmar a qu especie pertenecan. Talhinhas
(2002) afirma que la amplia variacin de Colletotrichum sp. en cultivo, junto con la
existencia de aislamientos que exhiben caractersticas intermedias o mezcladas, hacen que
algunos parmetros no sean definitivos para la diferenciacin entre estas dos especies. Sin
embargo, se puede afirmar que las caractersticas morfolgicas son una parte importante
para la identificacin del agente causal de la antracnosis y, slo con pruebas consecutivas
confirmatorias, se determin la especie del posible patgeno.
Las especies de Colletotrichum sp. han sido identificadas a partir de caractersticas
morfolgicas como forma y tamao de los conidios, ausencia o presencia de setas, color de
la colonia, produccin de pigmentos, presencia de halos concntricos, tasa de crecimiento y
sensibilidad al benomyl (Adaskaveg y Hartin, 1997; Peres et al, 2005). Segn los resultados
obtenidos de la caracterizacin morfolgica, las colonias pertenecientes a la coleccin de
estudio fueron homogneas en medio de cultivo; de acuerdo al color se pudieron reunir en
cuatro grupos: blancas con gris, blancas, naranjas y grises.
Las colonias blancas con gris tuvieron acrvulos de color rosado, una tasa alta de
crecimiento en medio selectivo para Colletotrichum sp. (Timmer et al, 1998) y fueron
sensibles al benomyl. Sutton (1992) describe las colonias de Colletotrichum
gloeosporioides de color grisceo blanco y, conidios formados en masas de color salmn
plido. Agostini y Timmer (1994) tambin reconocieron dentro de un grupo de tres especies
de Colletotrichum sp., patgenos de ctricos, una cepa que tena una alta velocidad de
crecimiento, de color gris, a la que denominaron FGG, colonia gris de rpido crecimiento y
la atribuyeron a Colletotrichum gloeosporioides. Estos resultados permiten sugerir que este
grupo de caractersticas sera un buen indicio de que estas colonias pertenecen al gnero C.
gloeosporioides.
Las colonias blancas, naranjas y grises presentaron conidios agrupados en masas de color
naranja y tuvieron una baja velocidad de crecimiento en medio selectivo. Timmer (1994),
Gunnell y Gubler (1992), afirman que las colonias correspondientes a Colletotrichum
acutatum en ctricos, presentan un lento crecimiento y producen micelio blanco con masas
naranjas de pequeos conidios fusiformes. A partir de lo anterior, se podra inferir que estas
colonias forman parte del gnero C. acutatum, aunque una prueba que permitira contribuir
a la diferenciacin de las especies sera, la tolerancia al benomyl.
El benomyl es uno de los fungicidas ms efectivos para el control de la antracnosis (Peres
et al, 2002) y ha sido utilizado en medio de cultivo, para diferenciar Colletotrichum
gloeosporioides de Colletotrichum acutatum, ya que este ltimo muestra cierta tolerancia al
benomyl. Todos los aislamientos de Colletotrichum sp. de guanbana mostraron tolerancia
a 1g/ml; esto podra indicar que, a bajas concentraciones, el fungicida no tiene efecto
sobre el crecimiento del patgeno, debido a que con una concentracin de 2g/ml se
inhibi el crecimiento de algunos aislamientos de la coleccin.
Albertini y Leroux (1999) y tambin Yarden y Katan (1993), realizaron anlisis de la
secuencia del gen de la -tubulina en hongos tolerantes al benomyl, los cuales revelaron
que esta resistencia se deba a una mutacin de un nucletido que permite el cambio de un
aminocido en el codn 198 o 200. As, se podra sugerir que los hongos tolerantes al
benomyl han sufrido estas mutaciones en alguno de sus aminocidos del codn
anteriormente mencionado, lo cual le confiere la insensibilidad al fungicida.
Se sugiere que las pruebas de caracterizacin morfolgica no diferencian a Colletotrichum
gloeosporioides de C. acutatum, debido a la alta variabilidad que pueden presentar los
aislamientos en medios de cultivo. Freeman (1997) tambin afirma que debido a influencias
ambientales sobre la estabilidad de rasgos morfolgicos y, la existencia de formas
intermedias, estos criterios no siempre son adecuados para una diferenciacin confiable de
las especies del gnero Colletotrichum sp. Los criterios morfotaxonmicos no son lo
suficientemente precisos para discriminar entre especies del gnero Colletotrichum sp.
(Freeman et al, 2000).
Las herramientas moleculares son una parte esencial en la caracterizacin e identificacin
de los patgenos, para conocer con precisin la identidad de las especies que causan
antracnosis en guanbana. Se utilizaron una serie de pruebas consecutivas que fueron desde
la caracterizacin morfolgica y taxonmica convencional, hasta la aplicacin de pruebas
moleculares. Mills et al (1994) determin la secuencia de nucletidos de las regiones
intergnicas (ITS), especficamente de la regin 1 de varias especies de Colletotrichum y,
con base en esta informacin, se desarrollaron primers especficos que al ser acoplados con
el primer universal ITS 4 y un primer especfico (CgInt) permiti la identificacin de C.
gloeosporioides. C. acutatum fue detectado e identificado mediante la combinacin de los
primers ITS4 y CaInt2.
El DNA de nueve aislamientos de la coleccin fue amplificado con el primer CgInt, el cual
fue extrado de 8 colonias de coloracin blanco con gris y, la nica que exhibi color gris,
las cuales tuvieron caractersticas morfolgicas similares y comportamientos parecidos en
el medio selectivo con hidrxido de cobre y con benomyl. El fragmento amplificado
present un peso aproximado de 450pb, lo cual concuerda con fragmentos previamente
publicados por Mills (1994) y Parikka y Lemmetty (2004).
Simultneamente, se pudieron evidenciar productos de PCR de otras nueve colonias con el
primer especfico CaInt2 para Colletotrichum acutatum, ya que fue posible observar un
fragmento de aproximadamente 490 pares de bases, el cual corresponde al descrito para C.
acutatum. Estas colonias corresponden a 5 aislamientos blancos y 4 de coloracin naranja,
los cuales tuvieron una baja tasa de crecimiento en medio selectivo y fueron tolerantes al
benomyl en ambas concentraciones; adicionalmente, tuvieron conidios pequeos con
extremos acusados en por lo menos uno de sus extremos, lo cual sugiere que este grupo
pertenece a la especie Colletotrichum acutatum.
Dentro de los aislamientos de la coleccin, dos de ellos no amplificaron con ninguno de los
primers, uno de sntomas en botn y el otro de infecciones latentes (SB05 y IL01). Estas
colonias presentaron diferentes caractersticas frente a los dems aislamientos, aunque
ambas fueron tolerantes al benomyl y con conidios fusiformes. Se podra pensar que se
trata de Colletotrichum acutatum, aunque la prueba molecular result negativa y por lo
tanto, la identidad del aislamiento no pudo ser definida. La alta variabilidad gentica del
gnero Colletotrichum sp. puede ser una de las razones por las cuales no todos los
aislamientos fueron positivos para las pruebas moleculares. Para otras investigaciones, sera
conveniente trabajar con otras regiones intergnicas, como ITS2 o ITS3.

6. CONCLUSIONES
La deteccin de infecciones latentes originadas por Colletotrichum gloeosporioides y
Colletotrichum acutatum en el follaje asintomtico de Annona muricata fue posible con el
uso del paraquat, a una concentracin del 4%, durante un perodo de 30 minutos.
La presencia de infecciones latentes de Colletotrichum sp., se evidenci tanto en hojas
maduras como jvenes y fue ms frecuente en la zona occidental de la copa de Annona
muricata.
Con el diseo de una escala de medicin de la presencia de estructuras reproductivas de
Colletotrichum sp., se cuantificaron las infecciones latentes en el follaje asintomtico de
guanbana.
Las pruebas biolgicas y moleculares permitieron la identificacin de Colletotrichum
gloeosporioides y C. acutatum, aislado a partir de infecciones latentes en follaje
asintomtico y sntomas de la enfermedad.

7. RECOMENDACIONES
Redisear la escala de cuantificacin de infecciones latentes, la cual podra sugerirse con
ms niveles y menor rango de valor para cada nivel, con el objetivo de perfeccionar la
evaluacin de la presencia de cuerpos fructferos de Colletotrichum sp. en el follaje.
El tiempo de muestreo podra ser mayor, as que sera conveniente en prximos estudios,
analizar la dinmica de la fuente de inculo de Colletotrichum sp. durante doce meses, con
el propsito de incluir todos los perodos secos y lluviosos que inciden en el ciclo de la
enfermedad.
Para tener mayor exactitud con los resultados moleculares, se propone secuenciar los
productos de PCR y comparar estas secuencias con las bases de datos internacionales.
Tambin sera de gran informacin amplificar nuevamente el ADN de los aislamientos que
no fue posible caracterizar y, posteriormente, secuenciar estas amplificaciones con el fin de
conocer su identidad.
Disear pruebas de campo y laboratorio para conocer la forma en que interactan
Colletotrichum gloeosporioides y C. acutatum, como responsables de las antracnosis en
guanbana.
Realizar pruebas de patogenicidad exhaustivas, para determinar cules de los cuatro grupos
de colonias son realmente patognicos en guanbana.

BIBLIOGRAFIA
ADASKAVEG, J.E. & Frster, H. 2000. Occurrence and management of anthracnose
epidemics caused by Colletotrichum species on tree fruit crops in California. In: Prusky, D.,
Freeman, S. & Dickman, M.B. (eds.), Colletotrichum: Host Specificity, Patho-logy, and
Host-Pathogen Interaction, pp. 317-336. The Ameri-can Phytopathological Society. St. Paul
MN.
ADASKAVEG, J.E; Hartin, R.J. 1997. Characterization of Colletotrichum acutatum
causing anthracnose of almond and peach in California. Phytopathology. Vol 87: 979-987.
ADIKARAM, N. Y Brown, A. 1981. A study of latent infections of Capsicum spp. By
Colletotrichum capsici and Glomerella cingulata. PhD. Tesis, Queen`s University., Belfast.
AFANADOR-KAFURI, L., Minz, D., Maymon, M. y Freeman, S. 2003. Characterization
of Colletotrichum isolates from tamarillo, passiflora and mango in Colombia and
identification of a unique species from the genus. Phytopathology 93:579-587
AGOSTINI, , J.P; Timmer, L.W. 1.994. Population dynamics and sorvival of strains of
Colletotrichum gloeosporioides on citrus in Florida. Phytopathology, Vol 84: 420-425.
AGOSTINI, J. P., Timmer, L. W y Mitchell, D. J. 1992. Morphological y pathological
Characteristics of strains of Colletotrichum gloeosporioides from citrus. Phytopathology.
82: 1377-1382.
AGRIOS, G.N.1997. Plant Pathology. Academia press. San Diego, CA. USA. p.635.
AGRIOS, George. Fitopatologa. Segunda Edicin. Editorial Limusa. Mxico, D.F.
Mxico. p 838. 1999.
ALBERTINI, C., Gredt, M., Leroux, P. 1999. Mutations on the -tubulin gene associated
with benzimidazole resistance in the cereal eyespot fungi Tapesia yallundae y Tapesia
acuformis. Pestic. Biochem. Physiol. 64:17-31.
BAILEY, J. JEGER, A. Colletotrichum: biology, pathology and control. Wallingford: CAB
International, 1992.
BAXTER, A. P., Westhuizen, G. C. A., Eicker, A. 1983. Morphology and taxonomy of
South African isolates of Colletotrichum. South African Journal of Botany 2: 259-289
BENO-MOUALEM, D y Prusky, D. 2000. Early events during quiescent infection
development by Colletotrichum gloeosporioides in unripe avocado fruits. Phytopathology.
90: 553-559.
BIGSS, Alan. 1.995. Detection of latent infections in apple fruit with paraquat. Plant
Disease, Vol 79: 1062-1067.
BINYAMINI, N. y Schiffmann-Nadel, M. 1972. Latent infection in avocado fruit due to
Colletotrichum gloeosporioides. Phytopathology 62:592-594.
BROWN, A.E; Sreenivasaprasad, S; Timmer, L.W. 1.996.Molecular Characterization of
slow-growing orange and key lime anthracnose strains of Colletotrichum from citrus as C.
acutatum. Molecular Plant Pathology, Vol 86:523-527.
BROWN, G. 1975. factors affecting postharvest development of Colletotrichum
gloeosporioides in citrus fruits. Phytopathology 65: 404-409.
BRYSON, R. J., Caten, C. E., Hollomon, D. W., y Bailey, J. A. 1992. sexuality and
genetics of Colletotrichum. En J. A. Bailey y M. J. Jeger (ed.), Colletotrichum: biology,
pathology and control. CAB International, Wallingford, United Kingdom.
CANNON, P., Bridge, D., y Monte, E. 2000. Linking the past, present and future of
Colletotrichum systematics. En: Colletotrichum: Host specificity, pathology and host-
pathogen interaction. Prusky, D. Freeman, S. y Dickman, M. APS Press. USA. pp. 1-20.
CERKAUSKAS, R. F. 1988. Latent colonization by Colletotrichum spp.: Epidemiology
considerations and implications for mycoherbicides. Can. J. Plant Pathology 10:297-310.
DAVIDSE, L. C. 1986. Benzimidazole fungicides: Mechanism of action and biological
impact. Annual Review of Phytopathology 24:43-65
ESCOBAR, T. 1987. Aspectos generales sobre el guanbano, (Annona muricata L.). En:
ASIAVA. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Secretara de Agricultura y Fomento del
Valle del Cauca. Feriva Ltda.. Cali, Colombia. p. 79-98.
ESCOBAR, W. y Snchez, L. A. 1995. Fruticultura Colombiana: Guanbano. Editorial
Produmedios. Bogot, Colombia.
FAGAN, H. J. 1979. Postbloom fruit drop, a new disease of citrus associated with a form of
Colletotrichum gloeosporioides. Annual Applied Biology. 91:13-20.
FIGUEROA, M. 1978. El cultivo de la guanbana. En: Curso Internacional sobre
fruticultura Tropical. Maracay (Venezuela). 28p.
FITZELL, R.D. 1987. Epidemiology of anthracnose disease of avocados. South African
Avocado Growers Association Yearbook 10: 113-116.
FRSTER, H. & Adaskaveg, J.E. 1999. Identification of subpopulations of Colletotrichum
acutatum and epidemiology of almond anthracnose in California. Phytopathology 89: 1056-
1065.
FREEMAN, S., Minz, D., Jurkevitch, E., Maymon, M. y Shabi, E. 2000. Molecular
Analyses of Colletotrichum species from Almond and other fruits. Phytopathology 90:608-
614
GOES, A. y Kimati, H. 1994. Efeito de benomyl no crescimiento micelial de
Colletotrichum gloeosporioides, agente causal da queda prematura de frutos joven de
citros. Summa Phytopathol. 20:46
GONZALEZ, L. C. 1977. Introduccin a la fitopatologia. Instituto interamericano de
ciencias Agrcolas, IICA. San Jos de Costa Rica. pp. 148.
GUNNEL , P. S. y Gubler, W. D. 1992. Taxonomy and morphology of Colletotrichum
species pathogenic to strawberry. Mycologia 84:157-165.
GUZMAN, A. F. 1982. La guanbana. Universidad del Tolima. 33p. (Mimeografiado.
Material docente frutales).
HARTAM, G. L., Manandhar, J. B., y Sinclair, J. B. 1986. Incidence of Colletotrichum
spp. On soybeans and weeds in Illinois and pathogenicity of Colletotrichum truncatum.
Plant Disease 70:780-782.
HUBER, L., Fitt, B. D. L. y McCarteny, H. A. 1996. The incorporation of pathogen spores
into rain-splash droplets: A moddeling aproach. Plant Pathology. 45:506-517.
JARVIS, W. 1994. Latent infections in the pre and post-harvest environment. Hortscience
29:749-751.
KING, W. T., Madden, L. V., Ellis, M. A. y Wilson, L. L. 1997. Effects of temperature on
sporulation and latent period of Colletotrichum spp. Infecting strawberry fruit. Plant
Disease 81: 77-84
KING, W.T.; Madden, L.V.; Ellis, M.A.; Wilson, L.L. 1997. Effects of temperature on
sporulation and latent period of Colletotrichum spp. infecting strawberry fruit. Plant
Disease. Vol 81: 77-84.
LATUNDE-DAD, A. O. 2001. Colletotrichum: tales of forcible entry, stealth, transient
confinement and breakout. Molecular Plant Pathology 2(4):187-198.
LEN, J. 1968. Annonceas. En: Fundamentos botnicos de los cultivos tropicales IICA
OEA (Costa Rica) p. 467.
MCMILLAN, NR.T. 1986. Serious diseases of tropical fruits in Florida. Proceedings of the
Florida State Horticultural Society 99: 224-227.
MERTELY, J.C; Legard, D.E. 2004. Detection, isolation, and pathogenicity of
Colletotrichum spp. from strawberry petioles. Plant disease. Vol 88: 407-412.
MORTON, J.F. 1966. The Soursop, or guanabana (Annona muricata L.) Proceedings of the
florida State Horticultural Society. V. 79. p. 355-366.
NICHOLSON, R.L. y Moraes , W.B.C. 1980. Survival of Colletotrichum graminicola:
imporatnce of the spore matriz. Phytopathology 70, 255-261.
NOONAN, C.J. 1953. Review of investigations on the Annona species. Proc. Fla. St. Hort.
Soc. Series N 190. p. 205-210.
NTAHIMPERA, N., madden, L. V., Wilson, L. 1997. Effect of rain distribution alteration
on splash dispersal of Colletotrichum acutatum. Phytopathology 87, 649-655.
OCONELL, R. J., Nash, C., y Bailey, J. A. 1992. Lectin Cytochemistry: A new approach
to understanding cell differentiation, pathogenesis and taxonomy in Colletotrichum. En J.
A. Bailey y M. J. Jeger (ed.), Colletotrichum: biology, pathology and control. CAB
International, Wallingford, United Kingdom.
OSPINA, C., lvarez, E. 2003. caracterizacin gentica y patognica de Colletotrichum
spp. Agente causal de la antracnosis en guanbana (Annona muricata L.) en el Valle del
Cauca. En: Memorias XXIV Congreso Ascolfi. Armenia, Colombia.
PALOMINO, S.J.G Y J.F. Rentera, C., 1986. Control qumoco de la antracnosis
(Colletotrichum gloeosporioides penz) del guanbano Annona muricata L. Invitro y en
condiciones de invernadero. Facultad de ciencias agropecuarias, Palmira. 76 p.p (Tesis de
grado)
PERES, N. A. R., Souza, N. L., Peever, T. L. y Timmer, L. W. 2004. Benomyl sensitivity
of isolates of Colletotrichum acutatum and c. gloeosporioides from citrus. Plant disease
88:125-130.
PERES, N. A. R., Souza, N. L., Zitko, S. E. y Timmer, L. W. 2002. Activity of benomyl for
control of postbloom fruti drop of citrus caused by Colletotrichum acutatum. Plant Disease
86:620-624.
PERES, N. A., Timmer, L. W., Adaskaveg, J. E., y Correll, J. C. 2005. Lifestyles of
Colletotrichum acutatum. Plant Disease 89:784-795.
POPENOE, W. 1956. las frutas anonceas. La Hacienda (EE.UU.), V. 51 N 3 p. 56 58.
PRUSKY, D. 1996. Pathogen quiescence in postharvest diseases. Annual Review of
Phytopathology. Vol 34: 413-434.
PRUSKY, D. y Plumbey, R. A. 1992. Quiescent infections of Colletotrichum in tropical
and subtropical fruits, p. 289-307. En J. A. Bailey y M. J. Jeger (ed.), Colletotrichum:
biology, pathology and control. CAB International, Wallingford, United Kingdom.
SINCLAIR, J. B. 1991. Latent infection of soybean plants and seeds by fungi. Plant
Disease 75:220-224.
SMITH, B.J. & Black, L.L. 1990. Morphological, cultural, and pat-hogenic variation
among Colletotrichum species isolated from strawberry. Plant Disease 74: 69-76.
SREENIVASAPRASAD, S., Mills, P. R., Meehan, B. M. Y Brown, A. 1996. Phylogeny
and systematics of 18 Colletotrichum species based on ribosomal DNA spacer sequences.
Genome 39:499-512.
SREENIVASAPRASAD, S., Mills, P. R., y Brown, A. 1994. Nucleotide sequence of the
rDNA spacer 1 enables identification of solates of Colletotrichum as C. acutatum.
Mycology 98:186-188.
SUTTON, B. C. 1980. The Coelomycetes. Fungi imperfecti with pycnidia, acervuli and
stromata. Commonwealth Mycological Institue, Kew, Uk. 696p.
SWINBURNE, T. 1983. Quiescent infections in post-harvest diseases. En Post-harvest
pathology of fruits and vegetales. Editorial Dennis. Londres. pp.121.
TALHINHAS, P., Sreenivasaprasad, S., Neves-Martins, J., Oliveira, H. 2002. Genetic and
morphological characterization of C. acutatum causing anthracnose of lupins.
Phytopathology 92: 986-996.
TIMMER, L.W; Brown, G.E; Zitko, S.E. 1.998. The role of Colletotrichum spp. In
postharvest anthracnose of citrus and survival of C. acutatum in fruit. Pland Disease, Vol
82: 415-418.
TORRES, M. F. 2005. Anlisis de la distribucin espacial de las infeccines latentes del
agente causal de la antracnosis (Colletotrichum sp.) en el rea foliar del tomate de rbol
(Solanum betacea). Trabajo de grado. Pontificia Universidad Javeriana, Bogot.
VERHOEFF, K. 1974. Latent infections by fungi. 1974.Annual Review of Phytopathology.
Vol 12: 99-110.
VILLANUEVA, R., Hernndez, A., Ynez, M., Tliz, D., Mora, a., Crdenas, E., y
Castaeda, A. 2005. Characterization and identification of Colletotrichum fragariae on
Cherimoya fruits. Agrociencia 39:93-106
WALLER, J. M. 1992. Colletotrichum diseases of perennial and other cash crops, p. 167-
185. En J. A. Bailey y M. J. Jeger (ed.), Colletotrichum: biology, pathology and control.
CAB International, Wallingford, United Kingdom.
WHARTON, Phillip; Diguez-Uribeondo, J. 2004. The biology of Colletotrichum acutatum
en Anales del Jardn Botnico de Madrid. 61(1):3-22
YARDEN, O., Katan, T. 1993. Mutations leading to substitutions at amino acids 198 and
200 of beta-tubulin that correlate with benomyl resistance phenotypes of field strains of
Botrytis cinerea. Phytopathology 83: 1478-1483
ZRATE, R. D. 1987. Principales problemas fitosanitarios del guanbano (Annona
muricata L.), y las medidas preliminares de control. En: Asociacin de Ingenieros
Agrnomos del Valle, Palmira (colombia); Secretaria de Agricultura y Fomento del Valle,
Palmira (Colombia); facultad de Ciencias Agropecuarias, Palmira (Colombia). Produccin
de Frutales en Valle del Cauca, p. 83-90
ZARATE, R. D. 1998. enfermedades de la guanbana (Annona muricata L.) Departamento
de Agricultura. Universidad Nacional de Colombia (Palmira). pp.59
ZULFIQAR, M., Brlansky, R. H., Timmer, L. W. 1996. Infection of flower and vegetative
tissues of citrus by Colletotrichum acutatum y C. gloeosporioides.Mycologia 88: 121-128.

Antracnosis de Guanabana

Transféré par

Informations du document

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Antracnosis de Guanabana

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

DINMICA DE LAS FUENTES DE INCULO E IDENTIFICACIN DEL AGENTE

CAUSAL DE LA ANTRACNOSIS (Colletotrichum sp) EN GUANBANA (Annona

) acidificado con cido lctico, para ajustar el pH entre 5 y 6. Las cajas de

) para el aislamiento de los mismos.

Vous aimerez peut-être aussi