Anticuerpos monoclonales de primera generacin

Los anticuerpos policlonales, o antisueros, son poblaciones complejas de Ac, formadas por
distintas clases de Ig en las que est presente una variedad de especificidades. Por el contrario, el
trmino anticuerpo monoclonal (AcMo) se usa para referirse a una poblacin de molculas de Ac,
todas idnticas, las cuales consecuentemente, poseen todas la misma especificidad. De lo anterior
se desprende que, en una prueba analtica, el chance de obtener falsos positivos, es decir,
"reconocer lo que no es como si lo fuera" es mucho menor cuando se usan reactivos
monoclonales.
En 1975, en un trabajo que posteriormente les vali el premio Nobel, G. Kohler y C. Milstein
demostraron la posibilidad de producir AcMo mediante la fusin de linfocitos B con clulas
mielomatosas (clulas tumorales inmortales). Ellos demostraron que los hbridos resultantes de tal
fusin heredan la capacidad para crecer indefinidamente en cultivo y para producir anticuerpos, y
que, adems, es posible aislar del producto heterogneo de fusin aquellos hbridos secretores del
anticuerpo en el cual se est interesado (56). As nacieron los AcMo, posteriormente denominados
de primera generacin, para distinguirlos de los anticuerpos producidos mediante tcnicas de
biologa molecular y ADN recombinante, que han sido llamados de segunda generacin.
La tcnica original descrita por Kohler y Milstein (Figura 4) permite la obtencin de AcMo de ratn.
De manera resumida, el proceso se inicia con la inmunizacin de ratones de laboratorio (cepa
Balb/c) con el antgeno para el cual se desea producir los anticuerpos. Una vez que se tiene la
certeza del status inmune de estos animales (por lo general esto se establece tomando muestras
de sangre y examinando y/o cuantificando la presencia de anticuerpos especficos en el suero
inmune), los mismos son sacrificados y se obtiene el bazo, en el cual se encuentra una poblacin
numerosa de linfocitos B. A continuacin, los esplenocitos se fusionan con clulas mielomatosas
inmortales que son mantenidas en el laboratorio en la forma de lneas celulares gracias a su
capacidad para crecer indefinidamente en cultivo. La fusin, fenmeno poco comn en clulas
somticas, es facilitada mediante la adicin de agentes virales (virus Sendai), qumicos
(polietilenglicol) o fsicos (electricidad), de los cuales el ms usado es la sustancia qumica
denominada polietilenglicol (PEG). El producto de la fusin entre un esplenocito y una clula
mielomatosa es denominado hibridoma. Los hibridomas heredan caractersticas fenotpicas de
ambas clulas parentales de manera tal que son capaces de crecer indefinidamente y de producir
el anticuerpo codificado en los genes del esplenocito pariente. Obviamente, la poblacin de
hibridomas obtenida mediante una fusin, como la descrita anteriormente, es heterognea en
cuanto a los anticuerpos secretados por ella. Con el objeto de seleccionar los hbridos productores
del anticuerpo de inters se realiza clonacin celular. Esta clonacin consiste en sembrar los
hibridomas en microcultivos a una densidad celular tan baja que se garantiza que las clulas
integrantes de la poblacin obtenida en cada microcultivo sean todas idnticas, es decir,
conformen un clon. Los anticuerpos secretados por estas poblaciones clonales de hibridomas son
anticuerpos monoclonales. Utilizando un principio, similar al antes descrito, se han preparado
reactivos monoclonales provenientes de otras especies, inclusive humanos. Numerosas revisiones
han sido publicadas en las cuales se examina la produccin y uso de estos reactivos (22; 31; 50;
71; 107).

Ahora bien, adems de su altsima especificidad, es necesario reconocer otros dos atributos que
han contribuido al xito de los AcMo como reactivos analticos. En primer lugar, los AcMo son
sustancias qumicamente bien definidas, su naturaleza y estructura se conoce en detalle y ello
permite la formulacin de preparaciones estables y facilita enormemente los procedimientos para
su conjugacin a trazadores tales como sustancias fluorescentes, enzimas, radioistopos, oro
coloidal, molculas electrn-densas (ferritina), etc. En segundo lugar, son reactivos susceptibles de
ser preparados en forma pura, en condiciones muy controladas y en grandes cantidades.
En lo concerniente a aplicaciones biomdicas, los AcMo de primera generacin han desplazado de
muchas aplicaciones a los anticuerpos policlonales, han permitido el desarrollo y avance de
numerosas y nuevas pruebas diagnsticas y son, en la actualidad, los reactivos de eleccin para
aplicaciones analticas, tanto en el mbito de lo mdico-clnico como en distintas reas de la
investigacin en biociencias. Lo anterior es cierto para todo aquello relacionado con pruebas de
laboratorio "in vitro", tanto en clnica como en investigacin.
Por razones de espacio, mencionaremos solo algunos ejemplos de AcMo de primera generacin,
los cuales han encontrado aplicaciones de inters en biomedicina, no sin antes advertir que se
trata de una muestra pequea tomada de un universo mucho ms amplio y, por tanto, imposible de
cubrir en su totalidad en el presente contexto. Comenzar por mencionar las numerosas pruebas
diagnsticas para fenotipificacin de tumores sanguneos que actualmente hacen uso de AcMo de
primera generacin. Aun cuando algunas de estas enfermedades pueden diagnosticarse
claramente, mediante criterios clnicos e histolgicos bien establecidos, hay otros casos, como las
leucemias linfoblsticas agudas y los linfomas del tipo no-Hodgkin, donde es imprescindible la
inmunofenotipificacin para el establecimiento inequvoco del diagnstico, la clasificacin, la
prognosis y el tratamiento (13; 114). La forma rutinaria, tomadas por estas pruebas de tipificacin,
es la citometra de flujo con paneles de AcMo fluorescentes. Estos Ac fluorescentes reconocen
molculas marcadoras de las poblaciones sanguneas en estudio y las tien, permitiendo su
identificacin diferencial por medios electrnicos.
Otro ejemplo ilustrativo, lo constituyen los AcMo con especificidad por la molcula CD4, la cual se
expresa en la superficie de un subset de linfocitos T humanos. Uno de los mejores indicadores de
la progresin de la infeccin por el virus HIV, hacia la aparicin del sndrome de inmunodeficiencia
adquirida (SIDA) en los pacientes infectados, es precisamente una cada sustancial en el nmero
de linfocitos T circulantes en la sangre que portan este marcador de superficie CD4. La prueba de
rutina empleada para la estimacin del nmero de linfocitos T CD4+ utiliza AcMo fluorescentes
anti-CD4 humano para teir y luego examinar, por citometra de flujo o en el microscopio de
fluorescencia, las muestras de sangre de los individuos seropositivos.
La tipificacin de grupos sanguneos humanos, como el ABO, de crucial importancia en
transfusiones y transplantes, se realiza en la actualidad mediante pruebas de aglutinacin en las
que se utilizan AcMo.
Pero los AcMo no han servido, nicamente, para el estudio de molculas asociadas a la superficie
de clulas. Existe adems un sinnmero de molculas solubles cuya deteccin en fluidos
biolgicos (sangre, orina, etc.) es de inters mdico-clnico. Algunos ejemplos son : drogas o
metabolitos de drogas como la marihuana (2W), la cocana (3W), la ciclosporina (4W), hormonas
como la hCG (test de embarazo; 3W), protenas asociadas a ciertos tipos de cncer como el PSA
(cncer de prostata; 5W) y el CEA (adenocarcinoma de colon; 6W) o protenas indicadoras de
infecciones por virus como Hepatitis B (7W) y CMV (4W). En la actualidad, los tests para la
deteccin, y/o cuantificacin de estas molculas, utilizan AcMo y, en su mayora, toman la forma de
inmunoensayos en los que una enzima (ELISA), un radioistopo (RIA) o un colorante ("dipstick")
sirven como medio de deteccin.
Virtualmente, todos los ejemplos de AcMo referidos se han obtenido mediante la generacin de
hibridomas de origen mrido (ratn o rata). Por desgracia, el uso de este tipo de AcMo, con
intenciones profilcticas o teraputicas, en humanos ha encontrado obstculos importantes. El
primero de ellos es que se trata de protenas extraas para el ser humano. Consecuentemente, su
administracin conduce a la aparicin de una respuesta inmune humana anti-AcMo, con la cual se
obstaculiza la eficacia del tratamiento. Adems, la mediacin de funciones efectoras necesarias o
deseables en ciertas situaciones, y el catabolismo de estos anticuerpos de ratn o rata en el
cuerpo humano, es diferente al de los correspondientes anticuerpos humanos. Por ltimo, hay
molculas humanas, como los aloantgenos del complejo principal de histocompatibilidad y los
antgenos del sistema sanguneo Rh, que no son distinguidos apropiadamente por el sistema
inmune de los roedores y, en consecuencia, no es posible producir AcMo de utilidad prctica, con
especificidad, por estos antgenos. De esta manera, una de las razones ms importantes que ha
impulsado el desarrollo de los AcMo de segunda generacin es precisamente esta imposibilidad de
utilizar Ac de roedores en humanos con fines profilcticos o teraputicos.
ANTICUERPOS MONOCLONALES
Un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo homogneo producido por una clula
hbrida producto de la fusin de un clon de linfocitos B descendiente de una sola y
nica clula madre y una clula plasmtica tumoral.
Los anticuerpos monoclonales (en acrnimo mAB, de la frase en ingls con idntico
significado que en espaol: monoclonal antibody), son anticuerpos idnticos porque
son producidos por un solo tipo de clula del sistema inmune, es decir, todos los
clones proceden de una sola clula madre. Es posible producir anticuerpos
monoclonales que se unan especficamente con cualquier molcula con carcter
antignico. Este fenmeno es de gran utilidad en bioqumica, biologa
molecular y medicina.



PRODUCCIN DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES
Si una sustancia extraa (antgeno) se inyecta en el cuerpo de un ratn o un humano,
alguna de las clulas B de su sistema inmune se transformar en clulas
plasmticas y empezarn a producir anticuerpos que se unirn a ese antgeno. Cada
clula B produce un solo tipo de anticuerpo, pero diferentes linfocitos B producirn
anticuerpos estructuralmente diferentes que se unen a distintas partes del antgeno.
Esta mezcla fisiolgica natural de anticuerpos es conocida como Antisuero policlonal.
Para producir anticuerpos monoclonales, primero se extraen clulas B del bazo de
un animal que ha sido expuesto al antgeno. Estas clulas B son fusionadas en
presencia de PEG (polietilenglicol) con clulas tumorales de mieloma mltiple (un tipo
de cncer) que pueden crecer indefinidamente en cultivo celular. Esta fusin hace a
las membranas celulares ms permeables. Estas clulas fusionadas hbridas,
llamadas hibridomas pueden multiplicarse rpida e indefinidamente, puesto que son
clulas tumorales despus de todo y pueden producir gran cantidad de anticuerpos.
Los hibridomas son suficientemente diluidos y cultivados para obtener un nmero
diferente de determinadas colonias, las cuales producen slo un tipo de anticuerpo.
Los anticuerpos de diferentes colonias son analizados para conocer su capacidad de
unirse a un antgeno determinado, por ejemplo con un tipo de test llamado ELISA, y
para seleccionarse y aislarse de la manera ms efectiva.
El proceso de produccin de anticuerpos monoclonales es complejo. Primero se
disgrega el bazo del ratn inmunizado, donde se acumulan los linfocitos B que tienen
una escasa viabilidad en cultivo, y se fusionan con clulas de mieloma deficientes en
enzimas implicados en la sntesis del nuevo ADN como la timidina quinasa (TK) o
la hipoxantina guanina fosforibosil transferasa(HGPRT). Los productos de la fusin
celular (hibridomas) son cultivados en medio HAT (de hipoxantina, aminopterina y
timidina) donde las clulas mielmicas son eliminadas. Solamente pueden crecer en
el medio de cultivo HAT las clulas que son producto de la fusin entre un linfocito y
una clula de mieloma. Las clulas hbridas obtenidas tras el proceso de fusin
contienen un nmero elevado de cromosomas (72 del mieloma y 40 del linfocito B)
que en las sucesivas divisiones celulares se irn perdiendo hasta oscilar entre los 70 y
los 80 cromosomas. Como consecuencia de dicho proceso, algunas clulas pierden la
capacidad de secrecin de anticuerpos o bien funciones bsicas para la viabilidad
celular. Por ello tan pronto como se identifica como positivo un pocillo se somete a un
proceso de clonacin para evitar el crecimiento de clulas no productoras que al
ser metablicamente ms eficientes acabaran por dominar el cultivo.
Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos en cultivos celulares o en
animales. Cuando las clulas de un hibridoma son inyectadas en cultivos de tejidos
como el peritoneo (cavidad peritoneal), produce tumores que sintetizan un fluido rico
en anticuerpos llamado lquido asctico.
Se conoce la tecnologa necesaria para la produccin de anticuerpos en ausencia de
inmunizacin del animal. Es la denominada tecnologa de los anticuerpos
recombinantes. Los avances en la tecnologa gnica han facilitado en gran medida la
manipulacin gentica, produccin, identificacin y conjugacin de fragmentos de
anticuerpos recombinantes, obtenindose nuevos anticuerpos multivalentes y
multiespecficos.
Estas tecnologas han permitido desarrollar estrategias de screening de anticuerpos
monoclonales fuera del cuerpo humano. Para ello es necesario disponer, en primer
lugar de enormes libreras de genes de anticuerpos, habitualmente mediante
amplificacin PCR de cADN de linfocitos, o, alternativamente, mediante sntesis in
vitro de genes usando cebadores randomizados ("randomized wobble"). El mtodo de
'screening' de estas libreras debe tener una eficiencia comparable a la del sistema
inmune, lo que se puede conseguir exponiendo en la superficie de microorganismos
los anticuerpos producidos. Ejemplos de los microorganismos empleados son los
fagos filamentosos como M13 o bacterias. Esta presentacin en superficie permite
establecer un enlace fsico entre la funcin de unin al antgeno y el gen del
anticuerpo, de forma que la afinidad al antgeno permite aislar el microorganismo
portador del gen del anticuerpo de inters entre millones de otros. Una vez aislado el
clon especfico se amplifica para la produccin del anticuerpo de inters por ejemplo
en E. coli.




DESCUBRIMIENTO DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES
Los investigadores Niels K. Jerne, Georges Khler y Cesar Milstein, describieron la
tcnica que permita el cultivo de hibridomas o clulas hbridas de linfocitos B con
clulas plasmticas tumorales de mieloma mltiple. Con esta fusin de dos clulas,
una programada para producir un anticuerpo especfico pero que no se multiplica
indefinidamente (linfocito) y otra inmortal con gran capacidad de crecimiento pero que
no produce inmunoglobulina (clula de mieloma), se combina la informacin gentica
necesaria para la sntesis del anticuerpo deseado y una capacidad de sntesis
proteica, permitiendo su multiplicacin indefinida tanto in vitro como in vivo. Por esta
aportacin a la ciencia Jerne, Klher y Milstein recibieron el premio Nobel de Medicina
en 1984.
En el ao 2010, los anticuerpos monoclonales han cumplido 30 aos desde su
invencin dejando de ser una curiosidad biolgica para ser una forma de tratamiento y
diagnstico muy importante en diversas enfermedades. Existen ms de 17
anticuerpos monoclonales aprobados por la FDA, pero el nmero de anticuerpos
monoclonales en fase de ensayo clnico es elevado y representan un 30 por ciento de
todos los compuestos en investigacin en el 2005. Muy importante para tratamientos
de distintas enfermedades como artritis reumatoide, distintos canceres, enfermedad
de Crohn.
APLICACIONES DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES
Una vez que se han producido anticuerpos monoclonales que se unen a determinadas
sustancias, estos pueden ser usados para detectar la presencia y cantidad de esta
sustancia, gracias a la prueba de Western blot, que detecta una sustancia en una
solucin o con una prueba de inmunofluorescencia, que detecta una sustancia en una
clula entera. Los anticuerpos monoclonales tambin son usados para purificar una
sustancia con tcnicas llamadas inmunoprecipitacin y cromatografa.
Los anticuerpos monoclonales muestran una serie de ventajas sobre los anticuerpos
policlonales como:
1. Mayor homogeneidad.
2. Reproductibilidad de sus efectos, como consecuencia de su homogeneidad.
3. Mayor capacidad potencial de seleccionar los mejores anticuerpos en afinidad, tipo de
reconocimiento.
Los anticuerpos monoclonales se utilizan en muchos campos como:
La investigacin biomdica, como la identificacin y clonacin de genes, la
identificacin y aislamiento de protenas, la activacin de enzimas, conocimiento de la
estructura molecular y morfognesis.
Diagnstico: En medicina, gracias a la gran especificidad y capacidad prcticamente
ilimitada de los anticuerpos monoclonales para reconocer cualquier estructura
qumica, permite la deteccin de hormonas, vitaminas, citocinas; la monitorizacin de
drogas, deteccin de enfermedades infecciosas en microbiologa; la deteccin de
alergenos en alergia, hematologa,marcadores tumorales e infartos de miocardio,
aplicaciones forenses, inmunoescintografa. En las tnicas diagnsticas se emplean
diversas herramientas de biologa molecular como ELISA,
EIA, citometra, inmunohistoqumica, inmunofluorescencia. Los anticuerpos
monoclonales son unas de las sustancias ms utilizadas en los laboratorios de
diagnstico.
Catlisis: Los anticuerpos monoclonales se han utilizado como catalizadores de
mltiples reacciones qumicas.
Biosensores: Los anticuerpos monoclonales acoplados a transductores electrnicos
pueden detectar tanto molculas orgnicas como inorgnicas como
la contaminacin de metales pesados en alimentos y agua, deteccin de gases
txicos, etc. Un biosensor es un instrumento analtico formado por un material
biolgico inmovilizado como una enzima, anticuerpo, clula entera, orgnulo o
combinaciones de los mismos, en ntimo contacto con un sistema transductor
adecuado que convierta la seal bioqumica en una seal elctrica cuantificable.
Tratamiento: Las aplicaciones teraputicas constituyen el campo ms importante de
los anticuerpos monoclonales, ya que son capaces de destruir clulas, incluidas las
tumorales, mediante distintos mecanismos. Se emplean en el tratamiento de
diversas enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide, el cncer o para
evitar el rechazo tras un trasplante. Existen varios anticuerpos monoclonales
aprobados para su uso en determinadas enfermedades.
ANTICUERPOS MONOCLONALES QUIMRICOS Y HUMANIZADOS
Los anticuerpos monoclonales de ratn o murinos, pese a ser perfectamente vlidos
para todos los usos teraputicos, no son tiles para su empleo en seres humanos,
especialmente en terapias que requieran tratamientos prolongados, ya que el sistema
inmune los identifica como cuerpos extraos y reacciona para destruirlos, por lo que
su eficacia teraputica se ve claramente disminuida. Adems pueden presentar
posibles efectos secundarios como nefrotoxicidad, reacciones anafilcticas, etc. Por
ello se debera obtener anticuerpos monoclonales humanos.
Se han desarrollado diferentes tcnicas para ofrecer soluciones a la inicial
imposibilidad de obtener anticuerpos monoclonales enteramente humanos, entre las
que destacan la transformacin de linfocitos B humanos en cultivo mediante el virus
de Epstein-Barr, la utilizacin de ratones con inmunodeficiencia severa combinada, el
uso de ratones transgnicos, o tcnicas de ADN recombinante. Todas estas tcnicas
han presentado distintos inconvenientes que han imposibilitado el desarrollo final de
los anticuerpos monoclonales humanos.
Sin embargo, se ha obtenido una segunda generacin de anticuerpos monoclonales,
basada en la humanizacin de los anticuerpos monoclonales de ratn
mediante ingeniera gentica, evitando as el rechazo del sistema inmune al ser
introducidos en el organismo. Son los llamados anticuerpos quimricos. Un
anticuerpo quimrico es creado de tal manera que incorpora parte animal y parte
humana. La parte animal o hipervariable (un 30%) es indispensable para que el
anticuerpo reconozca la sustancia extraa (antgeno) y la parte humana (un 70%) es
responsable de que el sistema inmunitario pueda contribuir a aadir efectividad a su
accin. De este modo es posible modificar los anticuerpos monoclonales, casi de
manera infinita para dotarlos de propiedades efectoras y de reconocimiento diferentes
a las originales y minimizar la posibilidad de generar respuesta inmune frente al propio
anticuerpo teraputico.
Un anticuerpo monoclonal humanizado significa que contiene un 90% de material
humano, lo que reduce la inmunogenicidad de los anticuerpos, es decir, el rechazo del
sistema inmunitario. Lahumanizacin es una tcnica que se basa en la estructura
terciaria del sitio de combinacin con el antgeno, el paratopo, donde existen unas
regiones responsables de la unin al antgeno mientras que otras zonas slo sirven de
soporte estructural al paratopo. Por lo tanto las regiones estructurales se obtienen de
un anticuerpo humano mientras que las regiones responsables de la unin al antgeno
proceden del anticuerpo del ratn.