1-Fund Teorico Practicos Inmunoh Serie Roja

01/11/2011
Dr. Silvio Rosell

Actualizacin en Inmunohematologa
Fundacin Hemocentro Buenos Aires
Noviembre 2011
El estudio de los antgenos y anticuerpos
presentes en la sangre, tanto en
condiciones normales como patolgicas
Es el estudio de los marcadores antignicos
propios de los glbulos rojos, plaquetas y
leucocitos, como as tambin de las respuestas
inmunolgicas que estos provocan
Slo los antgenos de los sistemas RH, KELL
MNS y LW, son especficos de la lnea
eritroide
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
La aglutinacin es la agregacin,
mediada por anticuerpos, de las
partculas que expresan antgenos
de superficie.
Tiene dos etapas
1. Sensibilizacin
2. Formacin de puentes entre las
clulas sensibilizadas.

La hemlisis es la destruccin de los glbulos
rojos, con liberacin de la hemoglobina
intracelular
La hemlisis no ocurre si los antgenos interactan
con los anticuerpos en sueros sin complemento o
plasma con anticoagulante
La hemlisis constituye un resultado positivo
Algunos antgenos de grupo sanguneo estn
presentes en formas solubles en saliva, orina y
plasma
Estas sustancias pueden utilizarse para inhibir la
reactividad de los anticuerpos correspondientes
La inhibicin tambin permite neutralizar
anticuerpos que enmascaran la presencia de otros
no neutralizables
El grado de ionizacin de
las molculas
Depende
fundamentalmente del pH
del medio
Constante de equilibrio
(afinidad de los
anticuerpos)
Deriva de las tasas relativas
de asociacin y disociacin
La inhibicin de la aglutinacin por exceso de
anticuerpos es sumamente infrecuente
La centrifugacin promueve el acercamiento
fsico de las clulas
La prueba antiglobulnica indirecta emplea
suero antiglobulnico
Otros mtodos actan:
reduciendo la carga negativa de las molculas
superficiales
disminuyendo la capa de hidratacin que rodea a las
clulas
introduciendo macro molculas con carga positiva
que las agregan
Albmina Humana
LISS (Low ionic saline solution)
PEG (Polietilenglicol)
POLYBRENE (BHDM)
Tcnicas con enzimas proteolticas

Disminuye el potencial Z, favoreciendo la 2 fase
de la aglutinacin.
En concentraciones de 30% o >favorece la
aparicin de rouleaux
En la PCI no aumenta la sensibilidad de la prueba
Por falta de ventajas objetivas est en desuso

Ante estos polmeros los GR normales exhiben
agregacin espontnea, que puede dispersarse con
sales neutras como el citrato de sodio

El BHDM es un polcatin de amonio cuaternario
que neutraliza las cargas negativas de los GR.

Favorecen la aglutinacin por Ig G
El Polybrene se aade a los GR incubados con
anticuerpos a baja potencia inica y bajo pH
Si se adiciona citrato de sodio, se restablece la
carga del GR
Si el aglutinado se disocia
prueba negativa
Si el aglutinado persiste
prueba positiva (aglutinacin irreversible a los GR
sensibilizados con Acs)
Tiene sensibilidad disminuida en la deteccin de
anticuerpos del sistema Kell

El PEG es un polmero lineal hidrosoluble que se
usa como aditivo para incrementar la captacin de
anticuerpos
Su accin principal es eliminar el agua
intercelular favoreciendo el acercamiento de los
GR
No debe centrifugarse el PEG con el suero y GR
Se lavan las clulas con solucin salina y luego se
efecta la prueba antiglobulnica
El reactivo AGH de eleccin en las
pruebas con PEG suele ser el anti-IgG
evita las reacciones falsas positivas con
algunos agentes poliespecficos
Precipitados podran interpretarse como
reacciones positivas
Potenciador de eleccin para la absorcin
de Ac calientes

Potencia mucho la captacin eritrocitaria de
anticuerpos en la fase I de la aglutinacin
La cantidad de iones +/- del LISS (0,03 M) es menor al
de la SF (0.17M)
En la actualidad la mayora de los profesionales
usa diluyentes o aditivos LISS
Contiene macromolculas adems de sales inicas
y amortiguadores
Puede aumentar hasta 1000 veces la afinidad
entre Ags y Acs
El aumento del volumen de suero acrecienta la
potencia inica del sistema LISS aditivo
Se deben respetar estrictamente las
instrucciones del fabricante

Ventajas:
Aumenta la sensibilidad
de la PCI para detectar
Acs clnicamente
significativos
Detecta Acs en baja
concentracin y los de
baja afinidad que
pueden perderse con los
lavados
Reduce el tiempo de
incubacin
Desventajas:
Debe ser sometido a
estricto control de
osmolaridad para evitar la
fijacin inespecfica de C
Los GR suspendidos el
LISS deben ser procesados
dentro de las 24 hs
Menor sensibilidad para
anti-K. (1 fase de
aglutinacin)

Bromelina, ficina, papana y tripsina
(Las ms usadas)
Desnaturalizan ciertos antgenos eritrocitarios, en
especial M, N, S, Fy
a
y Fy
b,
X
G
Disminuyen la carga superficial de los GR por
clivaje de las molculas de cido silico de las
cadenas polisacridas
El tratamiento enzimtico lleva a la formacin de
espculas en los GR y aumenta as el nmero
potencial de puntos de contacto
Adherencia eritrocitaria
en fase slida
(Microplacas)

Aglutinacin en columna,
pruebas en gel y
separacin por afinidad

Qimioluminiscencia

Pruebas Inmunoabsorbentes
ligadas a las enzimas (ELISA)

Inmunofluorescencia

Inmovilizacin de Antgenos
Eritrocitarios con Anticuerpos
Monoclonales Especficos
(IAEAM)

Radioinmunoensayo
Las reacciones se producen en
microcolumnas que contienen
mezclas de cuentas de vidrio
o gel, amortiguadores y a
veces reactivos
Se establecen barreras de
densidad permiten separar el
suero problema de los
eritrocitos
Una de sus ventajas es que se
evita el lavado con solucin
salina
F
e
n
o
t
i
p
i
f
i
c
a
c
i
n

Existen mtodos manuales, semiautomatizados y
automatizados
Utilizan antgenos o anticuerpos inmovilizados
En la prueba indirecta si las clulas indicadoras se
adhieren a las paredes de la cubeta, la reaccin es
positiva
Si sedimentan no se produjo reaccin Ag-Ac
Ditiotreitol (DTT)
2-Mercaptoetanol (2-ME)
2-Aminoetilisotiouronio (AET)
Mecanismo de accin
Clivan los puentes disulfuro que unen las
subunidades monomricas de los pentmeros de IgM
(19S en 7S)
Los puentes intercatenarios de las IgG monomricas
son bastante resistentes al clivaje
Determinacin de la clase de inmunoglobulina de
los Acs
Identificacin de las especificidades en mezclas de
Acs, IgM e IgG (desenmascarar)
Determinacin del monto relativo de IgG e IgM en
una especificidad dada
Disociacin de aglutinatos eritrocitarios por IgM
(crioglobulinas)

Destruccin de antgenos eritrocitarios
seleccionados para investigacin de Acs
(Kell, Dombrock, Cartwright, Gerbich y LW)
Combinacin con enzimas proteolticas, para
disociar los Acs IgG de GR (ZZAP)
DTT + Papana activada con cistena
La cistena forma puentes disulfuro que contribuyen al
plegamiento de las protenas

Principios
El tratamiento de los Acs IgM, anula las
actividades aglutinante y fijadora de
complemento
La visualizacin de la actividad de los Acs antes y
despus del tratamiento con sulfhidrilos es til
para determinar la clase de inmunoglobulina
El tratamiento con sulfhidrilos tambin se emplea
para abolir la actividad de los anticuerpos IgM y
permitir la deteccin de IgG coexistentes
Preparacin
Diluir 0,154 g de DTT en 100 ml de PBS a pH 7,3
Conservacin
2 a 6 C
Los reactivos sulfhidrilos en baja concentracin
debilitaran los Ag del sistema Kell
Pudiera observarse gelificacin de la muestra
Causas
Preparacin incorrecta del DTT o concentracin superior a
0,01 M.
Incubacin de suero y DTT prolongada
Las muestras gelificadas no pueden estudiarse
Para los procedimientos de adsorcin no existe
un procedimiento nico ideal
Para incrementar la captacin de anticuerpos
puede aumentarse la proporcin de antgenos
utilizando un volumen celular mayor
La temperatura de incubacin debe ser la de
reactividad ptima de los anticuerpos
Las pruebas de adsorcin requieren un
volumen importante de GR
Los eritrocitos testigos de los paneles
comerciales resultan insuficientes
las fuentes mas convenientes pueden ser unidades
donadas o muestras de sangre del personal de los
fenotipos deseados
Las tcnicas de elucin liberan las molculas de
Acs de los GR sensibilizados
Los Acs fijados pueden liberarse:
por modificacin de la termodinmica de las reacciones
Ag-Ac
neutralizacin o reversin de las fuerzas de atraccin
que mantienen unidos a los complejos
alteracin de la concordancia estructural entre los Ag y
los puntos de fijacin en las molculas de Acs
Las tcnicas de elucin pueden servir para:
Investigar una PAD positiva
Concentrar y purificar Acs, detectar Ag de expresin
dbil e identificar especificidades mltiples (junto a
adsorcin)
Preparar GR sin Acs para fenotipificacin o estudios de
adsorcin autlogos.
Si el eluato reacciona con todas las clulas
Alta probabilidad de que se deba a autoanticuerpos
Si el paciente no fue transfundido en fecha
reciente y no existen Acs sricos inesperados no
se requieren estudios serolgicos adicionales
Calor (56C)
Calor suave (45C)
Congelacin-descongelacin
Fro-cido
Digitonina-cido
Diclorometano (DCM)
Glicina-HCl / EDTA
CLOROFORMO
XILENO
ETER

Ventajas

Adecuado para EHRN
por incompatibilidad
ABO
Rpido y fcil

Desventajas

Recuperacin escasa
de otros auto y
aloanticuerpos de
grupo sanguneo
Ventajas
Adecuado para EHRN
por incompatibilidad
ABO
Rpido y fcil
Requiere un volumen
celular reducido
Desventajas
Recuperacin escasa
de otros auto y
aloanticuerpos de
grupo sanguneo

Ventajas
Rpido y fcil
Sensibilidad
comparable a
digitonina-cido
Desventajas
Menos sensible para
auto y aloanticuerpos
reactivos en caliente

Ventajas
Adecuado para anti-K
No inflamable
Desventajas
Txico
Recuperacin escasa
de anti-Fy
b

Ventajas
Mtodo de accin
rpida
Lquido no inflamable
Recuperacin de la
mayora de los
anticuerpos
significativos
Desventajas
Sustancia reconocida
como carcinognica
Altamente txico
Efecto narctico
inhalatorio

Ventajas
Buena recuperacin
de la mayora de los
Acs significativos
Desventajas
Carcinognico
Txico
Narctico
Provoca hemlisis

Ventajas
Excelente
recuperacin de la
mayora de los Acs de
grupo sanguneos
Desventajas
Narctico
Txico
Explosivo
Muy inflamable
Poca recuperacin de
anti-S-s

Ventajas
No peligroso
Recuperacin
adecuada de la
mayora de los Acs
significativos
Kit comercial
Desventajas
El lavado del estroma
es lento
Baja sensibilidad
sistema Kidd

Ventajas
Apropiado para preparar
eluatos y obtener clulas
PAD negativas
No destruye las clulas
tratadas
Sensibilidad comparable a
digitonina-cido
Desventajas
Desnaturaliza los
Ag del sistema Kell

Los GR con PAD positiva no pueden tipificarse
con reactivos que requieran una tcnica de
AGH
En condiciones controladas, el difosfato de
cloroquina disocia la IgG de la membrana de
los GR sin afectar su integridad.
Esto permite la fenotipificacin completa de los
GR recubiertos con autoanticuerpos reactivos
en caliente
Solucin de difosfato de cloroquina
preparada disolviendo 20 g en 100 ml de SF
Ajustar el pH a 5,1 con OH-Na 1 N
Conservacin
2 a 6 C
Se necesitan GR de control portadores de una
dosis simple de los antgenos a fenotipificar
Se utiliza reactivo anti-IgG monoespecfico
No disocia el complemento de la membrana
celular
Incubacin no > de 2 hs.
causa hemlisis y/o prdida de reactividad antignica
Los Ag del sistema Rh podran experimentar
cierta desnaturalizacin.
Pudieran no eliminarse por completo los Acs de
los GR sensibilizados
slo atenuar la intensidad de la PAD
La cloroquina atena la expresin de Ag HLA
de Clase I eritrocitarios
Principios
Es un mtodo semicuantitativo que se emplea
para determinar la concentracin de Acs en
muestras de suero o comparar la intensidad de
la expresin antignica en distintas muestras de
GR
Aplicaciones
Estimar actividad de Acs en embarazadas
alosensibilizadas
Definir la especificidad relativa de los
autoanticuerpos
Caracterizar Acs de ttulo alto baja avidez (TABA)
Ejemplo
Knops y Chido-Rodgers, Csa y JMH
Observar el efecto de los reactivos sulfhidrilo sobre
el comportamiento de los Acs (IgG o IgM)
Monitoreo de IgG en embarazadas
Interpretacin
Observar la mayor dilucin que produce
aglutinacin 1+
El ttulo es la inversa de la dilucin
Si se advierte aglutinacin en el tubo que contiene
el suero mas diluido no se alcanz el punto final
En los estudios comparativos la diferencia
significativa en los ttulos es de 3 diluciones
Los ttulos solos sin la evaluacin adicional de la
intensidad de la aglutinacin pueden ser
engaosos
Por ser un mtodo semicuantitavo la variabilidad
tcnica puede desviar los resultados

Score de Mars
Asignar un valor numrico a la intensidad de la
aglutinacin
4 + = 12
3 + = 10
2 + = 8
1 + = 5
La suma correspondiente a todos los tubos representa el
score
El umbral significativo arbitrario para comparar los
puntajes es de 10 ms

Claves Tcnicas
Calidad de las pipetas y su utilizacin
Respetar tiempo y temperatura de incubacin
Duracin y potencia de centrifugacin
La antigedad, el fenotipo y la concentracin de las
clulas influyen en los resultados
Es casi imposible lograr resultados reproducibles
en su totalidad
Las comparaciones son vlidas con anlisis
simultneos
Se disminuye la variabilidad con la utilizacin de
mayores volmenes
Nomenclatura
SISTEMA GENES ANTIGENOS FENOTIPOS
MNS M N S s M N S s M+ N+ S-s+

Duffy FYa FYb Fy
a
y Fy
b
Fy (a+b-)Fy (a+b+)Fy (a-b+)Fy (a-b-)

Kell K k Kp
a
Js
a
K k Kp
a
Js
a
K+k+ Kp(a+b-) Js (a+b-)

Kidd Jk
a
Jk
b

Jk
a
Jk
b

Jk (a+b+)
Referentes histricos:
Issit, Daniels, Garratty, Pineda
Hibridomas
La fusin de clulas
plasmticas normales,
productoras de anticuerpos,
con clulas plasmticas
neoplsicas permite obtener
lneas celulares con capacidad
reproductiva infinita.
Una clula B estimulada da origen a una
progenie clonal que produce Acs especficos
para un eptopo
El sobrenadante del cultivo de un clon de clulas
B contiene Acs de especificidad nica
Los eventos posteriores a la activacin pueden inducir
diferencias en el isotipo de las cadenas pesadas
la especificidad idiotpica codificada en las regiones
variables de las cadenas pesadas y livianas no se
modifica
Siempre comenzar por verificar la existencia de
antecedentes transfusionales recientes

Puede tratarse de:
Autoanticuerpos reactivos en fro
Autoanticuerpos reactivos en caliente
Macroscpica
BI
Haptoglobina
LDH
Hemoglobina libre en
plasma y orina
Si no hay clnica ni
laboratorio de
hemlisis no se
justifican estudios
adicionales
La reactividad de la mayora de los
autoanticuerpos reactivos en caliente aumenta
con el uso de PEG y enzimas
Es conveniente realizar la DAI sin los medios
potenciadores habituales
Si los resultados son negativos puede emplearse
el mismo procedimiento para la prueba de
compatibilidad sin necesidad de adsorciones
Si el autocontrol es positivo en la fase AGH, podra
haber clulas recubiertas con Acs que determinan
una PAD positiva con campo mixto
La elucin podra ser til en especial cuando las pruebas
sricas no son concluyentes
En el paciente con PAD positiva transfundido en
fecha reciente o no, podra ser difcil obtener el
fenotipo exacto de los GR
Muchos reactivos monoclonales pueden proporcionar
resultados vlidos a pesar de la PAD positiva

En nuestro pas, adems de los
laboratorios de investigacin y los que
realizan pruebas de compatibilidad para
transplantes de mdula sea y rganos
slidos, los bancos de sangre estn
realizando en forma rutinaria pruebas de
biologa molecular con amplificacin de
cidos nucleicos
01/11/2011 Dr. Silvio R. Rosell
4
6
5
7
2
1
3
4
6
2
1
7
7
9
9
1
5
9
4
12p12.3
6p21.3
A, B, AB, A
1
6
3
Sistemas antignicos eritrocitarios
01/11/2011 Dr. Silvio R. Rosell
Thermophilus aquaticus, es una bacteria termfila
que vive en la proximidad de las fuentes de agua
caliente
Vive a temperaturas comprendidas entre 50 y 80 C,
debido a que su cctel enzimtico resiste tales
condiciones
Normalmente, a esas temperaturas, las protenas
constitutivas de la mayora de los seres vivos se
desnaturalizan y no vuelven a ser funcionales
En la PCR se separan las cadenas de la
doble hlice del ADN mediante
desnaturalizacin trmica
Taq DNA Polimerasa
Una enzima de restriccin (o endonucleasas de
restriccin) es aquella que puede reconocer
una secuencia caracterstica de nucletidos
dentro de una molcula de ADN y cortar el
ADN en ese punto
El mecanismo de corte de DNA se realiza a travs de
la ruptura de dos enlaces fosfodister en la doble
hebra
Un fluorocromo, es un componente de una
molcula que hace que sta sea fluorescente
Un grupo funcional de la molcula absorber energa
de una longitud de onda especfica y la volver a
emitir en otra determinada de mayor longitud de onda
La hibridacin de cidos nucleicos (ADN
ARN) es un proceso por el cual se combinan
dos cadenas de cidos nucleicos antiparalelas
y con secuencia de bases complementarias
Se requieren oligonucletidos alelo esoecficos
complementarios a la secuencia a analizar
Gracias por vuestra amable atencin
01/11/2011
Dr. Silvio Rosell
medicinatransfusional@hotmail.com

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