Fundamento terico: Se determinarn los parmetros cinticos (velocidad mxima (V) y constante de Michaelis (K M )) de la enzima -glucosidasa de Penicillium purpurogenum. Para ello se determinar la actividad especfica de la enzima a concentraciones crecientes de sustrato, que van desde 0 a 4 mM. Para determinar la actividad especfica se utilizar el sustrato artificial p-nitrofenil -D- glucopiransido (pNPGlu) que por accin de la -glucosidasa libera p-nitrofenol, el cual se cuantifica a 405 nm en el espectrofotmetro.
Figura N 1: A la izquierda se ve una representacin esquemtica del p-nitrofenil -D-glucopiransido y a la derecha se muestra el sitio de corte de la -glucosidasa y la liberacin de p-nitrofenol.
Con las concentraciones crecientes de sustrato y la respectiva actividad especfica se realizar la grfica de saturacin.
Figura N 2: Grfica que representa la curva de saturacin de una enzima.
Objetivos:
a) Preparar una curva estndar de p-nitrofenol en condiciones que permita determinar posteriormente la actividad de la -glucosidasa. b) Determinar los parmetros cinticos de la -glucosidasa de P. purpurogenum.
Materiales:
Micropipetas p1000, p200, p100, p20 y p10. Puntas azules, amarillas y blancas. Gradilla y flotadores para tubos eppendorf. Tubos eppendorf de 1,5 ml y lpiz marcador. Amortiguador citrato y carbonato de sodio. p-Nitrofenol (pNP), HCl y NaOH. p-nitrofenil -D-glucopiransido (pNPGlu). Balanza, agitador magntico y pHmetro. 3 Vasos precipitados de 100ml. 3 probetas de 100 ml. magneto, caa y esptula. agua destilada. Bao termoregulado a 30C o estufa a esa temperatura.
Averige previo al laboratorio:
-Valor de parmetros cinticos de la enzima en estudio (Hidalgo, M., Steiner, J. y Eyzaguirre, J. (1992) -glucosidase from Penicillium purpurogenum: Purification and Properties. Biotechnology and Applied Biochemistry. 15: 185-191).
Experimentos:
a) Preparacin de la curva standard de p-nitrofenol
Prepare 70 ml de amortiguador citrato 50 mM pH 4,0 (P.M: 210,14). Prepare 50 ml una solucin de Na 2 CO 3 0,2 M (P.M: 105,99). Prepare 25 ml de solucin stock 10 mM de pNP (P.M: 139,11) en amortiguador citrato 50 mM pH 4,0 y prepare 10 ml de solucin 200 M de pNP en amortiguador citrato 50 mM pH 4,0. Prepare 16 tubos eppendorf, a los cuales debe adicionar el pNP y el amortiguador citrato 50 mM pH 4,0 (Tabla I). Mezcle suavemente Incube los tubos por 10 minutos a 30C. Detenga la reaccin con 450 l de Na 2 CO 3.
Mida la absorbancia a 405 nm. (recuerde hacer blanco cuando mida 0 M de pNP). Complete los datos que faltan en la Tabla I y trace la curva St de pNP. Ingrese la tabla y el grfico en su cuaderno. NO ELIMINE el amortiguador citrato 50 mM pH 4,0 PORQUE SERA UTILIZADO EN EL PROXIMO PRACTICO.
Tabla I
Concentracin de pNP (M) l de pNP 200 M l de buffer 50 mM citrato pH 4,0 l de Na 2 CO 3
b) Determinacin de parmetros cinticos de la -glucosidasa.
Prepare 1 ml de p-nitrofenil -D-glucopiransido (pNPGlu) 10 mM. Para ello hay que disolver 0,003 g de pNPGlu (P.M: 301,3) en 1 ml de amortiguador citrato 50 mM pH 4,0. Complete los datos de la columna l de buffer en la Tabla II, considerando que el volumen final de la reaccin es de 1 ml. Prepare una serie de tubos eppendorf con las soluciones sealadas en la Tabla II. Posteriormente adicione 10 l de enzima (-glucosidasa) a cada tubo. Mezcle suavemente e incube los tubos por 10 minutos a 30C. Detenga la reaccin con 450 l de Na 2 CO 3
Mida la absorbancia a 405 nm y anote los resultados en la Tabla II. Interpole los valores obtenidos en la curva estandard que prepar en el Laboratorio anterior y estime los valores de concentracin de p-nitrofenol liberados. Pregunte al Ayudante la concentracin de protena de la solucin enzimtica, para poder determinar la actividad especfica. Complete los datos que faltan en la Tabla II y trace la curva de saturacin. Ponga la tabla y la curva en su cuaderno.
Tabla II
Concentracin de pNPGlu mM l de pNPGlu del stock 10 mM l de buffer l de enzima l de Na 2 CO 3