Bio 369

Laboratrio de Anlisis Instrumental.

Experimento N 2

Cintica enzimtica

Fundamento terico:
Se determinarn los parmetros cinticos (velocidad mxima (V) y constante de
Michaelis (K
M
)) de la enzima -glucosidasa de Penicillium purpurogenum. Para ello se
determinar la actividad especfica de la enzima a concentraciones crecientes de sustrato,
que van desde 0 a 4 mM.
Para determinar la actividad especfica se utilizar el sustrato artificial p-nitrofenil -D-
glucopiransido (pNPGlu) que por accin de la -glucosidasa libera p-nitrofenol, el cual
se cuantifica a 405 nm en el espectrofotmetro.




Figura N 1: A la izquierda se ve una representacin esquemtica del p-nitrofenil -D-glucopiransido y a
la derecha se muestra el sitio de corte de la -glucosidasa y la liberacin de p-nitrofenol.


Con las concentraciones crecientes de sustrato y la respectiva actividad especfica se
realizar la grfica de saturacin.




Figura N 2: Grfica que representa la curva de saturacin de una enzima.



Objetivos:

a) Preparar una curva estndar de p-nitrofenol en condiciones que permita
determinar posteriormente la actividad de la -glucosidasa.
b) Determinar los parmetros cinticos de la -glucosidasa de P. purpurogenum.


Materiales:

Micropipetas p1000, p200, p100, p20 y p10.
Puntas azules, amarillas y blancas.
Gradilla y flotadores para tubos eppendorf.
Tubos eppendorf de 1,5 ml y lpiz marcador.
Amortiguador citrato y carbonato de sodio.
p-Nitrofenol (pNP), HCl y NaOH.
p-nitrofenil -D-glucopiransido (pNPGlu).
Balanza, agitador magntico y pHmetro.
3 Vasos precipitados de 100ml.
3 probetas de 100 ml.
magneto, caa y esptula.
agua destilada.
Bao termoregulado a 30C o estufa a esa temperatura.


Averige previo al laboratorio:

-Valor de parmetros cinticos de la enzima en estudio (Hidalgo, M., Steiner, J. y Eyzaguirre,
J. (1992) -glucosidase from Penicillium purpurogenum: Purification and Properties. Biotechnology
and Applied Biochemistry. 15: 185-191).


Experimentos:

a) Preparacin de la curva standard de p-nitrofenol

Prepare 70 ml de amortiguador citrato 50 mM pH 4,0 (P.M: 210,14).
Prepare 50 ml una solucin de Na
2
CO
3
0,2 M (P.M: 105,99).
Prepare 25 ml de solucin stock 10 mM de pNP (P.M: 139,11) en amortiguador citrato
50 mM pH 4,0 y prepare 10 ml de solucin 200 M de pNP en amortiguador citrato 50
mM pH 4,0.
Prepare 16 tubos eppendorf, a los cuales debe adicionar el pNP y el amortiguador citrato
50 mM pH 4,0 (Tabla I).
Mezcle suavemente
Incube los tubos por 10 minutos a 30C.
Detenga la reaccin con 450 l de Na
2
CO
3.

Mida la absorbancia a 405 nm. (recuerde hacer blanco cuando mida 0 M de pNP).
Complete los datos que faltan en la Tabla I y trace la curva St de pNP. Ingrese la tabla y
el grfico en su cuaderno.
NO ELIMINE el amortiguador citrato 50 mM pH 4,0 PORQUE SERA UTILIZADO EN
EL PROXIMO PRACTICO.


Tabla I

Concentracin
de pNP (M)
l de pNP 200
M
l de buffer
50 mM citrato pH 4,0
l de
Na
2
CO
3

Absorbancia
405 nm
0 0 550 450
10 50 500 450
15 75 475 450
20 100 450 450
25 125 425 450
30 150 400 450
35 175 375 450
40 200 350 450
45 225 325 450
50 250 300 450
55 275 275 450
60 300 250 450
65 325 225 450
70 350 200 450
75 375 175 450
80 400 150 450



b) Determinacin de parmetros cinticos de la -glucosidasa.

Prepare 1 ml de p-nitrofenil -D-glucopiransido (pNPGlu) 10 mM. Para ello hay que
disolver 0,003 g de pNPGlu (P.M: 301,3) en 1 ml de amortiguador citrato 50 mM pH
4,0.
Complete los datos de la columna l de buffer en la Tabla II, considerando que el
volumen final de la reaccin es de 1 ml.
Prepare una serie de tubos eppendorf con las soluciones sealadas en la Tabla II.
Posteriormente adicione 10 l de enzima (-glucosidasa) a cada tubo.
Mezcle suavemente e incube los tubos por 10 minutos a 30C.
Detenga la reaccin con 450 l de Na
2
CO
3

Mida la absorbancia a 405 nm y anote los resultados en la Tabla II.
Interpole los valores obtenidos en la curva estandard que prepar en el Laboratorio
anterior y estime los valores de concentracin de p-nitrofenol liberados.
Pregunte al Ayudante la concentracin de protena de la solucin enzimtica, para poder
determinar la actividad especfica.
Complete los datos que faltan en la Tabla II y trace la curva de saturacin. Ponga la tabla
y la curva en su cuaderno.

Tabla II

Concentracin
de pNPGlu
mM
l de
pNPGlu
del stock
10 mM
l de
buffer
l de
enzima
l de
Na
2
CO
3

Abs
405 nm
M p-NP U/mg
0 0 540 10 450
0,05 5 10 450
0,10 10 10 450
0,15 15 10 450
0,2 20 10 450
0,4 40 10 450
0,6 60 10 450
0,8 80 10 450
1 100 10 450
1,5 150 10 450
2,0 200 10 450
2,5 250 10 450
3,0 300 10 450
4,0 400 10 450

Informe de resultados:

-Utilizando los datos anteriores, haga el trazado de los dobles recprocos y est ime el K
M

y Vmx para pNPGlu de la enzima.
-Compare este valor con lo informado en la literatura.