ENSAYO DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS.

MATERIALES:

- Estufa a 200 C para despirogenizar
- Micropipetas de 1000, 500, 200 y 100 ul.
- Frascos y/o erlenmeyers de 250, 100 y 50 ml apirgenos.
- Tubos de ensayo con tapa de 10 x 75 mm apirgenos (Bio Whittaker Cd. N201)
- Tubos de ensayo de 20 x 120 mm apirgenos
- Bao Mara graduado a 37 C
- Agitador de tubos tipo Vortex
- Gradilla
- Papel aluminio
- Potencimetro o papel indicador de pH
- Gasa estril
- Alcohol etlico al 70 %

REACTIVOS:
- Reactivo Limulus amebocyte lisate (L.A.L.) =. 0.03, 0.06, 0.125 EU/ml
- Endotoxina de Escherichia. Coli
- Agua estril para inyeccin (apirgena)
- Agua L.A.L.
- Solucin de cido clorhdrico 0.1 N apirgena.
- Solucin de hidrxido de sodio 0.1 N apirgena.
- Solucin de hidrxido de sodio al 1%.

PROCEDIMIENTO.-

PREPARACIN DEL MATERIAL

Cuando se trata de un material a ser utilizado por primera vez, es necesario, colocarlo
en una solucin de NaOH al 1% aproximadamente por diez horas. Enjuagar el material
con agua bidestilada caliente (80 C), aproximadamente despus de cinco lavadas se
verifica el pH del agua de lavado el cual debe ser neutro.

PREPARACIN DE LAS SOLUCIONES:
Todos los reactivos y soluciones utilizados en este ensayo necesitan estar exentos de
pirgenos.

Solucin de HCl 0.1 N apirgena.-(para regular el pH de 6.0 7.5).

Diluir aspticamente en un frasco apirgeno 8.5 ml de HCl concentrado al 37 % para
1000 ml en agua destilada apirgena.

Esterilizar a 121 C por una hora y almacenar en refrigeracin.

CUIDADO: Adicione el cido al agua, nunca lo contrario.

Solucin de NaOH 0.1 N apirgena.- (para regular el pH de 6.0 7.5)

Disolver aspticamente en un frasco apirgeno, 4 g de NaOH puro en agua apirgena
y completar el volumen a 1000 ml

Esterilizar en autoclave a 121 C por una hora y almacenar en refrigeracin.
REACTIVO LIMULUS AMEBOCYTE LISATE (L.A.L.):

Reconstituir aspticamente el vial del reactivo L.A.L. con agua L.A.L usando una
micropipeta y punta estril, con el volumen apropiado segn lo que indica la etiqueta.

Cerrar con cuidado el vial con el tapn original para evitar contaminacin.

Girar muy suavemente el vial hasta completa disolucin del contenido.

NOTA: No agitar bruscamente ni en el agitador VORTEX puesto que el lisado se
degrada fcilmente.

Distribuir aspticamente todo el lisado en proporciones de 0.1 ml (100 l) en cada uno
de los tubos de ensayo apirgenos de 10 x 75 mm con tapa.

Separar los tubos necesarios que se van a usar en el ensayo y el resto de tubos
puede ser conservado a una temperatura entre 2C a -10 C y protegido de la luz, por
un tiempo de cuatro semanas como mximo.

NOTA: Una vez reconstituido el reactivo L.A.L. puede ser utilizado dentro de ocho horas
a temperatura ambiente. Evite exponer el lisado a temperaturas sobre los 25C.

El reactivo no reconstituido debe ser conservado entre +2 a 8 +C.

PATRN DE REFERENCIA DE ENDOTOXINA DE ESCHERICHIA COLI:

NOTA: Todas las concentraciones en Unidades de Endotoxina por ml, (EU/ml) son
basadas en la US Reference Standard Endotoxin (RSE) lote EC-5 que contiene 10.000
EU/ampolla. Por convencin, la USP recomienda que una endotoxina de control
estndar (CSE) sea utilizada en las pruebas de rutina. La CSE es dosificada frente a la
RSE. Cada vez que un nuevo lote de endotoxina es recibido puede ser necesario ajustar
las diluciones de acuerdo a la concentracin.

Reconstituir el control de endotoxina de acuerdo a las instrucciones la etiqueta con
agua LAL usando una micropipeta y puntas estriles.

Agitar en el aparato VORTEX hasta disolucin completa, por treinta minutos.

Conservar la endotoxina reconstituida en refrigeracin en su frasco original, a una
temperatura de +2 a +8C, mximo por treinta das.

NOTA: El patrn de endotoxina no puede ser congelado.
La endotoxina liofilizada debe ser conservada de +2 a +8C y hasta la fecha de
vencimiento indicada en el frasco.
Cada vez que se utilice la endotoxina reconstituida, primero retirar del refrigerador,
dejar a temperatura ambiente unos minutos y por ltimo agitar durante cinco minutos en
el Vortex antes de realizar la dilucin

Identificar correctamente con la fecha y dilucin que corresponda a cada dilucin de la
endotoxina en el tubo apirgeno de 20 x 120 mm, agitar durante un minuto en Vortex
antes de realizar la siguiente dilucin.

PREPARACIN DE LAS MUESTRAS:

Si fuera necesario ajustar el pH de la solucin a analizar entre 6.0 y 7.5 utilizando el HCl
0.1N o la NaOH 0.1N apirgenos.

NOTA: No ajustar el pH de muestras de agua o de soluciones salinas no tamponadas.


PREPARACIN DE LOS CONTROLES POSITIVOS:

A partir de la endotoxina preparada en 4.3.4., preparar aspticamente con agua estril
para inyeccin, una serie de diluciones hasta alcanzar la concentracin de la
sensibilidad lisado (EU/ml) a utilizarse.

Cada tubo (20 x 120 mm) de dilucin tapar con el papel aluminio con el que se
despirogen y agitar en el Vortex por un minuto antes de realizar la siguiente dilucin.

Verificar la concentracin de endotoxina indicada en el rtulo del frasco, referida
siempre a un lote de fabricacin.

Verificar tambin la sensibilidad del lisado indicada en la etiqueta del frasco. Ver
esquema N. 1, indicado para una endotoxina de concentracin 11 EU/ng y sensibilidad
del lisado de 0.125 EU/ml.

Para estudio de validacin de estufas de despirogenacin, utilizar una endotoxina de
alta concentracin conteniendo 2.5 mg/frasco 500 mg/ml despus de la reconstitucin
con 5 ml de agua LAL y agitacin vigorosa por treinta minutos en Vortex.

Seguir el esquema N. 2 de diluciones, agitando cada dilucin durante un minuto en el
Vortex e identificando bien a cada una de las diluciones.

PREPARACIN DEL CONTROL NEGATIVO:

El agua utilizada para reconstituir el reactivo L.A.L. y la endotoxina, cuando no se usa
agua L.A.L., precisan ser apirgenas para no obtener falsos positivos, de igual forma,
el agua utilizada para realizar las diferentes diluciones. Para la completa seguridad de la
apirogenicidad del agua efectuar la prueba de control negativo.

PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO:

Transferir aspticamente 0.1 ml de la muestra obtenida en 4.3.5. al tubo de ensayo con
tapa apirgeno de 10 x 75 mm, que contiene 0.1 ml del reactivo L.A.L. reconstituido y
homogeneizar suavemente.
NOTA 1: Todas las muestras deben ser efectuadas por duplicado y deben estar bien
identificadas con el producto y lote al que corresponde.
NOTA 2: No colocar el lquido por la pared del tubo, porque puede haber una prdida
significante del posible agente pirognico, en la superficie del vidrio.

Inmediatamente despus de la adicin de la muestra en cada tubo, incubarlos en bao-
mara a 37C 1 C por 60 min. 2 min., simultneamente con los controles positivos y
negativos.

Para los controles positivos, adicionar aspticamente 0.1 ml de la mezcla muestra-
endotoxina de concentracin igual a la sensibilidad del lisado en el tubo que contiene 0.1
ml de lisado reconstituido.

Para los controles negativos, adicionar aspticamente 0.1 ml de agua estril para
inyeccin utilizada como diluyente, en el tubo que contiene 0.1 ml de lisado
reconstituido.

NOTA: Los controles positivos y negativos no necesitan ser probados por duplicado.
Preparar los controles positivos y negativos una vez por semana a menos que sea
cambiado el lote de L.A.L. y/o de la endotoxina patrn.

Diariamente, se debe realizar el ensayo de Endotoxinas bacterianas del agua bidestilada
usada en la produccin de inyectables y del agua desmineralizada utilizada en el ltimo
enjuague del lavado de ampollas; documentar en el cuaderno respectivo del Laboratorio
de Microbiologa.

RESULTADOS:

Despus de los 60 min. de incubacin, observar cada tubo respecto a la formacin de
un gel firme girndolo suavemente 180

Si la solucin del fondo del tubo resbala, la prueba es NEGATIVA.

Si despus de girar 180 el tubo, el gel no se mantiene firme y resbala, la prueba
tambin es considerada NEGATIVA

Si despus de girar 180 el tubo, el gel es firme y mantiene su integridad, la prueba es
POSITIVA, es decir, existe la cantidad suficiente de endotoxina para que la reaccin
ocurra.

No agitar los tubos durante la lectura, pues provocar la destruccin del gel.

Inspeccionar cada tubo solo una vez y descartarlo.

Los tubos de ensayo no deben ser removidos de la incubacin o manipulados antes del
tiempo especifico para la lectura del ensayo.


INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS:

Interpretar los resultados de acuerdo a la siguiente tabla:

RESULTADO


INDICACIN


ACCIN RECOMENDADA

CONTROL
POSITIVO
(MUESTR
A)
CONTROL
POSITIVO
AGUA/DILU
Y.
CONTROL
NEGATIVO
AGUA/DILU
Y.


Positivo


Negativo


Negativo



Positivo

Positivo

Positivo


Positivo


Negativo



Negativo

Positivo

Negativo


Negativo


Negativo



Negativo

Positivo

Resultado esperado


Prueba inhibida por la
muestra.


- Actividad pirognica
destruida.
- Preparacin impropia de la
endotoxina

Tcnica impropia

Contaminacin por el agua
diluyente

Considere los resultados de la
muestra.

Establezca la Mxima Dilucin
Vlida de la muestra (MDV).

No considere los resultados de
las muestras.


Repita todo el procedimiento

No considere los resultados de
las muestras y repita el
procedimiento enfatizando en la
asepsia.


En los casos que los anlisis hayan sido invalidados proceder de la siguiente manera:

La formacin del gel firme en el control negativo del diluyente indica una falla tcnica y/o
falla en la despirogenizacin de materiales y/o soluciones.
Preparar y despirogenizar nuevos materiales y soluciones.

La no formacin de gel en los controles positivos indica, probablemente, una baja
concentracin de endotoxina. En este caso, repetir todo el procedimiento, preparacin y
dilucin de la endotoxina.

La formacin de gel firme en el control positivo del diluyente y no formacin de gel firme
en el control positivo de la muestra indica una incompatibilidad de la muestra.
Establecer la Mxima Dilucin Vlida (MDV) de la muestra que sea compatible con la
reaccin.

DOCUMENTACIN:
Anotar en el cuaderno de endotoxinas bacterianas todos los datos (proveedor, lote,
concentracin, sensibilidad, expiracin) del reactivo LAL, endotoxina y agua LAL usados
en el ensayo.

Para cada kit recibido, confirmar la sensibilidad del reactivo L.A.L.

Registrar todos los resultados en el cuaderno de Endotoxinas bacterianas, manteniendo
un control de todas las pruebas efectuadas.

Finalmente elaborar el certificado de anlisis de cada producto segn el anexo 1 y
adjuntarlo a la documentacin del producto en cuestin.