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Laboratorio de Cultivo de Tejidos # 9

Aislamiento de Protoplastos











Wendy Barboza Assia
Auris Carrillo Martnez
Nelcy Torres Paternina







Javier Beltrn

Docente









Universidad de Sucre
Facultad de educacin y ciencias
Programa de biologa
2013





Introduccin
El termino Protoplastos se refiere a componentes vivos de las clulas vegetales
que estn rodeados solo por la membrana plasmtica; en realidad, constituyen
clulas desnudas de una planta (imagen 1). Muchos Protoplastos pueden
resintetizar la pared clulas, dividirse, formar colonias e incluso regenerar plantas.
La capacidad para producir un organismo altamente diferenciado, a partir de una
sola clula somtica, es una caracterstica nica de los Protoplastos de las plantas
superiores.



Debido a la ausencia de la pared celular, los Protoplastos son adecuados para
diversas y diferentes manipulaciones genticas que no seran posibles con tantas
plantas o clulas intactas. Los Protoplastos sirven adems como herramientas
experimentales nicas para muchas investigaciones fisiolgicas, biofsicas y
bioqumicas ya que el mtodo permiti aislar altas cantidades de Protoplastos.
El primer aislamiento de Protoplastos vivos fue el descrito por Klercker (1892),
quien tuvo xito al aislar por mtodos enzimticos se hizo en clulas de levadura,
utilizando jugo gstrico del caracol Helix pomatia; aunque en ese momento no se
conoca el mecanismo de degradacin enzimtica de la pared celular, las
observaciones de este trabajo fueron muy importantes porque nos permitieron
aislar algunos Protoplastos. Cocking (1960) fue quien utilizo por primera vez
degradante de pared celular para aislar protoplastos de plantas superiores;
Imagen 1: protoplastos aislados.
usando una preparacin de celulosa cruda del hongo myrothecium varrucaria, este
investigador aisl protoplastos de races de tomate.
Los protoplastos son una herramienta fundamental para la investigacin en
biologa fundamental y aplicada. La ausencia de una pared celular rgida
(obstculo fsico-qumico) y la completa exposicin de la membrana celular
convierte a los protoplastos en un sistema ideal para la investigacin en procesos
de transporte y divisin celular, morfognesis, mutagnesis, seleccin, etc. Quiz
la aplicacin ms utilizada actualmente es la transformacin gentica por
hibridacin o fusin somtica, por introduccin-absorcin de protenas, DNA
(vegetal, vrico o bacteriano), macromolculas, etc. En fitopatologa se utiliza para
estudiar la etiologa de los virus, su absorcin, procesos infectivos y replicacin; la
especificidad y modo de actuacin de hongos y bacterias patgenas, la evaluacin
de toxinas, y finalmente la obtencin-seleccin de clones resistentes a diversos
patgenos y productos fitosanitarios para la mejora gentica. Los protoplastos se
pueden obtener de diversas partes de la planta, cultivadas tanto in vitro como ex
vitro. As pueden obtenerse protoplastos de tejidos de callo, pices de raz,
cladodios, pices de tallo, frutos, ndulos de races, coleptilos, lminas de
aleurona de cereales, microsporas e incluso de tubos polnicos, pero en la
actualidad la fuente de protoplastos ms habitual es el tejido de mesfilo de las
hojas jvenes.
Aunque existen un mtodo mecnico para el aislamiento de protoplastos por lo
general se utiliza el mtodo enzimtico y este depende en gran medida del tipo y
concentracin de los enzimas utilizados. Los dos enzimas esenciales son la
celulasa y la pectinasa, que degradan especficamente los componentes
celulsicos y pectnicos de la pared celular. Algunos tejidos tambien requieren
hemicelulasas adicionales para una correcta digestin de la pared. Otros
preparados enzimticos como la driselasa desarrollan un conjunto de actividades
lticas: celulasas, laminarinasas, xilanasas, pectinasas. Todos los preparados
enzimticos incluyen impurezas, como nucleasas y proteasas, que pueden tener
un efecto negativo sobre la viabilidad celular. Los enzimas deben presentar un pH
(4-6) y su temperatura ptima de actuacin es de 40 a 60C. Debido a la fragilidad
osmtica de los protoplastos, es necesario controlar perfectamente el potencial
osmtico tanto de la solucin enzimtica, como de la solucin de lavado y de la
solucin de recuperacin y cultivo de los protoplastos. Para ello se usan osmticos
inicos o no inicos como sorbitol, manitol, sacarosa, glucosa, cloruro clcico, etc,
a distintas dosis.



Los protoplastos se obtienen del mesfilo de la hoja en plantas (imagen 2), y
tambin a partir de suspensiones celulares. Son mantenidos en medio de
cultivo celular que permitan nutrir adecuadamente la clula; esto contempla el
suministro de macronutrientes y micronutrientes, incluyendo molculas orgnicas
que sean necesarias, como vitaminas. Estas clulas, al carecer del refuerzo
mecnico que otorga la pared celular, quedan ms proclives a destruirse por
diferencias de presin osmtica con respecto al medio.
Fases para la obtencin de protoplastos, La primera fase es la obtencin,
preparacin y desinfeccin del material vegetal. La segunda fase es la eliminacin
de la pared celular mediante enzimas lticos, en una solucin con un alto potencial
osmtico. La tercera fase es la recuperacin de los protoplastos, incluye la
eliminacin de los enzimas por lavado y el paso a un medio de cultivo para la
recuperacin de la pared y la promocin de las primeras divisiones celulares de
las clulas individuales obtenidas de los protoplastos. As como la regeneracin de
Imagen 2: mtodos para la obtencin de protoplastos.
la pared no representa ninguna dificultad, ya que ocurre inmediatamente al
eliminar los enzimas, la fase de divisin celular, suele ser muy problemtica y por
diversas causas necesita la cuidadosa purificacin y manipulacin previa de los
protoplastos as como la puesta a punto de un medio de cultivo especfico y
complejo, con sales minerales, vitaminas, carbohidratos, reguladores de
crecimiento y una dosis reducida paulatinamente del agente osmtico; esto se
realiza incubando el material a unos 25C en condiciones de oscuridad de 5 a 7
das. En esta fase se realizan los tratamientos y la seleccin del material frente a
diversos agentes. La cuarta fase es el cultivo de los microcallos obtenidos tras la
divisin celular, se cambia en ella la densidad poblacional, la composicin del
medio de cultivo, que se hace menos exigente y la incubacin se hace con luz. La
quinta fase es la regeneracin de plntulas a partir del tejido de callo, mediante
modificaciones de la composicin hormonal-mineral del medio de cultivo. La sexta
fase es el trasplante y aclimatacin de las plantas obtenidas en invernadero. A
pesar de que los avances de los ltimos diez aos se pueden calificar de
espectaculares, la aplicacin de estas tcnicas se ha estabilizado o ralentizado un
poco, ya que las tcnicas presenta cierto grado de dificultad en sus resultados, por
lo cual se ha implementado la ingeniera gentica en este proceso, aunque los
mtodos convencionales para el aislamiento de protoplastos son usados
activamente. En esta prctica de laboratorio se buscara obtener el mayor nmero
de protoplastos a travs de tcnicas mecnicas.











Objetivos
Objetivo general
Aislar protoplastos a travs de diversas tcnicas.
Objetivo especifico
Conocer y aprender las tcnicas empleadas para el aislamiento de
protoplastos
Entender la importancia del aislamiento de protoplastos.





























Materiales

Hojas sanas y frescas

Pinzas


Sacarosa





Agua estril

Cajas de Petri

Goteros

Portaobjetos

Cubreobjetos

Cuchillas (minora)

Mortero


Centrifugadora



Procedimiento

Para la realizacin de esta prctica se llevaron a cabo los siguientes
procedimientos:



Mtodo I
Se pes 0.5 gramos de hojas jvenes, luego se les retiro la cutcula, despus se
prepar 100ml de solucin de sacarosa 1M, ms tarde se deposit varias hojas en
una caja de Petri (imagen 4), adicionalmente se adiciono la solucin de sacarosa
0.7M y se dej plasmolizando por 20 minutos (imagen 5). Transcurrido el tiempo
se retir la solucin, se colocaron las hojas en un mortero, posteriormente se
adiciono la solucin de sacarosa 0.4M, seguidamente se macero suavemente el
tejido (imagen 6), se filtr y se centrifugo a 300rpm durante 4 minutos, una vez
terminado el procedimiento se tom el sobrenadante con un gotero, se agreg una
gota del sobrenadante en un portaobjetos previamente limpio y haciendo una
ngulo de 50 con el cubreobjetos se llev la muestra al microscopio donde se le
realizaron las debidas observaciones.

Imagen 3. Pesaje de
hojas.
Imagen 4. Hojas en caja de
petri.
Imagen 5. Hojas en
solucin de sacarosa.
Imagen 6. Hojas
maceradas.


Mtodo II. Cortes espina de pescado



Se prepar una caja de Petri con agua destilada estril (10ml), se tomaron varias
hojas sana y frescas del material disponible de unos 3 cm de largo, 2 cm de
ancho, las cuales se colocaron con el envs hacia arriba en la caja de Petri.
Posteriormente se sujet por el peciolo con ayuda de una pinza, con una cuchilla
se procedi a realizarle cortes espinas de pescado de la nervadura hacia afuera
(imagen 7), seguidamente con un gotero se toma una gota de la muestra, la cual
se agreg en un portaobjeto, ms tarde se le coloco el cubreobjetos y se llev la
muestra al microscopio para su posterior observacin. Cabe resaltar que se repiti
el mismo procedimiento con la caja de Petri que contena los 20 ml de solucin de
sacarosa 0.4M. A saber que cuando no se podan observar los Protoplastos en el
microscopio se hizo necesario la utilizacin de aceite de inmersin.







Imagen 7. Hojas con cortes espina de
pescado
Resultados
Una vez realizados todos los procedimientos se obtuvo los siguientes resultados:
Mtodo I



Mtodo II




Imagen 8: protoplastos aislados por el
mtodo I, objetivo 400X.
Imagen 9: protoplastos aislados por el
mtodo I. Objetivo 400X.
Protoplastos
Protoplastos
Imagen 10: protoplastos aislados con
agua destilada, mtodo II, objetivo
400X.
Imagen 11: protoplastos aislados con
sacarosa, mtodo II. Objetivo 400x.
Protoplastos
Protoplastos
Restos
citoplasmticos.
















Imagen 12: protoplastos aislados con sacarosa, mtodo II,
objetivo 400x, protoplastos sealado.
ANLISIS
Cuando hablamos de protoplastos nos referimos a los componentes vivos de las
clulas vegetales que estn rodeados slo por la membrana plasmtica;
constituyen las clulas desnudas de una planta. Muchos protoplastos pueden
resintetizar la pared celular, dividirse, formar colonias e incluso regenerar plantas.
Debido a la ausencia de la pared celular, los protoplastos son adecuados para
diversas y diferentes manipulaciones genticas que no seran posibles con plantas
o clulas intactas. Los protoplastos sirven adems como herramientas
experimentales nicas para muchas investigaciones fisiolgicas, biofsicas y
bioqumicas.
Existen mtodos mecnicos y enzimticos para el aislamiento de protoplastos, en
esta prctica de laboratorio se utiliz el mtodo mecnico para el aislamiento de
estos, teniendo en cuenta que en el mtodo I se observ una mayor cantidad de
protoplastos con respecto al mtodo II, debido a que se utiliz sacarosa y se
centrifugo la muestra lo que facilit la salida de estos y fcil observacin; los
protoplastos aislados con ayuda de agua destilada fueron en menor cantidad con
respecto a aquellos que se aislaron con sacarosa, teniendo en cuenta que la
sacarosa provoca plasmlisis en las clulas de las plantas, por lo cual ocurre una
lesin en los tejido y se liberan los protoplastos, este mtodo es muy
recomendable porque se evita el dao metablico causado por el uso de enzimas,
pero se obtiene una cantidad pequea de protoplastos, adems de que se
segregan desechos citoplsmicos de las clulas daadas por el corte, como se
pudo observar en la imagen 8, este mtodo no es muy utilizado debido a que no
se pueden obtener grandes cantidades de protoplastos, es muy econmico, por
otra parte el mtodo enzimtico es el ms utilizado y consiste en tratar al tejido
con una mezcla de enzimas degradantes de la pared, que en general son
celulasas, hemicelulasas y pectinasas, con estabilizadores osmticos. Presenta
varias ventajas como son la de obtener un mayor nmero de protoplastos por
unidad de tejido y el impedimento de que las clulas se rompan, como sucedera
con el mtodo mecnico, con lo cual se evita la intoxicacin causada por los
desechos de la degradacin celular.
Entre los Factores que afectan la produccin y viabilidad de los protoplastos
encontramos: la fuente de material, tratamientos pre-enzimticos, tratamientos
enzimticos y la osmolaridad. Los protoplastos son muy utilizados en una tcnica
denominada fusin de protoplastos en donde se produce un hbrido somtico
cuando se fusionan las membranas de dos o ms clulas. Se puede dar por fusin
espontnea, que se presenta durante la fase de aislamiento, pudiendo presentarse
clulas alodiploides aun antes de la fusin inducida, y se presenta cuando el
aislamiento se efectu durante el proceso de divisin, siendo ms probable
cuando stos provienen de cultivos celulares con una divisin rpida. Las clulas
hibridas obtenidas de la fusin pueden ser cultivadas e inducidas a la divisin,
regenerndose plantas a partir de ellos. La tcnica de fusin de protoplastos fue
muy prometedora en sus comienzos, pero fue desplazada por las tcnicas de
ingeniera gentica que permiten la transferencia de material gentico con mayor
control. Aun as, el aislamiento y cultivo de protoplastos sigue siendo un campo
importante dentro del cultivo de tejidos vegetales, por lo cual se requiere
conocimientos sobre esta tcnica.
1. Realice un listado de las posibles aplicaciones de aislamiento de
Protoplastos en el campo de la agricultura
Algunas de las posibles aplicaciones que tiene el aislamiento de los
protoplastos en el campo de la agricultura:
La fusin de protoplastos permite la obtencin de nuevas plantas.
Regeneracin de plantas mejoradas
Obtencin de plantas libres de virus
Obtencin de plantas bajo condiciones controladas
2. Cules podran ser las ventajas de utilizar una tcnica mecnica sobre la
digestin enzimtica en el proceso de aislamiento de Protoplastos
Algunas de las ventajas que se presentan con el mtodo mecnico son: bajo
costo, se evita el dao metablico causado por el uso de enzimas, pero se
obtiene una cantidad pequea de protoplastos, adems de que se segregan
desechos citoplsmicos de las clulas daadas por el corte. El procedimiento
ms usado para aislar protoplastos es el mtodo enzimtico, y consiste en
tratar al tejido con una mezcla de enzimas degradantes de la pared, que en
general son celulasas, hemicelulasas y pectinasas, con estabilizadores
osmticos. Presenta varias ventajas como son la de obtener un mayor nmero
de protoplastos por unidad de tejido y el impedimento de que las clulas se
rompan, como sucedera con el mtodo mecnico, con lo cual se evita la
intoxicacin causada por los desechos de la degradacin celular. Teniendo en
cuenta lo anterior se podra decir que son ms las desventajas que presenta el
mtodo mecnico frente al mtodo enzimtico.
3. Qu otros reguladores osmticos adems de la sacarosa, se pueden
utilizar para el proceso de aislamiento de Protoplastos
Para el aislamiento de protoplastos se pueden utilizar reguladores osmticos
como: como sorbitol, manitol, sacarosa, glucosa, cloruro clcico.
4. Platee sugerencias y observaciones sobre esta prctica.
En esta prctica de laboratorio se obtuvo buenos resultados pues se observ lo
esperado, una de las recomendaciones seria que utilizramos el mtodo
enzimtico tambin en los procedimientos para poder establecer diferencias
entre los dos mtodos, por otra parte nos gustara que tambin se utilizaran
otros reguladores osmticos no solo la sacarosa para establecer diferencias,
con respecto a los procedimientos, materiales e instrumentos de trabajo todo
estuvo bien.






















CONCLUSIONES

Los protoplastos constituyen las clulas desnudas de las plantas y juegan un
papel importante en la regeneracin de plantas.

La sacarosa es una sustancia importante para el aislamiento de protoplastos
porque permite la permeabilidad de la clula, lo que produce la salida de los
protoplastos, por lo cual se obtuvo un mayor nmero de protoplastos, mientras
que con agua destilada se obtuvo pocas cantidades de protoplastos.

El mtodo mecnico nos permite la obtencin protoplastos pero en pocas
cantidad y con algunos contaminantes (residuos de la membrana plasmtica)

A partir de protoplastos tambin es posible llevar a cabo el mtodo de
micropropagacion y realizar la tcnica de fusin de protoplastos, til en
mejoramiento gentico vegetal debido a la obtencin de tejidos hbridos.

El mtodo I presento mejores resultados que el mtodo II y eso se debi a la
utilizacin de los materiales.













Bibliografa
http://www.encuentros.uma.es/encuentros34/protop34.html
http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/Cultivo%20de%20Tejidos%
20en%20la%20Agricultura/capitulo10_parte1.pdf
http://www.encuentros.uma.es/encuentros34/protop34.html
http://datateca.unad.edu.co/contenidos/203024/203024/leccin_221_obtenci
n_y_cultivo_de_protoplastos.html