Manualtoxicología PDF

Laboratorio de Toxicologa
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEANZA

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Manual de guiones experimentales para
la enseanza y aprendizaje del laboratorio
de Toxicologa (clave 1614)


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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE QUMICA

DEPARTAMENTO DE FARMACIA

Manual de guiones experimentales para
la enseanza y aprendizaje del laboratorio
de Toxicologa (clave 1614)

Facultad de Qumica, UNAM Mxico, D.F. 2012
Mara Elena Bravo Gmez
Jorge Cornejo Garrido
Francisco Hernndez Luis
Juan Francisco Palacios Espinosa
Araceli Prez Vsquez
Francisco Snchez Bartez

Perla Carolina Castaeda Lpez
Manuel Gutirrez Aguilar
Bernardo Lucas Florentino
Carlos Prez Muoz
Alejandra Quijano Mateos


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Primera edicin: 2012

Fecha de edicin: 15 de enero de 2012

D. R. 2012 UNIVERSIDAD NACIONAL
AUTNOMA DE MXICO
Ciudad Universitaria, Delegacin Coyoacn,
C.P. 04510, Mxico, Distrito Federal.

ISBN: 978-607-02-3094-3
Tamao: 1.75 MB
Tipo de impresin: PDF
Tiraje: 300 unidades

Prohibida la reproduccin total o parcial por cualquier medio, sin la autorizacin
escrita del titular de los derechos patrimoniales.

Impreso y hecho en Mxico


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NDICE

Prlogo

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Reglamento de Higiene y Seguridad para los Laboratorios de la Facultad
de Qumica
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Reglamento Interno de Higiene y Seguridad para los Laboratorios
del Departamento de Farmacia

13
Reporte de Seguridad e Higiene 15

Extraccin y cuantificacin de txicos no voltiles
en una muestra problema

16
Cuantificacin de cianuro de hidrgeno, como txico voltil,
a partir de glucsidos cianognicos

29
Produccion de metahemoglobina por nitritos y efecto protector
del azul de metileno in vivo

40
Determinacin de malatin residual

49
Determinacin de la actividad antioxidante de la quercetina
y el cido nordihidroguayartico

58
Evaluacin de la actividad genotxica de la ciclofosfamida utilizando
la tcnica de microncleos en mdula sea

65
Efectos txicos de la administracin de plomo en ratas

77
Efecto del pH en la liberacin de plomo por utensilios de barro vidriado

90
Determinacin de etanol en una muestra problema

96
Identificacin de alcaloides y barbitricos en muestras problema

104


8

PRLOGO

En noviembre de 2004, el H. Consejo Tcnico de la Facultad aprob las modificaciones al plan de
estudios de la carrera de Qumica Farmacutico Biolgica (QFB), y en junio de 2005 fue aprobado
por el Consejo Acadmico del rea de las Ciencias Biolgicas y de la Salud (CAABYS). De tal
manera, que a partir del semestre 06-I se inici la implantacin gradual del mapa curricular del plan
de estudios 2005.

En este nuevo mapa curricular, la asignatura terico-experimental de Toxicologa, con clave 1614,
qued ubicada en el 6 semestre para la carrera de QFB. El diseo del actual contenido
programtico de la asignatura fue pensado para revisar los conocimientos bsicos de Toxicologa
como: citotoxicidad, bioactivacin txica, estrs oxidante, mutagnesis, carcinognesis y
teratognesis, para integrarlos a las etapas de estudio sobre el riesgo de exposicin, toxocintica
y toxodinamia de las reacciones adversas ocasionadas por xenobiticos frmacos, metales
pesados y sustancias de abuso. A travs del aprendizaje de esta asignatura, se pretende contribuir al
perfil del egresado en el diseo, evaluacin y produccin de medicamentos, produccin de reactivos
para diagnstico, diagnstico de laboratorio, investigacin biomdica y conservacin del medio
ambiente.

En consecuencia, el grupo de profesores de Toxicologa, en forma colegiada, decidi realizar la
actualizacin y modificacin del curso prctico, incluyendo algunos temas de inters actual en esta
asignatura y rediseando los existentes, de acuerdo con la reforma a la enseanza experimental
(Hernndez y Llano, 1994). Siguiendo estos criterios, se implementaron dos nuevas prcticas con el
apoyo del proyecto PE202006 a travs del Programa de Apoyo a Proyectos para la Innovacin y
Mejoramiento de la Enseanza (PAPIME), lo cual permiti la adquisicin de equipos, materiales
y reactivos para la enseanza experimental de esta asignatura.

Con base en lo anterior, los autores presentamos este Manual de guiones experimentales para la
enseanza y aprendizaje del laboratorio de Toxicologa, el cual est constituido por diez prcticas
que cubren las unidades temticas del curso (Tabla 1) y que permiten integrar, aplicar y relacionar
los conocimientos tericos adquiridos en la asignatura. Asimismo, los guiones propician la
integracin de algunos de los conocimientos adquiridos previamente en asignaturas como
Bioqumica, Farmacologa, Qumica Analtica, y Qumica Orgnica, as como su correspondiente
aplicacin en la resolucin de problemas de esta rea.


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Curso laboratorio
Guin experimental
Curso terico
Unidad temtica
Extraccin y cuantificacin de txicos no
voltiles en una muestra problema
Introduccin a la Toxicologa
Cuantificacin de cianuro de hidrgeno, como
txico voltil, a partir de glucsidos cianognicos
La biotransformacin de xenobiticos
y su importancia toxicolgica

Produccin de metahemoglobina por nitritos y
efecto protector del azul de metileno in vivo
Determinacin de malatin residual
Determinacin de la actividad antioxidante de la
quercetina y el cido nordihidroguayartico
El estrs oxidante
Evaluacin de la actividad genotxica de la
ciclofosfamida utilizando la tcnica de
microncleos en mdula sea
Mutagnesis, carcinognesis y teratognesis
Efectos txicos de plomo en ratas Toxicidad de metales pesados
Efecto del pH en la liberacin de plomo por
utensilios de barro vidriado
Toxicidad de metales pesados
Determinacin de etanol en una muestra
problema
Toxicidad de sustancias de abuso
Identificacin de alcaloides y barbitricos en
muestras problema
Toxicidad de sustancias de abuso

Tabla 1. Relacin entre las unidades temticas del curso terico y los guiones experimentales.

Los guiones experimentales se elaboraron siguiendo los criterios establecidos por la Reforma de la
Enseanza Experimental, donde la adquisicin del conocimiento se da a la luz de las evidencias
observables o medibles de los fenmenos que ocurren en el laboratorio. El estudiante es enfrentado
a los mismos a travs de un problema bien definido, el cual debe ser resuelto encontrando las
relaciones causa-efecto de stos a travs del trabajo experimental.

Cada uno de los guiones est estructurado de la siguiente manera:

OBJETIVO ACADMICO
Se establece para reforzar y enriquecer los conocimientos adquiridos en las clases tericas, as como
el desarrollo de habilidades para el manejo de materiales y tcnicas analticas empleadas
comnmente para determinar y/o identificar la presencia de xenobiticos.

PROBLEMA
Se plantea con la intencin de enfrentar al estudiante con fenmenos relacionados con el rea,
que le permita adquirir los conocimientos planteados en el OBJETIVO ACADMICO a travs
del trabajo experimental; encontrando las relaciones causa-efecto y relacionando estos
hallazgos con el riesgo de intoxicacin y/o el potencial toxicolgico.


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DESARROLLO EXPERIMENTAL
Describe el procedimiento y tcnicas utilizadas para el desarrollo y obtencin de resultados que
permitan resolver el PROBLEMA.

CUESTIONARIO
Se incluye con la intencin de dirigir al estudiante hacia la resolucin del PROBLEMA,
resaltando los aspectos vivenciales de la experiencia en el laboratorio y, de esta forma, reforzar
el proceso cognoscitivo.

APNDICE I
CONOCIMIENTOS PREVIOS
Este apndice contiene un listado de los conceptos indispensables para que el estudiante
comprenda el guin y sea capaz de resolver el PROBLEMA planteado.

APNDICE II
PREPARACIN DE REACTIVOS
En este apndice se indican las cantidades necesarias para la preparacin de los reactivos
a emplear en el DESARROLLO EXPERIMENTAL.

APNDICE III
DISPOSICIN DE RESIDUOS
Considerando que en cada sesin de laboratorio se generan un nmero importante de residuos,
se contempl la necesidad de indicar puntualmente cada uno de ellos, as como la manera en
que debern ser confinados y etiquetados para su posterior tratamiento.

Los autores consideramos importante tambin incluir en el presente material el Reglamento de
Higiene y Seguridad de la Facultad y del Departamento de Farmacia, para concientizar a los
alumnos de la relevancia y carcter obligatorio de ambos, promoviendo de esta forma el desarrollo
de actitudes apropiadas para un profesionista en el rea de las ciencias biolgicas y de la salud.

Finalmente, los autores agradecemos el apoyo brindado a travs del proyecto PAPIME No.
PE202006 de la Direccin General de Asuntos del Personal Acadmico (DGAPA) de la UNAM.

Hernndez Luna, M. y Llano Lomas, M. (1994) Propuesta de Reforma de la Enseanza Experimental en Revista
del IMIQ, Ao XXV, vol. 07, pp. 5-7.


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Reglamento de Higiene y Seguridad para los
Laboratorios de la Facultad de Qumica

ARTCULO 1. El presente Reglamento es aplicable en todos aquellos espacios de la Facultad de Qumica en donde
se realice trabajo experimental, sea de docencia o de investigacin. Estos sitios, para efectos del presente
Reglamento, sern denominados laboratorios.

Su observancia es obligatoria para el personal acadmico, alumnos y trabajadores administrativos y no excluye otra
reglamentacin que resulte aplicable.

Deber exhibirse visiblemente en cada laboratorio de la Facultad de Qumica.

ARTCULO 2. Es necesario que el personal que trabaja en cada laboratorio conozca el sistema de alertamiento, las
zonas de seguridad, las rutas de evacuacin, el equipo para combatir siniestros y las medidas de seguridad
establecidas en cada laboratorio.

ARTCULO 3. Los laboratorios debern estar acondicionados, como mnimo, con lo siguiente:

a) Un control maestro para energa elctrica
b) Un botiqun de primeros auxilios
c) Extintores
d) Un sistema de ventilacin adecuado
e) Agua corriente
f) Drenaje
g) Un control maestro para suministro de gas
h) Sealamientos de Proteccin Civil
i) Regadera
j) Lavaojos

ARTCULO 4. Todas las actividades que se realicen en los laboratorios debern estar supervisadas por un
responsable, nombrado por los departamentos acadmicos en sus reas correspondientes.

ARTCULO 5. Al realizar actividades experimentales, nunca deber estar una persona sola en los laboratorios.
El mnimo de personas deber ser, invariablemente, de dos y al menos una de ellas deber ser parte del personal
acadmico de la Facultad.

ARTCULO 6. Los usuarios debern abstenerse de dejar, en el lugar de trabajo, cosas de valor a la vista; adems
debern cerrar las puertas de cubculos y laboratorios, as como cajones y archiveros, siempre que se ausenten del
laboratorio.

ARTCULO 7. Para trabajar en los laboratorios es obligatorio que los estudiantes usen bata y lentes de seguridad. En el caso
del personal acadmico y administrativo, el equipo de proteccin personal, lo dictaminar la Comisin Mixta de Higiene y
Seguridad. Este equipo ser de uso obligatorio. El alumno que no tenga proteccin no podr permanecer en el laboratorio;
ser su responsabilidad contar con el equipo mencionado. Asimismo, no podr trabajar ni permanecer dentro de los
laboratorios, si no se encuentra su profesor o alguien responsable que lo sustituya.

ARTCULO 8. En los laboratorios queda prohibido: fumar, consumir alimentos o bebidas, el uso de lentes de
contacto y de zapatos abiertos (tipo huarache o sandalia).

ARTCULO 9. Para realizar trabajos con material radiactivo es obligatorio aprobar el curso de su manejo, as como
la obtencin del dosmetro correspondiente.

ARTCULO 10. Todas las sustancias, equipos, materiales, etc., debern ser manejados con el mximo cuidado,
atendiendo a las indicaciones de los manuales de uso o de los de seguridad, segn el caso.

ARTCULO 11. Las puertas de acceso y salidas de emergencias debern estar siempre libres de obstculos,
accesibles y en posibilidad de ser utilizadas ante cualquier eventualidad. El responsable del rea deber verificar
esto al menos una vez cada semana.

ARTCULO 12. Las regaderas debern contar con el drenaje correspondiente, funcionar correctamente, estar lo
ms alejadas que sea posible de instalaciones o controles elctricos y libres de todo obstculo que impida su uso
correcto. El responsable del rea deber verificar esto por lo menos una vez cada semana.

ARTCULO 13. Los controles maestros de energa elctrica y suministros de gas para cada laboratorio debern
estar sealados adecuadamente, de manera tal que sean identificados fcilmente. Las tuberas de cada laboratorio
debern estar pintadas de acuerdo con la norma correspondiente.

12

ARTCULO 14. En cada laboratorio deber existir un botiqun de primeros auxilios al alcance de todas las personas
que en l trabajen. El responsable del rea deber verificar, al menos una vez cada semana, el contenido del
botiqun, para reponer los faltantes.

ARTCULO 15. Los extintores de incendios debern ser de CO2 y de polvo qumico seco, segn lo determine la
Subcomisin Mixta de Higiene y Seguridad y/o el Departamento de Bomberos de la Universidad; debern recargarse
cuando sea necesario, de conformidad con los resultados de la revisin o por haber sido utilizados.

ARTCULO 16. En caso de emergencias, con incendios, derrames o personas accidentadas, dirigirse a la zona de
seguridad establecida y/o activar el servicio de Emergencias 55 (red digital UNAM). Al activarlo:

- Identifquese: Nombre y Puesto.
- Ubicacin: D el mayor nmero de referencias fsicas posibles y las vas de acceso.
- Tipo de siniestro.
- Nmero de lesionados.
- Apoyo: Especifique si requiere apoyo adicional de vigilancia.
- Avisar de inmediato al encargado de la Seguridad del rea y a la Coordinacin de Seguridad.

ARTCULO 17. Los sistemas de extraccin de gases debern mantenerse siempre sin obstculos que impidan que
cumplan con su funcin, evaluarse al menos una vez cada mes y recibir el mantenimiento preventivo o correctivo
que los responsables de cada rea soliciten.

ARTCULO 18. Tanto los sistemas de suministro de agua corriente como de drenaje, debern recibir el
mantenimiento preventivo o correctivo que los responsables de cada rea soliciten.

ARTCULO 19. Los lugares en que se almacenen reactivos, disolventes, equipos, materiales, medios de cultivo, y
todo aquello relacionado o necesario para que el trabajo en los laboratorios se lleve a cabo, estarn sujetos a este
Reglamento en su totalidad; los anaqueles y reas de almacenamiento debern contar con la proteccin adecuada
para prevenir accidentes.

ARTCULO 20. Queda prohibido desechar sustancias al drenaje o por cualquier otro medio. Los manuales de
prcticas correspondientes debern incluir la forma correcta de la disposicin de los residuos.

ARTCULO 21. Para transferir lquidos con pipetas, deber utilizarse la llenadora correspondiente. Queda prohibido
pipetear con la boca.

ARTCULO 22. Al finalizar las actividades en el laboratorio, el responsable del rea deber verificar que queden
cerradas las llaves de gas, agua, vaco, tanques de gases y aire, segn sea el caso; apagadas las bombas de vaco,
circuitos elctricos, luces, etc. En caso de requerir que algn equipo trabaje de manera continua, deber dejarse,
tanto en el interior como en el exterior del laboratorio correspondiente, en forma claramente visible y legible, la
informacin acerca del tipo de reaccin o proceso en desarrollo, las posibilidades fuentes de problema, la manera de
controlar los eventuales accidentes, y la forma de localizar al responsable del equipo.

ARTCULO 23. Cuando se trabaje con sustancias txicas, deber identificarse plenamente el rea respectiva.
Adems, se deber trabajar en rea con sistema de extraccin y equipo de proteccin personal (segn el manual
correspondiente).

ARTCULO 24. En cada laboratorio de la Facultad deber existir, en forma clara, visible y legible, la informacin
acerca de los telfonos de emergencia a los cuales llamar en caso de requerirlo.

ARTCULO 25. Los anaqueles, libreros, estantes, archiveros, tanques de gas y, en general, accesorios y muebles
de oficina y laboratorio, debern estar sujetos a la pared para prevenir accidentes.

ARTCULO 26. Queda prohibido que menores de edad permanezcan en el laboratorio sin la autorizacin por escrito
del responsable del rea.

ARTCULO 27. El personal (acadmicos, administrativos o estudiantes) que trabaje en los laboratorios debe
informar al responsable del rea o a su jefe inmediato, si padece enfermedades que requieran atencin especial y
puedan generar incidentes dentro del rea.

ARTCULO 28. Todas aquellas cuestiones que no estn especficamente sealadas en el presente Reglamento
debern ser resueltas por la Direccin de la Facultad, con la opinin de la Coordinacin de Seguridad, Prevencin de
Riesgos y Proteccin Civil.

ARTCULO 29. Cualquier alteracin en las condiciones de seguridad, o en el cumplimiento del presente
reglamento, deber ser reportado al responsable correspondiente.

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ARTCULO 30. Las personas a quienes se sorprenda haciendo mal uso de equipos, materiales, instalaciones, etc.
propias de los laboratorios, de todo aquello mencionado en el Artculo 2 del presente Reglamento, o de las
sealizaciones instaladas para Proteccin Civil, sern sancionadas conforme a la Legislacin Universitaria, segn la
gravedad de la falta cometida.

ARTCULO 31. En el caso de los alumnos, las sanciones aplicables sern las que decida el H. Consejo Tcnico de la
Facultad, conforme a las disposiciones de la Legislacin Universitaria.

ARTCULO 32. Si se trata de personal acadmico o administrativo, se levantarn las actas correspondientes y se
dictarn las sanciones conforme a las disposiciones de la Ley Federal del Trabajo.

ARTCULO 33. Cada rea acadmica deber tener un Reglamento Interno de Higiene y Seguridad que ser de
observancia obligatoria y complementario al presente Reglamento, en tanto no lo contravengan.

ARTCULO TRANSITORIO NICO. El presente Reglamento, una vez aprobado por el Consejo Tcnico, entrar en
vigor el da siguiente de su publicacin en la Gaceta de la Facultad de Qumica.

Aprobado por el H. Consejo Tcnico en su sesin del 15 de junio de 2006.

Reglamento Interno de Higiene y Seguridad para
los Laboratorios del Departamento de Farmacia

ARTCULO 1. El presente Reglamento es complementario del Reglamento de Higiene y Seguridad para los
Laboratorios de la Facultad de Qumica de la UNAM. Es aplicable en todos aquellos lugares del Departamento de
Farmacia de la Facultad de Qumica donde se realice trabajo experimental, sea de docencia o de investigacin;
estos sitios, para efectos del presente Reglamento, sern denominados laboratorios. Se considerarn tambin como
reas de laboratorio aquellos anexos donde se lleven a cabo experimentos.

Su observancia es obligatoria para el personal acadmico, alumnos y trabajadores administrativos y no excluye otra
reglamentacin que resulte aplicable.

ARTCULO 2. Los laboratorios debern estar acondicionados de acuerdo con lo establecido en el ARTCULO 3 del
Reglamento de Higiene y Seguridad para los Laboratorios de la Facultad de Qumica de la UNAM.

ARTCULO 3. Todas las actividades que se realicen en los laboratorios debern estar supervisadas por un
responsable.

a) En los laboratorios de docencia, el o los responsables de cada grupo sern cada uno de los profesores
de dicho grupo.
b) En los laboratorios de investigacin, los responsables sern los tcnicos acadmicos adscritos a los
mismos o el profesor encargado del laboratorio.

ARTCULO 4. Al realizar actividades experimentales, nunca deber estar una persona sola en los laboratorios. En el
caso de que una de ellas sea alumno, deber haber siempre un profesor como segunda persona.

ARTCULO 5. En general, deber usarse el cabello recogido cuando se utilice mechero; adems, el equipo de
proteccin personal que ser usado en los laboratorios y anexos del laboratorio donde se lleven a cabo trabajos
de experimentacin ser, para alumnos y profesores:

1. Bata de algodn 100% y zapato cerrado.
2. Lentes de seguridad (durante el tiempo que dure el experimento). En caso de lentes graduados,
debern ser de vidrios endurecidos e inastillables, de preferencia.
3. Guantes, en caso de que el experimento lo exija.

Para laboratoristas

1. Bata de algodn 100% y zapato cerrado.
2. Lentes de seguridad (durante el tiempo que estn en contacto con los reactivos). En caso de lentes
graduados debern ser de vidrio endurecido e inastillables, de preferencia.
3. Guantes, cuando se encuentre en contacto con los reactivos.

ARTCULO 6. Los residuos slidos generados durante los trabajos experimentales debern colocarse en los
contenedores identificados para este fin y mantenerse alejados del rea de trabajo.

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ARTCULO 7. Los restos de desechos biolgicos (animales de laboratorio), generados durante las sesiones
experimentales, debern ser colocados en bolsas de plstico y enviados al Bioterio de la Facultad. No debern ser
desechados directamente en la basura.

ARTCULO 8. Las sustancias txicas, voltiles o inflamables debern ser utilizadas dentro de las campanas de
extraccin.

ARTCULO 9. Cualquier muestra que se guarde en los refrigeradores deber estar etiquetada con la siguiente
informacin:

a) Nombre completo del alumno.
b) Fecha y periodo que se mantendr almacenada.
c) Tipo de muestra.
d) Nombre de la asignatura o proyecto de tesis.
e) Profesor responsable de la asignatura o proyecto.

ARTCULO 10. No se admitir a nadie que llegue extraoficialmente de visita.

ARTCULO 11. Los sistemas de extraccin de gases y campanas debern mantenerse siempre sin obstculos que
impidan el cumplimiento de su funcin.

ARTCULO 12. Cuando un extintor est vaco por haber sido utilizado, deber ser removido de su lugar para evitar
confusiones en caso de necesitarlo. El responsable del rea deber hacer la solicitud de recarga o reemplazo a la
brevedad posible, para que se cumpla con lo establecido en los Artculos 3 y 15 del Reglamento de Higiene y
Seguridad para los Laboratorios de la Facultad de Qumica.

ARTCULO 13. Al finalizar las actividades en el laboratorio, el responsable del rea, el profesor o el laboratorista (el
ltimo en salir del laboratorio), deber verificar que se cumpla el Artculo 22 del Reglamento de Higiene y Seguridad
para los Laboratorios de la Facultad de Qumica.

ARTCULO 14. Este Reglamento se dar a conocer a todos los alumnos al inicio del semestre lectivo y se recabarn
sus firmas de enterados. Asimismo, deber estar en un lugar visible en el laboratorio, al igual que el Reglamento de
Higiene y Seguridad para los Laboratorios de la Facultad de Qumica de la UNAM.

Artculo Transitorio nico
El presente Reglamento, una vez aprobado por el Consejo Tcnico, entrar en vigor el da siguiente de su
publicacin en la Gaceta de la Facultad de Qumica.

Aprobado por el H. Consejo Tcnico en su sesin del 5 de octubre de 2006.

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REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE

GRUPO: _____________ FECHA: ___________________
PRCTICA: ______________________________________________________________
INTEGRANTES: __________________________________________________________

UTILIZACIN DE REACTIVOS

Reactivo Cantidad empleada Observaciones

VIGILANCIA DE EQUIPO

Equipo Hora de inicio Hora final Observaciones

MEDIDAS DE SEGURIDAD

Tratamiento de residuos Observaciones

Firma del responsable: ________________________________________

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EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN DE TXICOS
NO VOLTILES EN UNA MUESTRA PROBLEMA

OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno emplee mtodos de extraccin cida y bsica para obtener eficientemente
txicos no voltiles de naturaleza cida y bsica en una muestra problema, y concluya qu
mtodo de extraccin es el ms eficiente.
PROBLEMA
Establecer las condiciones ms adecuadas para realizar una extraccin mayor o igual al 90%
de los txicos no voltiles cidos y bsicos (cido acetilsaliclico [AAS] y cafena) presentes
en una muestra problema. La muestra deber trabajarla en medio cido y medio bsico.
Reactivos

- cido tartrico - Cafena
- Hidrxido de sodio (NaOH) - Cloroformo (CHCl
3
)
- Nitrato frrico (Fe(NO
3
)
3
) - Salicilato de sodio
- cido clorhdrico (HCl) - Cloruro mercrico (HgCl
2
)
- Bicarbonato de sodio (NaHCO
3
) - Sulfato de sodio anhidro (Na
2
SO
4
)
Equipo
- Espectrofotmetro - Balanza analtica
- Rotaevaporador
- Vrtex
Material

Material por equipo

- Gradilla 1 - Piseta con agua destilada 1
- Tubos de ensayo 13 x 100 4 - Matraz de bola de 50 mL 2
- Matraz aforado de 10 mL 2 - Pipeta Pasteur 2
- Matraz aforado de 25 mL 2 - Probeta de 25 mL 1
- Embudo de separacin de 250 mL 2 - Esptula 1
- Matraz Erlenmeyer de 250 mL 1 - Pipeta graduada de 10 mL 2
- Anillo metlico 2 - Pipeta graduada de 1 mL 1

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Material para la curva patrn

- Gradilla 1
- Matraz volumtrico de 10 mL 5
- Matraz volumtrico de 25 mL 5
- Tubos de ensayo 10
- Vaso de precipitado de 100 mL 1
- Pipeta graduada de 1 mL 1

NOTA: El profesor proporcionar las celdas a los alumnos.

El profesor proporcionar 30 mL de muestra problema, la cual deber dividirse en dos
porciones de 15 mL para realizar a una de ellas la extraccin en medio cido; y a la otra, la
extraccin en medio bsico. La cuantificacin de cido acetilsaliclico (AAS) y cafena se
determinar siguiendo los apndices correspondientes.
A) Proceso de extraccin en medio cido para txicos no voltiles
1. Agregar cido tartrico hasta un pH = 2.
2. La solucin cida se extrae con 2 porciones de 15 mL de CHCl
3
, separando las fases
orgnicas y reunindolas en un matraz.
3. La fase acuosa se guarda, etiquetndola como fraccin A.
4. La fase orgnica se extrae con dos porciones de 10 mL de agua destilada y se renen las
fases acuosas con la fraccin A.
5. Tratamiento de la fase orgnica. Esta fase se trata con 5 mL de una solucin saturada de
NaHCO
3
, se separan las fases. Etiquetar la fase acuosa como fraccin B. Tratar esta
fraccin como se indica en el inciso C.

18

5.1. Extraer la fase orgnica con 5 mL de NaOH 0.1 N. La fase acuosa resultante,
etiquetarla como fraccin C y trabajarla como se indica en el inciso C. La fase orgnica
resultante marcarla como R1.
6. Tratamiento de la fraccin A. La fase acuosa obtenida del inciso 4 se alcaliniza hasta pH = 10
con NaOH 2.5 N.
6.1. Extraer con dos porciones de CHCl
3
de 10 mL (2 x 10 mL CHCl
3
) y separar las fases.
Desechar la fase acuosa resultante en el contenedor etiquetado como R2.
6.2. Concentrar la fase orgnica hasta sequedad en el rotaevaporador. Etiquetar como
fraccin D y tratarlo como se indica en el inciso D. El disolvente orgnico resultante que se
encuentra en el matraz de condensacin debe ser desechado en el contenedor etiquetado
como R1.
B) Proceso de extraccin en medio bsico para txicos no voltiles
1. La muestra se ajusta a pH = 10 con NaOH 2.5 N.
2. Realizar la extraccin con dos porciones de CHCl
3
de 15 mL, separando las fases.
3. La fase orgnica se concentra hasta sequedad y el residuo se etiqueta como fraccin E y
se trata como se indica en el inciso D.
4. La fase acuosa se etiqueta como fraccin F y se trata segn el inciso C.
C) Cuantificacin de cido acetilsaliclico
Tratamiento de la muestra (fracciones B, C y F)
1. Colocar 1 mL de las fracciones B, C y F en tubos de forma separada y adicionar a cada
una 5 mL del reactivo para desarrollar color (apndice II), agitar, esperar 2 min.

19
2. Determinar la absorbancia a 540 nm. Si la lectura de absorbancia no cumple con la ley
de Lambert y Beer, realice las diluciones necesarias, repita el procedimiento y vuelva a
realizar la lectura.
3. Calcular la concentracin de AAS presente en su muestra, interpolando la lectura de
absorbancia en la curva patrn.
4. Despus de haber realizado la lectura y una vez obtenidos los resultados, las fracciones
B, C y F se renen y desechan en el contenedor etiquetado como R3.
Curva patrn del AAS
1. Solucin patrn de salicilato de sodio (1000 g/mL). Pesar 25 mg de salicilato de sodio
y disolverlo. Llevar hasta 25 mL con agua destilada.
2. A partir de la solucin patrn de salicilato de sodio (1000 g/mL), preparar la curva
patrn como se describe a continuacin (realizar dos curvas patrn por grupo).

Alcuota de la
solucin patrn
(mL)
Aforo con agua
destilada
Concentracin
(g/mL)
0.5 10 50
1 10 100
3 10 300
5 10 500
7 10 700

En un tubo de ensaye colocar 1 mL de las soluciones recin preparadas y adicionar 5 mL
del reactivo para desarrollar color (apndice II), agit ar la muestra en un vrtex durante
1 min, esperar 2 min y determinar la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm,
ajustando a cero con un blanco (1 mL de agua y 5 mL del reactivo para desarrollar color).


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D) Cuantificacin de cafena
Tratamiento de la muestra (fracciones D y E)
1. Disolver por separado los residuos de las fracciones D

y

E

en 5 mL de NaOH 0.1 N.
Transferirlo a un matraz volumtrico de 25 mL y aforar con NaOH 0.1 N.
2. Determinar la absorbancia de la solucin anterior a 275 nm utilizando NaOH 0.1 N
como blanco. Si la lectura de absorbancia obtenida no cumple con la ley de Lambert y
Beer, realice las diluciones necesarias con NaOH 0.1N.
3. Calcular la concentracin de cafena presente en su muestra, interpolando la lectura de
absorbancia en la curva patrn.
4. Despus de haber realizado la lectura y una vez obtenidos los resultados, las fracciones
D y E se renen y desechan en el contenedor etiquetado como R2.
Curva patrn
1. Solucin patrn de cafena (100 g/mL). Disolver 10 mg de cafena anhidra en 10 mL
de NaOH 0.1 N y aforar con la misma solucin a 100 mL.
2. A partir de la solucin patrn de cafena (100 g/mL) preparar la curva patrn como se
describe a continuacin. Por grupo realizar dos curvas patrn.

Alcuota de la
solucin patrn
(mL)
Aforo con NaOH
0.1 N
Concentracin
(g/mL)
1 25 4
2 25 8
3 25 12
4 25 16
5 25 20

3. Determinar la absorbancia de la curva patrn a una longitud de 275 nm, ajustando a cero
con un blanco (NaOH 0.1 N).

21

CUESTIONARIO
1. En el caso de emplear una muestra biolgica indique cul es el objetivo de adicionar
cido tartrico adems de ajustar el pH.
2. Una vez desarrollado el guin para una eficiente extraccin de un xenobitico, qu
puntos del proceso y propiedades fisicoqumicas considera que son crticos?
3. Complete la siguiente tabla e indique los datos de la regresin lineal de cada curva.

AAS
[g/mL]
Abs*
curva
1
Abs*
curva
2
cafena
[g/mL]
Abs*
curva
1
Abs*
curva
2
50 4
100 8
300 12
500 16
700 20
Pendiente (m) Pendiente (m)
Ordenada al origen (b) Ordenada al origen (b)
Coeficiente de
correlacin lineal (r)

Coeficiente de
correlacin lineal (r)

*Abs: Absorbancia.
Tabla 1. Curva patrn.


22

Tabla 2. Lecturas de muestras.
4. Interpole los datos de absorbancia de cada una de sus fracciones y calcule la
concentracin de AAS y/o cafena en su muestra, indicando el procedimiento que sigui
para realizarlo.
5. Es necesario considerar el factor de dilucin para calcular la concentracin inicial de
los xenobiticos en su muestra? Justifique su respuesta.
6. Complete las siguientes tablas y, de acuerdo con los resultados grupales, concluya cul
es el mejor mtodo de extraccin analizado para los xenobiticos.

Equipo
cido acetilsaliclico
Extraccin en medio cido Extraccin en medio bsico
Concentracin
(g/mL)
Rendimiento
(%)
Concentracin
(g/mL)
Rendimiento
(%)
1
2
3

Tabla 3. Resultados grupales AAS.

Equipo
Absorbancia de las fracciones
B C F D E
1
2
3

23

Tabla 4. Resultados grupales cafena.

7. En caso de no haber obtenido un rendimiento superior al 90%, analice a qu puede
atribuirse el hecho.

Equipo
Cafena
Extraccin en medio cido Extraccin en medio bsico
Concentracin
(g/mL)
Rendimiento
(%)
Concentracin
(g/mL)
Rendimiento
(%)
1
2
3

24

Referencias bibliogrficas
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science of poisons. McGraw Hill, New York, 2001, p. 1071.
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basic science of poisons. McGraw Hill, New York, 2001, p. 203.
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in pharmaceuticals body fluids and post-mortem material. Vol. 1, Pharmaceutical
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Zubair, M.C., Hassan, M.A. y Al-Meshal, I.A. Caffeine en Analytical Profiles of drug
substances, Vol. 15. Florey, K. (Ed.). Academic Press Inc., London, 1991, pp. 71-150.


25

APNDICE I
1. Efectos txicos del cido acetilsaliclico (AAS) y de la cafena.
2. Relacin entre el pKa de una sustancia con el pH del medio en el que se encuentra
disuelto.
3. Estructura de la forma inica y no inica del AAS y de la cafena.
4. Reaccin de hidrlisis del AAS.
5. Valores de pKa del AAS, cido saliclico, cido tartrico, cido actico y de la cafena.
6. Solubilidad de una sustancia inica en medio acuoso y disolvente orgnico.
7. Densidad de los disolventes a emplear.
8. Fundamento de una extraccin mltiple y selectiva.
9. Sustancias que pueden precipitar protenas.
10. Esquema de los procesos de separacin empleados tanto en medio cido como en medio
bsico, especificando qu especies qumicas se encuentran en cada una de las fases.
11. Propsito de lavar la fase orgnica con dos porciones de agua destilada en la extraccin
en medio cido.
12. Propsito de juntar las facciones acuosas obtenidas de la particin con CHCl
3
con la
fraccin A en el proceso de extraccin en medio cido.
13. Objetivo de adicionar NaHCO
3
y NaOH 0.1N en el proceso de extraccin cida.
14. Naturaleza de los compuestos obtenidos en cada una de las fracciones.
15. Dibujo de la reaccin de identificacin y cuantificacin del AAS.
16. Rango de absorbancia en el cual se cumple la ley de Lambert y Beer.
17. Razn por la cual se determinan la cafena y el AAS a diferentes longitudes de onda.
18. Forma de obtener el rendimiento de la extraccin de una sustancia.
19. El anlisis de una muestra biolgica de 20 mL para determinar la presencia de
salicilatos y/o cafena arroj las siguientes lecturas de absorbancia:


26

Absorbancia a
= 540 nm
Volumen
(mL)
Absorbancia a
= 275 nm
Volumen
(mL)
fraccin B = 0.613 15 fraccin D = 0.785 6
fraccin C = 0.456 7

Tabla 1. Absorbancia y volumen final de las fracciones B, C y D.

Para la realizacin de los clculos considere el proceso de extraccin en medio cido
descrito en el guin experimental y tome en cuenta las diluciones necesarias.

Las lecturas de absorbancia de las curvas patrn para AAS y cafena son las que se
muestran a continuacin:

AAS Cafena
Concentracin
[g/mL]
A
= 540 nm
Concentracin
[g/mL]
A
= 275 nm

50 0.060 4 0.184
100 0.133 8 0.484
300 0.421 12 0.684
500 0.713 16 0.885
700 0.970 18 1.000
b = 5.8 x 10
-3

m = 1.409 x 10
-3

r= 0.999
b = 9.2 x 10
-3

m = 0.0566
r =0.996

Tabla 2. Curva patrn.

Calcule la concentracin de AAS y cafena en la muestra inicial.


27
APNDICE II
Reactivo para desarrollar color:
Pesar 4 g de HgCl
2
y disolverlo en 12 mL de HCl 1N. Adicionar 4 g de Fe(NO
3
)
3
y agitar
hasta su total disolucin. Diluir con agua destilada a 100 mL (considerar cantidades
adicionales para el blanco y curva patrn).
Solucin de hidrxido de sodio 2.5 N
Disolver 10 g de NaOH en 25 mL de agua destilada y aforar a 100 mL.
Solucin de hidrxido de sodio 0.1 N
Disolver 0.4 g de NaOH en 25 mL de agua destilada y aforar a 100 mL.
Solucin de cido clorhdrico 1 M
Colocar 83 mL de HCl concentrado en un matraz aforado y adicionar agua destilada hasta 1 L.
Solucin de cido tartrico al 10%
Colocar 10 g en 100 mL de agua destilada.
Solucin saturada de bicarbonato de sodio.
Colocar una cantidad aproximada de bicarbonato de sodio R.A., en 10 mL de agua
destilada, hasta que no se pueda disolver en fro.

28

APNDICE III


R1: Cloroformo (restos de cido acetilsaliclico y cafena).
R2: Solucin acuosa bsica de NaOH (pH = 10), tartrato de sodio y restos de cafena
ionizada, cido acetilsaliclico y cido saliclico.
R3: Solucin acuosa con HgCl
2
y Fe(NO
3
)
3
.


29
CUANTIFICACIN DE CIANURO DE HIDRGENO, COMO
TXICO VOLTIL, A PARTIR DE GLUCSIDOS CIANOGNICOS

OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno determine la cantidad de cianuro de hidrgeno liberado a partir de
glucsidos cianognicos presentes en muestras que forman parte de la dieta de humanos y
animales, y relacione la concentracin con su potencial toxicolgico.

PROBLEMA
Que el alumno cuantifique la concentracin de cianuro de hidrgeno presente en una serie
de 2 muestras de semillas o plantas, y concluya cul de estas muestras presentan riesgo de
toxicidad para el humano, con base en la cantidad de HCN que est presente en el consumo
de 100 g de muestra.

Reactivos
- Reactivo de Guignard *
- Cianuro de potasio * (KCN)
- Carbonato de sodio (Na
2
CO
3
)
- cido clorhdrico * (HCl)
- Cloroformo (CHCl
3
)
- cido pcrico
* Ver apndice I I .

Equipo
- Espectrofotmetro
- Termmetro
- Estufa


30

Material por equipo
- Tubos de ensaye 20 x 150 con
tapn de hule

3
- Tijeras 1
- Cajas Petri 1 - Pinzas 1
- Mortero con pistilo 1 - Navaja (traer por equipo) 1
- Tiras de papel filtro cualitativo
(filtracin rpida) de 2 x 10 cm

3
- Matraz Erlenmeyer de 250 mL con tapn de
hule

3
- Pipeta volumtrica de 25 mL 1 - Pipeta graduada de 1 mL 1
- Probeta de 50 mL 1 - Embudo de cola corta 3
- Vaso de precipitado de 100 mL 3 - Hielo (proporcionado por laboratorista)

Material para la curva
- Matraces Erlenmeyer de 250 mL con tapn de hule 6
- Matraces volumtricos de 25 mL 6
- Tubos de ensaye 20 x 150 con tapn de hule 6
- Papel filtro (tiras de 2 x 10 cm) 6

NOTA: El profesor proporcionar las celdas para las lecturas.

Material de estudio
Traer por equipo aproximadamente 1g de una de las siguientes muestras: almendra de
durazno, semillas de manzana roja, almendra de ciruela pasa, semillas de lima, almendra
de capuln, almendra de cereza.


31

Cada equipo trabajar con 2 muestras problema de plantas o semillas segn la lista
mencionada, una de las cuales ser proporcionada por el profesor.

NOTA: La solucin patrn de cianuro de potasio, el cido clorhdrico 0.5 N y el agua destilada
deben estar en bao de hielo antes de realizar la parte experimental.

Preparacin de la tira reactiva

1. Cortar 2 tiras de papel filtro de 2 x 10 cm. El equipo que prepare curva patrn de HCN
deber preparar 6 tiras adicionales.
2. Sumergir las tiras de papel filtro en el reactivo de Guignard y escurrirlas, colocndolas
para su secado sobre una caja de Petri.
3. Introducir las tiras en una estufa que se encuentre estable a una temperatura entre 50 y
55
o
C, dejndolas aproximadamente 10 min, cuidando que estn humedecidas.

Preparacin de las muestras

NOTA: Antes de comenzar a triturar y pesar su muestra debern tener todos los reactivos
necesarios dentro del matraz, as como lista la tira reactiva, tanto para su muestra como para la
curva patrn.

A cada una de las muestras se le realizar el siguiente procedimiento:
1. Medir 25 mL de agua destilada con pipeta volumtrica y agregarlos a un matraz
Erlenmeyer de 250 mL, colocar el matraz en bao de hielo.
2. Adicionar al matraz del inciso anterior 1 mL de solucin de HCl 0.5N y dos gotas de CHCl
3
.
3. Poner con cuidado la tira reactiva de papel en el matraz como se indica en la Figura 1.
4. Tapar inmediatamente cada uno de los matraces Erlenmeyer con su tapn despus de
concluir este procedimiento.

32
5. Pesar la cantidad de cada muestra de acuerdo con el siguiente cuadro y colocarla en el
mortero, cortarla con la ayuda de las pinzas de diseccin y navaja, y macerarla lo ms
rpido posible.

Semilla o almendra Peso en mg
Manzana 250
Durazno 200
Pern 150
Capuln y cereza 30
Mamey 200

Tabla 1. Pesos recomendados para la determinacin de cianuro en semilla o almendra.

6. Colocar rpidamente la muestra fragmentada en el matraz Erlenmeyer de 250 mL y
tapar de inmediato.
7. Introducir simultneamente en la estufa a 40C los matraces con las muestras problema y
con los correspondientes de la curva estndar de HCN durante 1 hr.

Figura 1. Preparacin de la muestra en el matraz y colocacin de la tira reactiva.

TAPN DE HULE
PAPEL FILTRO
(TIRA ACTIVA)
MUESTRA

33

Preparacin de la curva patrn de cido cianhdrico

La curva patrn de HCN se prepara colocando en matraces volumtricos de 25 mL los
volmenes de la solucin patrn de KCN indicados en la siguiente tabla y llevando al aforo
con agua destilada:

Alcuota de la solucin
patrn de KCN (mL)
Concentracin de HCN
(g/mL)
0.0 Blanco
0.1 0.4
0.2 0.8
0.3 1.2
0.4 1.6
0.5 2

Tabla 2. Curva patrn de HCN.

1. Preparar 6 matraces Erlenmeyer de 250 mL agregando 1 mL de la solucin de HCl 0.5 N
y dos gotas de CHCl
3
. Posteriormente, colocar con cuidado la tira reactiva en el interior
del matraz, cuidando de no mojarla con el contenido, y sujetarla en la boca del matraz
con un tapn, como se indica en la Figura 1.
2. Una vez preparadas las soluciones de la curva patrn, pasarlas de inmediato a los matraces
Erlenmeyer, debidamente etiquetados, y taparlos inmediatamente con su tapn despus de
concluir este procedimiento. Finalmente, colocar los matraces en bao de hielo.
3. Introducir simultneamente en la estufa a 40C los matraces con las muestras problema y
con los correspondientes de la curva estndar de HCN durante 1 h.


34

Tratamiento de las muestras problema, curva patrn y blanco

1. Transcurrido el tiempo de incubacin, los matraces se sacan de la estufa y se dejan
enfriar. Decantar el contenido del matraz y colocar el residuo lquido en un contenedor
etiquetado como R1. El material vegetal se deja secar en la campana sobre papel
peridico para ser desechado posteriormente.
2. Introducir en un tubo de ensaye la tira reactiva positiva (procedente de muestra
problema, curva estndar o blanco), adicionar al tubo 20 mL de agua destilada, tapar el
tubo y agitar vigorosamente. Filtrar la solucin con papel filtro para eliminar residuos de
la tira de papel.
3. Determinar la absorbancia de la muestra y de la curva patrn en el espectrofotmetro a
520 nm, utilizando como blanco el primer punto de la curva.
4. Despus de haber realizado la lectura y una vez obtenido resultados, la mezcla se coloca
en un contenedor etiquetado como R2.

35

CUESTIONARIO
1. Reporte, en la siguiente tabla, los valores de absorbancia obtenidos e indique los valores
de la regresin lineal.

HCN
[g/mL]
Absorbancia
0.4
0.8
1.2
1.6
2
Pendiente (m)
Ordenada al origen (b)
Coeficiente de correlacin lineal (r)

Tabla 1. Absorbancias de la curva patrn.

2. Interpole sus valores de absorbancia en la curva y calcule la concentracin de HCN en
mg/100g de muestra, indicando el procedimiento realizado para esta determinacin.


36

3. Reporte los resultados obtenidos en su grupo y llene la siguiente tabla:

Equipo
Material
vegetal
Concentracin de HCN
(g/mL)
mg HCN/100 g
de muestra
Riesgo de
toxicidad*
1

2

3

* alto 10 mg/100g de muestra; bajo < 10 mg/100g de muestra.
Tabla 2. Resultados grupales.

4. Indique cules muestras representan un riesgo potencial en caso de su consumo.
5. Cmo podra eliminar la presencia de glucsidos cianognicos de sus muestras?
6. Proponga un mtodo para extraer txicos voltiles a partir de una muestra.


37

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Vetter, J. (2000). Plant cyanogenic glycosides en Toxicon 38, 11-36.


38

APNDICE I

1. Estructura de un glucsido cianognico.
2. Hidrlisis enzimtica de un glucsido cianognico.
3. Importancia toxicolgica de los glucsidos cianognicos.
4. Reaccin de Guignard para la deteccin de HCN.
5. Importancia que tiene que, durante la prctica, la trituracin de la muestra se realice
rpidamente y sea colocada en bao de hielo.
6. Argumento por el cual la tira reactiva no debe tocar la solucin en que se encuentra la
muestra.
7. Razn por la que se da una reaccin positiva sin que la tira reactiva est en contacto
con la muestra.
8. Causa por la cual es necesario colocar en bao de hielo las soluciones de cianuro de
potasio y el HCl 0.5N empleadas en la preparacin de la curva patrn.
9. Finalidad de agregar HCl y CHCl
3
a la muestra y a la curva patrn.
10. Propsito de calentar la muestra a 40C en la estufa.

APNDICE II

Reactivo de Guignard
Colocar 2.5 g de cido pcrico en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y disolver con 200 mL
de agua destilada. Enseguida agregar 12.5 g de carbonato de sodio (Na
2
CO
3
) y agitar
cuidadosamente para disolverlo. Llevar la solucin a un volumen de 500 mL con agua
destilada.

NOTA: Manejar con cuidado el cido pcrico, ya que esta sustancia es cancergena y se absorbe
fcilmente por la piel.


39

Solucin patrn de cianuro de potasio (KCN)
Se pesan exactamente 12.05 mg de KCN. Transferir la pesada cuidadosamente a un matraz
aforado de 50 mL, disolver y aforar con agua destilada.

NOTA: A pesar de que la concentracin utilizada de KCN en este guin es de aproximadamente
0.24 mg/mL y esta concentracin est por debajo de la DL
50
en ratones, no deber descuidar las
medidas de seguridad para su trabajo.

Solucin cido clorhdrico 0.5 N (HCl)
Medir 42.5 mL de HCl concentrado (densidad: 36.46g/100mL) y vaciar a un matraz
volumtrico de 1000 mL que contiene aproximadamente 500 mL de agua destilada, aforar
enseguida con agua destilada.

APNDICE III

R1: Solucin acuosa de HCl (0.5 N), KCl, KCN.
R2: Solucin de cido pcrico, Na
2
CO
3
, restos de isopurpurina.


40
PRODUCCIN DE METAHEMOGLOBINA POR NITRITOS Y
EFECTO PROTECTOR DEL AZUL DE METILENO I N VI VO

OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno observe la formacin de metahemoglobina (MHb) como consecuencia de la
administracin de nitrito de sodio y el efecto protector del azul de metileno.

PROBLEMA
Determinar cuantitativamente, en ratas tratadas con NaNO
2
, la reduccin en el porcentaje
de MHb debida a la administracin de azul de metileno.

Reactivos
- Heparina 1000 UI o EDTA al 10% - Solucin amortiguadora de fosfatos*
- Cianuro de potasio* (KCN) - Ferricianuro de potasio* (K
3
[Fe(CN)
6
])
- Solucin salina isotnica (SSI) - Nuevo azul de metileno*
- cido actico glacial (CH
3
COOH) - Nitrito de sodio* (NaNO
2
)
- Hidrxido de amonio (NH
4
OH) - ter dietlico
*Ver apndice I I.

Equipo
- Espectrofotmetros UV-Vis
- Centrfugas
- Balanza para pesar animales


41

Material
- Jeringa de insulina (traer por equipo) 3 - Jeringa de 3 mL (traer por equipo) 3
- Tubos de ensaye 13x100 1 - Tijeras de diseccin 1
- Pinzas de diseccin 1 - Tabla de diseccin 1
- Caja de contencin 1 - Rejilla 1
- Pipeta graduada de 5 mL 2 - Pipeta graduada de 1 mL 1
- Pipeta graduada de 0.1 mL 1 - Tubos de ensaye 16 x 150 3

Animales de experimentacin
3 Ratas Wistar macho de 200-250 g (por equipo).

1. Pesar a cada uno de los animales e identificarlos como I, II y III.
2. Administrar a la rata III, por va intraperitoneal (i.p.) una dosis de 2 mg/Kg de la
solucin de azul de metileno y, 15 minutos despus, administrar por la misma va, 50
mg/Kg de la solucin de nitrito de sodio.
3. Administrar a la rata I, por va i.p., 1 mL/Kg de SSI.
4. Administrar a la rata II, por va i.p., 50 mg/Kg de la solucin de nitrito de sodio.
5. Dejar transcurrir 30 min despus de la administracin.
6. Preparar 3 jeringas con 0.1 mL de solucin de heparina o EDTA y 3 tubos de ensaye
con 0.3 mL del mismo anticoagulante e identificarlos de acuerdo con el nmero de rata
correspondiente.
7. Anestesiar a cada rata con ter, colocarla en la tabla de diseccin y extraer de cada una,
por puncin cardiaca, 1 mL de sangre.
8. Colocar la muestra sangunea en el tubo correspondiente. Quitar la aguja de la
jeringa para evitar hemolizar la muestra sangunea. Mezclar los tubos
perfectamente por inversin, para evitar la coagulacin de las muestras.
9. Depositar las jeringas y las agujas en el contenedor para residuos peligrosos biolgico-
infecciosos (RPBI). Envolver los restos de los animales de experimentacin en una

42
hoja de papel peridico y colocarlos en la caja de contencin para su posterior
incineracin.
10. Determinar el contenido de metahemoglobina y hemoglobina total de cada muestra
como se indica a continuacin:
a) Colocar 4.9 mL de solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.6 en un tubo de ensaye.
b) Agregar 0.1 mL de sangre. Conservar el resto de la muestra hasta el final de la
determinacin y despus desactivar con hipoclorito de sodio (NaClO).
c) Mezclar y dejar reposar durante 5 minutos.
d) Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos.
e) Separar el sobrenadante.
f) Medir la absorbancia del sobrenadante a 630 nm (lectura A
1
), contra un blanco de
solucin amortiguadora de fosfatos.
g) Pasar la solucin a un tubo limpio.
h) Agregar una gota de la solucin neutralizada de KCN al sobrenadante y al blanco.
i) Mezclar y dejar reposar 2 minutos.
j) Determinar nuevamente la absorbancia a 630 nm (lectura A
2
). Recuperar la
solucin en el mismo tubo.
k) Agregar una gota de NH
4
OH concentrado al tubo del inciso i, y mezclar.
l) Transferir 2 mL de la solucin del tubo del inciso k, a otro tubo y agregar 8 mL de
la solucin amortiguadora y 0.1 mL de la solucin de K
3
[Fe(CN)
6
] al 20% en
solucin acuosa. Desechar el sobrante de la solucin proveniente del inciso k en el
contenedor etiquetado como R1.
m) Preparar un blanco empleando 2 mL de agua destilada, 8 mL de solucin
amortiguadora y 0.1 mL de la solucin de K
3
[Fe(CN)
6
] al 20% en solucin acuosa.
n) Despus de 2 minutos agregar una gota de la solucin neutralizada de KCN a cada
tubo (blanco y problema).
o) Mezclar, esperar 10 minutos y determinar la absorbancia a 540 nm, contra su
respectivo blanco (lectura A
3
). Despus de haber realizado la lectura y, una vez
obtenidos los clculos, desechar el contenido de la celda y el resto de la solucin
del inciso n en el contenedor etiquetado como R1.


43

NOTA: Todo material de vidrio que estuvo en contacto con muestras sanguneas deber ser
inactivado con NaClO previamente a su lavado.

11. Clculos:
Hemoglobina total (Hbt) en g/100 mL = A
3
x 37.4
Metahemoglobina total (MHbt) en g/100 mL = (A
1
- A
2
) 23.4
Porcentaje de MHb en sangre total (%MHbt) = (MHbt) x 100/Hbt

44

CUESTIONARIO
1. Reporte los resultados grupales en las siguientes tablas:

Equipo
SSI NaNO
2

Azul de metileno
+ NaNO
2

A
1
A
2
A
3
A
1
A
2
A
3
A
1
A
2
A
3

1
2
3

Tabla 1. Lecturas espectrofotomtricas.

Eq
SSI NaNO
2

Azul de metileno +
NaNO
2

Hbt
(g/100 mL)
MHbt
(g/100mL)
Hbt
(g/100 mL)
MHbt
(g/100mL)
Hbt
(g/100 mL)
MHbt
(g/100mL)
1
2

3
Prom
SD

%CV

Tabla 2. Determinaciones de Hb y MHb totales.

Equipo
SSI NaNO
2
Azul de metileno + NaNO
2

%MHbt %MHbt %MHbt
1
2
3
Prom
SD
%CV

Tabla 3. Comparacin del porcentaje de MHb en los diferentes tratamientos.


45

2. Graficar los resultados promedio de Hbt y MHbt para cada tratamiento.
3. Graficar los resultados porcentuales de MHbt para cada tratamiento.
4. Qu efecto observ en el %MHbt en la rata II? A qu lo atribuye?
5. Qu efecto observ en el %MHbt en la rata III? A qu lo atribuye?
6. Observ algn cambio en la cantidad de Hbt en funcin de los xenobiticos
administrados? Por qu?
7. Por qu es necesario comparar la cantidad de MHbt en valores porcentuales?


46

Dreisbach, R.H. y Robertson, W.O. Tratamiento de los envenenamientos en Manual de
toxicologa clnica, prevencin diagnstico y tratamiento, Editorial El Manual
Moderno (6 ed.), Mxico, D.F., 1988, pp. 68-70.
Hall, R.; Malia, R.G. Investigation of hemolitic anaemias en Medical Laboratory
Hematology. Ed. Butterworths, Gran Bretaa, 1984, pp. 327-333.
Klassen, C.D.; Watkins, J.B; Casarett & Doull, Manual de Toxicologa. Ed. McGraw-Hill
Interamericana (5 ed.), Mxico, 2001, pp. 394 y 395.
Stahr, H.M. Inorganic and other Analisis en Analitical Methods in toxicology. Ed. John
Wiley and sons, inc., USA, 1991, pp. 5-7.

47
APNDICE I
1. Efectos txicos de una intoxicacin por nitritos.
2. Efectos txicos de una intoxicacin con azul de metileno.
3. Esquema que explique el efecto protector del azul de metileno en una intoxicacin por
nitritos.
4. Fundamento de los mtodos analticos para determinar hemoglobina total y
metahemoglobina en sangre.
5. Especies que se determinan en A1, A2 y A3.
6. Propsito de agregar la solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.6, NH
4
OH en el paso
k de su tcnica, K
3
[Fe(CN)
6
] y KCN.

APNDICE II

Solucin amortiguadora de fosfatos pH = 6.6.
Realizar una primera solucin amortiguadora de fosfatos, disolviendo 3.8 g de fosfato
disdico anhidro (Na
2
HPO
4
) y 5.44 g de fosfato monopotsico anhidro (KH
2
PO
4
) en 1000 mL
de agua destilada. Mezclar una parte de la solucin anterior con tres partes de agua
destilada y ajustar el pH a 6.6.

Solucin de cianuro de potasio neutralizada. (KCN)
Mezclar una parte de una solucin de cianuro al 10% y otra parte de cido actico glacial al
12% (v/v).

NOTA: Tanto el cianuro de hidrgeno como los cianuros slidos o en disolucin son txicos por
absorcin por la piel, ingestin e inhalacin.


48
Solucin de ferricianuro de potasio al 20%. (K
3
[Fe(CN)
6
])
Preparar 10 mL de esta solucin.
Solucin Salina Isotnica (SSI)
Preparar 50 mL de esta solucin o comprar una presentacin comercial.

EDTA al 10%. (Preparar slo en caso de no haber heparina, consultar con el laboratorista
o el profesor)
Pesar 1 g de EDTA y disolver en agua destilada, aforar a 10 mL.

Solucin de nuevo azul de metileno en SSI (4 mg/mL)
Preparar 10 mL de esta solucin, pesando 40 mg de nuevo azul de metileno y disolviendo
en 10 mL de SSI.

Solucin de nitrito de sodio (NaNO
2
) en SSI (100 mg/mL)
Preparar 10 mL de esta solucin, pesando 1 g de NaNO
2
y disolvindolos en 10 mL de
solucin salina isotnica.

APNDICE III


R1: Solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.6, KCN, NH
4
OH, K
3
[Fe(CN)
6
] y residuos de
sangre.


49
DETERMINACIN DE MALATIN RESIDUAL

OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno sea capaz de extraer y cuantificar un xenobitico empleando sus
propiedades cido-base y reacciones de degradacin.

PROBLEMA

Cuantificar malatin residual en la superficie de vegetales comestibles y reportar un
porcentaje de recuperacin mayor o igual al 75% en la muestra control. Relacionar la
cantidad de insecticida presente en ambas muestras con el riesgo toxicolgico de su
consumo.

Material

Material vegetal
Traer por equipo 50 g de cscara de limn, calabaza o chayote; o bien 50 g de hojas
externas de col o coliflor.

Material por equipo
- Frasco de vidrio de boca ancha
con tapa (traer por equipo)

2

- Probeta graduada de 25 mL

1
- Pipeta volumtrica de 10 mL 1 - Tubo de ensaye de 16 x 150 2
- Pipeta graduada de 1 mL 3 - Vasos de precipitado de 100 mL 2
- Pipeta graduada de 5 mL 2 - Propipeta 1
- Pipeta graduada de 10 mL 2 - Soporte universal c on anillos de fierro 2
- Embudo de filtracin rpida 2 - Embudo de separacin de 125 mL 2


50

Material para la curva

- Embudo de separacin de 125 mL 3 - Pipeta graduada de 5 mL 1
- Tubo de ensaye de 16 x 150 3 - Vasos de precipitado de 100 mL 3
- Embudo de filtracin rpida 3
Reactivos
- Sulfato de sodio* (Na
2
SO
4
) - Malatin al 50%
- Hidrxido de sodio* (NaOH) - Fenolftalena*
- Cloruro frrico* (FeCl
3
) - Etanol (EtOH)
- Sulfato cprico* (CuSO
4
) - Tetracloruro de carbono (CCl
4
)
- Acetona - Disulfuro de carbono (CS
2
)

* Ver apndice II .

1. Colocar 25 g del material de estudio (nicamente la cscara o superficie del vegetal) en
un frasco de vidrio de boca ancha y aadir 30 mL de CCl
4
, tapar y agitar
vigorosamente durante 5 minutos.
2. Filtrar y recolectar cuando menos 20 mL. Medir el volumen exacto con una probeta.
3. Desechar el material vegetal tratado con CCl
4
colocndolo sobre un papel peridico,
identificar como R1 y colocar en la campana. Al finalizar la sesin, los responsables de
seguridad e higiene debern colocar R1 en una bolsa de plstico y cerrarla.
4. Preparar un tubo problema con 10 mL del extracto filtrado, midiendo con pipeta
volumtrica. Adicionar a cada tubo 0.2 mL de solucin de CS
2
al 0.5% y 5 mL de
etanol. Pasar esta mezcla a un embudo de separacin y agitar suavemente.
5. Adicionar 15 mL de solucin cida de Na
2
SO
4
al 9% y agitar cuidadosamente el
embudo por 1 minuto.

51
6. Colectar la fase orgnica en un vaso de precipitado y filtrarla, transfirindola nuevamente al
embudo de separacin enjuagado previamente con acetona. Etiquetar la fase acuosa como R2.
7. Aadir 5 mL de etanol, agitar y aadir 0.2 mL de NaOH 6N. Agitar nuevamente por 5
minutos, dejar reposar durante 1 minuto y adicionar 15 mL de solucin de Na
2
SO
4
al 9%.
Mezclar, separar las fases, recolectar la fase acuosa y desechar la fase orgnica
etiquetndola como R3.
8. Aadir 5 mL de CCl
4
a la fase acuosa y una gota de indicador fenolftalena al 1%.
Neutralizar gota a gota con HCl 6N con agitacin continua hasta la desaparicin del
color azul violeta.
9. Agregar 0.2 mL de solucin de FeCl
3
, agitar y desechar la fase orgnica en el
recipiente etiquetado como R3.
10. Aadir a la fase acuosa 5 mL de CCl
4
y 0.3 mL de solucin de CuSO
4
al 3.5% y agitar.
Colectar la fase orgnica y desechar la fase acuosa etiquetndola como R4.
11. Leer la fase orgnica en el espectrofotmetro a 416 nm, ajustando previamente a 100%
de transmitancia con CCl
4
.
12. Una vez que se obtengan los resultados finales, desechar la fase orgnica, etiquetndola
como R5.


52

Procedimiento para la curva patrn
Preparar la curva patrn de la siguiente forma:

Tubo Reactivos Concentracin
1 1 mL de solucin patrn de malatin + 4 mL de etanol 8 g/mL
2 2.5 mL de solucin patrn de malatin + 2.5 mL de etanol 20 g/mL
3 5.0 mL de solucin patrn de malatin 40 g/mL

Tabla 1. Procedimiento para la curva patrn de malatin.

Colocar el contenido de cada tubo en un embudo de separacin. Adicionar 10 mL de CCl
4
y
0.2 mL de solucin de CS
2
al 0.5%. Agitar suavemente y continuar el procedimiento como
en la muestra a partir del inciso 5.


53

Adrien, A. Selective Toxicity: the physicochemical basis of therapy. Ed. Chapman and Hall
(6a ed.), London, 1979, pp. 455-463.
CremLyn, C. Pesticides and mode of action, John Wiley & Sons, New York, 1978.
Katzung, B. Farmacologa Bsica y Clnica. Ed. El Manual Moderno (7 ed.), Mxico,
1999, pp. 119-121.
Klassen, C.D.; Watkins, J.B. Casarette & Doull, Manual de Toxicologa. Ed. McGraw-Hill
Interamericana, Mxico, 2001, pp. 615-618, 624-634, 937.
Morifusa, E. Organophosphorus pesticides: Organic and Biological Chemistry. CRC Press,
Cleveland, 1979, pp. 62-77, 103, 196-199.
Negherban, O.W. Handbook of toxicology: Insecticides. W.B. Saunders Comp., E.U.A.,
1959, pp. 451-464.
Norris, M.V.; Voil, W.A.; Averall, P.R. Colorimetric estimation of malation residues en
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1954, 2, p. 570.
Robertson, W.O., Dreishbad, R.H. Manual de Toxicologa Clnica. Prevencin,
Diagnstico y Tratamiento. El Manual Moderno (6 ed.), Mxico, 1987, pp. 95-104.
White-Stevens, R. Pesticides in the Environment, Part I and II, Marcel Dekker, Inc., New
York, 1971.


54

CUESTIONARIO

1. Reporte sus resultados en la siguiente tabla:

Malatin (g/mL) %Transmitancia Absorbancia
8
20
40
Muestra 1
Muestra 2
Pendiente (m)
Ordenada al origen (b)
Coeficiente de correlacin lineal (r)

Tabla 1. Resultados.

2. Explique por qu se determinan las lecturas en transmitancia.
3. Indique el procedimiento que sigui para realizar los clculos de concentracin de
malatin en sus muestras.
4. Reporte los resultados grupales en la siguiente tabla:
Equipo Material
vegetal
Malatin
(g/mL)
Rendimiento Malatin en la
muestra (ppm)
Riesgo
txico*
1

---
2

---
3

---

* Alto 8 ppm; bajo < 8 ppm
5. De acuerdo con los resultados obtenidos, concluya si existe un riesgo toxicolgico por el
consumo del material vegetal analizado.

55
6. En caso de encontrar una baja concentracin en alguna de las muestras, comente cmo
influira cada uno de estos factores en el resultado del anlisis: A) estabilidad del
compuesto, B) el desarrollo experimental realizado, C) cumplimiento de las normas de
aplicacin del pesticida en cuestin.

APNDICE I

1. Usos y propiedades biolgicas del malatin.
2. Ventajas que presentan los pesticidas organofosforados con relacin a los
organoclorados.
3. Mecanismo de toxicidad del malatin en el insecto.
4. Mecanismo de potenciacin del efecto txico del malatin en insectos.
5. Enzimas involucradas en la destoxificacin del malatin en insectos y en mamferos.
6. Comparacin de los valores de DL
50
para mamferos y para insectos.
7. Propsito de adicionar los siguientes reactivos: CCl
4
, CS
2
, EtOH, solucin cida Na
2
SO
4

al 9%, NaOH, solucin Na
2
SO
4
al 9%, fenolftalena, HCl, FeCl
3
y CuSO
4
.
8. Dibuje la reaccin que se lleva a cabo con el malatin en medio bsico y presencia de
etanol.
9. Estructura del compuesto de coordinacin que se forma durante la prctica con los
productos de la reaccin anterior y el catin Cu
2+
. Relacin matemtica entre
absorbancia y transmitancia.
10. Lmites permitidos de acuerdo con la NOM vigente para el malatin.


56

APNDICE II
Solucin patrn de malatin 40 g/mL
Medir 0.1 mL de malatin al 50% y aforar con etanol a 100 mL. De esta solucin medir
8 mL y aforar a 100 mL con etanol.

Nota: El malatin es inhibidor de la colinesterasa y se absorbe fcilmente por piel y vas
respiratorias, se debe extremar cuidado con su contacto directo. Sus efectos agudos incluyen
convulsiones, coma y fallo respiratorio.

Disulfuro de carbono al 0.5% (CS
2
)
Para preparar 100 mL, medir 0.5 mL de CS
2
y aforar a 100 mL con CCl
4
.

Nota: El CS
2
es altamente txico, se absorbe por piel y vas respiratorias. Sus efectos txicos
incluyen irritacin de membranas, nusea, vmito, prdida de conocimiento y convulsiones.

Sulfato de sodio al 9% (Na
2
SO
4
)
Para preparar 100 mL, pesar 9 g de Na
2
SO
4
y aforar a 100 mL con agua destilada.

Solucin cida de sulfato de sodio
A 100 mL de solucin de Na
2
SO
4
al 9% adicionar 3 mL de HCl concentrado.

Hidrxido de sodio 6N (NaOH)
Para preparar 100 mL, pesar 24 g de NaOH y aforar a 100 mL con agua destilada.

cido clorhdrico 6N (HCl)
Para preparar 100 mL, medir 48.5 mL de HCl concentrado y aforar a 100 mL con agua
destilada.


57

Cloruro frrico al 5% (FeCl
3
)
Para preparar 100 mL, pesar 5 g de FeCl
3
y disolver en 1 mL de HCl 6N, aforar a 100 mL
con agua destilada.

Sulfato cprico al 3.5% (CuSO
4
)
Para preparar 100 mL, pesar 3.5 g de CuSO
4
Fenolftalena al 1%
Para preparar 100 mL, pesar 1 g y aforar a 100 mL con EtOH.

APNDICE III


R1: Material vegetal con CCl
4.

R2: Solucin cida de Na
2
SO
4
al 9% y EtOH.
R3: CCl
4
y subproductos orgnicos de hidrlisis cida.
R4: CuSO
4
, FeCl
3
, Na
2
SO
4
, fenolftalena, H
2
O.
R5: CCl
4
y compuesto de coordinacin de cobre.


58

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
DE LA QUERCETINA Y EL CIDO NORDIHIDROGUAYARTICO

OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno sea capaz de determinar la capacidad antioxidante de sustancias qumicas.

PROBLEMA
Determinar la capacidad antioxidante de la quercetina y el cido nordihidroguayartico
mediante la reduccin en la produccin de anin superxido, utilizando el sistema xantina-
xantina oxidasa-nitroazul de tetrazolio.

Reactivos
- Xantina (Xan) - Carbonato de sodio (Na
2
CO
3
)
- Xantina oxidasa (XO) - Bicarbonato de sodio (NaHCO
3
)
- Nitroazul de tetrazolio (NAT) - EDTA
- Quercetina - Nitrato de cobre (Cu(NO
3
)
2
)
- cido nordihidroguayartico (ANDG)

Equipo
- Balanza analtica - Potencimetro
- Espectrofotmetro

Material por equipo
- Tubos Eppendorf 1.5 mL 4 - Gradilla 1
- Micropipeta de 100-1000 l 1 - Esptula de cromo nquel 1
- Micropipeta de 10-100 l 1 - Nave de pesado 1
- Celda 1 - Matraces de 250 mL 2

59

1. Todo el material de vidrio deber ser enjuagado previamente con EDTA.
2. Marcar 4 tubos Eppendorf como control positivo (C+), control negativo (C-), quercetina
y ANDG.
3. Preparar los tubos de acuerdo con la siguiente tabla, siguiendo el orden de adicin
indicado en la columna reactivo.

Tubo
Reactivo
Control
positivo
(L)
Control
negativo
(L)
Antioxidante 0.25 M
quercetina (L) ANDG (L)
a. Xantina 100 100 100 100
b. EDTA 100 100 100 100
c. Solucin
amortiguadora
300 600 200 200
d. NBT 300 300 300 300
e. Antioxidante - - 100 100
f. XO* 300 - 300 300
g. Agitar e I ncubar ** 1h 1h 1h 1h
h. Cu(NO
3
)
2
200 200 200 200

* Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo.
** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversin e incubar a 24-30C.

Tabla 1. Preparacin de los tubos problema y control.

4. Transcurrido el tiempo de incubacin, leer las diferentes muestras a 560 nm, empleando
como blanco una solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2.
5. Interpretar los resultados obtenidos considerando que el control positivo representa el
100% de formazn en el sistema Xan-XO-NAT de acuerdo con la siguiente frmula.
% atrapamiento= 100 - [(A
M
) x100/A
C+
]

En donde:
A
M
= absorbancia de la quercetina y/o ANDG
A
C+
= absorbancia del control positivo


60

6. Una vez obtenidos los resultados, desechar el contenido de los tubos en un frasco
etiquetado como R1.
7. Depositar las puntas y los tubos Eppendorf en un contenedor proporcionado por el profesor.

CUESTIONARIO
Control positivo (C+) Quercetina ANDG
Absorbancia
% Atrapamiento 0 %

Tabla 1. Resultados por equipo.

2. Cul de los dos antioxidantes muestra una mayor capacidad atrapadora del radical O2-?
3. Considera que el consumo habitual de estos antioxidantes contribuira a disminuir el
estrs oxidante? Justifique su respuesta.
Equipo
% de Atrapamiento
Quercetina ANDG
1
2
3
4
Promedio
Desviacin estndar


5. En caso de que los resultados grupales muestren una elevada variabilidad, discutan a qu
factores se podra atribuir dicho comportamiento.


61

Cadenas, E.; Packer, L. Handbook of Antioxidants. Marcel Dekker, Inc., New York, 2002.
Klaassen, C.D., Watkins, J.B. Manual de Toxicologa de Casarett & Doull: la ciencia
bsica de los txicos, (5 ed.), McGraw-Hill, Mxico, 2001.
Klassen, C.D. Casarett and Doulls Toxicologa: la ciencia de los venenos, (6a ed.), Ed.
Mc Graw-Hill, Interamericana, 2001.
Martnez-Flrez, S.; Gonzlez-Gallego, J.; Culebras, J.M., y Tun, M.J. (2002). Los
flavonoides: propiedades y acciones antioxidantes en Nutricin Hospitalaria. XVII,
271-278.
Owena, P.L.; Johns, T. (1999). Xanthine oxidase inhibitory activity of northeastern north
American plant remedies used for gout en Journal of Ethnopharmacology 64, 149-160.
Tsutomu, K.; Susumu, T.; Hidetaka, N., et al. (2003). A novel and potent biological
antioxidant, kinobeon A, from cell culture off sunflower en Life Sciences 74, 87-97.
Wardman, P., (2007). Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative
and nitrosactive species in cells and tissues: Progress, pitfalls, and prospects en
Free Radical Biology & Medicine 43, 995-1022.
World Health Organization monographs on selected medicinal plants, Volume 1, 1999,
Geneva, pp. 16-32.

62

APNDICE I

1. Definicin del proceso de estrs oxidante.
2. Reaccin catalizada por la XO.
3. Nocin de radical libre y especies reactivas.
4. Concepto de antioxidante.
5. Reaccin de Fenton.
6. Propsito de la adicin secuencial de: xantina, EDTA, solucin amortiguadora de
carbonatos pH 10.2, nitroazul de tetrazolio, XO y Cu(NO
3
)
2.

7. Completar los productos en el siguiente diagrama.

+

8. Especie qumica que absorbe a 560 nm.


63

APNDICE II

Xantina 1.5 mM
Pesar 22.7 mg de xantina, agregar Na
2
CO
3
0.4 M hasta solubilizar y aforar a 50 mL con
solucin amortiguadora de carbonatos.

Solucin amortiguadora de bicarbonato de sodio-carbonato de sodio 84 mM, pH 10.2
Pesar 970 mg de NaHCO
3
y 1.01 g de Na
2
CO
3
, disolverlos con agua destilada. Ajustar pH a
10.2 y aforar a 250 mL.

Nitroazul de tetrazolio 0.1 M
Pesar 41 mg de nitroazul de tetrazolio y aforar a 50 mL con agua destilada. Guardar la
solucin en un frasco mbar en el refrigerador.

EDTA 0.1 mM
Pesar 33.6 mg de EDTA, disolver con agua destilada, aforar a 1 L.

Xantina oxidasa
La enzima se preparar durante la sesin de laboratorio de acuerdo con la indicacin de los
profesores.

Nitrato de cobre 0.2 mM (Cu(NO
3
)
2
)
Pesar 4 mg de Cu(NO
3
)
2

Quercetina 0.25 M
Pesar 1.4 mg de quercetina y aforar a 250 mL con solucin amortiguadora de carbonatos
pH 10.2 (solucin stock).


64

ANDG 0.25 M
Pesar 1.3 mg de ANDG y aforar a 250 mL con solucin amortiguadora de carbonatos pH
10.2 (solucin stock).

APNDICE III
R1: xantina, xantina oxidasa, EDTA, solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2,
nitroazul de tetrazolio, quercetina, cido nordihidroguayartico, Cu(NO
3
)
2
, formazn, cido
rico, H
2
O
2
.


65

EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD GENOTXICA DE LA
CICLOFOSFAMIDA UTILIZANDO LA TCNICA DE
MICRONCLEOS EN MDULA SEA

OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno sea capaz de determinar la actividad genotxica de un xenobitico
empleando la tcnica de cuantificacin de microncleos en mdula sea de ratn.
PROBLEMA
Identificar la presencia de microncleos, inducidos por ciclofosfamida, en eritrocitos
policromticos de mdula sea murina.

Animales de experimentacin
Un ratn ICR por equipo, administrado 24 horas antes con ciclofosfamida con una dosis de
40 mg/Kg i.p. o un ratn ICR control negativo no tratado.

Material por equipo
- Tijeras de diseccin 2 - Portaobjetos 6
- Pinzas de diseccin 2 - Pipeta Pasteur 4
- Bulbo para pipeta Pasteur 4 - Contador de clulas 1
- Microscopio ptico 2

Reactivos
- Solucin salina isotnica (SSI) - Colorante de Giemsa 2 %
- Aceite de inmersin. - Etanol (EtOH)
- Solucin amortiguadora de fosfatos pH=6.8


66

NOTA: El siguiente protocolo requiere que no pasen ms de 30 minutos entre los pasos 1 y 9.

1. Sacrificar al ratn por dislocacin cervical.

2. Una vez muerto el animal de experimentacin, fijarlo a la mesa de trabajo.
3. Dislocar la articulacin del fmur con la cadera, estirando las patas traseras del animal.

4. Diseccionar y extraer el fmur cortando por arriba de la cresta iliaca (en la cadera) y por
debajo de la rodilla.


67
5. Limpiar cuidadosamente cada fmur con papel hasta eliminar totalmente todo el tejido
muscular. Para facilitar la eliminacin del tejido muscular, tomar la parte que queda
debajo de la rodilla y rotarla al lado contrario del movimiento natural de la articulacin
de la rodilla y el fmur.

6. Una vez limpio, cortar cuidadosamente ambas epfisis y lavar el interior del fmur con 3
mL de SSI empleando una jeringa de 3 mL con aguja del nmero 21. Recolectar y reunir
en un mismo tubo de 13 x 100, la mdula de cada fmur.

7. Envolver los restos del animal de experimentacin en una hoja de papel peridico,
colocarlos en la caja de contencin para incinerarlo posteriormente.


68

8. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 min el tubo que contiene la mdula (tubo del inciso 6),
extraer el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta Pasteur, y resuspender el botn
en una gota de SSI. Depositar el sobrenadante en una solucin de hipoclorito de sodio.
9. Realizar 4 extendidos de la siguiente manera: colocar en la orilla de un portaobjetos una
gota de la suspensin de mdula sea y un segundo portaobjetos justo atrs de la gota en
ngulo de 45. Dejar que la muestra se distribuya por capilaridad y deslizar suavemente
para formar una delgada capa de clulas.

10. Secar completamente los extendidos al aire.
11. Adicionar por goteo EtOH a las laminillas, hasta cubrir la superficie y secar al aire.
Repetir esta operacin durante 5 minutos.


69
12. A cada laminilla adicionar dos o tres gotas de colorante de Giemsa 2% y cubrir con un
cubreobjetos. Dejar reposar durante 10 minutos.

13. Retirar cuidadosamente el cubreobjetos, y enjuagar la laminilla con agua destilada.

14. Cubrir la laminilla con solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.8 durante 5 minutos.
15. Enjuagar la laminilla una vez ms con agua destilada y secar al aire.
16. Observar al microscopio con aceite de inmersin, y registrar los siguientes datos:
- El nmero de eritrocitos policromticos por cada 200 eritrocitos totales.
- El nmero de eritrocitos policromticos micronucleados por cada 1000 eritrocitos
policromticos.

70

NOTA: Debido a que el conteo de los microncleos se debe realizar al ciego, el alumno no sabr
hasta el final de la prctica si el animal de experimentacin proporcionado ha sido tratado o no
con ciclofosfamida.
CUESTIONARIO

1. Con base en la experiencia adquirida, indique dos caractersticas que le permitan
identificar un microncleo y diferenciarlo de un artefacto producto de la tincin.
EPC
a
/ ET
b
EPCMN
c
/ EPC
Laminilla 1
Laminilla 2
Laminilla 3
Laminilla 4
Sumatoria /200 ET /1000 EPC

*EPC: Eritrocitos policromticos,
b
ET: Eritrocitos totales,
c
EPCMN: Eritrocitos policromticos micronucleados.

Tabla 1. Resultados por equipo.

Eritrocito
policromtico
micronucleado
Eritrocito
normocromtico
Eritrocito
policromtico
Eritrocito normocromtico
micronucleado

71


Ciclofosfamida EPC
a
/ ET
b
EPCMN
c
/ EPC

Promedio /200 ET /1000 EPC

Datos tericos de los individuos control
Control (-) n=3
Promedio 116/200 ET 5/1000 EPC
cociente 0.58 0.005
SD 0.0006 0.0006

*EPC: Eritrocitos policromticos,
b
ET: Eritrocitos totales,
c
EPCMN: Eritrocitos policromticos micronucleados.


4. Realice una comparacin estadstica mediante (t-Student) entre los dos grupos y
concluya si existen diferencias significativas como para considerar un dao genotxico.

5. Con el protocolo empleado y los resultados obtenidos, podra establecer si el dao
genotxico ocasionado por la ciclofosfamida fue clastognico o aneuploidgeno? Explique
su respuesta.


72


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73

APNDICE I

1. Definicin de eritropoyesis.
2. Concepto de microncleo y proceso de formacin.
3. Diferencia entre dao clastognico y aneuploidgeno, y cmo se pueden diferenciar con
la tcnica de microncleos.
4. Fundamento de la tincin de Giemsa.
5. Coloracin que adquieren los eritrocitos maduros, inmaduros y micronucleados con el
colorante de Giemsa.
6. Mecanismo de accin genotxica de la ciclofosfamida.
7. Usos clnicos de la ciclofosfamida.
8. Propsito de adicionar EtOH y solucin amortiguadora de fosfatos pH=6.8.
9. Se determin la actividad genotxica de la daunorrubicina y la apigenina en sangre
perifrica de ratn, administrando grupos de 15 animales para cada tratamiento. Los
xenobiticos en estudio se administraron a 2.5 mg/kg, mientras que el grupo control fue
administrado con SSI, obteniendo los siguientes resultados:

Grupo Microncleos/1000 clulas
SSI 0.5 0.33
Daunorrubicina 18.6 0.62
Apigenina 1.6 0.80

Tabla 1. Promedio de nmero de microncleos por cada tratamiento.


74

Realice una comparacin estadstica (t-Student) de los grupos tratados con especto al
control, y concluya si existen diferencias significativas que sean indicativas de dao
genotxico.

(n
1
- 1)S
1
2
+ (n
2
1)S
2
2

n
1
+ n
2
- 2
S
p
=

2

S
p
*

y
1
y
2

n
1
+ n
2

t
0
=
2
1 + 1

75

Grados
de
libertad
0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.025 0.01 0.005
1 1.000 1.376 1.963 3.078 6.314 12.706 31.821 63.657
2 0.816 1.061 1.386 1.886 2.920 4.303 6.965 9.925
3 0.765 0.978 1.250 1.638 2.353 3.182 4.541 5.841
4 0.741 0.941 1.190 1.533 2.132 2.776 3.747 4.604
5 0.727 0.920 1.156 1.476 2.015 2.571 3.365 4.032
6 0.718 0.906 1.134 1.440 1.943 2.447 3.143 3.707
7 0.711 0.896 1.119 1.415 1.895 2.365 2.998 3.499
8 0.706 0.889 1.108 1.397 1.860 2.306 2.896 3.355
9 0.703 0.883 1.100 1.383 1.833 2.262 2.821 3.250
10 0.700 0.879 1.093 1.372 1.812 2.228 2.764 3.169
11 0.697 0.876 1.088 1.363 1.796 2.201 2.718 3.106
12 0.695 0.873 1.083 1.356 1.782 2.179 2.681 3.055
13 0.694 0.870 1.079 1.350 1.771 2.160 2.650 3.012
14 0.692 0.868 1.076 1.345 1.761 2.145 2.624 2.977
15 0.691 0.866 1.074 1.341 1.753 2.131 2.602 2.947
16 0.690 0.865 1.071 1.337 1.746 2.120 2.583 2.921
17 0.689 0.863 1.069 1.333 1.740 2.110 2.567 2.898
18 0.688 0.862 1.067 1.330 1.734 2.101 2.552 2.878
19 0.688 0.861 1.066 1.328 1.729 2.093 2.539 2.861
20 0.687 0.860 1.064 1.325 1.725 2.086 2.528 2.845
21 0.686 0.859 1.063 1.323 1.721 2.080 2.518 2.831
22 0.686 0.858 1.061 1.321 1.717 2.074 2.508 2.819
23 0.685 0.858 1.060 1.319 1.714 2.069 2.500 2.807
24 0.685 0.857 1.059 1.318 1.711 2.064 2.492 2.797
25 0.684 0.856 1.058 1.316 1.708 2.060 2.485 2.787
26 0.684 0.856 1.058 1.315 1.706 2.056 2.479 2.779
27 0.684 0.855 1.057 1.314 1.703 2.052 2.473 2.771
28 0.683 0.855 1.056 1.313 1.701 2.048 2.467 2.763
29 0.683 0.854 1.055 1.311 1.699 2.045 2.462 2.756
30 0.683 0.854 1.055 1.310 1.697 2.042 2.457 2.750
40 0.681 0.851 1.050 1.303 1.684 2.021 2.423 2.704
60 0.679 0.848 1.046 1.296 1.671 2.000 2.390 2.660
120 0.677 0.845 1.041 1.289 1.658 1.980 2.358 2.617
0.674 0.842 1.036 1.282 1.645 1.960 2.326 2.576

Tabla 2. t-Student.

76

APNDICE II

Solucin salina isotnica (SSI)
Para preparar 100 mL, se pesan 0.9 g de NaCl y se disuelven en 100 mL de agua destilada;
o bien, puede utilizarse la solucin comercial.

Solucin amortiguadora de fosfatos
Na
2
HPO
4
.....................2.56 g
KH
2
PO
4
........................6.63 g
Agua destilada (cuanto baste para un litro)

Giemsa al 2%
Tomar 2 mL de Giemsa comercial y diluir en 100 mL de agua destilada.


77
EFECTOS TXICOS
DE LA ADMINISTRACIN DE PLOMO EN RATAS

OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno visualice el dao macroscpico ocasionado en hgado y bazo de ratas
administradas de forma sub-aguda con diferentes dosis de acetato de plomo por va i.p.
Relacionar dicho dao con las alteraciones que se presentan en la morfologa de los eritrocitos y
en los valores del hematocrito (Hto), hemoglobina total (Hbt) y hemoglobina libre (Hbl).

PROBLEMA
Identificar cul de las dos soluciones de acetato de plomo causa mayor dao en las ratas, al
relacionar los resultados encontrados macroscpicamente en el hgado y bazo, con los
encontrados microscpicamente en los eritrocitos y en la cuantificacin del Hto, Hbt, y Hbl.

El trabajo experimental se desarrollar por equipos en 4 sesiones de laboratorio.

Animales de experimentacin (por equipo para las cuatro sesiones)
3 ratas del mismo sexo y peso entre 180 y 300 g.

Material por equipo
- Balanza para animales - 3 jeringas para INSULINA (traer por cada sesin)
- Caja de contencin - Traer marcadores de tinta permanente color rojo, negro y azul
- Algodn - Perforador (primera sesin)

Reactivos
- Acetato de plomo (Pb(CH
3
COO)
2
) - ter etlico
- Solucin salina isotnica (SSI) - Etanol (EtOH)
- Hipoclorito de sodio al 6% (NaClO)

78

Procedimiento Sesin I (primera administracin)
1. Cada equipo contar con 3 ratas.
2. Pesar e identificar mediante tincin en la cola y perforaciones en la oreja, previa
anestesia con ter, a cada una de las ratas.

Nota: El profesor indicar el color con el que se deber marcar las colas de las ratas en cada
equipo y qu numeracin se asignar a cada una de las ratas, de acuerdo con el siguiente cdigo.

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10

3. A cada equipo se le proporcionar 3 soluciones etiquetadas como solucin A, B, y SSI.
4. A cada rata se le administrar, por va intraperitoneal, un volumen de 0.5 mL de la
solucin que le corresponda.

Procedimiento para la Sesin II y III (segunda y tercera administracin)
1. Pesar a cada una de las ratas.
2. A cada rata se le administrar un volumen de 0.5 mL de la solucin que le corresponda
por va intraperitoneal.

Unidades = Oreja derecha
Decenas = Oreja izquierda

79

Procedimiento para la Sesin IV
Material por equipo
- Navaja para bistur con porta bistur 1 - Pinza de diseccin 1
- Gradilla 1 - Tubos de ensayo de 13 x 100 15
- Tijeras de diseccin 1 - Tabla de diseccin 1
- Caja de contencin 1 - Pipetas graduadas de 10 mL 2
- Jeringas de 5 mL 5 - Tubos de ensayo de 16 x 150 5
- Tubos capilares 8 - Vasos de precipitados de 100 mL 2
- Portaobjetos 16 - Algodn
- Pipetas volumtricas de 5 mL 2 - Celdas de vidrio 2
- Vaso de precipitados de 250 mL 1 - Cajas de Petri 4
- Micropipeta 1 - Pipeta graduada de 1 mL 1

Reactivos
- Nuevo azul de metileno - Reactivo de Drabkin
- Solucin de heparina 1000 UI o EDTA al 10% - ter etlico
- Colorante de Wrigth - Etanol (EtOH)
- Solucin patrn de cianometahemoglobina
(CNMHb)
- Bencidina al 1%
- Perxido de hidrgeno al 1% (H
2
O
2
) -Solucin salina isotnica
(SSI)
Equipo
- Centrfuga para microhematocrito - Espectrofotmetro
- Microscopio de ptico(s) con objetivo de inmersin - Centrfuga

1. Preparar 3 jeringas con 0.1 mL de solucin de heparina o EDTA al 10%.
2. Marcar 3 tubos de ensayo de 13 x 100 con el nmero de la rata que corresponda y
agregar 0.1 mL de heparina o 0.5 mL de EDTA al 10 % como anticoagulante.
3. Anestesiar las ratas con ter etlico y, mediante puncin cardiaca, obtener un volumen
de 3 mL de sangre de cada una de las ratas.


80

4. Quitar la aguja de la jeringa y transferir la sangre inmediatamente al tubo de 13 x 100
correspondiente. Mezclar perfectamente con el anticoagulante por inversin del tubo.
5. Sacrificar la rata por dislocacin cervical.
6. Llenar dos capilares con la sangre obtenida en el inciso 4 para calcular el hematocrito
de acuerdo con lo indicado en la seccin de tcnicas experimentales.
7. Realizar dos frotis de cada una de las muestras sanguneas con colorante de Wright de
acuerdo con la seccin de tcnicas experimentales.
8. Realizar dos frotis de cada una de las muestras sanguneas con colorante nuevo azul de
metileno (NAM) de acuerdo con la seccin de tcnicas experimentales.
9. Realizar la cuantificacin de hemoglobina total de acuerdo con la seccin de tcnicas
experimentales. Una vez realizadas las determinaciones anteriores, centrifugar cada
uno de los tubos con la sangre restante a 2500 rpm x 5 min y separar el plasma del
paquete celular. Determinar hemoglobina libre en plasma segn la seccin de tcnicas
experimentales. Colocar el tubo con el paquete celular residual en un contenedor con
hipoclorito de sodio.
10. Hacer una incisin en la parte media del abdomen y extraer el bazo y el hgado de cada
rata. Colocar los rganos en cajas de Petri con SSI, para evitar su deshidratacin.
Observar y comparar los rganos con respecto a la rata control.
11. Envolver los restos de los animales de experimentacin en una hoja de papel peridico
y colocarlos en la caja de contencin para su posterior incineracin.
12. Los animales que no fueron empleados debern ser devueltos al bioterio.

Tcnicas experimentales

Tcnica de microhematocrito

1. Llenar con sangre las 2/3 partes de un tubo capilar para cada muestra. Realizar esta
operacin por duplicado.
2. El extremo vaco se cierra con calor.
3. Colocar los capilares con el extremo cerrado hacia fuera en los surcos radiales de la
centrfuga para microhematocrito y centrifugar a 11000 rpm x 10 min.

81

4. Calcular el hematocrito midiendo la altura del paquete globular (M
2
) en relacin con la
altura total de la muestra (M
1
) y expresarla en %.

5. Una vez obtenido los resultados, depositar los capilares en el contenedor para residuos
peligrosos biolgico-infecciosos (RPBI).

Tincin de Wright

1. Hacer un frotis de cada muestra, de la siguiente forma:

Muestra de sangre

1
2
1
2
1
A. Poner una pequea
gota de sangre sobre el
portaobjetos 1 y colocar
el portaobjetos 2 en
frente de la muestra.
B. Mediante un
movimiento uniforme
deslizar el portaobjetos
2 sobre el 1.
C. Para formar una
monocapa uniforme
de clulas.
M
1
_________ 100 %

M
2
_________ X%
M
2

_
_
_
_
_
_
_
_
_

X

%

M
2

_
_
_
_
_
_
_
_
_

X
M
1

M
2


82

2. Dejar que los extendidos sequen al aire.
3. Adicionar por goteo EtOH a las laminillas hasta cubrir la superficie y secar al aire.
Repetir esta operacin durante 5 minutos.
4. Cubrir el portaobjetos por completo con el colorante de Wright. Transcurridos 5
minutos, enjuagar con agua destilada y dejar secar. Depositar los residuos de la tincin
en un frasco etiquetado como R1.
5. Observar los frotis al microscopio con el objetivo 100x, usando aceite de inmersin.

Tincin con nuevo azul de metileno

1. Agregar con una pipeta Pasteur 3 gotas de sangre y 3 de colorante a un tubo de 13 x 100 y
mezclar. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 5 min.
2. Colocar una gota de la mezcla anterior en un portaobjetos y hacer un frotis siguiendo la
tcnica descrita (la metodologa de la tincin de Wright). Dejar secar al aire.
3. Observar los frotis al microscopio con el objetivo 100x, usando aceite de inmersin.
4. Colocar los tubos en el contenedor con hipoclorito de sodio y lavar.

Cuantificacin de hemoglobina total

1. Preparar 5 tubos de acuerdo con la siguiente tabla, agitando cuidadosamente despus
de la adicin de cada reactivo y dejar reposar 10 min.

Tubo
REACTIVO (mL)
Blanco Referencia* A B SSI
SOLUCIN DE REFERENCIA ---- 0.02 ---- ---- ----
MUESTRA ----- ---- 0.02 0.02 0.02
DRABKIN 5 5 5 5 5

*Consultar la concentracin de la solucin de referencia en la etiqueta del frasco.

Tabla 1. Cuantificacin de Hbt


83

2. Ajustar la absorbancia a cero con el blanco y leer a 540 nm.
3. Calcular la concentracin de Hbt en g/dL empleando la siguiente frmula:

Hbt = A
prob
*(C
ref.
/A
ref.
)

Donde:
C
ref.
= concentracin de la solucin de referencia (g/dL)
A
prob
= absorbancia del problema
A
ref.
= absorbancia de la solucin de referencia

4. Una vez ledos, colocar el contenido de los tubos en un contenedor etiquetado como R2.

Cuantificacin de hemoglobina libre en plasma

1. Marcar 6 tubos de 16 x 150 y trabajar segn la siguiente tabla:

A B SSI Solucin
Estndar*
Blanco
Bencidina 1% 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL
Plasma 0.02 mL 0.02 mL 0.02 mL ------ ------
Estndar ------ ------ ------ 0.02 mL ------
Agua destilada ------ ------ ------ ------ 0.02 mL
H
2
O
2
1% 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL
Mantener los tubos a temperatura ambiente durante 20 minutos
cido actico
10%
10.0 mL 10.0 mL 10.0 mL 10.0 mL 10.0 mL

*Preparar una solucin estndar de hemoglobina con una concentracin de 150 mg/L a partir de la solucin
estndar de hemoglobina total.

Tabla 2. Cuantificacin de Hbl.


84

2. Mezclar y dejar reposar 10 min a temperatura ambiente, leer a 515 nm.

Abs. del problema
Clculos: mg de Hbl = ----------------------------- * concentracin del estndar (mg/L)
Abs. del estndar

3. Una vez ledos, colocar el contenido de los tubos en un contenedor etiquetado como R3.

CUESTIONARIO

Rata Absorbancia Hbt Absorbancia Hbl
Hematocrito* (cm)
M
1

M
2

M
1

M
2

SSI
A
B

*M
1
= altura total de las muestras, M
2
= altura del paquete globular.

2. Con los datos de la tabla anterior, calcule segn la seccin de tcnicas experimentales:
Hto, Hbt, Hbl y reporte sus resultados en la siguiente tabla:

Rata rganos* Frotis* Hto
%
Hbt
g/dL
Hbl
mg/L
Efecto*
Txico Hgado Bazo Wrigth NAM
A
B
SSI

*En los espacios para hgado, bazo, frotis Wrigth, NAM y efecto txico, calificar con cruces el efecto txico,
siendo (++) para el de mayor efecto, (+) para el menor y (-) para la ausencia de efecto.

85

3. Cules fueron las diferencias en las alteraciones morfolgicas en hgado y bazo para
cada tratamiento?
4. Cules fueron las diferencias observadas en las clulas sanguneas, con respecto al
control utilizando las tinciones de Wright y NAM?
5. Qu relacin observ entre las alteraciones morfolgicas de las clulas sanguneas y
la proporcin de reticulocitos?
6. Qu relacin observ entre las alteraciones morfolgicas de las clulas sanguneas y
los valores de hematocrito encontrados en cada una de las ratas? Qu relacin observ
entre la proporcin de reticulocitos, los valores de Hbl y Hbt?
7. Qu relacin observ entre la proporcin de reticulocitos con los valores obtenidos de
Hto? Cmo afect la dosis de la solucin A y B al valor de Hbl y Hbt con respecto al
control?
8. Qu relacin observ entre los valores de Hbt y Hbl con el Hto en cada una de las ratas?
9. Concluya qu solucin provoc mayor efecto txico.


86

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87

APNDICE I

1. Fundamento de la determinacin de hemoglobina total, por el mtodo de la
cianometahemoglobina y el de la hemoglobina libre, por el mtodo de la bencidina.
2. Fundamento de la determinacin del hematocrito, por la tcnica del microhematocrito.
3. Fundamento de la tincin de Wrigth y del Nuevo Azul de Metileno.
4. Influencia de la edad del individuo en la absorcin gastrointestinal del plomo.
5. Tejidos principales de distribucin y depsito del plomo en el organismo.
6. Efectos que ocurren en los eritrocitos cuando la concentracin de plomo rebasa el valor
de 80g/dL y qu es lo que provoca esta manifestacin.
7. Manifestacin principal en una intoxicacin por plomo en el sistema nervioso central.
8. Sntomas principales de intoxicacin por plomo en el tracto gastrointestinal.
9. Influencia de la edad y el sexo en los niveles de plomo en sangre en los seres humanos.
10. Efectos que producen la anemia que se manifiesta por la intoxicacin por plomo.
11. Vida media del plomo en sangre y huesos. Papel que juegan los eritrocitos en la
relacin de concentracin plasma/orina en la eliminacin del mismo.
12. Caractersticas en una intoxicacin crnica (30-50 g/dL) por plomo en los nios.
13. Papel que juega la sal Na
2
CaEDTA, en dosis de 40 mg/Kg en el diagnstico por
intoxicacin por plomo.
14. Medidas teraputicas que se toman en una intoxicacin por plomo y que concentracin
plasmtica del mismo debe de estar presente para que se aplique a los nios.

APNDICE II

Solucin salina isotnica (SSI)
Puede utilizarse la solucin comercial o preparar una solucin de cloruro de sodio al 0.9 %.
Para preparar 100 mL, se pesan 0.9 g de cloruro de sodio y se disuelven en 100 mL de agua
destilada.


88

Reactivo de Drabkin. (preguntar al profesor si ya est preparado)
Bicarbonato de sodio (NaHCO
3
) 1.0 g
Ferricianuro de potasio (K
3
[Fe(CN)
6
]) 0.20 g
Cianuro de potasio (KCN) 0.05 g
Saponina 0.1 g
Agua destilada c.b.p. 1000 mL

Nota: El reactivo de Drabkin y la solucin estndar de CNMHb. Contienen derivados de
CI ANURO, los cuales son txicos, sin embargo las concentraciones de stos estn por debajo
de la dosis letal referida a un litro de solucin.

Nuevo azul de metileno: (preguntar al profesor si ya est preparado)
Nuevo azul de metileno 0.5 g
Oxalato de potasio 1.40 g
Cloruro de sodio 0.80 g
Agua destilada c.b.p. 100 mL
Filtrar antes de usar.

Solucin de bencidina al 1%
Solubilizar 1 g de bencidina en 100 mL de cido actico al 10%.

Nota: La bencidina es un reactivo considerado como carcinognico, por lo que se deben
extremar precauciones en su manejo.

Perxido de hidrgeno al 1%

cido actico al 10%

Colorante de Wright (preguntar al profesor si ya est preparado)


89

Utilizar colorante de Wright comercial. Agregar alcohol poco a poco, unos cuantos
mililitros cada vez, y mezclar bien con la ayuda de 10 a 20 esferillas de vidrio. Conservar
bien tapado para evitar la evaporacin, guardar en un sitio oscuro durante dos o tres
semanas, mezclar con frecuencia. Filtrar antes de usarlo.

APNDICE III

R1: Colorante de Wright, sangre de rata, EtOH.
R2: Sangre de rata, NaHCO
3,
K
3
[Fe(CN)
6
], KCN, saponina.
R3: Plasma de rata, bencidina, H
2
O
2
, cido actico.

90
EFECTO DEL pH EN LA LIBERACIN DE METALES PESADOS
POR UTENSILIOS DE BARRO VIDRIADO

OBJETIVO ACADMICO

Que el alumno determine cualitativamente la presencia de plomo en recipientes de cermica
a diferentes valores de pH.

PROBLEMA
Realizar un anlisis cualitativo comparativo de varios tratamientos de curado para vasijas
de barro vidriado y sugerir cul de ellos presenta mejores resultados para reducir el
contenido de plomo en estos recipientes. Discutir el riesgo de exposicin al plomo liberado
por recipientes de barro vidriado en los seres humanos.

Materiales

- Vasija de barro vidriado* 6 - Mechero 3
- Tubos de ensayo 13x100 10 - Rejilla de asbestos 3
- Anillo metlico 3 - Gradilla 1
- Papel pH 3 - Pipetas de 1 mL 3
- Probeta de 100 mL 1 - Pinza para tubos 1

*Este material debe ser nuevo y del mismo lote, se requiere la cantidad de 6 por cada dos equipos
con una capacidad mxima aproximada de 250 mL.

REACTIVOS

- Agua destilada - cido clorhdrico (HCl)
- Hidrxido de sodio 1 N (NaOH) - cido ntrico (HNO
3
)
- Yoduro de potasio (KI)


91


1. Previo a la sesin, el profesor indicar a los alumnos los tratamientos de curado a
realizar a 3 de las 6 vasijas:

Vasija 1 - Ajo: Untar ajo suficiente para cubrir la superficie del interior de la vasija
de barro y dejar reposar por un da antes de lavarla con jabn eliminando cualquier
residuo que se haya formado, secar.

Vasija 2 - Vinagre: Llenar partes de la vasija con vinagre blanco y hervir durante
1 hora, reponiendo el volumen perdido durante esta operacin. Lavar y secar.

Vasija 3 - Cal: Agregar una cucharada sopera de CaCO
3
comercial por cada 100
mL de agua y hervir durante 1 hora, reponiendo el volumen perdido durante esta
operacin. Lavar y secar.

2. Marcar las vasijas no curadas como A, B y C y reunirlas con las vasijas curadas 1, 2 y 3
3. Colocar el volumen necesario en cada una segn el diseo de la siguiente tabla.

A B C 1 2 3
Solucin HCL, pH 2 X X X X
Solucin NaOH, pH 10 X
Agua destilada X

Tabla 1. Diseo experimental.

4. Calentar las vasijas a ebullicin y dejarlas hervir 30 minutos. En caso de que el
contenido de agua disminuya considerablemente, reponer el volumen perdido con agua.
5. Agitar y raspar ligeramente las paredes de cada vasija con una esptula.

92

6. Colocar por separado 0.5 mL de solucin de cada vasija en tubos de ensayos.
7. Enfriar los tubos con ayuda del agua de la llave por la parte exterior, y medir el pH.
8. Agregar a cada tubo tres gotas de HNO
3
concentrado.
9. Agregar a cada tubo, 1 mL de la solucin de yoduro de potasio procurando que la
solucin caiga directamente en el contenido del tubo. Agitar por unos segundos, dejar
reposar en su gradilla y observar.
10. Una solucin o precipitado amarillo indica la presencia de plomo. Emplee un control
negativo con agua destilada y proceda de la misma forma como se indica en los pasos 6 y 7.
11. Una vez obtenidos los resultados, vaciar el contenido de los tubos en un contenedor
etiquetado como R1.
12. Reunir el contenido de las vasijas con tratamiento cido (A, 1, 2 y 3) en el contenedor
etiquetado como R1.
13. Reunir el contenido de las vasijas con tratamiento neutro (C) y bsico (B) en un
contenedor etiquetado como R2.


93

CUESTIONARIO

1. Reporte sus resultados en la siguiente tabla, indicando la presencia de plomo con cruces:
negativo (-), bajo (+), medio (++), alto (+++). Utilice el control negativo como referencia.

Vasija pH inicial pH final Presencia de plomo
A HCl
B NaOH
C agua destilada
1 ajo
2 vinagre
3 cal

Tabla 1. Resultados.

2. Compare los resultados obtenidos entre las vasijas A, B y C. Concluya qu mtodo de
extraccin fue ms eficiente.
3. Compare los resultados obtenidos en las vasijas 1, 2 y 3 con la vasija A e indique si hay
alguna diferencia. A qu la atribuye?
4. Compare los resultados obtenidos entre las vasijas 1, 2 y 3. Concluya qu mtodo de
curado fue ms eficiente.
5. Considera usted que los alimentos contenidos en vasijas de barro podran ser una fuente
de exposicin a plomo?
6. Considera que el proceso de curado es suficiente para evitar la exposicin a plomo?
Justifique su respuesta.


94


Blanke, R.V.; Decker, W.J. Analysis of toxic substances en Textbook of clinical
chemistry. Philadelphia, Saunders. pp. 1670-1744. 1986.
Klaassen, C.D. PhD. Casarett y Doulls. Toxicology. The basic science of poisons.
6
th
edition. McGraw Hill 2001. pp. 827-834.
Clark, E.E. Isolation and Identification of Drugs. Pharmaceutical Press, London, 1972. Vol.
I y II.
Torres-Snchez, L.; Lpez-Carrillo, L. y Ros, C. Eliminacin del plomo por curado
casero en Salud Pblica, Mxico. 41:5106 5108 (1999).
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM- 009- SSA1- 1993.
Public information office and Bureau of consumer health. Los peligros del plomo.
www.kdhe.state.ks.us

95

APNDICE I
1. Proceso de vidriado de utensilios de barro.
2. Reacciones que se llevan a cabo en las vasijas de barro vidriado A y B durante el
proceso de extraccin e identificacin.
3. Precauciones que se pueden aplicar en casa para reducir el riesgo de exposicin a plomo
por consumo de alimentos.
4. Cinco alimentos de naturaleza cida y cinco de naturaleza alcalina.
5. Lmite mximo permitido de plomo en utensilios de barro vidriado por la NOM vigente.

APNDICE II

Solucin de HCl pH 2 y solucin de NaOH pH 10
Calcular la cantidad adecuada para preparar la solucin de pH = 2 con HCl y la solucin de
pH 10 con NaOH.

Solucin de yoduro de potasio 16.5% (KI)
Pesar 16.5 g de KI y colocarlos en un matraz aforado de 100 mL, disolver en
aproximadamente 25 mL de agua mezclar y aforar. Esta solucin es sensible a la luz.

APNDICE III


R1: HCl, HNO
3
, PbI
2
, KI
R2: NaOH, PbI
2

NOTA: El responsable de residuos reunir el contenido de R1 y R2 al finalizar la sesin,
tomando las precauciones necesarias y etiquetando el recipiente final.

96
DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE ETANOL EN
UNA MUESTRA PROBLEMA

OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno realice la determinacin presuntiva y cuantitativa de etanol en muestras
problemas mediante un mtodo indirecto.

PROBLEMA
Cuantificar al menos el 80% de la concentracin de etanol en mg/dL en dos muestras
problema y mediante los resultados obtenidos indicar el grado de intoxicacin de los
sujetos de los cuales provienen las muestras analizadas.

Reactivos

- Dicromato de potasio* (K
2
Cr
2
O
7
) - Carbonato de potasio* (K
2
CO
3
)
- cido sulfrico (H
2
SO
4
) - Etanol (EtOH)

* Ver Apndice I I .

Equipo

- Espectrofotmetro
- Estufa
- Balanza analtica

Material

- Caja de Petri con centro de vidrio 2 - Matraz volumtrico de 10 mL 3
- Pipeta volumtrica de 2 mL 3 - Pinzas para tubo de ensayo 3
- Pipeta volumtrica de 1 mL 4 - Papel filtro (2 x 5 cm) 1
- Tubo de ensayo 16 x 150 6 - Pipeta graduada de 5 mL 3
- Pipeta volumtrica de 5 mL 2 - Pipeta graduada de 1 mL 3
- Celda de vidrio para
espectrofotmetro

5
- Pipeta Pasteur con globo 4


97


A cada alumno se le proporcionarn 2 muestras problema a las cuales se les realizar la
determinacin presuntiva y cuantitativa de etanol.

I. Determinacin presuntiva de etanol
1. Rotular 4 tubos como control positivo, control negativo, muestra 1 y muestra 2.
2. Al tubo control positivo agregarle 5 gotas de etanol.
3. Al tubo control negativo agregarle 5 gotas de agua destilada.
4. A los tubos muestra 1 y 2 agregarles 1 mL de cada una de las muestras problema
respectivamente.
5. A cada uno de los tubos, adicionarles 0.5 mL de solucin de K
2
Cr
2
O
7
(Solucin A).
6. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente y observar la coloracin de los tubos.
7. Reunir el contenido de los 4 tubos y confinarlos en un recipiente etiquetado como R1.

II. Determinacin cuantitativa de etanol

Centro de vidrio

Esquema 1. Cmara de Conway.


98

Cada una de las muestras se tratar de acuerdo con el siguiente procedimiento:

1. Colocar 2 mL de la solucin B de K
2
Cr
2
O
7
en el recipiente B.
2. Adicionar 1 mL de solucin saturada de K
2
CO
3
en el recipiente B, agitando suavemente.
3. Colocar 1 mL de la muestra problema en el recipiente A y tapar inmediatamente con el
recipiente C, como se muestra en el esquema 1.
4. Colocar la cmara de Conway en una estufa a 40C, durante 45 minutos.
5. Una vez transcurrido el tiempo indicado, transferir el contenido del recipiente B a un
matraz volumtrico de 10 mL, lavando perfectamente dicho recipiente y la parte
externa del recipiente A con un volumen mximo de 5 mL de agua destilada para
ambos recipientes. Finalmente, aforar a 10 mL con agua destilada (en ocasiones puede
aparecer un precipitado que desaparece al aforar).
6. Determinar la absorbancia a 450 nm, utilizando como blanco agua destilada.
7. Determinar la absorbancia de la solucin B de dicromato de potasio diluida 1 a 10, a
450 nm, utilizando como blanco agua destilada. Esta solucin se utilizar como
referencia para realizar los clculos pertinentes.
8. Confinar el contenido del recipiente B y la solucin de referencia en el frasco
etiquetado como R1.

CUESTIONARIO

1. Reporte en la siguiente tabla sus resultados de la prueba presuntiva para cada muestra.

Muestra Coloracin Resultado (+/-)
1
2
Control negativo
Control positivo

Tabla 1. Resultados presuntivos.


99

2. Considera que la intensidad de color en la prueba presuntiva es un indicador de la
concentracin de EtOH en sus muestras?
3. Proponga una modificacin a la tcnica presuntiva que le permita emplearla como prueba
cuantitativa.
4. Indique las lecturas de absorbancia obtenidas para cada muestra. Calcular la concentracin
de etanol en la muestra en mg/dL, desglosando los clculos realizados para cada una de las
muestras tomando en cuenta la lectura de absorbancia de la solucin de referencia. Considere
todas las diluciones realizadas tanto de su muestra biolgica como de la solucin de referencia.

Muestra Absorbancia Dilucin*
Concentracin
(mg/dL)
1
2
Solucin de
referencia

*En caso de haberse realizado.

Tabla 2. Resultados de la prueba cuantitativa.

5. Con los valores obtenidos en sus muestras, relacione la sintomatologa en la siguiente
tabla y concluya si los valores se encuentran por encima del lmite legal establecido.


100

Concentracin
(mg/dL)
Observaciones clnicas
50 a 150 Falta de coordinacin, tiempo de reaccin lento, y visin
borrosa.
150 a 300 Deterioro visual, tambaleo y lenguaje cercenado,
hipoglucemia intensa, sobre todo en nios.
300 a 500 Falta notoria de coordinacin, estupor, hipoglucemia y
convulsiones.
500 Coma y muerte, excepto en individuos tolerantes.

Tabla 3. Observaciones clnicas segn el grado de intoxicacin.

6. Cul es la concentracin mxima de EtOH que se puede determinar con este protocolo?
7. Qu resultados esperara si la concentracin de EtOH en la muestra es mayor a la
concentracin mxima que puede determinar el protocolo?


101

Fister, H.J. Ethyl alcohol. Manual of standardized procedures for spectrophotometric
chemistry. E-10a.1-E-10b.3 (1950) U.S.A. Standard scientific supply corporation. U.S.A.
Hobbs, W.H.; Rall, T.W.; Verdoorn, T.A. Hipnticos y sedantes: etanol en Goodman &
Gilman. Las bases farmacolgcas de la teraputica. 1. 9a ed. Ed. McGraw-Hill
Interamericana, Mxico D.F., 1996, pp. 411419.
Klassen, C.D.; Watkins, J.B. Efectos de los solventes y vapores en Toxicologa Clnica
en Casarett & Doull, Manual de Toxicologa, la ciencia bsica de los txicos. (5 ed.)
McGraw-Hill Interamericana, Mxico D.F. 2001, pp. 739-744, 934-935.
Pesce, A.J., y Kaplan, L.A. Alcohol por Schroeder, T.J. Methods in clinical chemistry.
The C.V. Mosby Company. U.S.A., 1987, pp. 324-329.
Sunshine, I. Ethanol en Methodology for Analitical Toxicology. CRC Press, Inc., 1978,
pp. 145-154.

102

APNDICE I

1. Balanceo de la siguiente ecuacin:

CH
3
OH + K
2
Cr
2
O
7
Cr
3+
+ R-COO
-

2. Color de las soluciones que contienen cromo (VI) y cromo (III).
3. Especificidad de la prueba, tipo de sustancias que pueden dar un resultado falso positivo.
4. Longitud mxima de absorcin del K
2
Cr
2
O
7
en el visible.
5. Fundamento de la prueba presuntiva.
6. Fundamento de la prueba cuantitativa.
7. Propsito de adicionar solucin saturada de K
2
CO
3
e incubar.
8. Lmite mximo de EtOH en sangre legalmente establecido para conductores.
9. Calcular la concentracin de etanol en sangre de la siguiente muestra problema:
Solucin de referencia: 2 mL de una solucin 0.01 M de dicromato de potasio se
diluyeron a 10 mL, de esta solucin se tomaron 5 mL y se diluyeron a 10 mL. La
lectura de absorbancia para la ltima solucin, a 450 nm, fue de 0.205.
Muestra: 2 mL de la solucin 0.01 M de dicromato de potasio se colocaron en la
celdilla B y se hicieron reaccionar con 1 mL de muestra problema (celdilla A). Al
trmino de 45 minutos de calentamiento, el contenido de la celdilla B se diluy a 10 mL
y se ley a 450 nm, dando una absorbancia de 0.23.
Respuesta: 60.72 mg de etanol/100 mL de sangre.


103

APNDICE II

Solucin A: Solucin de dicromato de potasio (K
2
Cr
2
O
7
)
Pesar 2.5 g de K
2
Cr
2
O
7
y solubilizarlo en 20 mL de H
2
SO
4
al 50 %, aforar a 100 mL con
H
2
SO
4
al 50 %.

Solucin B: Solucin de dicromato de potasio (K
2
Cr
2
O
7
)
Disolver 0.5 g de K
2
Cr
2
O
7
en 25 mL de agua destilada y agregar cuidadosamente 40 mL de
H
2
SO
4
concentrado, dejar enfriar y diluir con agua destilada a 100 mL.

NOTA: El contacto con altas concentraciones de dicromato de potasio puede resultar en
ulceracin de manos, destruccin de membranas mucosas y perforacin del tabique
nasal.

Solucin saturada de carbonato de potasio (K
2
CO
3
)
Con agitacin, agregar la cantidad necesaria de K
2
CO
3
en el volumen de agua destilada
a preparar hasta su saturacin (se observa que ya no se disuelve). Posteriormente filtrar.
PM del etanol: 46 g/mol
PM del K
2
Cr
2
O
7
: 294.7

g/mol

Densidad del etanol: 0.7893 a 20C

APNDICE III

R1: EtOH, K
2
Cr
2
O
7
, H
2
SO
4
, CH
3
COOH, Cr(SO
4
)
3
, K
2
SO
4
, K
2
CO
3


104
IDENTIFICACIN DE ALCALOIDES Y BARBITRICOS EN
MUESTRAS PROBLEMA

OBJETIVO ACADMICO
Con base en los conocimientos adquiridos en los guiones anteriores, que el alumno
proponga un proceso de extraccin e identificacin para alcaloides y barbitricos.
PROBLEMA
Aislar e identificar escopolamina y/o cido barbitrico de una muestra problema.
Reactivos
- Hidrxido de amonio (NH
4
OH) - Cromatofolios de aluminio
- Metanol (MeOH) - Yoduro se sodio (NaI)
- cido actico glacial - Acetato de etilo
- Carbonato de bismuto (Bi
2
(CO
3
)
3
) - Isopropilamina
- Acetato de cobalto tetrahidratado - Escopolamina
- cido barbitrico
Equipo
- Rotaevaporador - Bomba de aspersin
- Lmpara de luz ultravioleta
Material
- Embudo de separacin de 250 mL 2 - Agitador de vidrio 1
- Embudo de cola corta 2 - Probeta de 10 mL 1
- Matraz de bola de 50 mL 2 - Anillo metlico 1
- Vaso de precipitado de 250 mL 3 - Tubos de ensayo 4
- Vaso de precipitados de 100 mL 4 - Anillos de corcho 2
- Pipeta Pasteur 3 - Tubo capilar 2


105

1. El profesor proporcionar una muestra que contiene escopolamina y/o cido barbitrico.
El alumno desarrollar el procedimiento que proponga para aislar la forma no ionizada de
los compuestos antes mencionados.
2. Una vez obtenida la forma no ionizada de las sustancias, evaporar a sequedad en un
rotaevaporador. Dejar enfriar y reconstituir cada uno de los residuos con 0.5 mL (3 o 4
gotas) de metanol. Etiquetar cada uno de ellos con el nombre de la sustancia que espera que
contenga.
3. Para el proceso de identificacin, solicitar a los profesores dos placas para cromatografa
en placa fina. En una de ellas (placa 1) del lado izquierdo tendr aplicada previamente la
referencia de escopolamina, y en la otra (placa 2) la de cido barbitrico. Una muestra del
residuo reconstituido previamente ser aplicada del lado derecho de cada una de las placas
de acuerdo con el siguiente esquema.

Esquema 1. Placa cromatogrfica.


106

4. Para la identificacin de la escopolamina emplear como sistema de elucin una mezcla
CHCl
3
/MeOH (9:1) + 3 gotas de NH
4
OH.
5. Para la identificacin del cido barbitrico emplear como sistema de elucin una
CHCl
3
/Acetona (9:1) + 3 gotas de cido actico.
6. Saturar las cmaras durante 10 minutos antes de eluir las muestras en las placas
cromatogrficas.
7. Eluir hasta la lnea lmite de elucin indicada en el Esquema 1.
8. Visualizar la presencia de escopolamina y/o cido barbitrico con una lmpara de luz
U.V. y posteriormente, revelar las cromatoplacas utilizando la solucin etiquetada como
solucin reveladora de reactivo de Dragendorff para el caso del alcaloide, y con yodo
para el otro compuesto. Calcular el Rf

para cada sustancia de acuerdo al esquema 1 y
comparar el valor obtenido con el de la referencia proporcionada.
9. Con el residuo reconstituido excedente realizar el siguiente procedimiento de identificacin.

Alcaloides
a) Colocar 2 gotas del residuo reconstituido correspondiente, y agregar 2 gotas de HCl
1N ms 2 gotas de solucin stock del reactivo de Dragendorff.
b) Realizar un control positivo con las muestras de referencia y un control negativo (con
agua) para esta reaccin.
Barbitricos
a) Colocar tres gotas del residuo reconstituido correspondiente y agregar tres gotas del
reactivo A y tres gotas del reactivo B (Dille-Koppanyi).
b) Realizar un control positivo con las muestras de referencia y un control negativo (con
agua) para esta reaccin.

107

CUESTIONARIO
1. Reporte el diagrama de separacin que utiliz para esta prctica y justifique los
cambios, si los hubo, con relacin al diagrama diseado en los conocimientos previos.
2. Reporte en la siguiente tabla los resultados que obtuvo en las pruebas de
identificacin. Marque con una cruz si la reaccin fue positiva.

Referencia
escopolamina
Residuo
reconstituido de
escopolamina
Referencia
de cido
barbitrico
Residuo
reconstituido
de cido
barbitrico
Dille-Koppanyi
Dragendorff
Rf
Tabla 1. Resultados de las pruebas de identificacin.

3. Indique si su muestra contena cido barbitrico. Explique su respuesta.
4. Indique si su muestra contena escopolamina. Explique su respuesta.
5. Cules son los puntos que considera crticos para la adecuada separacin e
identificacin de la muestra?


108


Benko, A. (1985). Toxicological Analysis of Amobarbital and Glutethimide from Bone
Tissue en Journal of Forensic Sciences 30, 708-714.
Blanke, R.V.; Decker, W.J. Analysis of Toxic substances en Textbook of clinical
chemistry. Saunders, Philadelphia, 1986, pp. 1670-1744.
Bowman y Rand. Farmacologa. Bases Bioqumicas y Patolgicas. (2 ed). Editorial
Interamericana, Mxico, 1984. 42.25-42.32.
Bruneton, J. Alcaloides, Generalidades en Farmacognosia. Fitoqumica. Plantas
Medicinales. Ed. Acribia, Zaragoza, Espaa, 2001, pp. 775-792.
Clark, E.E. Isolation and Identification of Drugs. Vol. I y II. Pharmaceutical Press,
London, 1972.
Cochin, J.; Daly, J.W. (1963). The Use of Thin-Layer Chromatography for the Analysis of
Drugs. Isolation and Identification of Barbiturates and Nonbarbiturates Hypnotics
from Urine, Blood and Tissues en Journal of Pharmacology and Experimental
Therapeutics 139, 154-159.


109

APNDICE I
1. Propiedades cido-base (pKa) de la escopolamina y el cido barbitrico.
2. Forma ionizada y no ionizada de cada uno de ellos.
3. Diagrama de separacin para aislar escopolamina y cido barbitrico presentes en
una muestra problema, justificando en cada etapa el uso de los reactivos sugeridos.
4. Indicar en el diagrama anterior la recoleccin y almacenamiento de los desechos
generados.
5. Fundamento de la reaccin de Dragendorff.
6. Bases de la reaccin de Dille-Koppanyi.
7. Fundamento de la cromatografa en capa fina como herramienta de identificacin de
sustancias qumicas utilizando luz UV, Yodo y reactivo de Dragendorff como
reveladores.
APNDICE II
Reactivo de Dragendorff (solucin patrn)
Solubilizar 2.6 g de Bi
2
(CO
3
)
3
y 7.0 g de NaI en 25 mL de cido actico glacial, calentar por
10 minutos a 40
o
C para solubilizar el reactivo. Dejar reposar por 12 horas y posteriormente filtrar la
solucin. Mezclar 20 mL del filtrado (solucin rojo-caf) con 8 mL de acetato de etilo, la solucin
anterior se guarda en un frasco mbar (la cual es estable por 6 meses).
Reactivo de Dragendorff (solucin reveladora)
Mezclar 10 mL de la solucin patrn con 25 mL de cido actico glacial y 60 mL de
acetato de etilo.


110

Reactivo A (Dille-Koppanyi)
Solubilizar 0.1 g de acetato de cobalto tetrahidratado en 100 mL de MeOH absoluto y
agregar 0.2 mL de cido actico glacial.
Reactivo B (Dille-Koppanyi)
Mezclar 5.0 mL de isopropilamina con 25 mL de MeOH absoluto.
NOTA: El reactivo A y el reactivo B son estables por 2 das.


111

Manual de guiones experimentales para la enseanza
y aprendizaje del laboratorio de Toxicologa (clave 1614)
Editado por la Facultad de Qumica
Se utilizaron en la composicin tipo
Times New Roman puntaje 11 y 12
Tipo de impresin PDF
El cuidado de la edicin estuvo a cargo de
Brenda lvarez Carreo.
La formacin estuvo a cargo del departamento de Diseo y Medios Audiovisuales.
Diseo de interiores y portada: LDG. Daniel Jos Mara Ramrez Olvera

Publicacin aprobada por el Comit Editorial de la Facultad de Qumica.
Abril 2012

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