El gen de Saccharomyces cerevisiae ICY1 afecta el consumo de nitrgeno durante la

fermentacin alcohlica

Antecedentes: Saccharomyces cerevisiae es el microorganismo principal responsable de la
fermentacin alcohlica. En este proceso, el consumo de nitrgeno es de gran importancia ya que
se encuentra en cantidades limitantes y su deficiencia produce fermentaciones lentas y / o
pegados generando grandes prdidas econmicas en la industria vincola. En un trabajo previo se
compararon los perfiles de transcripcin entre cepas genticamente relacionadas con las
diferencias en el consumo de nitrgeno, la deteccin de genes con expresin diferencial que
podra estar asociado a las diferencias en los niveles de nitrgeno consumido. Uno de los genes
identificados fue ICY1. Con el objetivo de confirmar esta observacin, en el presente trabajo se
evalu el consumo de amonio durante la fermentacin de cepas que han eliminado o sobre
expresado este gen.
Resultados: Nuestros resultados confirman el efecto de ICY1 en la absorcin de nitrgeno
mediante la evaluacin de su expresin en las levaduras del vino durante las primeras etapas de la
fermentacin a baja (MS60) y normal (MS300) de nitrgeno asimilable. Nuestros resultados
muestran que los niveles de mRNA de ICY1 disminuyen cuando la cantidad de nitrgeno asimilable
es bajo. Adems, se construyeron cepas derivadas de la cepa EC1118 industrial como un mutante
nulo en este gen, as como una sobre expresin de ella.
Conclusiones: Nuestros resultados sugieren que la expresin de ICY1 est regulada por la cantidad
de nitrgeno disponible en el mosto y est implicado en el consumo de amonio, dado el aumento
en el consumo de esta fuente de nitrgeno observado en la cepa mutante nulo.
1. Introduccin

La fermentacin del vino es un proceso complejo que implica numerosos microorganismos, donde
la levadura Saccharomyces cerevisiae es uno de los ms importantes y responsable de la
fermentacin alcohlica. Durante este proceso, la cantidad de nitrgeno asimilable levadura es
limitante [1], que es, en muchos casos, la causa de fermentaciones lentas o estancadas que
producen grandes prdidas econmicas en la industria vincola [2,3,4]. Las principales fuentes de
nitrgeno en el mosto son aminocidos y el ion amonio; ambos compuestos se incorporan en la
clula a travs de transporte activo por permeasas especficas [5,6,7,8]. Una vez dentro de la clula,
estos compuestos se incorporan en el metabolismo del nitrgeno principal, donde los iones de
amonio transportados desde el exterior de la clula o de los aminocidos son asimilados por su
incorporacin en una molcula de -cetoglutarato, llevado a cabo por la enzima glutamato
deshidrogenasa [5] . Por otro lado, el nitrgeno de los aminocidos se podra incorporar al
glutamato generacin de glutamina por la enzima glutamina sintetasa [5,9,10]. Las diferentes
fuentes de nitrgeno disponible en el mosto se consumen en el orden de preferencia con respecto a
su capacidad para ser incorporados en themain el metabolismo del nitrgeno [6,11]. El sistema
principal de la regulacin de genes implicados en el consumo de nitrgeno es el sistema de
represin catablica de nitrgeno [5], que permite que el consumo de las diferentes fuentes de
nitrgeno disponibles a la levadura a ser regulado y es de gran importancia en el consumo de
nitrgeno durante la fermentacin alcohlica [5 , 12]. Todos estos procesos explican la complejidad
del metabolismo del nitrgeno en la levadura y por lo tanto la participacin de numerosos genes en
este rasgo de gran inters enolgico [5,10].

Debido a la importancia del metabolismo del nitrgeno en la fermentacin alcohlica, numerosos
estudios se han llevado a cabo para identificar los genes implicados en este proceso [13,14,15].
Dentro de este contexto, Jimnez-Mart et al. [16] se describe la expresin de diversos genes como
una respuesta de la levadura a la sustitucin del mosto con diferentes fuentes de nitrgeno
observacin de que la respuesta gen depende de la fuente de nitrgeno utilizada. Adems, el efecto
de algunos genes especficos en el consumo de nitrgeno se ha definido, por ejemplo GAP1 [7], los
genes que codifican para las permeasas de amonio MEP1, 2 y 3 [17], entre otros, que han permitido
la identificacin de la principales genes implicados en la regulacin del metabolismo de nitrgeno
durante la fermentacin alcohlica. Por otro lado, diversos estudios de todo el genoma que analizan
los cambios transcripcionales asociados con el consumo de nitrgeno se han llevado a cabo
[13,14,17,18,19]. Por lo tanto, la adicin de fosfato de amonio se ha descrito para promover
cambios de expresin de 350 genes implicados en el transporte de molculas pequeas, protenas y
sntesis de purina, entre otros [14]. Adems, Varela et al. [19] utilizaron SAGE para analizar la
expresin gnica durante la fermentacin notar variaciones en los genes importantes implicados en
el transporte, GAP1, en el metabolismo, GDH2, GDH3 y PUT1 o en la regulacin, GCN4 y MET30. A
pesar de la gran cantidad de informacin disponible sobre este importante rasgo enolgico, es vital
recordar que al igual que otros rasgos enolgicas, el consumo de nitrgeno es un fenotipo
polignica, donde varios genes contribuyen al rasgo observado, y por lo tanto muchos otros genes
podra potencialmente participar en este proceso. En este sentido, nuestro laboratorio implement
un enfoque experimental basado en la cra de identificar los genes que an no se han relacionado
con este rasgo [15].

Esta estrategia consisti en la obtencin de un hbrido del acoplamiento de cepas de vino silvestres
y la generacin posterior, por esporulacin y autodiploidization de 115 cultivos monospricos de
este hbrido, produciendo una poblacin de individuos genticamente relacionados que presentan
una distribucin normal para el rasgo de consumo de nitrgeno. Las cepas AC19 y AC114, que
diferan en el consumo de nitrgeno de amonio durante la fermentacin alcohlica, se
seleccionaron a partir de esta poblacin. Estas cepas fueron objeto de un anlisis comparativo de la
transcripcin utilizando microarrays permite la identificacin de la expresin diferencial de 121
genes, entre ellos, el gen ICY1 [15]. Este gen se asocia con el fenotipo "petit negativo" lo que sugiere
que es esencial en las cepas que pierden el ADN mitocondrial [20]. Otras mutaciones de los genes
que se han descrito se repite el fenotipo, que estn asociados con: el transporte de protenas a la
mitocondria [20,21], componentes de la F1-ATPasa [22], los componentes de la / antiport ADP ATP y
protenas que forman parte del sistema i-AAA [23,24]. Todos estos procesos estn relacionados con
la capacidad de las mitocondrias para mantener la diferencia de potencial entre el exterior y el
interior de este orgnulo. Sin embargo, no existe informacin que indique la funcin especfica de
ICY1 en estos procesos o la relacin con el consumo de nitrgeno.
En el presente trabajo, se evalu el efecto de la ICY1 gen en el consumo de nitrgeno durante la
fermentacin alcohlica utilizando el anlisis de la transcripcin y mutacional.

2. Materiales y Mtodos
2.1. Cepas y medios de cultivo
Las levaduras utilizadas en este estudio fueron las culturas monospricos AC19 y AC114, aisladas por
micromanipulacin de ttradas obtenidos de L3044 hbrido formado por la unin de las dos cepas
silvestres, L3217 y L3218, recolectados en una zona de vinos en el Valle del Maipo, Santiago, Chile
[15]. Tambin se utiliz la cepa EC1118 comercial (Lalvin).
El mosto sinttico (MS300) se prepar como se ha descrito antes en Rossignol et al. [18] con algunas
modificaciones. Este medio contiene 125 g l-1 de la glucosa, 125 g l-1 de fructosa, sales minerales
(750 mg l-1 KH2PO4, 500 mg l-1 K2SO4, 250 mg l-1 MgSO4 7H2O, mg l-1 CaCl2 2H2O, 200mgl-1 de
NaCl, 4mgl-1MnSO4 H2O, 4 mg l-1-1 ZnSO4,1mgl CuSO4 5H2O, 1 mg l-1 KI, 0.4mgl-1 CoCl2 6H2O,
1 mg l-1H3BO3,1mgl 1NaMoO4 2H2O ) y vitaminas (20 mg / lmyo-inositol, 2 mg l-1 de cido
nicotnico, 1,5 mg l-1 pantotenato de calcio, HCl 0,25 mg l-1 de tiamina, 0.25 mg l-1 piridoxina HCl,
0,003 mg l-1 biotina). . El medio contena factores anaerobias (15 mg l-1ergosterol; 5 mg l-1 oleato
de sodio), aadida al medio en 1 ml de Tween 80 / etanol (50/50 v / v). El pH se regul a 3,3 con
NaOH. Las fuentes de nitrgeno fueron de 300 mg l-1 de nitrgeno asimilable donde 120 mg l-1
viene de 460 mg l-1 de cloruro amnico y 180 mg l-1 de una mezcla de 19 aminocidos (612,6 mg l-1
L-prolina , 505,3 mg l-1 L-glutamina, 374,4 mg l-1 L-arginina, 179,3 mg l-1 L-triptfano, 145,3 mg l-1
L-alanina, 120,4 mg l-1 L-glutmico, 78,5 mg l -1 L-serina, 75,9 mg l-1 L-treonina, 48,4 mg l-1 L-
leucina, 44,5 mg l-1 L-asprtico, 44,5 mg l-1 L-valina, 37,9 mg l-1 L-fenilalanina, 32,7 mg l-1 L-
isoleucina, 32,7 mg l-1 L-histidina, 31,4 mg l-1 L-metionina, 18.3 mg l-1 L-tirosina, 18.3 mg l-1 L-
glicina, 17,0 mg l -1 L-lisina, y 13,1 mg l-1 L-cistena). Para los experimentos llevados a cabo bajo
condiciones de bajo contenido de nitrgeno (60 mg L-1 de nitrgeno asimilable llamada MS60), el
sinttico debe contener slo 20% de las fuentes de nitrgeno mencionadas. Las fermentaciones se
realizaron a 25 C durante 20 d sin agitacin en 15 ml tubos cnicos que contienen 12 ml de mosto
sinttico en seis repeticiones. El inculo consisti de 1 106 clulas ml-1 obtenidos de un 16 h de
cultivo en la misma necesidad con agitacin. Produccin de CO2 se control mediante el pesaje de
los tubos para determinar la prdida de peso.
2.2. Secuencias de genes

Extracciones de ADN de levadura se llevaron a cabo con el Kit de Purificacin de Asistente genmico
de ADN (Promega, Madison, EE.UU.), utilizando 10 mg ml-1 de Zymolyase 20 T (Seikagaku Corp.,
Tokio, Japn) y medidos espectrofotomtricamente a 260 nm. El gen se ICY1 amplificated usando los
cebadores VGM56 y VGM57 (Tabla 1) y el producto de PCR se purific usando el EZNA Ciclo kit Pure
(Omega, Biotek, Georgia, EE.UU.) siguiendo el protocolo descrito por el fabricante. La PCR
productwas subclon en el vector pGEM-T Easy (Stratagene, California, EE.UU.) siguiendo los
protocolos descritos por el fabricante. Esta muestra se secuenci automticamente byMacrogen
(Sel, Corea). El anlisis de las secuencias se llev a cabo con el programa Vector NTI 9,0 (Life
Technology, California, EE.UU.).
Table 1. Los cebadores utilizados en este trabajo

2.3. Preparacin de ARN
La extraccin de RNA se realiz a partir de cultivos que crecen en el mosto sinttico sin agitacin en
tubos cnicos de 15 ml con 12 ml de MS300 o MS60 a 25 C. Las muestras se recogieron por
centrifugacin durante la fase temprana de la fermentacin, porque se ha descrito que en este paso
los genes associatedwith nitrgeno metabolismreach mayores niveles de expresin [25]. La
extraccin de ARN se realiz inmediatamente usando un kit comercial (RNeasy Mini Kit, Qiagen,
EE.UU.) de acuerdo con el protocolo descrito por el fabricante y fue seguido por DNAseI tratamiento
(Promega, Madison, EE.UU.). La cantidad de ARN y qualitywere se determinaron usando
espectrometra UV y la determinacin de la relacin 260/280 nm. Las extracciones de ARN
mostraron una proporcin de 260/280 1,9-2,0 confirmando la buena calidad del ARN. El
sampleswere almacen a -80 C.

2.4. Ensayo de RT-qPCR
La reaccin de transcripcin inversa se llev a cabo usando una unidad de M-MLV transcriptasa
reversa, 1 g de Oligo (dT) 15 Primer (Promega, Madison, EE.UU.) y 3 g de ARN digerido en un
volumen final de 25 l de acuerdo con los protocolos se describe por el fabricante. muestras de ADNc
obtenidos se cuantificaron mediante espectroscopa de UV y se utilizaron como molde en la reaccin
qPCR. La reaccin qPCR se realiz en un volumen final de 20 l. La mezcla de reaccin contena 10 l de
2 Brilliant II Master mezcla SYBR Green qPCR (Stratagene, California, EE.UU.), 0,1 mg ml-1 de BSA
(New England Biolabs, EE.UU.) y 2 M de cada cebador. La reaccin qPCR se realiz en LightCycler 1.5
equipos por triplicado (Roche, Alemania). Los resultados se analizaron utilizando el software
LightCycler 4.0 (Roche, Alemania). Los genes evaluados y los cebadores utilizados se enumeran en la
Tabla 1 La expresin relativa de cada genewas cuantific usando el mtodo matemtico descrito por
Livak y Schmittgen [26], utilizando ACT1, TUB1 y PGK1 como genes de referencia despus de una
seleccin previa de los genes de referencia segn el kit de geNorm [27].

2.5. Parmetros enolgicos

El azcar, glicerol y etanol residual se determin por HPLC en un equipo Shimadzu Prominence HPLC
(Shimadzu, EE.UU.) usando una columna de exclusin inica Aminex HPX-87H siguiendo el mtodo
de Nissen et al. [28]. El consumo de amonaco y los 19 aminocidos presentes en el mosto (vase la
Seccin 2.1) se determinaron mediante derivatizacin con DEEMM y la separacin por HPLC usando
una columna C18 5-HL como fue descrito por Gmez-Alonso [29].

2.6. Clonacin y secuenciacin del gen ICY1

El gen ICY1 se clon en el vector YEpACT4MX obtenido a partir del vector YepACT4 [30] que
incorpora el G418 (KanMX) casete de resistencia en el sitio de restriccin EcoRV obtenido a partir del
vector pUG6. Anteriormente, y para eliminar el sitio NcoI en el casete KanMX, el vector pUG6 se
someti a una mutagnesis dirigida al sitio usando el sistema de QuikChangeSite-
DirectedMutagenesis (Stratagene, California, EE.UU.) y los cebadores NCOITF y NCOITR (Tabla 1).
Como resultado, el sitio CCATGG fue sustituido por el CTATGG secuencia utilizando el sitio NcoI en la
estrategia de clonacin en el vector YEpACT4MX. El ICY1 gen se amplific a partir del ADN genmico
de las cepas EC1118 o S288C y se subclon en el vector pGEMT easy (Promega, Madison, EE.UU.),
utilizando los cebadores VGM56 y VGM57. El constructo se verific mediante PCR, digestin y
secuenciacin. Muchos de los clones obtenidos en esta etapa se analizaron por secuenciacin
usando cebadores T7 y SP6 (Tabla 1) (Macrogen, Corea, Japn). Posteriormente, los insertwas
clonaron en el vector YEpACT4MX en los sitios NcoI y SalI. El constructo se utiliz para transformar la
cepa EC1118 de acuerdo con el mtodo descrito por Becker y Guarente [31]. El anlisis de las
secuencias obtenidas se llev a cabo con el programa Vector NTI 9,0 (Life Technology, California,
EE.UU.).
2.7. Supresin del gen ICY1 en la cepa EC1118 vino comercial

El mutante de delecin del gen ICY1 se llev a cabo de acuerdo con Shao et al. [32]. Los cebadores
VGM56, VGM82, VGM50, VGM51, VGM83 y VGM57 se utilizaron (Tabla 1). La transformacin de la
cepa EC1118 se realiz como se describe anteriormente [31]. El segundo alelo fue mutado utilizando
la misma estrategia pero utilizando el gen de resistencia a la higromicina y los cebadores VGM84,
VGM85, VGM88, VGM89 y VGM57 como marcadores (Tabla 1). Los productos de PCR fueron
purificados con el E.Z.N.A. Ciclo kit puro (Omega Biotek, Georgia, EE.UU.) y se utiliza para
transformstrain EC1118. Se seleccionaron los clones transformantes en G418 o G418 e higromicina y
verificados por PCR usando los cebadores VGM58 y VGM62 (Tabla 1).

2.8. El anlisis estadstico

El datawere parmetro enolgico se sometieron a anlisis de varianza (ANOVA) y los valores medios
de los experimentos se analizaron estadsticamente mediante la prueba de LSD. Las diferencias se
consideraron significativas cuando la probabilidad era 0.05.

3. Resultados
3.1. La expresin del gen en cepas de vino ICY1
Para evaluar la participacin de ICY1 en el consumo de nitrgeno, los niveles de expresin de este
gen en cepas AC19 y AC114, el L3044 hbrido, las cepas L3217 y L3218 de los padres, y de la cepa
EC1118 vino comercial se cuantificaron en el mosto que contiene 300 mg l-1 y 60 mg l-1 de nitrgeno
asimilable (Tabla 2). Los resultados indican que ICY1 gen muestra una mayor cantidad de transcritos
en fermentaciones que contiene L-1 300 mg que en condiciones de baja de nitrgeno. Este
comportamiento se observa en todas las cepas analizadas. Por otro lado, la expresin relativa del gen
en las cepas analizadas mostr diferencias en themagnitude de la respuesta. Por lo tanto, las cepas
EC1118, AC114 y L3044 showthe diferencia ms pequea en las transcripciones entre las dos
condiciones analizadas, mientras que la cepa monosprico AC19 muestra la mayor diferencia (Tabla
2).
Tabla 2. Expresin relativa del gen ICY1 en fermentaciones contienen 300 mg l-1 y 60 mg l-1 de nitrgeno.




3.2. Secuencia de la ICY1 gen en la cepa industrial EC1118

Las diferencias en los niveles de transcripcin relativas del ICY1 gnica en respuesta a las cantidades
variables de nitrgeno en el mosto, adems de las diferencias en la expresin de este gen en las
cepas monospricos AC114 y AC19 reportados por Contreras et al. [15], podra ser el resultado de las
diferencias en la secuencia de la regin promotora de este gen en las cepas analizadas (regulacin
cis). Para evaluar esta propuesta, el gen fue secuenciado en las cepas monospricos y EC1118 la cepa
comercial, sin embargo, los resultados obtenidos muestran la regin promotora es idntica en todas
estas cepas que indican que las diferencias en los niveles de transcripciones no se deben a factores
cis.
Adems, la comparacin de la secuencia de la regin codificante del gen en cepas AC19 y AC114 con
la secuencia S288c cepa de referencia muestra un cambio de base de timina a citosina en el
nucletido 267 en las cepas monospricos lo que implica una mutacin sinnimo de que no altera la
secuencia de la protena traducida . Adems, cuando se secuenciaron varios subclones obtenidos en
el vector pGEM-T Easy por amplificaciones de ADN genmico de la cepa EC1118, se observaron dos
alelos en esta cepa. Uno de estos programas 99% de similitud con la ICY1 gen de la cepa de
referencia S288c, con una diferencia en el nucletido 31, donde una guanina se reemplaza por una
adenina resultando en un cambio de un cido asprtico por una asparagina en el residuo de
aminocido 11 La otra alelo obtenido, adems del polimorfismo se mencion anteriormente, tiene
un polimorfismo en la posicin 267 que resulta en una timina en vez de una citosina, que se traduce
en un synonymousmutation que no afecta a la secuencia de la protena. Los lattermutationwas el
mismo que el obtenido para las cepas themonosporic AC114 y AC19. Estos resultados difieren
fromthose descrito por Novo et al. [33] y sugieren que EC1118 cepa es heterocigoto para el gen ICY1,
que ambos alelos codifican para protenas idnticas de 127 aminocidos y el aminocido asparagina
en la posicin 11 se sustituye por un residuo de asparagina en comparacin con la cepa de referencia
S288c.
Tabla 3. El consumo de nitrgeno de cepas AC114, AC19 y EC1118 durante la fermentacin en MS300.






3.3. El consumo de nitrgeno en la cepa EC1118 monoesprico e industrial
Para comparar el consumo final de cada fuente de nitrgeno disponible en el mosto, cepas
monosporic AC19 y AC114 y el EC1118 cepa industrial se fermentaron en MS300 y MS60 (Tabla 3).
Los resultados indican que las cepas de ambos monosporic consumen menos de nitrgeno total que
la cepa industrial y esta diferencia se obtiene principalmente mediante un consumo de amonio
inferior. La comparacin detallada del consumo de los diferentes aminocidos (Tabla 4) muestra que
la cepa EC1118 consume la mayor cantidad de cido asprtico (41,23 1,53 mg l-1) y cido glutmico
(108,00 4,48 mg l-1) en comparacin con ambas cepas monospricos. Sin embargo, la cepa AC19
consume mayores cantidades de glutamina, serina, arginina y valina, con valores de 428,43 1,85,
51,71 1,30, 82,27 3,96 y 40,63 0,50 y mg l-1, respectivamente. AC114 Strain muestra los
consumos ms bajos de estos aminocidos que alcanzan valores de 26,70 0,85 mg l-1 para el cido
asprtico, 47,50 3,46 mg l-1 para el cido glutmico, 373,67 0,84 mg l-1 para la glutamina, 29,20
0,35 mg L-1 para serina, 3,93 1,96 mg l-1 para valina y 26,07 0,67 mg l-1 de fenilalanina. Por otro
lado, la cepa EC1118 muestra el consumo ms bajo de la arginina con un valor de 23,40 13,36 mg l-
1, mientras que AC114 cepa muestra un valor de 53,10 6,29 mg l-1.

Alternativamente, en las fermentaciones llevadas a cabo por la cepa EC1118 la cantidad de nitrgeno
consumida a partir de aminocidos est entre las cantidades consumidas por las cepas monospricos
(Tabla 3). Sin embargo, esta cepa consume una gran cantidad de nitrgeno de amonio (89,04 5,10
mg l-1) frente a la observada para las cepas monospricos. Por otro lado, las fermentaciones en
MS60 no mostraron diferencias en el consumo de nitrgeno de amonio en las cepas analizadas ya
que este compuesto se consume completamente por todas las cepas durante la fermentacin. Con
respecto a los aminocidos en MS60, hay un consumo total de la mayora de los aminocidos
presentes con un Yan de los aminocidos cerca de 27 mg l-1 en todas las cepas.

3.4. La sobreexpresin y mutacin del gen ICY1 en el EC1118 cepa industrial y su efecto sobre el
consumo de nitrgeno durante la fermentacin

Un enfoque utilizado para evaluar el efecto de la ICY1 gen en el consumo de nitrgeno fue analizar la
absorcin de este compuesto en las fermentaciones llevadas a cabo cepas o cepas que sobre
expresin el gen ICY1 mutante. La caracterizacin de las fermentaciones de las cepas que sobre
expresin el alelo de la cepa EC1118 no muestra una diferencia estadstica significativa en los
parmetros enolgicos analizados, tales como el consumo de azcar o etanol y la produccin de
glicerol con respecto a la cepa EC1118YEPMX, incluyendo el consumo de nitrgeno de amonio. Sin
embargo, hay una tendencia a consumir menos nitrgeno de esta fuente. Debido a las diferencias en
las secuencias encontradas en la ICY1 gen en cepas EC1118 y S288c, el efecto en el consumo de
nitrgeno de la sobreexpresin de cada alelo en el EC1118 cepa se evalu (Tabla 5). Los resultados
mostraron que la cepa que sobreexpresa el alelo de la cepa S288c consume una menor cantidad de
nitrgeno de amonio, que es diferente a lo que se observa con la sobreexpresin del alelo de la cepa
EC1118. Por otro lado, la fermentacin llevada a cabo por la cepa mutante nulo en el gen ICY1
mostr una tendencia hacia un mayor consumo total de nitrgeno como resultado de la mayor
consumo de nitrgeno de amonio. Es importante destacar que la diferencia en el consumo de
nitrgeno no afecta a los otros parmetros enolgicos, lo que indica que este gen slo afecta el
consumo de este compuesto y no la fermentacin en s (Tabla 5).

4. Discusin

Para identificar los genes implicados en el consumo de nitrgeno durante la fermentacin alcohlica,
nuestro laboratorio se compararon los perfiles de transcripcin de las cepas monospricos AC19 y
AC114, que provienen de la misma hbrido hacindolos genticamente relacionado, pero que
difieren en su consumo de nitrgeno [15]. Los resultados mostraron una correlacin entre el
consumo de nitrgeno con diferencias en la expresin de algunos genes tales como ICY1. Esto
muestra que la cepa AC19, que consume una mayor cantidad de nitrgeno de amonio, tiene una
expresin ms alta de la ICY1 gen de AC114 cepa. En el trabajo actual, donde se evalu el consumo
de las diversas fuentes nitrogenadas en detalle en las cepas mencionadas anteriormente, se
encontr que difieren no slo en el consumo de amonio sino tambin en el consumo de algunos
aminocidos especficos cuando se realizan las fermentaciones en el mosto con 300 mg/ l de
nitrgeno asimilable. El consumo detallado de aminocidos en las cepas estudiadas muestra que la
cepa AC114 consume la menor cantidad de los aminocidos, cido asprtico, cido glutmico,
glutamina, serina, valina y fenilalanina. Por lo tanto, las diferencias en el consumo de ciertos
aminocidos explican las diferencias descritas para Yan a partir de aminocidos. Esta observacin no
se ha detectado en los experimentos descritos por Contreras et al. [15] tal vez porque el mosto
utilizado en estos experimentos simula las condiciones industriales y por lo tanto contiene una alta
concentracin de nitrgeno asimilable (518 mg l-1) ofwhich 339 mg de nitrgeno proviene de
amonaco. Adems, slo contiene 9 aminocidos que corresponden a aquellos preferencialmente
consumido por la levadura: arginina, serina, treonina, lisina, cido asprtico, cido glutmico,
asparagina, glutamina y leucina. Por ltimo, muchos de los aminocidos consumidos
diferencialmente por las cepas AC19 y AC114 se han descrito como los de mayor consumo durante la
fermentacin alcohlica [11] que puede tener implicaciones importantes en el desarrollo de la
fermentacin alcohlica.
La prediccin de los sitios de regulacin del promotor del gen ICY1 utilizando el YEASTRACT servidor
(http://www.yeastract.com/findregulators.php) y promotor de levadura Atlas
(http://ypa.ee.ncku.edu.tw/) sugiere que este gen est regulado transcripcionalmente por muchos
factores, tales como Gcn4p [34], Phd1p [35], Hap5p [36], y Nrg1p [37], para los cuales la unin a la
zona promotora del gen ICY1 se ha descrito. Sin embargo, la mayora de estas interacciones se
detectaron mediante tcnicas de masas tales como CHIP en el chip [38], y por lo tanto no hay
ninguna evidencia experimental de que identifica el efecto de estos factores en la expresin del gen.
Como resultado de ello, y dado que las secuencias de la regin promotora del gen en cepas ICY1
AC19 y AC114 son idnticas, las diferencias en la cantidad de ARNm pueden explicarse por la
expresin diferencial de un regulador transcripcional o como resultado de polimorfismos en uno de
estos reguladores que afecta a la unin al ADN o la interaccin con la maquinaria transcripcional, que
produce directa o indirectamente los cambios en la cantidad de mRNA de este gen. En este contexto,
la expresin de la va general de sistema de control de factor transcripcional (GCN), Gcn4p, se
desencadena por la falta de aminocido. Este factor de transcripcin activa la expresin de alrededor
de 500 genes. Uno de los objetivos de la regulacin de este factor es el ICY1 gen, lo que podra
explicar el aumento de su expresin bajo condiciones de hambre de nitrgeno [39,40]. En nuestros
experimentos, la expresin de la ICY1 gen es greaterwhen las cepas son en el mosto que contiene L-1
de nitrgeno asimilable 300 mg. Una posible explicacin para esta observacin es aunque es una
condicin de alta nitrgeno asimilable, puede ser otro factor transcripcional implicados, porque la
expresin de GCN4 se sobreexpresa inMS60 (datos no presentados). Sin embargo, es necesario llevar
a cabo ms trabajo para determinar la transcripcin especfica factorswhich regular la expresin de
este gen y howthe diferencias en la expresin entre las cepas AC114 y AC19 pueden explicarse.

En el presente trabajo la participacin de ICY1 gen en el consumo de nitrgeno se observa por un
aumento en el consumo de amoniaco por la cepa nullmutant y se confirma por el menor consumo de
este compuesto por la cepa que sobreexpresa el alelo de la cepa S288c.However , la cepa que
sobreexpresa el alelo EC1118 no muestra diferencias en la absorcin de nitrgeno en relacin con el
control de la tensin. Estos resultados podran ser explicados por las diferencias en las secuencias de
protenas que sugieren que el cambio en el aminocido 11 de un residuo de cido asprtico por
asparagina cambia las funciones de la protena y por lo tanto vara el consumo de nitrgeno durante
la fermentacin. Estos, junto con la expresin diferencial de la ICY1 gen con respecto a la cantidad de
nitrgeno disponible en el mosto sugieren que este gen desempea un papel importante en el
nitrgeno consumido en condiciones de fermentacin.

En cuanto al efecto de la ICY1 gen en nitrogenmetabolism, no hay informacin suficiente para
permitir la definicin de amechanism de accin. Sin embargo, los resultados de este estudio sugieren
que ICY1 gen afecta el consumo de amonio en condiciones de fermentacin y que la expresin de
este gen est regulada por la cantidad de nitrgeno disponible en themust. Algunos estudios, como
los que por Dunn y Jensen [20] indican que este gen est relacionado con la supervivencia celular en
ausencia de ADNmt como se mencion anteriormente. Adems, existe una relacin directa entre la
funcin de este orgnulo y themain nitrogenmetabolism, ya que en condiciones de fermentacin de
la -cetoglutarato necesaria para la asimilacin de amonio se produce por la va retrgrada del ciclo
de Krebs, la va que afecta el mantenimiento de ADNmt [41]. Por lo tanto, ICY1 gen podra afectar a
la va retrgrada del ciclo de Krebs y el normal funcionamiento de las mitocondrias y el consumo de
amonio por -cetoglutarato.