Analisisasamnukleatsecarakuantitatif

AnalisisDNAMikroarray
AnalisisPCR
AnalisisSAGE

Analisisasamnukleatsecarakualitatif
DNASequencing
Elektroforesis(agarosedanSDSPage)
Staining
Blotting
Hibridisasi

AnalisisDNAMikroarray

Teknikanalisismicroarraydigunakanuntukmenginterpretasikandatayangdihasilkandari
eksperimenterhadapDNA,RNA,danprotein.Metodeinimemungkinkanparapenelitiuntuk
menyelidikikeadaanekspresisejumlahbesardarigendalambanyakkasus,suatuorganismediseluruh
genomdalamsatupercobaan.Percobaantersebutdapatmenghasilkanvolumedatayangsangat
besar,memungkinkanparapenelitiuntukmenilaikeadaankeseluruhanselatauorganisme.Jumlahdata
yangbesarinidapatsulituntukdianalisis,terutamadalamketiadaangenanotasi.

Contohdarisekitar40.000probeyangditandaidenganoligomicroarraydandiperbesaruntuk
menunjukkandetail.

Analisisdatamicroarraymelibatkanbeberapalangkahyangberbeda,sepertiyangdiuraikandibawah
ini.Mengubahsalahsatudarilangkahlangkahyangmemilikipotensiuntukmengubahhasilanalisis,
sehinggaproyekMAQC[1]diciptakanuntukmengidentifikasistrategistandar.Perusahaanadayang
menggunakanprotokolMAQCuntukmelakukananalisislengkap.

Creating raw data

microarraykebanyakanprodusen,sepertiAffymetrixdanAgilent,[3]menyediakanperangkatlunak
analisisdatakomersialdenganmicroarrayperalatansepertipiringpembaca.
Background correction
tergantungpadajenisarray,sinyalyangberkaitandengannonspesifikmengikatfluorophoredapat
dikurangiuntukmencapaihasilyanglebihbaik.Salahsatupendekatanmelibatkanmengurangi
intensitassinyalrataratakawasanantarabintikbintik.Berbagaialatuntukkoreksilatarbelakangdan
analisislebihlanjuttersediadariTIGR,[4]Agilent(GeneSpring),[5]danOcimumBiosolusi(Genowiz).[6]
Depending on the type of array, signal related to nonspecific binding of the fluorophore can be
subtracted to achieve better results. One approach involves subtracting the average signal
intensity of the area between spots. A variety of tools for background correction and further
analysis are available from TIGR,
[4]
Agilent (GeneSpring),
[5]
and Ocimum Bio Solutions
(Genowiz).
[6]

Quality control
Seluruharraymungkinmemilikijelaskelemahanterdeteksiolehinspeksivisual,pairwiseperbandingan
untukarraydalamkelompokeksperimentalyangsama,ataudengananalisisRNAdegradasi.[7]Hasil
dapatmeningkatkandenganmenghapusarrayinidarianalisissepenuhnya.
Entire arrays may have obvious flaws detectable by visual inspection, pairwise comparisons to
arrays in the same experimental group, or by analysis of RNA degradation.
[7]
Results may
improve by removing these arrays from the analysis entirely.
Spot filtering
Identifikasivisualartefaklokal,sepertimencetakataumencuciCacat,demikianjugamungkin
menyarankanpenghapusanbintikbintikindividu.Inidapatmengambilsejumlahbesarwaktu
tergantungpadakualitasmanufakturarray.Selainitu,beberapaprosedurpanggilanuntukpenghapusan
semuabintikdenganekspresinilaidibawahambangbatasintensitastertentu.
Visual identification of local artifacts, such as printing or washing defects, may likewise suggest
the removal of individual spots. This can take a substantial amount of time depending on the
quality of array manufacture. In addition, some procedures call for the elimination of all spots
with an expression value below a certain intensity threshold.
Aggregation and normalization
Membandingkanduaarrayyangberbeda,atauduasampelberbedahibridisasikearraysamaumumnya
melibatkanmembuatpenyesuaianuntukkesalahansistematikyangdiperkenalkanolehperbedaan
dalamprosedurdanpewarnaintensitasefek.Normalisasipewarnauntukduawarnaarrayseringdicapai
denganregresilokal.LIMMAmenyediakanseperangkatalatuntukkoreksilatarbelakangdanscaling,
sertapilihanuntukrataratabintikbintikduplikatpadaslide.[8]Metodeumumuntukmengevaluasi
seberapabaikdinormalisasiarray,adalahuntukplotMAplotdata.
Comparing two different arrays, or two different samples hybridized to the same array generally
involves making adjustments for systematic errors introduced by differences in procedures and
dye intensity effects. Dye normalization for two color arrays is often achieved by local
regression. LIMMA provides a set of tools for background correction and scaling, as well as an
option to average on-slide duplicate spots.
[8]
A common method for evaluating how well
normalized an array is, is to plot an MA plot of the data.
Raw Affy data contains about twenty probes for the same RNA target. Half of these are
"mismatch spots", which do not precisely match the target sequence. These can theoretically
measure the amount of nonspecific binding for a given target. Robust Multi-array Average
(RMA)
[9]
is a normalization approach that does not take advantage of these mismatch spots, but
still must summarize the perfect matches through median polish.
[10]
The median polish
algorithm, although robust, behaves differently depending on the number of samples analyzed.
[11]

Quantile normalization, also part of RMA, is one sensible approach to normalize a batch of
arrays in order to make further comparisons meaningful.
The current Affymetrix MAS5 algorithm, which uses both perfect match and mismatch probes,
continues to enjoy popularity and do well in head to head tests.
[12]

Factor Analysis for Robust Microarray Summarization (FARMS)
[13]
is a model-based technique
for summarizing array data at perfect match probe level. It is based on a factor analysis model for
which a Bayesian maximum a posteriori method optimizes the model parameters under the
assumption of Gaussian measurement noise. According to the Affycomp benchmark
[14]
FARMS
outperformed all other summarizations methods with respect to sensitivity and specificity.
Identification of significant differential expression
Many strategies exist to identify which array probes show an unusual level of over expression or
under expression. The simplest one is to call "significant" any probe that differs by an average of
at least twofold between treatment groups. More sophisticated approaches are often related to t-
tests or other mechanisms that take both effect size and variability into account. Curiously, the p-
values associated with particular genes do not reproduce well between replicate experiments, and
lists generated by straight fold change perform much better.
[15][16]
This represents an extremely
important observation, since the point of performing experiments has to do with predicting
general behavior. The MAQC group recommends using a fold change assessment plus a non-
stringent p-value cutoff, further pointing out that changes in the background correction and
scaling process have only a minimal impact on the rank order of fold change differences, but a
substantial impact on p-values.
Pattern recognition
Commercial systems for gene network analysis such as Ingenuity
[17]
and Pathway studio
[18]

create visual representations of differentially expressed genes based on current scientific
literature. Non-commercial tools such as GenMAPP and Moksiskaan also aid in organizing and
visualizing gene network data procured from one or several microarray experiments. A wide
variety of microarray analysis tools are available through Bioconductor written in the R
programming language. The frequently cited SAM Excel module and other microarray tools
[19]

are available through Stanford University. Another set is available from Harvard and MIT.
[20]

Specialized software tools for statistical analysis to determine the extent of over- or under-
expression of a gene in a microarray experiment relative to a reference state have also been
developed to aid in identifying genes or gene sets associated with particular phenotypes. One
such method of analysis, known as Gene Set Enrichment Analysis (GSEA), uses a Kolmogorov-
Smirnov-style statistic to identify groups of genes that are regulated together.
[21]
This third-party
statistics package offers the user information on the genes or gene sets of interest, including links
to entries in databases such as NCBI's GenBank and curated databases such as Biocarta
[22]
and
Gene Ontology. Protein complex enrichment analysis tool (COMPLEAT) provides similar
enrichment analysis at the level of protein complexes.
[23]
The tool can identify the dynamic
protein complex regulation under different condition or time points. Related system, PAINT
[24]

and SCOPE
[25]
performs a statistical analysis on gene promoter regions, identifying over and
under representation of previously identified transcription factor response elements. Another
statistical analysis tool is Rank Sum Statistics for Gene Set Collections (RssGsc), which uses
rank sum probability distribution functions to find gene sets that explain experimental data.
[26]
A
further approach is contextual meta-analysis, i.e. finding out how a gene cluster responds to a
variety of experimental contexts. Genevestigator is a public tool to perform contextual meta-
analysis across contexts such as anatomical parts, stages of development, and response to
diseases, chemicals, stresses, and neoplasms.

AnalisisPCR
Biotechnology,PCRMay7,2009at2:28pm
MengenalPCR(PolymeraseChainReaction)
byYepyHardiRustam
Tentu Anda sudah mengenal yang namanya DNA. DNA
ini sering disebut-sebut terutama berkaitan dengan kriminalitas, diagnosa penyakit, penentuan
keabsahan keturunan, dll. Mungkin Anda bingung bagaimana caranya polisi bisa mengungkap
pelaku kejahatan dengan berbekal sehelai rambut pelaku yang tercecer di TKP, atau dari tetesan
sperma pemerkosa yang mengering di tubuh korban. Padahal kan sampel yang dianalisa
jumlahnya sangat sedikit, ajaib!
Ternyata hal ini gak lepas dari yang namanya PCR alias Polymerase Chain Reaction. Proses
yang berlangsung secara in vitro dalam tabung reaksi sebesar 200 l ini mampu menggandakan
atau mengkopi DNA hingga miliaran kali jumlah semula. Maka pantes aja dengan berbekal DNA
yang terkandung dalam sampel yang cuma secuil itu bisa diperoleh banyak sekali informasi
sesuai kebutuhan kita.
Reaksi PCR meniru reaksi penggandaan atau replikasi DNA yang terjadi dalam makhluk hidup.
Secara sederhana PCR merupakan reaksi penggandaan daerah tertentu dari DNA cetakan
(template) dengan batuan enzim DNA polymerase.
PCR terdiri atas beberapa siklus yang berulang-ulang, biasanya 20 sampai 40 siklus. Nah,
sekarang bayangkan bahwa pada setiap siklus DNA polymerase akan menggandakan DNA
sebanyak 2 kali, dan coba hitung berapa salinan utas ganda DNA yang akan dihasilkan setelah 30
siklus? Yup, 2 pangkat 30 alias 1.073.741.824 kali! Tentu saja nilainya tidak tepat seperti itu,
kita masih harus memperhitungkan efisiensi reaksi, tapi tetap saja hasilnya akan sangat banyak.
[simage=201,512,y,left]
KomponenPCR
Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yang
dibutuhkan adalah:
Primer
Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi
sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan
membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya
kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang
maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang
untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel
mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.
dNTP(deoxynucleosidetriphosphate)
dNTP alias building blocks sebagai batu bata penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4
macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.
Buffer
Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan
optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase.
IonLogam
Ionlogambivalen,umumnyaMg++,fungsinyasebagaikofaktorbagienzimDNApolymerase.
TanpaioninienzimDNApolymerasetidakdapatbekerja.
Ionlogammonovalen,kalsium(K+).
TahapanReaksi
[simage=200,512,y,left]
Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:
Denaturasi
Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama 30-60 detik. Pada suhu ini DNA
utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal.
Annealing
Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40-60oC selama 20-40 detik untuk
memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang
komplemen dengan sekuen primer.
Ekstensi/elongasi
Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase,
biasanya 70-72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada
pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan dipasang dNTP, begitu seterusnya
(ingat pasangan A adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya). Enzim akan
memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu ekstensi bergantung pada
panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.
Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:
Pradenaturasi
Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan
mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu).
FinalElongasi
Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk memastikan
bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan
setelah siklus PCR terakhir
PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan
menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. Pada awalnya orang
menggunakan tiga penangas air (water bath) untuk melakukan denaturasi, annealing dan ekstensi
secara manual, berpindah dari satu suhu ke suhu lainnya menggunakan tangan. Tapi syukurlah
sekarang mesin Thermal Cycler sudah terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan.
AplikasiteknikPCR
Kita harus berterima kasih kepada Kary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan
PCR pada tahun 1984. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam
kebutuhan, diantaranya:
IsolasiGen
Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia saja
panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Oh ya, gen itu apaan
ya?
Sebagaimana kita tahu bahwa fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai
panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian
diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA
genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan
protein atau disebut junk DNA, DNA sampah yang fungsinya belum diketahui dengan baik.
Kembali ke pembahasan isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk
diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi atau
babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta
memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin
manusia.
Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari
DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri
dapat memproduksi insulin juga [http://www.littletree.com.au/dna.htm]. Dan ajaib! Hasilnya
insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin
tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara
konvensional yang harus mengorbankan sapi atau babi.
Nah, untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama probe yang
memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat
dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.
DNASequencing
Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum
digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi
menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan
pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2
primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna
fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa
ditentukan.
Forensik
Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban
kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin
lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian
tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu
DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang.
Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah,
misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa
dipastikan identitas orang yang dimaksud.
Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua
sesungguhnya dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.
DiagnosaPenyakit
Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini,
bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa
yang cepat dan akurat.
PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa
dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah
tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus
atau makhluk lainnya.
Masih banyak aplikasi PCR lainnya yang sangat bermanfaat. Maka tak salah panitia Nobel
menganugrahkan hadiah Nobel bidang kimia yang bergengsi ini kepada Kary B Mullis hanya 9
tahun setelah penemuannya (1993).

AnalisisSAGE
DNASequencing
PrinsipDasarDNASequencing
DNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai pijakannya.
DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan (template) untuk
kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR,
namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu. Proses ini dinamakan cycle sequencing.

Proses Cycle Sequencing (Image from appliedbiosystems.com)

Jadi yang membedakan cycle sequencing dengan PCR biasa adalah:
Primeryangdigunakanhanyasatuuntuksatuarahpembacaan,tidakdua(sepasang)sepertiPCR
ddNTPs(dideoxyNucleotideTriphosphate)adalahmodifikasidaridNTPsdenganmenghilangkan
gugus3OHpadaribosa.

Struktur molekul dNTP dan ddNTP, perhatikan bedanya (Image from csa.fi.it)
Saat proses ekstensi, enzim polimerase akan membuat rantai baru DNA salinan dari template
dengan menambahkan dNTP-dNTP sesuai dengan urutan pada DNA cetakannya. Nah, jika yang
menempel adalah ddNTP, maka otomatis proses polimerisasi akan terhenti karena ddNTP tidak
memiliki gugus 3-OH yang seharusnya bereaksi dengan gugus 5-Posfat dNTP berikutnya
membentuk ikatan posfodiester.
Pada akhir cycle sequencing, yang dihasilkan adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang
bervariasi. Jika fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan elektroforesis, maka akan terpisah-
pisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu basa. Lalu bagaimana caranya menentukan
urutan basa DNA dari produk cycle sequencing ini?
CaraKlasik
Metode yang pertama kali dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun 1975, yaitu dengan
melakukan reaksi cycle sequencing pada empat tabung terpisah yang masing-masing berisi
semua pereaksi yang dibutuhkan. Khusus untuk ddNTP, yang ditambahkan hanya 1 jenis untuk
setiap tabung. Setiap tabung diberi tanda, A jika yang ditambahkan adalah ddATP, G jika
ddGTP, C jika ddCTP dan T jika ddTTP.
Setelah reaksi cycle sequencing selesai, keempat hasil reaksi tersebut dilarikan pada gel
electrophoresis sehingga fragmen-fragmen yang dihasilkan dapat terpisah. Urutan basa DNA
dapat ditentukan dengan mengurutkan fragmen yang muncul dimulai dari yang paling bawah
(paling pendek). Fragmen DNA dapat divisualisasi karena primer yang digunakan dilabel dengan
radioaktif atau fluorescent. Pada teknik lain, bukan primer yang dilabel melainkan dNTP.

Prinsip Sanger Method dengan primer labelling (Image from noaa.gov)

DyePrimersdenganLabelBerbeda
Agar proses pemisahan fragmen pada gel electrophoresis bisa digabung dalam 1 lajur saja,
digunakanlah pelabel fluorescent dengan 4 warna berbeda untuk setiap reaksi cycle sequencing.

Prinsip Sanger Method dengan primer fluorescent labelling yang berbeda-beda (Image from
appliedbiosystems.com)
Dengan teknik ini visualisasi dan penentuan urutan basa dapat dilakukan dengan lebih mudah
karena keempat reaksi dipisahkan dalam satu lajur electrophoresis dengan 4 warna berbeda.
Coba bandingkan cara ini dengan cara sebelumnya, lebih mudah mana membacanya?

Pembacaan sekuen DNA, lebih mudah mana? (Image from wikipedia.org)

DyeTerminatorsSequencing
Cara yang lebih simple akhirnya ditemukan juga. Para ilmuwan cerdas menemukan cara untuk
melabel ddNTP dengan 4 label fluorescent yang berbeda-beda untuk ddATP, ddCTP, ddGTP dan
ddTTP. Dengan demikian, reaksi cycle sequencing dapat dilakukan dalam 1 tabung reaksi dan
dirun pada satu lajur gel electrophoresis saja. Sangat simple dan cepat.

Prinsip Sanger Method dengan dye dideoxy terminator (Image from appliedbiosystems.com)
Dengan ditemukannya mesin Automated Capillary Sequencer, proses pemisahan fragmen dan
pembacaan urutan basa DNA dapat dilakukan dengan lebih simple, cepat dan terotomatisasi.
Jumlah kapiler pada mesin ini bervariasi, mulai dari 1, 4, 16, 48 hingga 96 kapiler dalam satu
mesin, semakin banyak jumlah kapiler, semakin banyak pula jumlah sampel DNA yang bisa
ditentukan urutan basanya.
Hasil pembacaan mesin sequencer disebut electropherogram, yaitu peak-peak berwarna yang
menunjukkan urutan basa DNA-nya.

Contoh Electropherogram (image from ggpht.com)

Teknik DNA Sequencing yang berbasis fragment analysis saat ini tidak hanya digunakan untuk
menentukan urutan basa-basa DNA semata, tapi bisa dikembangkan untuk berbagai aplikasi,
seperti penentuan SNP (Single Nucleotide Polymorphism), analisa keragaman genetik seperti
DNA Microsatellite dan AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), community
analysis seperti tRFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) dan segudang
aplikasi lainnya. Banyaknya aplikasi DNA Sequencing kapiler ini menunjukkan bahwa metode
ini meskipun kini tergolong lambat setelah ditemukannya high-throughput sequencing akan
tetap jadi primadona dan andalan para life-scientist di seluruh dunia. Dan tak heran pula jika
Frederick Sanger menerima hadiah Nobel bidang kimia untuk kedua kalinya di tahun 1980 atas
penemuannya ini.

Elektroforesis
Elektroforesis
SebelumfragmenfragmenDNAgenomikhasildigestirestriksidiligasikankedalamsuatuvektortertentu
(lihatBabIX)terlebihdahuluperludilakukanpemeriksaanataskeberhasilandigestitersebut.Untukmelihat
keberhasilan digesti restriksi, DNA divisualisasikan menggunakan teknik elektroforesis. Namun,
elektroforesissendirisebenarnyabukanlahteknikvisualisasiDNAsematamatakarenateknikinidapatjuga
digunakanuntukkeperluanisolasidanpemurnianfragmenDNAtertentu.

Prinsipkerjaelektroforesisadalahmemisahkanmolekulmolekulbermuatanlistrikberdasarkanatasukuran
(berat molekul) dan muatan listriknya. Khusus untuk DNA, pemisahan tidak didasarkan atas perbedaan
muatan listriknya, tetapi menurut ukuran dan konformasi atau struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa
digunakan adalah agarosa dan poliakrilamid. Gel agarosa digunakan untuk memisahkan sampel DNA
denganukurandaribeberaparatushingga20.000pasangbasa(pb),sedangkangelpoliakrilamiddigunakan
untukfragmenfragmenDNAyanglebihkecil.MolekulDNAbermuatannegatifsehinggadidalammedan
listrikakanbermigrasimelaluimatriksgelmenujukutubpositif(anode).Makinbesarukuranmolekulnya,
makinrendahlajumigrasinya.Jikahubunganantaraukuranmolekuldanlajumigrasi102dipetakandalam
suatugrafiklogaritmik,makaakandiperolehkurvalinier.Olehkarenaitu,kitadapatmemperkirakanberat
molekul suatu fragmen DNA dengan melihat atau membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi
fragmenfragmenmolekulDNAstrandar(marker)yangtelahdiketahuiukurannya.
FragmenfragmenDNAdivisualisasikandibawahsinarultravioletsetelahterlebihduludirendamdi
dalamlarutanetidiumbromid,pewarnayangakanmenyisipataumelakukaninterkalasidiselaselabasa
DNA.Perendamandilakukansetelahmigrasidianggapcukupuntukdihentikan.FragmenDNAakannampak
sebagaipitaberwarnamerahdenganposisimigrasiyangsesuaidenganberatmolekulnya.Carainidapat
memvisualisasikanfragmenDNAhinggasekecil0,05g.Sepertitelahdikatakandiatasbahwaselainkarena
perbedaan ukurannya, laju migrasi DNA pada gel elektroforesis juga ditentukan oleh konformasi
molekulnya. DNA dengan bentuk covalently closed circular (CCC) akan bergerak paling cepat, disusul
berikutnya konformasi open circular (OC), dan yang terakhir linier. Oleh karena perbedaan konformasi
menyebabkanperbedaanlajumigrasi,makapenentuanukuransuatufragmenDNAselaludilakukanpada
konformasilinier.

Southernblotting
Dinamaisetelahpenemunya,biologiEdwinSelatan,SelatanBlotadalahmetodeuntukmenyelidiki
keberadaan sekuens DNA tertentu dalam sampel DNA. DNA sampel sebelum atau setelah pencernaan
enzimrestriksidipisahkandenganelektroforesisgeldankemudianditransferkemembrandenganblotting
melaluiaksikapiler.MembrantersebutkemudianterkenaprobeDNAberlabelyangmemilikiurutanbasa
pelengkapuntukurutanDNApadabunga.Kebanyakanprotokolasliyangdigunakanlabelradioaktif,namun
nonradioaktif alternatif yang sekarang tersedia. Southern blotting kurang umum digunakan dalam ilmu
laboratoriumkarenakapasitastekniklain,sepertiPCR,untukmendeteksiurutanDNAspesifikdarisampel
DNA.Bercakinimasihdigunakanuntukbeberapaaplikasi,bagaimanapun,sepertimengukurjumlahsalinan
transgenpadatikustransgenik,ataurekayasagenselindukgarisKOembrio.
SouthernblotadalahsuatuteknikyangdikembangkanolehEdwin.M.Southernpada1975,seorang
ahlibiologiasalInggris. Teknik inidigunakan untukpendeteksiansuatuDNAsequencespesifik(gen atau
lain) dalam sample kompleks DNA (selular DNA). Ini juga digunakan untuk menentukan bobot molekular
suatu restriksi fragmen dan untuk mengukur sejumlah relatif dalam sample berbeda. Di bawah kondisi
kondisi optimal, Southern blot mendeteksi ~ 0.1 pg DNA yang menarik. Blot teknik digunakan untuk
memindahkanproteinDNAdanRNAkesuatupengangkutsehinggadapatdipisahkan,danseringjugadiikuti
penggunaansuatugelectrophoresis.SouthernblotdigunakanuntukmemindahkanDNA.Digunakanbiologi
molekular untuk melihat kemungkinan kehadiran suatu urutan DNA dalam suatu sample DNA. Southern
blotSelatanberkombinasigelagaroseelectrophoresisuntukseparasiukuranDNAdenganmetodauntuk
memindahkanDNAkesuatumembranfilteruntukpemeriksaanhybridisasi.MetodalainadalahWestern
blotdanNorthernblotmemilikiprinsipkerjayangsamatetapimenggunakanRNAdanprotein.
Setelah electrophoresis, gel tersebut diperlakukan dengan suatu alkali yang menyebabkan DNA
terdenaturasidanterpisahmenjadirantaitunggal.Suatumembransepertiselaputditempatkanpadagel
dandiberitekananmelaluipengisapanataumetodamundanedalamkertashanduk(papertowels)dengan
suatu berat. DNA berpindah tempat ke membran dan stick. Membran DNAimpregnanted dibakar atau
menyebar secara permanen dengan menyertakan DNA tersebut. Molekul yang kemudian diperlakukan
dengansuatupemeriksaanhybridisasiyangmanahanyasuatumolekulDNAdenganurutandikenaliyang
akan dipasangkan dengan urutan DNA yang telah ditandai (diblot). Pemeriksaan DNA berlabel dengan
fluorescents atau chromogenic berpijar sehingga dapat teridentifikasi. Dengan pengujian pola dari
hybridisasi dengan sinar X atau Autoradiografi, peneliti dapat menentukan fragmen yang berisi DNA
sequencespesifikataugen.
Southernblotsdigunakanpenemuangendanpemetaan,evolusidanstudipengembangan,forensik
dan diagnostik. Dalam tingkat genetik untuk memodifikasi pada organisme, Southern blot digunakan
sebagaitestuntukmemastikanbahwabagianDNAtertentumengenalurutangen.Southernblotanalysis
untukmenandaikaraktertransforman.Southernblotanalysisbermanfaatuntukmengidentifikasibentuk
berbeda, menentukan memasukkan atau menyisipkan jumlah copy dan untuk mendeteksi gross DNA
penyusunan kembali yang mungkin telah terjadi perubahan. Jika kamu sedang menganalisis
galactosidase dengan memasukkan atau menyisipkan dan dipotong potong dengan EcoRV maka akan
dihasilakn potongan sekitar 1kb dari atas dan bawah dari urutan galactosidase persandian dimulai.
Pemecahanolehenzimrestriksi,AnalisisGel,danbloting.
IniadalahprosedurstandardariSouthernblotanalysis.
1.dipecahsedikitnya1uggenDrosophiladenganenzimrestriksiyangsesuai.Dipecah15ugDNAdalam
volume20uldengan10unitenzim.Pemecahandilalukanselama412jam.
2. Periksa kualitas pemecahan dengan analisis 100 ng dari tiap sample dalam minigel. meliputi sample
controlyangbelumdipecahsebagaiperbandingan.Sampleyangtelahdipecahtampaksebagaibandband
darirepetitifsequen(urutanberulang)yangdapatdiperlihatkan.
3. Sisa DNA 1% pada gel agarose meliputi jalur dengan penanda lamda untuk gel yang diwarnai dengan
ethidiumbromidadandifoto.
4.Geldiwarnaiselama20menitdalam1ug/mlethidiumbromida.Destaindalamairselama10menitdan
difoto.
5.Serapgelselama15menitdalam0.12MHCLbromophenolbluehinggamenguning.
6.Serapgeldalam0.4MNaOHselama30menit.
7.Potong3potongandalammemblotkertasyangakanmeluassekitar1incidiluargelpadaempatsisi.
Rendammasingmasingdengan0.4MNaOHDantumpukandalamsuatukaca.
8. Potong gel sampai pertengahan dan membuang bagian puncaknya. Dengan memotong jalur
pertengahan,identasiakantertinggaldipuncakgeldimanageldiratakandenganprosedurblotting,danini
dapat digunakan untuk penyaringan baik telah ditempatkan dia tas gel. Hempaskan gel yang tak teratur
dan menempatkannya pada pertengahan tumpukan kertas hisap untuk mendorong ke luar gelembung
udara.
9.GeldilemparkandisebabkanDNApadaumumnyasemakindekatkepadasisibawahgel.framegeldengan
potongan plastik. Plastik meluas di bawah tepi gel dari 1 2 milimeter. dengan perlahan memaksa
gelembungudaramemberesbebasdarigel.Plastikmencegahpenyanggamengalirdisekitargel.
10. Suatu potongan Genescreen yang lebih untuk memenuhi ukuran gel. Permukaan basah gel dengan
beberapa tetesan 0.4 M NaOH. perlahan lahan meletakkan gen menyaring ke permukaan gel. Hindari
menjeratgelembungudaradibawahsaringanjugamenghindaribergesernyasaringanyangberhubungan
dengangelsepertibeberapaDNAmungkintelahmulaiuntukdipindahkankesaringan.
11. Dua potongan kertas hisap untuk memenuhi Genescreen dan meletakkan hingga lembar tersebut
mengeringkanpadawaktuyangsamadiatassaringan.Kertaspertamabasah,danmelicinkannyasebelum
menambahkan yang kedua. Potongan yang kedua basah sepenuhnya mengumpulkan tumpukan paper
towels.
12. Menumpuk 1 inchi lapisan dari paper towels di atas potongan puncak kertas hisap. Towels harus
memotonguntukmemenuhiukuransaringan.
13. Tempatkan potongan flat/plexiglass atau kaca yang diletakkan di paling atas. Menimbang tumpukan
yang hancur bersama suatu botol yang berisi 200 500 ml tentang segala bentuk. Kemudian DNA
dipindahkanselama6jam.
14.Setelahtransfer,dipindahkankesaringandandiserapselama15menitdalam200ml0.2MTrisClpH
7.5,2XSSC.
15. Blot filter dikeringkan dengan paper towels dan kemudian dibiarkan kering selama sedikitnya 1 jam.
Saringandapatdisimpanbilatelahkering,keadaaninicukupuntukmenentukanDNAkedalamsaringan.
TidakkebutuhanuntukmembakarsaringangenescreenuntukmenyertakanDNA.
PersiapanDNAradiolabeleduntukmenyelidikiSouthernblot.Beberapakotakpersediaanberbeda
untuk pemeriksaan radiolabeling. Kotak berdasarkan pada cat dasar acak menghasilkan radioaktif
memeriksadenganaktivirtaskirakira109cpm/ul.SuatufragmenDNAgelpurifiedakandisediakanuntuk
reaksi dasar yang acak. Sejak reaksi dasar paling acak terutama yang sama, prosedur yang berikut dapat
digunakanuntukmemindahkanunincorporatedradioactivenucleotide
1.Stopreaksidenganmenambahkan0.5MEDTAdengankonsentrasiakhirkirakira20mM.
2.TambahkanNambahkan400ulTE,1ul5mg/mlDNAsalmondan20ul100mMspermine.Campuran
denganbaik.
3.Inkubasidiatasesselama15menit,sentrifugasimesinselama15menitdanbuangansupernatant.
4.Pecahkanbutirpada37oCdalam50ul0.5MNaCl/TEselama10menituntukmemecahkan.
5. Tambahkan 200 ul TE dan menghitung jumlah kecil untuk menentukan efisiensi label DNA. Simpan
pemeriksaandidalamlemaries.
AnalisisSouthernblotdenganpemeriksaanradiolabeled.Saringanpertamadirendamuntukperiodeyang
singkat dalam pemeriksaan campuran hybridisasi. Kemudian pemeriksaan ditambahkan secara langsung
hybridisasisolusi.Tidakadaprehybridisasicampurankhusus.
1.GulungblotkedalamsilindersehinggasisiDNAsisikearahpusatsilinderdanmenempatkanblotdalam
tabung50ml.
2.Siapkankirakira10mlhybridisasicampuran(minusprobe)dalam200ul5mg/mlDNAsalemsonicated
selama5menitdanvampurkansecaramenyeluruh10ml6XSSC,50%Formamide,1%SDS,10%Dextran
Sulfate.(30mlsolusiyangkekuranganDNAsalmondapatdibuatdenganmeletakkan9ml20XSSC,15ml
Formamide,3ml10%SDS,3gSodiumDextranSulfatekedalamsuatutabung50mldanputarcampuran
itudalamtungkuhybridisasitungkupadasuhu42oCselamabeberapajam.Simpancampuranpada20oC
dansuhupanas42oCsebelumpenggunaan)
3.tambahakancampuranhybridisasikedalamtabungyangberisiblot,captabung,danberputartabung
dalamtungkuhybridisasipadasuhu42oCselamaminimal15menit.
4. Didihkan 5 10 juta cpms dalam volume 200 ul TE selama 5 menit dan kemudian menempatkan
pemeriksaandiatases.
5. Mindahkan tabung yang berisi blot dari tungku hybridisasi dan menambahkan pemeriksaan dengan
hybridisasi solusi. Mengikhtisarkan tabung, campurkan dan kembali tabung ke tungku hybridisasi. Putar
tabungdengansuhu42oC.
6. Hari berikut, menuangkanhybridisasi radioaktif dan mencampurkan ke dalam tabung untuk
dipergunakankembalijikadiperlukan.Menyimpancampuranhybridisasidalamlemaries.(untukdigunakan
pemeriksaankembali,didihkancampuranselama15menit)
7.Siapkantotal200ml2XSSC,0.5%SDSuntukmencuciblot.Tambahkankirakira30mldarisolusiinike
dalam tabung yang berisi blot itu, rekap dan berputar tabung pada suhu 25C selama 15 menit. Buang
denganmencucilimbahradioaktifdanmengulangimemeriksaprosedurduakali.
8.Pindahkanblotdaritabung50mldancuciblotselama15menitpadasuhukamardalambakidengan2X
SSC,0.5%SDS(~100ml).buangtabungradioaktif.
9.Siapkan200ml0.1XSSC,0.1%SDSdandalamkeadaanhangatataupadasuhu55oC.
10. Gulungkan tblot ke dalam suatu silinder dengan sisi DNA ke arah pusat dan menaruhnya ke dalam
tabung baru 50 ml. Tambahkan 30 ml 0.1X SSC, 0.1% SDS pada blot dan putar tabung dalam tungku
hybridisasiselama15menitpadasuhu55oC.Buangdenganmencucidanmengulangimemeriksaprosedur
sampaisolusihabistercuci.
11.Pindahkanblotdari tabungdantempatkan padaflat potonganplastik.Blotcairankelebihandibuang
tetapitidakdengansaringanuntukdikeringkansepenuhnya.
12.SingkapkansaringankefilmsinarxPenyinaranmemfilmkandalamintensifscreen.
IniadalahsuaturingkasdariSouthernblotdilakukandansepertiapadatayangdapatdiperoleh.Southern
blotsmemberikanpenyelidikanatauanalisisuntukmenentukanbobotmolekularsuaturestriksifragmen
fragmendanuntukmengukursejumlahrelatifdalamcontohberbeda.
1.DNA(genomicatausumberlain)dipecahdenganenzimrestriksiEnzimrestriksiendonucleasedigunakan
untuk memotong highmolecularweight DNA strands ke dalam fragmen yang lebih kecil. DNA fragmen
kemudian adalah di electroforisis pada suatu agarose gel untuk dipisahkan berdasarkan ukurannya pada
umumnyanampaksebagaiband.DNAterdenaturasimenjadirantaitunggaldenganinkubasidenganNaOH.
2. Jika sebagian dari fragmen DNA lebih besar dari 15 kb, kemudian sebelum di blot, gel mungkin
diperlakukandengansuatuasam,sepertiHCLencer,yangdepurinatesfragmenDNA,memotongDNAke
dalam potongan lebih kecil, dengan begitu membiarkan perpindahan yang lebih efisien dari gel ke
membran. DNA ditransfer ke membran seperti lembaran dari kertas hisap khusus. DNA fragementsw
mempertahankan pola separasi yang sama dalam gel. Blot di inkubasi dengan banyak copy dalam
pemeriksaanyangmerupakanDNAsinglestranded.
3.Jikametodaperpindahanalkalidigunakan,gelyangmengandungDNAditempatkankedalamsuatusolusi
bersifat alkali (Secara khas berisi Sodium hydroxide) untuk mengubah sifat DNA yang doublestranded.
DenaturationdalamlingkunganbersifatalkalimenyediakanuntukikatanDNAyangbermuatannegatifke
dalam membran bermuatan positif, memisahkannya ke dalam rantai DNA tunggal untuk pemeriksaan
hybridisasidanmenghancurkanRNAresiduyangmasihhadirdalamDNA.
4.PemeriksaaniniakanmembentukbasepairsdenganDNAsequenceyankomplitdanbanddalambentuk
molekul DNA doublestranded. Pemeriksaan tidak bisa dilihat tetapi selain dengan radioaktif atau enzim
dapatdilihat(phosphatasebersifatalkaliatauhorseradishperoxidase).
5.Penempatanlokasipemeriksaandiungkapkandenganinkubasisubstratetanpaterwarnaiitumengikat
enzimmengkonversiprodukdiwarnaiyangdapatdilihatataumenyemburkancahayayangakandisingkap
dengansunarX.Jikapemeriksaantelahdiberilabeldenganradioaktifitas,dapatmenyingkapkanfilmsinar
X secara langsung. Misalnya pada Southern Blot analysis of DNA Panel yang kiri adalah suatu gel
electrophoretic yang diwarnai dengan ethidium bromida. Total DNA telah diekstrak dari 9 clon plasmid
(lanes ## 19), yang didigesti dengan pembatasan endonuclease restriksi tertentu dan yang dipisahkan
menurutukuranolehelectrophoresis.DNAyangterlihatdinodainampakdengantidakadaikatanterpisah,
tidaksatupunurutanDNAhadirlebihdarisatucopy.MolekulardenganberatstandarStandardmempunyai
saturangkaianfragmenDNAdariukurandikenal.SuatuclonfragemenDNAtelahterisimuatanlane#10:
bebanstandarmenandaiadanyaukuransekitar400bp.
Panel tenggah adalah suatu southern blot autoradiogram gel yang sama. DNA dalam gel telah
ditransfer (yang dinodai) ke suatu filter, kemudian filter diunjukkan ke suatu DNA radioactivelylabelled
yangdibuatdariDNAmemuatjalur#10.SaringankemudianadalahdiunjukkandenganfilsinarX.Dimana
pemeriksaan DNA ditemukan suatu urutan homolog sepancaran yang di nodai, basepairs (hybridizes)
untuk DNA. Radioaktifitas kemudian menyingkapkan film itu dan menghasilkan suatu band gelap di atas
film sinar X.
Panel kanan adalah suatu bagan untuk southern autoradiogram, isi informasi adalah kehadiran atau
ketidakhadiran suatu band serta ukurannya. Kehadiran suatu band menunjukkan bahwa urutan DNA
homolog dalam pemeriksaan itu DNA hadir dalam clone ## 3, 4,& 8, dengan ukuran yang sama ketika
pemeriksaan,danketidakhadiranclone##1,2,5,&9.Dijalur#6urutanhomologyanghadirtetapidengan
suatulokasipembatasantambahanyangmemotongfragmenitumenjadiduafragmenlebihkecil.Analisa
inimenunjukkanbahwagenmenarikmenjadiclonsuksesdengansatuantertentudalamplasmid,danada
variasigenetikdalamclone#6.Geninisekarangdapatdianalisalebihlanjut.
A. Pria normal : ikatan tunggal yang ukurannya normal serta tidak mengandung metil
B.Wanitanormal:duaikatanyangukurannyanormal,satutidakmengandungmetil(kromosomXaktif)
dan satu mengandung metil (kromosom X yang tidak aktif)
C.Priapremutasi:ikatantunggalyangukurannyaditingkatkansertatidakmengandungmetil.Premutation
inimempunyai75pengulangan(diukuranolehanalisisPCR).
D. Wanita premutation : empat ikatan dengan pola tidak mengandung metil (X aktif)) dan mengandung
metil (X tidak aktif) bentuk keduaduanya premutasi dan ikatan normal. Premutation ini mempunyai 92
pengulangan(diukuranolehanalisisPCR)
E.Priamutasipenuh:ikatan>200pengulanganyangikatannyamengandungmetil.Ketidakhadiransuatu
ikatantidakmengandungmetilnormal.Dalamhaliniadatigaukuranmutasipenuhberbeda,280,430dan
920pengulangan(diukurdenganSouthernblotanalysis)
F.Wanita,mutasipenuh:ikatan>200pengulanganyangikatannyamengandungmetil.Duaikatannormal
dariallelyangnormaladalahjugatersedia.Mutasipenuhinimempunyai355pengulangan(diukurdengan
Southernblotanalysis)
G. Pria mosaik : Mutasi penuh dan premutation. Dalam hal ini mutasi yang penuh mempunyai 510
pengulangan(diukurdenganSouthernblotanalysis)danpremutationmempunyai84pengulangan(diukur
dengananalisisPCR)
Metode ini mengkombinasikan elektroforesis gel agarosa untuk memisahkan DNA berdasarkan
ukurannya dan kemudian ditransfer ke membran filter untuk selanjutnya dilakukan hibridisasi dengan
probe. Untuk mengidentifikasi ataupun melacak suatu fragmen DNA spesifik diperlukan suatu pelacak
(probe).DNAdipisahkanterlebihdahuludenganelektroforesis.Probeyangdilabelakanterhibridisasipada
pitapita DNA untuk mengetahui apakah DNA tersenonetheless mengandung gen yang diinginkan.
SouthernblotmendeteksissDNAdenganmenggunakanDNAsebagaipelacak.SelainSouthernBlotmetode
lainyangmiripdandikembangkandariSouthernBlotadalahWesternBlotNorthernBlotdanSouthwestern
Blot yang memiliki prinsip yang sama namun molekul yang akan dideteksi dan pelacak yang digunakan
berbeda.KegunaandariSouthernBlotadalahuntukmenganalisiskeberadaanmutanyangadapadasuatu
organismedandapatdiketahuiukurandarigenyangmenjadimutanpadaorganismetersenonetheless.
==Aplikasi
TeknikSouthernBlottelahdigunakandalamberbagaiaplikasidibidangkesehatanmaupunpadarekayasa
genetika. Salah satunya digunakan untuk menganalisis sistem major histokompatibilitas pada tikus dan
menganalisis penyusunan klon dari gen Tcell receptor penyakit luka yang diakibatkan oleh mikosis dari
fungoides.GuntherEWurstWWonigeitKEpplenJT.Analysisoftheratmajorhistocompatibilitysystemby
Southernblothybridization.JImmunol143(2);12571261.Dosaka NTanakaTFujitaMMiyachiYHorioT
ImamuraS.1989.SouthernblotanalysisofclonalrearrangementofTcellreceptorgeneinplaquelesion
ofmycosisfungoides.JInvestDermatology93;626629.
TahapanSouthernBlot
TahapawaldarimetodeSouthernBlotadalahpendigestianDNAdenganenzimrestriksiendonuklease
sehingga terbentuk fragmenfragmen DNA yang lebih kecil. Kemudian DNA dipisahkan sesuai ukuran
denganelektroforesisagarosa.SetelahDNAterpisahdilakukanpemindahanDNAkemembrannitroselulosa
tahapinidiseneverthelessdengantahapblotting.Membrannitroselulosadiletakkanpadabagianatasdari
gel agarosa. Pada teknik blotting dengan menggunakan vakum membran diletakkan pada bagian bawah
gel. Tekanan diberikan secara merata pada gel untuk memastikan terjadi kontak antara gel dengan
membran.Prosestransferberlangsungdenganmemanfaatkandayakapilaritas.setalahDNAditransferke
gelmembrannitroselulosadipanaskandengansuhutinggi(60oC100oC)kemudianmembrandiberiradiasi
UV agar terbentuk ikatan kovalen dan permanen antara pitapita DNA dengan membran. Lalu membran
dicampur dengan probe (pelacak) yang telah dilabel radioaktif tetapi dapat juga digunakan tag
nonradioaktifyangdapatberpendar.ProbeyangdigunakanadalahDNAutastunggalyangmemilikisekuen
yang akan dideteksi. Probe diinkubasi dengan membran agar dapat berhibridisasi dengan DNA yang ada
pada membran. Setelah proses hibridisasi probe yang tidak terikat dicuci dari membran sehingga yang
tinggal hanya probe yang hibrid dengan DNA di membran. Pola hibridisasi kemudian dideteksi dengan
visualisasipadafilmXraymelaluiautoradiografi.
PemisahanDNAdanRNAberdasarkanukurandenganelektroforesispadaberbagaisistemgelmerupakan
teknikdasaryangpentingdalambiologimolekuler.PadapHnetral,DNAdanRNAbermuatannegatifdan
akan bermigrasi ke arah anoda. Jika migrasi dilakukan pada matriks polimer (gel), fragmen kecil akan
bergeraklebihcepatdaripadafragmenyangbesar(Gambar12).Dengandemikian,migrasielektroforetik
melalui gel akan memisahkan campuran fragmen DNA sehingga nampak sebagai pitapita yang berbeda
ukurannya. Banyak matriks gel yang dapat dignakan untuk pemisakhan asam nukleat, tapi yang paling
banyakdigunakanadalahgelagarosedanpoliakrilamid.GelagarosesesuaiuntukpemisahanfragmenDNA
yangberukuran0.120kb,sedangkanpoliakrilamiduntukfragmenDnaberukuran0.0252kb.Denaturan
sepertiureadapatditambahkanpadagelpoliakrilamiduntukdapatmemisahkanfragmenDNAsampaipada
tingkat resolusi 1 pb (misalnya untuk sekuensing DNA). Salah satu jenis elektroforesis el agarose adalah
pulsedfieldgelelectrophoresis(PFGE)yangdigunakanuntukmemisahkanfragmenDNAyangsangatbesar
(lebihdari1000kb).UntukmelihatfragmenDNAsetelahdipisahkandenganelektroforesisgeldigunakan
teknik lain. Jika fragmen DNA cukup banyak, gel dapat langsung diwarnai (staining) selama atas setelah
elektroforesis sehingga DNA dapat langsung dilihat. Ethidium bromide mengikat DNA dan akan
berfluoresensi/berpendar merah dibawah sinar UV. Jika jumlah DNA terlalu sedikit untuk divisualisasi
langsung, radioaktif digunakan untuk mendeteksi (lihat hibridisasi). Hibridisasi asam nukleat. Hibridisasi
asamnukleatadalahsalahsatumetodeanalisisyangpalingseringdigunakan.Teknikinidigunakanuntuk
Southern blotting, Northern blotting dan untuk skrining library. Tujuan metode ini adalah untuk melihat
(visulisasi) sekuens asam nukleat tertentu (DNA atau RNA) dalam lingkungan/latar belakang campuran
sekuens lain yang kompleks. Teknik ini memanfaatkan sifat DNA yaitu dua untai asam nukleat yang
komplemenakansalaingmengikat(hibridisasi)dengantingkatspesifisitasyangtinggi.Sebaliknya,sekuens
asam nukleat yang nonkomplemen tidak berikatan secara spesifik, mismatch nukleotida menurunkan
temperatur/titikleleh.UntukmendeteksiDNAatauRNAtertentudalamsuatucampuranyangkompleks,
isicampuranharusdiimobilisasipadamembrandandiubahmenjadibentukuntaitunggal(lihatSouthern
danNorthernblotting).Larutanhibridisasiyangmengandungprobeuntaitunggalyangdilabelradioaktif
ditambahkanagarterjadihibridisasipadakondisitertentu.Temperaturdankonsentrasigarampadalarutan
hibridisasi menentukan kespesifikan pengikatan. Pada temperatur tinggi dan konsentrasi garam rendah,
probehanyaakanmengikatsekuenstargetyangbenarbenarcocok.Setelahhibridisasi,kelebihanprobe
yangtidakterikatdicuci,sinyalradioaktifakanterdeteksipadalokasidimanasekuenstargetterletak.Sinyal
radioaktif divisualisasi dengan mengeksposkan pada fim Xray menghasilkan titik atau pita hitam pada
tempat radioaktif. Southern blotting. Ketika DNA genom didigesti dengan endonuklease restriksi dan
dipisahkan dengan elektroforesis gel, fragmen individual tidak akan dapat dilihat, bahkan jika digunakan
DNAdalamjumlahbesar.KarenakompleksnyaDNAgenom,digestidenganenzimrestriksiyangdivisualisasi
denganethidiumbromideakanmenghasilkanpolasmearyangterciptadariribuanfragmenDNA.Untuk
mendeteksifragmentertentupadasmeartersebutdigunakanteknikhibridisasidenganproberadioaktif
yanglazimdikenalsebagaiSouthernblotting(diambildarinamapenemunyaEdSouthern)(Gambar19).
SouthernblottingdimulaidenganpemisahanelektroforesisgelfragmenDNAyangtelahdidigestidengan
enzim pemotong. DNA kemudian didenaturasi (dipisahkan menjadi 2 untai tunggal) dengan perlakuan
alkali,selanjutnyauntaitunggalditransferkemembranmelaluitransferkapilaritas.DNAakanterikatpada
secarakovalenpadamembrandandiimobilisasipadafasepadat,menghasilkanreplikafragmenpadagel.
Fagmen DNA spesifik pada membran dapat diidentifikasi dengan hibridisasi menggunakan probe yang
spesifikuntukfragmengenyangdikehendaki.

Gambar19Southernblot.DNAgenomdiisolasidandigestidenganenzimrestriksi.DNAkemudiandirun
pada gel agarose dan ditransfer ke membran di mana DNA kemudian diikatkan secara kovalen. DNA
selanjutnyadihibridisasimenggunakanprobeyangdilabel32P.InteraksiantaraDNAdanprobeyangdilabel
dideteksidengancaramemajankanDNAmembrankefilmotoradiografi

Northernblotting
Blot utara digunakan untuk mempelajari pola ekspresi dari jenis tertentu molekul RNA sebagai
perbandingan relatif antara set sampel yang berbeda dari RNA. Ini pada dasarnya adalah kombinasi dari
denaturasiRNAelektroforesisgel,dansebuahnoda.DalamprosesiniRNAdipisahkanberdasarkanukuran
dan kemudian ditransfer ke membran yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel urutan
kepentingan. Hasilnya dapat digambarkan melalui berbagai cara tergantung pada label yang digunakan,
namun hasil yang paling dalam penyataan band yang mewakili ukuran RNA terdeteksi dalam sampel.
Intensitas bandband ini berkaitan dengan jumlah RNA target dalam sampel yang dianalisis. Prosedur ini
umumnya digunakan untuk mempelajari kapan dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan
mengukur berapa banyak bahwa RNA hadir dalam sampel yang berbeda. Ini adalah salah satu alat yang
palingdasaruntukmenentukanpadawaktuapa,dandalamkondisiapa,gengentertentuyangdinyatakan
dalamjaringanhidup.

Northernblotting.PemisahangeldanhibridisasiasamnukleatdapatjugauntukanalisisRNAmenggunakan
prosedurNorthernblotting(Tabel12).BeberapahalyangmembedakandenganSouthernblottingadalah:
(1) RNA jauh lebih rentan terhadap degradasi dibanding DNA, oleh karena itu elektroforesis dilakukan
dalambuferyangmengandungzatkimiayangbersifatmelindungi(biasanyaformaldehid),(2)RNAsudah
berupauntaitunggaldanmembutuhkankondisidenaturasiyanglebihringan,(3)RNAbiasanyaberukuran
tertentu sehingga tidak memelukan digesti enzim untuk memperoleh pola pita. Kedua prosedur sangat
mirip karena setelah elektroforesis RNA juga ditransfer ke membran melalui difusi kapilaritas. Biasanya
sinarUVdigunakanuntukmengikat(crosslink)RNApadamembransehinggatidakbergerak(imobilisasi).
Penentuan urutan nukleotida merupakan analisis DNA yang paling detil. Ada beberapa teknik untuk
sekuensing DNA, tetapi metode penghentian rantai dengan dideoksi (dideoxy chain termination) yang
dikembangkanolehSangeradalahmetodeyangpalingbanyakdigunakan(Gambar110).DNAmulamula
harus didenaturasi dan dipisahkan menjadi untai tunggal dengan cara pemanasan. Satu primer
oligonukleotidayangdilabelradioaktifkemudianditambahkankedalamreaksidanakanmenempelpada
sekuens pasangannya pada DNA target. DNA polimerase digunakan untuk menyalin DNA untai tunggal.
dNTPdalamjumlahbanyak(sampaijenuh)hanyaakanmenghasilkanprodukekstensidenganujungterlabel
radioaktif,tapitidakmenghasilkaninformasiurutanbasa.PenambahansedikitddNTPkedalamcampuran
dNTP akan dapat memberikan informasi urutan basa DNA. Dideoksinukleotida akan terinkorporasi pada
ujung3untaiDNAyangbarudisintesis.DNApolimerasetidakdapatmenambahkanbasabarupadaddNTP.
Dengandemikian,inkorporasiddNTPmengakibatkanpenghentiansintesisrantaiDNA.PenambahandNTP
dan ddNTP dengan rasio yang tepat memungkinkan untuk menghentikan sintesis rantai DNA pada tiap
posisi nukleotida. Sebagai contoh, jika ektensi primer dilakukan menggunakan dATP, dTTP, dGTP dann
ddCTP, polimerase akan mensintesis untai DNA baru sampai dia harus menggunakan ddCTP (misalnya
ketika basa komplemennya G). ddCTP akan terinkorporasi, dan pada titik ini DNA polimerase tidak akan
dapat melanjutkan ekstensi. Dengan demikian, panjang produk hasil ekstensi yang terlabel radioaktif
menentukan osisi G pertama yang disalin. Untuk menentukan posisi G yang lain, bukan hanya G yang
pertama,reaksisekuensingyangsebenarnyadilakukandenganmenggunakancampurandCTPdanddCTP
denganperbandingan~200:1.PadakondisiinikemungkinanterjadipenghentianrantaiDNAadalah~1:200
yang terjadi ketika terdapat G pada DNA yang disekuensing. Akan diperoleh produk ekstensi dengan
berbagaipanjang,yangdapat divisualisasisetelah elktroforesispadagelpoliakrilamid.Berdasarkan pada
panjang produk, maka tiap fragmen akan menentukan posisi satu G. Untuk menentukan posisi keempat
basa,empatreaksisekuensingdilakukanuntuktiapsampel.PadatiapreaksidicampurkandNTPdanddNTP
yang sesuai dikombinasi dengan 3 dNTP lainnya dalam konsentrasi jenuh. Keempat reaksi kemudian
dielektroforesis bersebelahan pada gel (poliakrilamiddenaturasi) sekuensing sehingga hasil sekuens DNA
dapat langsung dibaca. Secara teoritis sekuensing DNA nampaknya cukup rumit, tapi sebenarnya pada
kenyataannyarelatifsangatmudah.Teknologimoderntelahmemungkinkanuntukmelakukanotomasisasi
sekuensingDNA.Untukskalabesar,robotdapatdigunakanuntukmenyiapkanreaksisekuensing.Yanglebih
pentingadalahperalatanyangadasaatinitelahmemungkinkankitauntukdapatmembacahasilsekuensing
secara langsung dan sekaligus dapat menyimpan data ke dalam database komputer. Selain mengurangi
kerja manusia, otomasisasi demikian juga mengurangi faktor kesalahan yang sering terjadi dalam
pembacaan dan pemulisan urutan DNA secara manual. Kebanyakan mesin sekuensing sekarang
menggunakan fluorescent (cat yang berfluoresensi) sebagai pengganti radioaktif. Cat ini dapat
diinkorporasikankedalamprimersekuensingataukedalamnukleotida.Sepertipadasekuensingmanual,
elektroforesis gel (atau elektroforesis kapiler) digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasrkan
ukurannya. Hanya saja pada sekuensing otomatis deteksi fragmen DNA yang berfluoresensi dilakukan
dengan bantuan sinar laser dan sinyal diproses oleh komputer.

Gambar110SekuensingDNA.Cetakan,primerdanpolimeraseditambahkanpadasuatureaksiyangberisi
dideoksi dan deoksinukleotida. Empat reaksi yang terpisah yang masingmasing menggunakan ddATP,
ddTTP,ddCTPdanddGTP.Tiapreaksikemudiandirun(dielektroforesis)padagelpoliakrilamid.Atausebagai
alternatif,reaksisekuensingdilakukanmenggunakannukleotida(atauprimer)yangdilabelfluorescentagar
dapatdideteksidenganlaser.Sekuens/urutanDNAkemudiandidownloadkekomputer.
Metode sekuensing otomatis lainnya sedang dikembangkan, termasuk penggunaan chips DNA. Pada
strategiinisejumlahbesarnukleotidayangdiaturdandilekatkanpadachipsDNA.HibridisasifragmenDNA
pada chips memungkinkan deteksi sekuens yang overlap yang dapat diubah menjadi sekuens DNA yang
terhubung(nyambung).Teknologiiniterutamaakansangatbergunauntukmendeteksipolimorfismedan
mutasi,karenasekuensyangtelahdiketahuidapatdilekatkanpadachipsdenganvariasitertentupadatiap
nukleotida.

Molecular Probe and Hybridization

Lecture 4, by Fatchiyah
Probe is labeled, defined sequence used to search mixture of nucleic acids for molecule
containing a complementary sequences.
click here Molecular probe ppt
HIBRIDISASI
Teknik hibridisasi meliputi dua proses, yaitu proses denaturasi atau pemisahan dua rantai asam
nukleat yang komplementer dari proses renaturasi atau perpaduan kembali dua rantai asam
nukleat. Proses denaturasi biasanya dilakukan dengan cara pemanasan DNA untuk memecah
ikatan hidrogen yang terdapat di antara pasangan basa sehingga rantai asam nukleat akan
terpisah. Proses ini kemudian diikuti dengan proses renaturasi dengan cara pendinginan.
Pengujian sel bakteri pembawa rekombinan, gen-gen target, level mRNA, hasil pemotongan ER
(RFLP) dan uji lainnya yang menggunakan teknik hibridisasi, membutuhkan proses denaturasi
dan fragmen asam nukleat yang tidak diketahui dan memfiksasi fragmen tersebut pada bahan
solid seperti filter nitroselulosa. Untuk pengujian dengan hibridisasi diperlukan suatu probe asam
nukleat yang komplementer dicampurkan dengan fragmen asam nukleat yang terdapat pada
bahan solid tersebut pada kondisi yang mendukung terjadinya hibridisasi. Proses hibridisasi
dapat juga dilakukan dalam larutan (bukan bahan solid). Baik DNA yang hendak didiagnosis
(target) maupun probe dimasukkan dalam larutan buffer. Kedua DNA tersebut bebas bergerak
dan proses hibridisasinya berlangsung 5-10 kali lebih cepat daripada di bahan solid. Keadaan
tersebut sangat penting dalam aplikasi kebanyakan diagnostik mikrobiologi yang memiliki
konsentrasi DNA target sangat sedikit dan membutuhkan waktu diagnosis lebih cepat. Probe
dapat juga dibuat dari oligonukleotida (biasanya terdiri dari 30-40 nukleotida) yang dibuat secara
sintetik. Oligonukleotida tersebut dapat berupa fragmen DNA rantai tunggal atau fragmen RNA
yang dilabel.
Proses hibridisasi dan visualisasi diawali dengan transfer DNA dari gel agarose ke nilon berpori
atau membrane nitroselulosa. Transfer DNA disebut Southern blotting, mengacu kepada nama
penemu teknik tersebut yaitu E.M. Southern (1975). Pada metode ini mula-mula gel
didenaturasi dengan larutan dasar dan diletakkan pada suatu nampan. Selanjutnya di atas gel
hasil elektroforesis diletakkan nilon berpori atau membrane nitroselulosa, kemudian di atasnya
diberi pemberat. Semua fragment hasil pemotongan dengan enzim restriksi yang pada awalnya
berada pada gel akan ditransfer secara kapiler ke membrane tersebut dalam bentuk untai
tunggal. Pola fragmen akan sama dengan yang berada pada gel.
Gambar . Skreening pustaka DNA genomik
(www.personal.psu.edu/rch8/workmg/Isolat_analy).
Untuk identifikasi bakteri atau sel inang yang membawa plasmid rekombinan juga dilakukan
hibridisasi dengan menggunakan membran nitrosellulosa yang meiliki ukuran dan bentuk sesuai
dengan petridish yang digunakan. Membran ditempel ke medium LB yang telah ditumbuhi
koloni bakteri, kemudian membrane diambil dan petri berisi koloni bakteri diinkubasi lagi untuk
ditumbuhkan kembali. Kemudian membran diinkubasi bersama probe DNA Bila antara probe
dan DNA target merupakan komplemen maka akan terjadi hibridisasi. Bila probe yang
digunakan dilabeli maka selanjutnya dupleks yang terjadi dapat dideteksi.
Bila kondisi hibridisasi yang digunakan mempunyai stringency yang tinggi (highly stringent),
maka tidak akan terjadi hibridisasi dengan DNA yang mempunyai kekerabatan yang jauh atau
non homolog. Jadi probe DNA akan mengenali hanya sekuen yang komplemen dan secara ideal
homolog diantara beribu-ribu atau bahkan berjuta-juta fragmen yang bermigrasi sepanjang
gel. Fragmen yang diinginkan dapat dideteksi setelah dilakukan pemaparan membran yang
telah mengalami hibridisasi pada film. Ada berbagai cara untuk memperoleh dari melabel probe
asam nukleat. Sebuah gen dan agen penyakit yang akan dideteksi harus dimurnikan terlebih
dahulu, kemudian dilabel apakah dengan radioisotop seperti 32P atau dengan substansi non-
radioisotop. Walaupun substansi non-radioisotop dan dapat disimpan dalam waktu yang lebih
lama. Sensitifitas uji diagnostik menggunakan probe yang dilabel dengan non-radioisotop dapat
ditingkatkan dengan penggunaan PCR. Substansi non-radioisotop yang paling sering digunakan
sebagai label adalah biotin dan digoxigenin.