Doctorado en ciencias: rea Ciencias Agrcolas y Forestales
Especiacin recombinacional y relaciones filogenticas en Satureja macrostema var. laevigata.
TESIS Que para obtener el Grado de Doctor en Ciencias rea Ciencias Agrcolas y Forestales Presenta:
Jos Mario Aguilar Ramrez
Asesores:
Dr. Vctor M. Villalobos Armbula Dra. Martha I. Vergara Santana Dr. Rafael Salgado Garcglia Dr. Alfonso Pescador Rubio Dr. Sebastin Lemus Jurez Dr. Roberto Lezama Gutirrez
Tecomn, Colima, Mxico. Octubre del 2002
UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS Y AGROPECUARIAS
OFICIO No. 593/2002. C. JOSE MARIO AGUILAR RAMIREZ EGRESADO DEL DOCTORADO EN CIENCIAS AREA: CIENCIAS AGRICOLAS Y FORESTALES PRESENTE.
Con fundamento en el dictamen emitido por el jurado revisor del colegiado del rea: de Ciencias Agrcolas y Forestales de esta Facultad a mi cargo, de su trabajo de tesis de Doctorado y en virtud de que efectu las correcciones y acat las sugerencias que le haban indicado los integrantes del mismo, se le autoriza la impresin de la tesis " Especiacin recombinacional y relaciones filogenticas en Satureja macrostema var. laevigata ", misma que ha sido dirigida por los C.C.Dr. Vctor M. Villalobos Armbula, Director de la oficina de Asuntos Internacionales de la SAGARPA, Mxico, D.F. y el Dr. Rafael Salgado Garciglia, Profesor Investigador de la UMSNH.
Este documento reuni todas las caractersticas apropiadas como requisito parcial para obtener el grado de Doctor en Ciencias; rea: Ciencias Agrcolas y Forestales y fue revisado en cuanto a forma y contenido por los C.C. Dr. Sebastin Lemus Jurez, la Dra. Martha Imelda Vergara Santana , Dr. Roberto Lezama Gutirrez y el Dr. Alfonso Pescador Rubio, Profesores Investigadores de la Universidad de Colima.
Sin otro particular de momento, me despido de usted muy cordialmente.
Fuente de alegras y satisfacciones Razn de mi ser y la fuerza que me impulsa en el logro de mis ms grandes anhelos.
AGRADECIMIENTOS
Al INIFAP por todas las facilidades brindadas.
Al Dr. Jos Luis Hernndez Mendoza. por la oportunidad que nos otorg de estudiar en el PICAF.
Al Dr. Vctor M. Villalobos Armbula, por su apoyo y disposicin cuando lo necesite.
Mi profunda gratitud al Dr. Rafael Salgado Garcglia, quien siempre mostr su disposicin y apoyo incondicional y porque desde el principio y hasta el final me respaldo.
Especial agradecimiento a la Dra. Martha I. Santana Vergara, por sus enseanzas tericas y constante estmulo, que permitieron el logro de esta meta y que sin duda quedaron plasmadas en el documento.
Al Dr. Abraham Garca Chvez, por su colaboracin en el laboratorio de Biologa Molecular del CINVESTAV-lrapuato por todos sus comentarios y apoyos bibliogrficos
Mi reconocimiento a cada uno de mis asesores por sus valiosas sugerencias, Dr. Alfonso Pescador Rubio, Dr. Sebastin Lemus Jurez y al Dr. Roberto Lezama Gutirrez.
A mis compaeros del PICAF
A mis compaeros de trabajo, especialmente a los C. Ing. Jess Muoz Flores e Ing. Miguel ngel Hernndez Lpez, por hacerme fuerte en los momentos de apuro.
Finalmente a todos mis amigos y familiares de quienes solo recib su apoyo, por el sacrificio de su amistad.
CONTENIDO Pgina NDICE DE CUADROS i NDICE DE FIGURAS iii RESUMEN iv SUMMARY i I INTRODUCCIN 1 II REVISIN DE LITERATURA 5 2.1 Evolucin 5 2.1.1 Teora del equilibrio puntuado 13 2.1.2 Especiacin 16 2.1.3 Filognesis y Filogenia 20 2.1.4 Marcadores moleculares 30 2.1.4.1 Marcadores moleculares en plantas 31 2.1.4.2 Caracteres moleculares 32 2.1.4.3 Secuencias 33 2.1.4.4 La regin de ITS del ADN Ribosomal del ncleo (nrADN) 33 2.1.4.5 La regin de los espaciadores internos transcritos (ITS) del nrADN en angiospermas y gimnospermas 35 2.1.4.6 ITSs en angiospermas 36 2.1.5 Satureja macrostema (Labiatae) como modelo de estudio 39 2.1.6 Clasificacin botnica de Satureja macrostema (Benth) Briq 41 2.1.6.1 Descripcin de la especie Satureja macrostema (Benth) Briq 41 2.1.6.2 Distribucin geogrfica 42 2.1.6.3 Importancia, usos y propiedades curativas del t nurite(S. macrostema). 43 2.1.6.4 Usos actuales y potenciales. 43 III PROBLEMA ESPECFICO, HIPTESIS Y OBJETIVOS 45 IV MATERIALES Y MTODOS 47 4.1 Colecta e Identificacin del material vegetal. 47 4.2 Extraccin y limpieza del ADN 48 4.3 Extraccin del ADN 48 4.4 Determinacin de la concentracin del ADN 51 4.5 Determinacin de la calidad del ADN 51 4.6 Espacios transcritos internos (ITS). 51 4.7 Primera amplificacin del ADN. 52 4.8 Limpieza. 52 4.9 Segunda amplificacin 53 4.10 Purificacin de ADN. 53 4.11 Secuenciacin 54 4.12 Alineacin de secuencias. 55 4.13 Bsqueda y reporte de secuencias en el GenBank. 55 4.14 Determinacin de la distancia gentica. 57 4.15 Determinacin de la distancia gentica y filogenia por medio de
cladogramas. 57 4.16 Filogenia de las secuencias obtenidas. 58
V
RESULTADOS
59 5.1 Extraccin del ADN 5.2 Amplificacin 60 5.3 Secuencias 61 5.4 Recorte de secuencias 62 5.5 Alineacin 63 5.6 Comparacin con algunos Gneros de la misma Familia 80 5.7 Dendrogramas 83 5.8 Nmeros de accesin en el GenBank 84
VI
DISCUSIN
85
VII
CONCLUSIONES
108
VIII
LITERATURA CITADA
110
i NDICE DE CUADROS
Cuadro Pgina 1 Caractersticas de las localidades donde se colect material botnico de S. macrostema. 47 2 Ejemplares de S. macrostema utilizados en el estudio. 48 3 Secuencias obtenidas por espcimen de Satureja macrostema con los primers ITS1-4.
61 4 Longitud del ITS1, 5.8S e ITS2; promedio y contenido de G+C. 63 5 Nmero de veces que aparecen las "Palabras" formadas por Trinucletidos y Dinucletidos en los ITS1 e ITS2 al comparar SATIN contra SATIB
64 6 Nmero y porciento de purinas (adeninas-ti minas) y piridiminas (citosinas-guaninas), de SATIN-SATIB y SATSJ-SATPA. 65 7 Comparacin entre secuencias SatIN contra SatIB 66 8 Comparacin entre secuencias SatSJ contra SatIB 67 9 Comparacin entre secuencias SatSJ contra SatPA 68 10 Comparacin entre secuencias SatIN contra SatPA 69 11 Comparacin entre secuencias SatIN contra SatSJ 70 12 Comparacin entre secuencias SatPA contra SatIB 71 13 Porciento de emparejamiento, alineamiento, deleciones, inserciones y mutaciones (transversiones y transiciones) 72
14 Tipo de mutacin (transversin-transicin) y n de sitio por ITS 73 15 Reporte de alineamiento del gene 5.8S de Satureja macrostema 74 16 Porciento de Similaridad y Divergencia del Gene 5.8S de S. Macrostema 75
17 Reporte de alineamiento del espaciador ITS1 de S. macrostema 76 18 Reporte de alineamiento del espaciador ITS2 de S. macrostema 77 19 Reporte de alineamiento de la regin ITS1-5.8s-ITS2 de S. macrostema 78
ii
20 Porciento de Similaridad y Divergencia de la regin ITS1-5.8s- ITS2 de S. macrostema 79 21 comparacin de Satureja con otras especies de otros gneros 82 22 Porcentajes de divergencia y similitud entre plantas de Satureja y otras especies de otros Gneros 84
NDICE DE FIGURAS
Figura Pgina 1 Distribucin del te nurite (S. macrostema) en el Estado de Michoacn 42 2 Gel 1 Electroforesis del DNA de diferentes especimenes de S. Macrostema 60 3 Gel 2 Amplificacin de la regin ITS1-5.8s-ITS2 con los primers ITS 1 60 4 rboles filogenticos del alineamiento del gene 5.8 S de S. Macrostema 75 5 rboles filogenticos del alineamiento de la regin ITS1-5.8s- ITS2 de S. macrostema. 79 6 Fenograma de distancias genticas usando Meg Align de DNASTAR Software, entre gneros de Labiatae, usando a Ipomea y a Heliopsis como grupos externos. La filogenia de Satureja macrostema se resalta con las lneas negras ms intensas. Los nmeros de la lnea inferior indican el porciento de disimilitud entre los ITSs de las diferentes especies 83 7 Cladograma de mxima similitud usando Meg Align de DNASTAR Software. Los nmeros de la linea inferior indican el tiempo de divergencia entre los ITSs de las diferentes especies en decenas de miles de aos. 83 8 Relaciones evolutivas y distancia gentica de S. macrostema en Estudio 91 9 Prediccin del posible ARNm que formaran las secuencias ITS1-2 de las especies de S. macrostema en estudio y reportadas del Genebank 97
iv
RESUMEN
Especiacin recombinacional y relaciones filogenticas en Satureja macrostema var. laevigata.
Jos Mario Aguilar Ramrez
Facultad de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima, Apartado postal N 36, C.P. 28100, Tecomn, Colima, Mxico.
La evolucin es un cambio gentico que sufre una poblacin de organismos en el transcurso del tiempo, o "descendencia con modificacin", y la teora del equilibrio puntuado propone que el registro fsil refleja la manera en que ocurri la evolucin, con largos periodos de rpida especiacin, los resultados obtenidos en el presente estudio sugieren que S macrostema var. laevigata, se encuentra actualmente en perodo de especiacin rpida (hbrida o recombinacional), la cual es de tipo puntuado y el anlisis de las secuencias de la regin de los ITS de S. macrostema var. laevigata sugiere que las plantas en estudio pueden ser consideradas como especies. La gran utilidad de las tcnicas moleculares es que permiten observar diferencias directamente en el ADN, es decir en la molcula qumica que contiene toda la informacin gentica del organismo, este es el mximo nivel de resolucin posible y as pueden inferirse las relaciones filogenticas en especies y subespecies.
Recombinational speciation and phylogenetic relationships in Satureja macrostema var. laevigata.
Jos Mario Aguilar Ramrez
Facultad de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima, Apartado postal N 36, C.P. 28100, Tecomn, Colima, Mxico.
The evolution is a genetic change that a population of organisms suffers in the course of the time, or "descendant with modification", and the theory of the punctuated balance intends that the fossil registration reflects the way in that happened the evolution, with long periods of quick speciation. The results obtained in this study suggest that S macrostema var. laevigata, is at the moment in period of quick speciation (hybrid or recombinational) which is of punctuated type. The analysis of the sequences of the region of the ITS of S. macrostema var. laevigata suggests that the plants in study can be considered as species. The great utility of the molecular techniques is that they allow to observe differences directly in the DNA, that is to say in the chemical molecule that contains all the genetic information of the organism, this it is the maximum leve) of possible resolution and the phylogenetic relationships can be inferred this way in species and subspecieses.
Key Words: Evolution, Speciation, Sequences, DNA.
1 I. INTRODUCCIN
El concepto de evolucin, es esencial en el desarrollo de las ciencias de la vida, y ha aportado nuevas y revolucionarias maneras para responder a las preguntas que el hombre se ha planteado durante siglos, de las cuales las ms importantes son: "porqu estoy aqu, cul es el propsito de la existencia humana?", y "en que consiste la naturaleza del mundo de vida que nos rodea? " (Dobzhansky, 1982).
Actualmente la llamada "Teora Sinttica de la Evolucin" se apoya en la "Teora Darwinista de la Seleccin", en los conocimientos de la gentica y del tratamiento matemtico de la dinmica de poblaciones, abarcando la teora del gen, la teora cromosmica, y la evolucin molecular. Las investigaciones evolucionistas se desarrollan principalmente en dos direcciones: por una parte la biologa evolucionista especial (relativo al concepto de especie), que trata de explicar la filognesis y el parentesco de grupos de especies ms o menos grandes y por la otra la biologa evolucionista general (Ayala et al., 2000).
Tras establecerse esta nueva gran sntesis de gentica de poblaciones se plante la cuestin de s los procesos filogenticos ms importantes como son, el proceso evolutivo y la formacin de nuevas especies, quedaban explicadas por esta teora (Ayala et al. 2000; Filchak et al., 2000), o si se requeran otras explicaciones complementarias, dicho de otro modo: son suficientes los tres mecanismos (mutacin, seleccin y aislamiento) propuestos por la Teora Sinttica de la Evolucin, para explicar cualquier fenmeno evolutivo, o por el contrario, proponer otros posibles mecanismos?
Los tres mecanismos estudiados se han promovido como respuesta al gran desafo de la biologa evolutiva: el entender los procesos genticos involucrados en la formacin de especies, ya que estos procesos son responsables de la diversidad biolgica existente. Estos procesos han sido difciles de estudiar por los distintos
2 mecanismos de especiacin que se han reportado. Cada uno con rasgos nicos que dificultan su estudio (Rieseberg y Ungerer, 1999).
Entre otras teoras surgidas con la finalidad de aportar explicacin a mecanismos evolutivos se encuentra la "Teora del Equilibrio Puntuado", la cual a travs del registro fsil propone que la evolucin ocurre con largos periodos de rpida especiacin (surgimiento de una o ms especies), estos periodos de rpida especiacin pueden ser causados por grandes cambios en el ambiente, cuando se rompe el equilibrio por la acumulacin de mutaciones (Sheldon, 2000)
Un reflejo o manifestacin del proceso de evolucin, puede ser observado a travs de la ubicacin de los organismos en el llamado "rbol de la vida", que es un grfico que representa las relaciones filogenticas entre los diferentes taxones, resultando en una hiptesis sobre las relaciones filogenticas de un taxn (Christoffersen, 1995; Bush, 2001), construidos mediante semejanzas de secuencias y basados en mtodos de distancias (Swofford et al., 1996). As, la filogenia, ocupa un lugar central en la sistemtica y en la taxonoma, al ayudar a resolver problemas de ubicacin y nomenclatura de organismos (Forey, 1992), entre los mtodos empleados para inferir filogenia, los que consideran la obtencin de datos moleculares proporcionan registros indirectos de los eventos de especiacin y ofrecen un enorme potencial para la investigacin de las causas generales y las tasas de especiacin dentro de clados (Barraclough y Nee, 2001).
La tcnica de anlisis molecular que permite el estudio de la regin de los espaciadores internos transcritos (ITS) ha sido considerada como una fuente muy til de caracteres para estudios filogenticos en angiospermas (Baldwin et al. 1995). Dado que los ITS se encuentran altamente representados en el genoma, se pueden amplificar con cantidades pequeas de ADN y las secuencias altamente conservadas dentro de la mayora de los genes del nrADN son muy tiles en el diseo de oligonucletidos ("primers") "universales", lo que facilita la amplificacin de los ITS mediante el uso de la reaccin en cadena de la polmerasa (PCR) (Liston 1992;
3 Planta Y Rau, 1999). Los espaciadores internos transcritos son la parte ms variable de la regin de los ITS, la regin de los ITS comprende el ITS2, la subunidad 5.8S y el ITS1, debido a que se encuentran flanqueando a la subunidad 5.8S, que es ms conservada y se posibilita la alineacin no ambigua de esta regin (Baldwin et al., 1995).
La regin de los espaciadores internos transcritos (ITS) ha sido ampliamente usada para el esclarecimiento de las relaciones entre taxa a niveles inter e intragenricos, as como intraespecficos en angiospermas (Hamby y Zimmer, 1992; Baldwin et al., 1995; Buckler y Holtsford 1996; Liston et al., 1996).
Respecto al proceso de especiacin, se han reportado diferentes modalidades del mismo, entre estas, la especiacin simptrica (en que las nuevas especies surgen sin el aislamiento geogrfico es decir, en el mismo lugar geogrfico) es el origen de dos o ms especies de una sola poblacin local (Kondrashov y Kondrashov, 1999; Dieckmann y Doebeli, 1999), puede ocurrir cuando el flujo gentico es eliminado entre las poblaciones y se forman especies nuevas, por rangos de distribucin, dado que se genera aislamiento en el mismo sitio por variacin de nichos (Mousseau y Olvido, 2001), e Incluye la poliploida e hibridizacin que son mecanismos importantes de especiacin en plantas (Rieseberg, 1999, Widmer y Baltisberger, 1999; Rieseberg y Ungerer, 2001)
El mecanismo de hibridacin o "recombinacin" puede dar origen a nuevas especies, y se seala que la "especiacin recombinacional" utiliza este mecanismo para tal fin, al hibridizarse especies paternales divergentes gentica o cromosmicamente; adems la teora predice que este modo de especiacin es puntuada, pero ha sido poca la evidencia emprica generada para apoyarla (Ungerer et. al., 1998). Los estudios de especiacin pueden ser estudiados en plantas sujetas a seleccin artificial, como es el caso de Satureja macrostema.
4 McVaugh y Schmid (1967) mencionan que existen dos variedades dentro de Satureja macrostema y son; S. macrostema var. macrostema y S. macrostema var. laevigata sealando que ambas variedades se han reportado para el estado de Michoacn, y que quizs actualmente se traslapan en algunas reas del centro de la entidad, por lo que cabra la posibilidad de que ambas hibridicen, asimismo mencionan que algn flujo de genes entre las dos variedades parece probable.
El gnero Satureja ha sido tradicionalmente usado como estimulante, estomtico, carminativo, expectorante y afrodisaco. El aceite esencial ha demostrado actividad antimicrobial y antidiarreica por los compuestos fenlicos que contiene y ha sido usado en el tratamiento contra el cncer (Simon, et al., 1984; http://www.hort. purdue.edu. Newcrop /med.aro/savory.), como antioxidante (Lagouri y Boskou, 1996); tambin ha mostrado actividad contra los virus HSV-1 y VSV (Abad et al., 1999) y actividad anti-HIV-1 (Yamasaki et al., 1998).
Con base en lo anterior, Satureja macrostema var. lavgata fue considerado como modelo de estudio para determinar las relaciones filogenticas entre cuatro poblaciones de esta variedad presentes en el estado de Michoacn, e inferir el proceso de especiacin que podra estar en desarrollo.
5 II. REVISIN DE LITERATURA
2.1. Evolucin.
Para Dobzhansky (1982), la evolucin es un hecho histrico completamente establecido, y pregunta qu factores son responsables del cambio evolutivo?, y menciona que la evolucin es ante todo un proceso gentico, y la gentica de poblaciones es la disciplina biolgica que suministra los principios tericos de la evolucin. Para Mayr (1997), la evolucin no es solamente un cambio en la frecuencia gentica sino una mejor respuesta de la capacidad de adaptacin. La evolucin es la transformacin hereditaria de los organismos, a travs de las generaciones y las especies, por cambios en el material gentico. Dado que los organismos interactan con su ambiente, los cambios de ste influyen directa o indirectamente en el curso de la evolucin (Myers y Knoll, 2001).
Para Stebbins (1999), la evolucin es un proceso de dos pasos que requiere de la variacin gentica inicial dentro de las poblaciones, as como de la modelacin de esta variacin va la recombinacin del gen y de la seleccin natural, y una de sus preguntas de estudio es la aplicacin indiscriminada de insecticidas y herbicidas a las poblaciones de plantas con el propsito de la eliminacin de pestes y cizaas esta induciendo su evolucin hacia la resistencia a las mismas?, y menciona que la crisis bitica y la prdida de la biodiversidad estn afectando los procesos de evolucin.
Resumiendo, la evolucin es la teora que explica la diversidad de los seres vivos, se ocupa de los mecanismos que producen cambios en los organismos y del mismo cambio, as como la repercusin que para los organismos suponen estos cambios (Reznick, 2000; Sheldon, 2000,Callahan, 2001).
6 La biologa moderna se construye actualmente alrededor de dos paradigmas centrales 1) la evolucin como centro de un gran rango de disciplinas (como la sistemtica, ecologa, paleontologa, historia natural y gentica), y 2) la expresin del gen (enfoque de la bioqumica, biologa molecular, biologa celular, fisiologa, biologa del desarrollo y gentica); la unin de estos dos grandes paradigmas es lo que constituye actualmente la ltima sntesis (Schneider, 1999).
La era genmica revolucion la biologa evolucionarla, y algunas de sus preguntas actuales son: cunta de la diversidad genmica y fenmica en la naturaleza es adaptada y procesada por la seleccin natural?, cul es el origen y evolucin de los procesos de adaptacin y especiacin bajo variables ambientales, espacio temporales macro y microgeogrficas? (Nevo, 2001); otras grandes preguntas son: cunto de la diversidad del genoma codificado y no codificado afecta los procesos de adaptacin y especiacin?, y cunta de esta diversidad codificada y no codificada contribuye a la regulacin y adaptacin diferencial de los organismos y est sujeta a la seleccin natural?, qu proporcin de la diversidad gnica y no gnica observada es mantenida por la seleccin?, cunta de la diversidad no codificada en el ADN est adaptada y regula la expresin del gen, la transcripcin, translacin, recombinacin y reparacin? (Nevo, 2001), cmo surgen o se originan nuevas especies? (Korol, 2000); cmo el ambiente y las interacciones ecolgicas influyen en la formacin de nuevas especies? (Schneider, 2000), se agregan las preguntas de Francis y Kingston (2001): Cmo puede el mismo gen recordar que esta apagado en un linaje celular y encendido en otro?. Estas preguntas de la biologa evolucionarla esperan respuestas.
Respecto al problema de la diversidad, Darwin lo estudia y en su obra "El origen de las especies", Darwin propuso la explicacin a ese problema. Sin embargo, de acuerdo con Harder (2001), el problema no es solo explicar la diversidad de la vida as como el nmero de especies y la variedad de sus fenotipos.
7 La teora cientfica aceptada actualmente para explicar la evolucin, fue propuesta por Darwin en su obra "On the Origin of species" (Bowler 1999; Reznik, 2000; Filchak et al., 2000) y puede ser resumida en los siguientes principios:
(1) Los individuos dentro de una especie y toda poblacin biolgica pueden tener genes similares, pero an as, diferirn en las caractersticas del fenotipo y en su comportamiento debido a las diferencias existentes tambin en el genotipo y a las respuestas ambientales, este es el principio de la "variacin" (Harrison, 2000).
(2) Las variaciones pueden ser transmitidas de una generacin a la siguiente, y la progenie de los individuos que presentan una variacin particular, tendern a tener esa misma variacin, ese es el principio de la "herencia" (Harrison, 2000).
(3) Algunas de estas variaciones le dan a los poseedores de la misma una ventaja en su vida ( impiden una desventaja, lo que en trminos relativos es lo mismo), permitiendo que el organismo obtenga ms alimento, escape ms eficientemente de sus predadores, utilice los recursos de su medio ambiente con mayor eficacia, etc.. Esta progenie, debido al principio de la herencia, tiende a poseer las mismas variantes benficas que sus predecesores, lo que hace que a travs del tiempo, la frecuencia de estas variaciones ventajosas se incremente. Este es el principio de la "seleccin natural" (Harrison, 2000; Reznik, 2000).
Estos principios se combinan para formar el ncleo del modelo evolutivo (Bowler, 1999). El punto de vista Darwiniano tradicional afirma que pequeos cambios incrementales en la estructura y comportamiento de los organismos, ocasionados por la seleccin natural de las variaciones, producen, luego de un largo periodo de tiempo, organismos tan diferentes a sus ancestros, que ya no son ms los mismos organismos, y deben ser entonces clasificados como especies diferentes (Ayala et al., 2000).
8 La teora de la evolucin biolgica ve en las poblaciones y en las especies las unidades bsicas de la evolucin. El cambio evolutivo se realiza mediante: mutaciones genticas, cambios en la estructura y nmero de los cromosomas, mutaciones de los portadores extranucleares de la herencia, recombinacin, seleccin, aislamiento, hibridacin y alteraciones casuales de las frecuencias gnicas en poblaciones pequeas o por fluctuaciones del tamao de la poblacin (Johnston, 1999; Ennis, 2000; Bazzaz, 2001; Cupples, 2001).
Por otro lado, la palabra "mutacin" trmino de origen latn mutare - cambiar, fue usado para indicar un cambio hereditario por el botnico holands y bilogo evolutivo Hugo De Vries (Johnston 1999). Es decir cualquier alteracin del material gentico heredable, incluye fenmenos diversos tales como: cambios en el nmero de cromosomas, cambio en la estructura de conjunto de los cromosomas y cambios dentro de los genes mismos (Harrison 2000). La pregunta fundamental acerca de la naturaleza de las mutaciones, es qu mecanismos y que factores controlan y tasan la mutagnesis? Esta pregunta ha estado en el centro de un intenso estudio durante las ltimas dcadas, los Investigadores que han trabajado sobre la mutagnesis han realizado estudios para comprender los orgenes de las mutaciones y sus efectos en los procesos biolgicos como la carcinognesis y la evolucin. (Harrison 2000; Ennis 2000; Cupples 2001).
De Vries "descubridor" de Mendel, public "Die mutations theorie", y concluy en gran parte que la evolucin se efecta por medio de cambios discretos repentinos, o "mutaciones", como l las llam aunque sus ideas fueron inaceptables como una teora evolutiva general, y muchos de los cambios repentinos que observ resultaron que no eran debido a las mutaciones, sino debido a la redistribucin de la variacin gentica existente por la recombinacin (Johnston, 1999). De Vries reconoci la importancia de la mutacin como un proceso gentico fundamental. En realidad, la mutacin es la fuente principal de toda nueva variacin gentica y sin ella no habra sido posible la evolucin (Johnston, 1999). "La causa principal de variabilidad que hace posible el proceso evolutivo de la vida son las mutaciones, que no son sino 9 alteraciones espontneas del material hereditario (Grant y Shoemaker, 2000; Harrison, 2001).
En relacin con lo anterior se reconocen varios tipos de mutaciones, la ms comn es la llamada "mutacin puntiforme" causada por un cambio dentro del gen al nivel molecular (Ennis, 2000), en contraste con las mutaciones que resultan de una prdida o delecin (deficiencia) de una porcin de un cromosoma. La mayora de las mutaciones puntiformes son mutaciones espontneas. Estas mutaciones a menudo son reversibles en el sentido del que el gen puede mutar en retroceso, o sea, regresar a su condicin original mientras que las mutaciones por delecin o deficiencia no pueden invertirse (Johnston, 1999). Las mutaciones tambin pueden originarse por la transferencia y readhesin de un segmento cromosmico u otro cromosoma, fenmeno conocido como "translocacin" cromosmica (Ennis, 2000). La situacin particular en la que un cromosoma se rompe en uno o ms segmentos, se reconstituye pero en orden diferente se le llama "inversin" y puede ocasionar tambin mutaciones (Harrison, 2001; Cupples, 2001).
Otro aspecto importante es la variabilidad gentica, que se puede definir como: "la habilidad gentica para variar", y por lo tanto, es tener la capacidad para responder tanto a variaciones de ndole ambiental como a cambios en los objetivos de seleccin, por lo que la variabilidad gentica constituye la base del progreso gentico (Rochambeau et al., 2000). En una especie determinada, la variabilidad puede representarse de tal modo que las diferencias entre individuos sean graduales y en este caso se habla de variabilidad continua y estas diferencias pueden ser debidas a factores ambientales que solo afectan al fenotipo y que por tanto no son heredables (Burd, 2000). La variabilidad discontinua, en cambio, es brusca y se debe a cambios que no responden a las leyes de la herencia, es decir, que aparecen de forma espontnea en el seno de una poblacin y estos cambios se llaman mutaciones (Reeve y Sherman, 1999). La variacin es la materia prima sobre la cual la seleccin acta (Ayala et al., 2000). El resultado, a travs del tiempo, de la interaccin de ambos procesos es la evolucin y "La variacin hereditaria es el 10 producto de la mutacin, el paso de material gentico entre poblaciones y la recombinacin de factores genticos, unidos con una seleccin que moldea el patrn de la variacin (Barton y Keightley, 2002; Reznick, 2000).
Dentro de los elementos que contribuyen a la evolucin de las poblaciones cuando estas son pequeas, es el azar el cual puede provocar cambios en sus frecuencias gnicas (Hastings, 2001), sin embargo, en una poblacin muy grande, los eventos al azar no son importantes para la poblacin en su totalidad, mientras que en una poblacin pequea, dichos eventos pueden cambiar drsticamente el pool gnico (Hastings, 2001), y cuando se presenta un aumento o disminucin en la frecuencia de un gen en generaciones sucesivas de una poblacin que resulta del azar, se llama deriva gnica, (Ayala et al., 2000).
Otro de los procesos evolutivos es la migracin, que es el movimiento de organismos de un lugar a otro y puede ser en dos sentidos: cuando los individuos salen de una poblacin se habla de emigracin; la llegada de individuos a una poblacin se conoce como inmigracin y permite el cambio evolutivo ya que causa el movimiento de genes hacia dentro o hacia fuera de una poblacin y a este fenmeno se llama flujo gnico (Mousseau y Olvido, 2001). La migracin puede conducir a cambios de las frecuencias de los alelos (Tonsor y Moore, 2001), cuando implican animales en movimiento o plantas que cambian de ambiente y los patrones geogrficos de la variacin gentica intraespecfica estn determinados por la historia de la migracin. (Hagen, 2001).
Sin duda un aspecto bsico de la teora de la evolucin es la seleccin natural, la cual es consecuencia de la reproduccin diferencial de unas variantes respecto a otras, es decir, de la seleccin natural la cual acta sobre los dos principales recursos de la variacin gentica: la mutacin y la recombinacin; esta accin de la seleccin natural sobre la variabilidad hace posible que sobrevivan individuos en la poblacin que interaccionen de una manera ms eficiente con el ambiente (Reznick, 2000). Darwin y Wallace propusieron en 1859 que la naturaleza produce un nmero
11 excesivo de organismos y luego selecciona las condiciones genticas ms favorables (Whitlock y Phillips 1999), en esencia, la seleccin natural es reproduccin diferencial de unas variantes genticas respecto de otras. Se puede definir de manera ms rigurosa como el proceso que resulta del cumplimiento de las tres condiciones siguientes: (1) variacin fenotpica entre los individuos de una poblacin, (2) supervivencia o reproduccin diferencial asociada a la variacin, y (3) herencia de la variacin. Si en una poblacin de organismos se dan estas tres condiciones, entonces se sigue necesariamente un cambio en la composicin gentica de la poblacin por seleccin natural (Reznick 2000; Mitton 2001).
Algunas de las preguntas actuales en seleccin natural son: qu tan fuerte es la seleccin sobre los rasgos cuantitativos en la naturaleza?, es fuerte la seleccin direccional comn?, la seleccin de viabilidad es tpicamente ms fuerte o ms dbil que la seleccin sexual?, est la fuerza de la seleccin correlacionada con el perodo de tiempo sobre el cual este es medido? (Hoekstra et al., 2001). Brandon, (1990), menciona que lo que se encuentra bajo discusin, es el intento de respuesta a las siguientes preguntas: dnde acta la seleccin natural? o cul es el nivel de accin de la seleccin natural?, ya que los mismos bilogos estn en desacuerdo al intentar dar respuesta a las interrogantes anteriores y quiz lo que haga falta es una revisin terica sobre las implicaciones o consecuencias que se derivan de la teora de la evolucin por seleccin natural (Brandon, 1990). Las respuestas a stas preguntas y otras similares son fundamentales para entender cmo la seleccin determina el cambio evolutivo y la adaptacin (Hoekstra et al., 2001).
La adaptacin, por otro lado, ha sido una idea central en biologa evolutiva desde Darwin, pero ha sido difcil de caracterizar las adaptaciones en un solo trmino unificado y contina generando controversia; sin embargo, no hay ninguna discordancia en que la seleccin natural es el nico proceso que crea las adaptaciones (Reeve y Sherman 1999; Burd 2000). Los bilogos evolutivos usan el trmino adaptacin de dos maneras distintas pero relacionadas: la adaptacin es un proceso evolutivo y un producto de seleccin natural, en ambos casos, la evolucin
12 se maneja por la seleccin natural. El uso del trmino es dado por Mitton (2001) de la siguiente manera: (1) 'la adaptacin' es un proceso de evolucin en que los rasgos en una poblacin son modificados por la seleccin natural para enfrentar los desafos del ambiente local. (2) 'una adaptacin' es un rasgo del fenotipo amoldado por la seleccin natural. El rasgo podra ser fisiolgico, de comportamiento, de desarrollo o morfolgico.
Con la combinacin de la Teora de la Evolucin de Darwin y con los aportes de la Gentica, se gener lo que se conoce como Neodarwinismo o teora sinttica de la evolucin (T.S.E.), la que se sustenta en los siguientes principios:
1. La unidad sobre la que acta la evolucin no es el individuo sino otra de orden superior: la poblacin (Schaal y Olsen, 2000).
2. En las poblaciones hay variabilidad entre los individuos. Esto se observa en la especie humana y en cualquier otra, si se analiza con detalle (Schaal y Olsen, 2000). Sobre la variabilidad del contenido gentico, actuaran la seleccin natural, la mutacin, la migracin y la deriva gentica provocando cambios en las frecuencias gnicas. (Hoekstra, 2001).
Actualmente la teora sinttica de la evolucin se apoya en la teora darwinista de la seleccin, en los conocimientos de la gentica y del tratamiento matemtico de la dinmica de poblaciones abarcando la teora del gen, la teora cromosmica, la evolucin molecular y las investigaciones evolucionistas se desarrollan principalmente en dos direcciones: por una parte la biologa evolucionista especial que trata de explicar la filognesis y el parentesco de grupos de especies ms o menos grandes y por la otra la biologa evolucionista general (Ayala et al., 2000).
La mayora de los investigadores interesados en las filogenias asumen explcitamente dos supuestos (Farris, 1986): 1) La evolucin es "descendencia con modificacin", 2) Las similitudes observadas son explicables por herencia y ancestra
13 comn)
La "Teora Sinttica moderna" basada en una concepcin de la transmisin de los caracteres estrictamente mendeliana, tiene como premisas fundamentales:
1.- La Evolucin es un proceso gradual de sustitucin de alelos en el seno de una poblacin. La fuente de variabilidad de estos alelos son las mutaciones puntuales o micromutaciones (Schaal y Olsen, 2000; Harrison, 2001).
2.- El material gentico es slo la materia prima, lo que dirige el proceso evolutivo es la seleccin (Bowler 1999; Reznick, 2000; Hoekstra et al., 2001).
En "Sobre el Origen de las Especies", Darwin propuso que la seleccin natural tena un papel fundamental sobre la especiacin, pero este punto de vista ha disminuido con la aparicin del concepto de la "Teora sinttica de la evolucin" o "Sntesis moderna" (Bowler 1999; Filchak et al., 2000), fortalecida en el siglo veinte por Stebbins con su obra "Variacin y evolucin en plantas"; Dobzhansky con su obra "Gentica y el origen de las especies"; "Sistemtica y el origen de las especies" de Mayr; y "Modo y tiempo en evolucin" de Simpson (Ayala et al., 2000).
En 1908, Hardy y Weinberg efectuaron independientemente una deduccin a partir de las leyes de Mendel que constituira el inicio de la gentica evolutiva y de poblaciones, la cual se fundamenta en que las frecuencias relativas de los genes en una poblacin permanecern constantes de una generacin a la siguiente si: a) La poblacin es grande. b) No hay seleccin en favor o en contra de un gen o alelo especfico, es decir, si el apareamiento ocurre al azar. c) No hay mutaciones. d) No hay inmigracin o emigracin en la poblacin. (Hastings, 2001; Harrison, 1999), y surge la interrogante cmo medir los cambios evolutivos?
2.1.1. Teora del equilibrio puntuado. En 1977, el bilogo francs P. Grass escriba sobre la comprobacin en la naturaleza de la actuacin de la seleccin
14 natural: "...Es sencillamente la observacin de factores demogrficos, de fluctuaciones locales de genotipos y de distribuciones geogrficas. A menudo las especies observadas han permanecido prcticamente sin cambios durante cientos de siglos!". La constatacin de este fenmeno, se ha plasmado finalmente en la " Teora del equilibrio puntuado", propuesta en 1972 por los paleontlogos Eldredge y Gould (Sheldon, 2000). Los dos postulados de esta teora son (Gould y Elredge, 1993):
1.- La estasis: la mayora de las especies no exhibe cambio direccional alguno durante su estancia sobre la tierra. Aparecen en el registro fsil con una apariencia muy similar a cuando desaparecen.
El cambio morfolgico es generalmente limitado y no direccional.
2.- La aparicin repentina: en cualquier rea local, una especie no surge gradualmente por la transformacin constante de sus antecesores, sino que aparece de una vez.
En la actualidad, las investigaciones evolucionistas se desarrollan principalmente en dos direcciones: por una parte la llamada biologa evolucionista especial que trata de explicar la filognesis y el parentesco de grupos de especies ms o menos grandes, y por otra, la biologa evolucionista general, que investiga el ulterior desarrollo de la teora de la evolucin, de las fuerzas activas, de la interaccin de los factores y de las leyes que gobiernan los procesos de microevolucin y macroevolucin (Reznick, 2000; Sheldon, 2000; Callahan, 2001)
Una de las ms recientes teoras evolutivas es, la teora neutralista de la evolucin molecular, propuesta por Kimura en 1968 y apoyada por otros autores, admite que la evolucin de los caracteres morfolgicos, etnolgicos y ecolgicos est gobernada mayoritariamente por la seleccin natural. Estos autores proponen, sin embargo, que la evolucin de la mayora de las protenas y de los genes que las
15 codifican se debe en su mayor parte al azar. Kimura (1983), seala que el carcter diferenciador del Neodarwinismo es el papel central que da a la seleccin en la produccin de diferencias genticas entre las especies. Este punto de vista resulta del todo razonable al considerar el material hereditario como un paquete de genes, cada uno de los cuales tiene algn papel importante.
Kimura (1983), propone en su teora neutralista que la mayor parte de las substituciones mutantes no son mantenidas por una seleccin darwiniana positiva sino que son fijadas aleatoriamente por deriva gentica, aunque este autor no renuncia a que, una vez fijadas en el tiempo, lleguen a tener importancia cuando las especies se vean sometidas a cambios ambientales. Kimura ve confirmada su hiptesis al observar la constancia de la tasa de substitucin encontrada en los aminocidos de las hemoglobinas y la de los nucletidos de los pseudogenes (Hasatoshi, 1983), As, Kimura lleg a dos conclusiones:
1 La mayora de las sustituciones de nucletidos son el resultado de la fijacin al azar de mutantes neutros, o casi neutros, ms que el resultado de una seleccin darwiniana.
2 Muchos de los polimorfismo protenicos son selectivamente neutros o casi neutros y su persistencia en la poblacin se debe al equilibrio existente entre la aportacin de polimorfismo por mutacin y su eliminacin al azar.
Segn Bromham (2001), una consecuencia de la teora neutralista de la evolucin es la existencia de un reloj molecular aleatorio, segn el neutralismo, el ritmo en el que se sustituyen las variantes genticas en las poblaciones es proporcional a la tasa de mutacin neutra, as, cuando dos poblaciones o especies se separan, el nmero de diferencias genticas que le separan ser proporcional al tiempo que hace que han divergido las dos especies, de este modo, el nmero de diferencias que existe entre un conjunto de secuencias correspondientes a distintas especies puede usarse como un reloj molecular que permite ordenar los tiempos
16 relativos de divergencia entre esas especies, la idea sera equivalente a utilizar el nmero de kilmetros de las calles de varias ciudades para predecir el orden relativo de los tamaos de las ciudades. El reloj molecular es una herramienta muy til para establecer los tiempos relativos de ramificacin de rboles evolutivos
2.1.2. Especiacin
La especiacin es definida como la formacin de dos o ms nuevas especies de una especie ancestral (Wood y Rieseberg, 2001). El proceso de especiacin es el responsable de la basta cantidad de diversidad biolgica que se encuentra actualmente, sin embargo se conoce poco acerca de los mecanismos biolgicos de la formacin de especies, debido al largo tiempo de los procesos y a que son pocas las excepciones que pueden ser observadas en la naturaleza o en un laboratorio (Wood y Rieseberg, 2001).
Ms de 150 aos despus del origen de la publicacin de "On the Origin of species" de Darwin, la pregunta del cmo dos especies divergen de una sola especie ancestral sigue todava vigente, as como cuntos cambios genticos son necesarios para crear nuevas especies?, todos los genes cambian en una cantidad pequea?, o la especiacin depende de un solo grupo de genes conectados con la reproduccin? (Gee, 2000). Por otro lado, la formacin de dos especies separadas a partir de un solo antepasado y el mantenimiento. subsecuente de estas nuevas especies sin la hibridacin, es un problema central en la biologa evolutiva (Gee, 2000b). Una de las preguntas ms persistentes en la biologa evolutiva es: cmo surgen o se originan nuevas especies? (Korol, 2000).
El entendimiento de la especiacin es un problema fundamental en biologa (Dieckmann y Doebeli, 1999). Las especies difieren en el nmero y forma de cromosomas as como en la anatoma, fisiologa y gentica. La reestructuracin del cromosoma juega un papel importante en la evolucin de especies debido a como sus genomas se expresan y a los mecanismos de aislamiento reproductor (Burt,
17 2001). De acuerdo con Otte (2001), las especies pueden surgir por dos mecanismos: la anagnesis y la cladognesis, sea de una forma o de otra, para que exista especiacin debe haber divergencia gentica y aislamiento reproductivo entre dos poblaciones antes relacionadas, estos dos procesos pueden ocurrir de dos maneras conduciendo a la especiacin aloptrica o a la especiacin simptrica.
De acuerdo con Rieseberg y Ungerer (2001), la cladognesis es el modo fundamental de especiacin y el responsable directo de la biodiversidad, la cladognesis se produce por aislamiento reproductivo de las poblaciones de una especie y las barreras reproductoras se pueden dividir en precigticas y postcigticas; las barreras precigticas son mecanismos de aislamiento que tienen lugar antes o durante la fecundacin y las ms importantes son:
a) La reproduccin que se produce en diferentes pocas del ao.
b) Los mecanismos conductuales que utilizan las especies para reconocerse entre ellas por ejemplo, el cortejo de muchos animales, o el canto de numerosas especies de aves; cuya finalidad es la del reconocimiento mutuo entre los individuos de la misma especie.
c) La incompatibilidad de las estructuras utilizadas en el acoplamiento, por ejemplo, la genitalia de los insectos, aunque determinadas especies son muy semejantes exteriormente, su genitalia presenta diferencias que hacen imposible el acoplamiento de un macho de una especie con una hembra de otra.
d) Aunque algunas especies viven en el mismo hbitat, difieren en el micro ambiente al que estn adaptados, por ejemplo, determinados parasitoides (Hymenoptera, Chalcidoidea) que an viviendo juntos parasitan a especies hospedadoras diferentes y;
18 e) Cuando los gametos no reconocen los de otro a nivel molecular, por ejemplo, los granos de polen pueden llegar al estigma de diferentes especies pero slo pueden fertilizar vulos de la suya propia, o de especies muy semejantes.
Mientras que las barreras postcigticas (Howard, 2000), son los abortos espontneos, esterilidad del hbrido, muerte prematura e hbridos dbiles; el aislamiento reproductor se produce mediante mecanismos de aislamiento postcigticos, es decir, posteriores al apareamiento y formacin del cigoto, y por medio de mecanismos de aislamiento precigticos, esto es, mecanismos que impiden que se llegue a formar el cigoto.
Por otro lado, la especiacin aloptrica, vicariante o geogrfica, es aquella que se presenta cuando las poblaciones comienzan a divergir y el flujo de genes entre ellas se restringe o se ve totalmente interrumpido como una consecuencia de la dispersin y divergencia en diferentes ambientes (Mousseau y Olvido, 2001). El aislamiento geogrfico es, a menudo, la primera etapa de este proceso (Howard, 2000). La separacin espacial durante un largo periodo de tiempo da lugar a la aparicin de novedades evolutivas en una o en las dos poblaciones (Wood y Rieseberg, 2001).
Mientras que la especiacin simptrica se refiere a las nuevas especies que surgen sin el aislamiento geogrfico es decir, en el mismo lugar geogrfico y que es el origen de dos o ms especies de una sola poblacin local (Kondrashov y Kondrashov, 1999; Dieckmann y Doebeli, 1999). Puede ocurrir cuando se genera aislamiento en el mismo sitio por rangos de distribucin, ocasionando que el flujo gentico sea eliminado entre las poblaciones y se forman especies nuevas (Mousseau y Olvido, 2001), por variacin de nichos o por el conjunto de mecanismos que produce una o ms especies nuevas a partir de una especie ancestral sin segregacin geogrfica de las poblaciones, existe alguna barrera de tipo biolgico (Wood y Rieseberg, 2001).
19 La especiacin hbrida o "recombinacional" se refiere al origen de nuevas especies va hibridacin entre especies paternales divergentes cromosmica o genticamente y de acuerdo con los estudios de simulacin realizados por Ungerer et. al.,(1998), sugieren que este tipo de especiacin es puntuado, es decir con largos perodos de estasis, en los cuales la mayora de las especies no exhibe cambio direccional alguno durante sus estancia, seguido por abruptas transiciones en las cuales las especies paternales individuales son desplazadas rpidamente por las neoespecies hbridas (McCarthy, 1995; Ungerer et al., 1998).
En relacin con la formacin de subespecies esta se presenta cuando una poblacin debilita su entrecruzamiento reproductor con el resto de las poblaciones de la especie, por encontrarse en periodo de especiacin o cladognesis. Esta poblacin puede seguir dos caminos diferentes (O'Hara, 1993):
1.- La poblacin debilita sus relaciones reproductoras y posteriormente se produce una ruptura permanente entre la poblacin y el resto de la especie. En este caso estaramos ante un verdadero fenmeno de diferenciacin, una tendencia evolutiva propia que conlleva un destino histrico concreto: la separacin y formacin de una nueva especie. La tendencia evolutiva propia implica la adquisicin de novedades evolutivas o, autapomorfas. Es una subespecie que formar una especie.
2.- La poblacin debilita sus relaciones reproductoras pero posteriormente es absorbida por el resto de la especie, con lo que la separacin es slo temporal. Es la misma situacin que en el apartado anterior (diferenciacin de una poblacin). Sin embargo, tiene un destino histrico diferente en el que no se forma una nueva especie, debido a la falta de tendencias evolutivas propias. Es una subespecie que no formar una especie.
20 2.1.3. Filognesis y Filogenia
Dobzhansky declar que "Nada tiene sentido en biologa excepto a la luz de la evolucin", y un corolario muy particular sobre el tema central de este documento, es que todo tiene mucho ms sentido a la luz de la filogenia (Soltis y Soltis, 2000).
Los trminos filognesis y filum fueron acuados por Haeckel en 1866 del siguiente modo: la filognesis hace referencia a un proceso particular, mientras que la filogenia es la ciencia que estudia los procesos y sus resultados (Ax, 1987). Otros autores enfatizan la bifurcacin como el eje central de la filogenia, por ejemplo, O'Hara (1988) utiliza la siguiente definicin: filogenia es la crnica evolutiva: la secuencia ramificada del cambio de caracteres en los organismos a travs del tiempo. De acuerdo con estas ideas, el objetivo de la investigacin filogentica es descubrir los productos de la filognesis y su ordenacin o relacin en la secuencia de especiacin en el tiempo, es llamado sistemtica filogentica y el resultado de este empeo es llamado sistema filogentico (Wagner, 2000). Por lo tanto, la filogenia se encarga mayoritariamente del estudio de la cladognesis, esto es: el proceso de origen de nuevos linajes (ramas) como resultado de la bifurcacin de las especies (Ax, 1987).
La filognesis cubre la gnesis de todas las unidades en la Naturaleza y la anagnesis es el proceso de cambio evolutivo en los linajes, es decir, el origen de novedades evolutivas en las poblaciones de especies (Wiley, 1981) Este trmino es sinnimo de "evolucin filtica" y es el proceso por el cual un carcter gentico o fenotpico cambia en una especie. No hace referencia a la bifurcacin sino al cambio gradual de un rgano en el transcurso del tiempo. A nivel de especie las filogenias inferidas a travs de datos moleculares proporcionan registros indirectos de los eventos de especiacin que han dirigido la expansin de las especies y ofrece un enorme potencial para la investigacin de las causas generales y las tasas de especiacin dentro de clados (Barraclough y Nee, 2001). Una especie filogentica es un grupo de organismos que comparten rasgos nicos morfolgicos o genticos que
21 les hacen distintos de otros grupos, estos rasgos compartidos se infieren por ser el resultado de un linaje comn y este concepto (especie filogentica) tiene sus races en la rama de biologa evolutiva que se enfoca en reconstruir la historia evolutiva de los organismos (Wood y Rieseberg, 2001).
La filogenia ocupa un lugar central en la sistemtica y en la taxonoma, al ayudar a resolver problemas de posicin y nomenclatura (Forey, 1992). El centro del concepto de la sistemtica filogentica es el uso de caracteres apomrficos o derivados para reconstruir las relaciones ancestrales ms comunes y la agrupacin de taxa basadas en el linaje comn. Por qu debemos estar interesados en este enfoque en el que la sistemtica filogenetica es diferente de la sistemtica tradicional? la respuesta es simple: las clasificaciones que son conocidas por no ser filogenticas, son posiblemente artificiales y son por consiguiente, tiles slo para la identificacin y no para responder a preguntas acerca de la evolucin (Wiley et al., 1991).
Para la de reconstruccin filogentica, existen los mtodos de distancia y hay dos grupos importantes de anlisis para examinar lazos filogenticos entre las secuencias: mtodos fenticos o de distancia y mtodos cladsticos. El principio en que se fundamentan los mtodos de distancia (fenticos) es que los organismos ms parecidos deben de ser los filogentica mente ms emparentados, el problema es que el parecido puede conducir a conclusiones errneas y la solucin que se ha propuesto es utilizar una gran cantidad de caracteres: algunos sern influenciados por la seleccin, pero la mayora reflejarn los patrones evolutivos (Sneath y Sokal, 1973; Hull, 1988).
En los mtodos de distancia calcula un ndice de distancia entre pares de taxa, tomando en cuenta cules son los caracteres que comparten y, a partir de ellos, siguiendo una serie de reglas se obtiene un rbol filogentico (Sokal, 1985). En otras palabras, reducen todos los caracteres analizados a un solo nmero (la distancia "evolutiva") entre un par de taxa. La eleccin del mtodo para obtener las distancias evolutivas es importante, ya que los diferentes estimadores de distancia se
22 construyen a partir de distintos supuestos del proceso evolutivo (Nei, 1987).
Una vez transformada la matriz de caracteres original a una matriz de distancia entre pares de taxa, se requiere elegir el mtodo de reconstruccin filogentica para lo cual existen gran cantidad de mtodos, que tienen diferentes supuestos y diferentes capacidades y entre los ms utilizados se tienen al UPGMA y al Neighbor-joining (Unin de vecinos), UPGMA (unweigthed pair group method with arithmetic mean), este fue uno de los primeros mtodos cuantitativos para la reconstruccin filogentica y fue propuesto originalmente por Sokal y Michener (Sneath y Sokal, 1973).
Este es uno de los pocos mtodos que presentan directamente una "raz" (la mitad de la distancia entre la ltima rama y el resto del rbol), y las distancias de las ramas son simplemente las medias entre las distancias de cada grupo de organismos. La ventaja ms grande que tiene este mtodo es que es rpido, y puede ser bastante eficiente en la reconstruccin de la filogenia, si las tasas de cambio son relativamente constantes (Sokal, 1985). Si existe heterogeneidad en la tasa de cambio evolutivo entre linajes, el mtodo de UPGMA puede conducir a errores en la reconstruccin del rbol filogentico (Nei, 1991).
Uno de los mtodos de distancia ms extensivamente usados actualmente es el de Neighbor-Joining (Unin de vecinos) (Saitou y Nei 1987), ya que es mucho ms confiable a los problemas de diferencias en las tasas de substitucin que el UPGMA y otros algoritmos, y es razonablemente rpido en la bsqueda de la reconstruccin filogentica (Hillis et al., 1994), en este mtodo, se buscan secuencialmente los taxa ("vecinos") que minimizan el largo total del rbol y cada vez que une un par de taxa, se vuelve a ajustar el largo de las ramas del rbol para cada par de nodos, basndose en la divergencia promedio entre los pares de nodos, por lo tanto no requiere que exista un reloj molecular estricto (Li, 1997). Por otra parte, se ha demostrado que si se emplea el anlisis de distancia adecuado, el mtodo de distancia puede ser tan bueno o mejor que los de parsimonia para encontrar el rbol
23 filogentico verdadero (Nei, 1991; Hillis et al., 1994).
De acuerdo con Simpson (1961), los "fenetistas" analizan los datos mediante uno o ms programas de ordenador que harn que se agrupen las OTU's (Unidades Taxonmicas Operativas), concepto introducido por Sneath y Sokal (1973), en funcin de ndices de semejanza, o de diferencia, global y producen un diagrama ramificado (dendrograma) denominado fenograma, los fenogramas son dendrogramas utilizados por el feneticismo y las hiptesis filogenticas pueden generarse con base en el fenograma que resume los patrones de similitud total.
De acuerdo con Kumar y Fiplipski (2001), las tcnicas computacionales han pasado a ser una herramienta fundamental para el manejo y anlisis de la informacin biolgica. Si bien esto es aplicable a cualquier rea de la biologa, es particularmente importante en la biologa molecular, esto se evidencia en el desarrollo, mantenimiento y permanente actualizacin de gigantescas bases de datos pblicas de secuencias biolgicas tanto de cidos nucleicos (GenBank, EMBL, JDB, etc.) como de protenas (SwissProt, PIR, PDB, etc.); y en la tendencia creciente en el uso de herramientas bioinformticas o de biocomputacin como apoyo a las tcnicas experimentales (Taylor, et al., 1995).
El desarrollo de la bioinformtica y la biocomputacin ha generado tcnicas de anlisis de secuencias de cidos nucleicos y protenas con mltiples objetivos: determinacin de homologa, alineamiento de secuencias homlogas, prediccin de estructura, filogenia, evolucin molecular, diseo de frmacos, entre otros (Brock, 1994).
Por anlisis de secuencias se entiende el proceso de hacer inferencias biolgicas a partir de las estructuras primarias de las protenas, el ARN y el ADN; una de las inferencias ms ambiciosas del anlisis de secuencias es que, a partir de la estructura primaria (secuencia de aminocidos), se pueda predecir la estructura y
24 funcin de la protena; o incluso hacer esta prediccin a partir de la secuencia de bases nitrogenadas del gen codificante (Bodmer, 1995).
Desde la determinacin de la estructura y funcin del ADN por Watson y Crick, se conoce con detalle cmo se interpreta una determinada secuencia de bases nitrogenadas para sintetizar la secuencia de aminocidos de una protena, esto constituye el llamado dogma central de la biologa. Se afirma adems que en teora es posible determinar las propiedades de una protena a partir de su secuencia de aminocidos (Welsh y McClelland, 1990).
Sin embargo, esta informacin se conoce, no ha sido posible la implementacin de mtodos certeros, por medio de los cuales, dada una secuencia de ADN, se pueda deducir la funcin de la protena para la cual ste codifica (Steffen, 1995). A pesar de esto, el anlisis de secuencia contina siendo un rea de mucho inters. A tal punto, que el lograr obtener un mtodo preciso de anlisis de secuencia se ha convertido per se en un objetivo de la investigacin cientfica que agrupa a bilogos, matemticos, estadsticos, computistas, fsicos, etc., (Brock, 1994).
Nei y Kumar (2000), mencionan que el anlisis de secuencias se realiza en una primera instancia sobre las cadenas de caracteres que representan aminocidos o nucletidos sin importar a priori su estructura y funcin, de hecho el anlisis de secuencias biolgicas tiene muchas aplicaciones en el procesamiento de textos en computacin y por otro lado, el anlisis de secuencia no est siendo utilizado exclusivamente por aquellos interesados en predecir estructura, tambin es empleada para determinar relaciones evolutivas entre organismos.
El anlisis de secuencias est siendo empleado por algunos investigadores para construir nuevos rboles filogenticos que estn revolucionando la sistemtica de los organismos vivos y es tal vez en esta rea donde el anlisis de secuencias ha dado los mayores resultados inmediatos (Kumar y Filipski, 2001). En las secciones
25 siguientes se hacen unas breves descripciones de los conceptos centrales que implican el trabajo con anlisis de secuencias.
Los proyectos de secuenciamiento de genomas de organismos biolgicos como el del Genoma Humano, estn generando inmensa cantidad de informacin de secuencias de cidos nucleicos y aminocidos. Esta informacin es almacenada en Bases de Datos internacionales, a las cuales los investigadores envan las secuencias una vez que son determinadas (Taylor, et al., 1997).
El explosivo crecimiento de la informacin genmica y las complejas relaciones a travs de las cuales debe ser relacionada, est exigiendo a las ciencias de la computacin el desarrollo de cada vez ms sofisticados esquemas de diseo y administracin de bases de datos y se puede decir que en los ltimos aos la informacin biomdica est "empujando" el desarrollo de las bases de datos. (Waldrop, 1995).
Estas bases de datos son esfuerzos coordinados, que intentan en lo posible, almacenar la informacin de una manera no-redundante. Existen principalmente dos bases de datos de este tipo en el mundo, para secuencias de ADN: El Genbank en el National Center for Biotechnology Information de los Estados Unidos y el EMBL en el European Bioinformatics Institute de Europa. Del mismo modo, existen diversas bases de datos de secuencias de protenas a nivel mundial, como el PIR, SwisProt y PDB (Taylor, et al, 1997).
Un ejemplo de la tendencia a que el uso de estas bases de datos sea sencillo e integrado directamente con la informacin bibliogrfica, lo muestra el National Center for Biotechnology Information, que administra dos bases de datos distintas, una de cidos nucleicos y otra de aminocidos; y junto con el Medline, la base de datos de citas bibliogrficas de la literatura biomdica de la National Library of Medicine, conforman un sistema integrado de datos de genomas biolgicos. Para la navegacin fluida a travs de esta data, el NCBI cre el Entrez, un sistema de
26 navegacin entre las tres bases de datos, que permite un fcil acceso de toda la informacin relativa a determinada secuencia (Waldrop, 1995).
Si bien el diseo de estas bases de datos y su sistema de navegacin resulta atractivo, algunos autores consideran que los tipos de bsquedas que pueden hacerse sobre ellos son muy limitadas (Waldrop, 1995)
De acuerdo con Taylor et al., (1997), estas son slo algunas de las bases de datos existentes para biologa molecular, existen otros tipos de servidores ms especficos, tanto para ADN como para protenas, por ejemplo, servidores de dominios de protenas, de oligonucletidos, de enzimas y sus sitios de restriccin, de mutaciones, entre otras. Estas bases de datos pretenden actualizar mutuamente su informacin, de tal modo que solicitar o enviar una secuencia a una de ellas sea prcticamente lo mismo que hacerlo a otra. Sin embargo esto no siempre es as, por lo cual es conveniente familiarizarse con sus interfaces, y hacer las solicitudes de secuencias a todos ellos.
BLAST y FASTA se han convertido en los algoritmos estndares de comparacin de secuencias problema en la Intemet, la operacin de ejecutar comparaciones con estos organismos tambin es llamada "bsqueda de similitud de secuencias" (sequence similarity searches). Estos dos algoritmos, suficientemente probados y mejorados desde su creacin, emplean distintos enfoques estadsticos al momento de comparar secuencias.
Sus diferencias estriban principalmente en velocidad y precisin. Un enfoque es conectarse a servidores remotos de BLAST, de FASTA y obtener a partir de ellos los resultados de inters. Ms an, cuando este acceso es gratuito y mundialmente actualizado (Waldrop, 1995)
BLAST fue desarrollado por Altschul et al., (1990) y es el algoritmo ms empleado por el NCBI (National Center for Biotechnology Information). Los usuarios
27 del GenBank, tienen la posibilidad inmediata de emplear el BLAST al hacer all las bsquedas de sus secuencias (Brock, et al, 1995).
La principal caracterstica del BLAST es su velocidad, pudiendo tomar pocos minutos cualquier bsqueda en la totalidad de la Base de Datos. De hecho, los resultados del BLAST ejecutados a travs de la pgina Web del NCBI se presentan en pantalla inmediatamente despus de calculados (aunque tambin pueden ser recibidos por correo electrnico).
Adems de velocidad, el BLAST posee otras fortalezas, en primer lugar las bases de datos que emplea, por ejemplo la nr (non redudant) que posee los registros no redundantes entre las dos bases de datos principales a nivel mundial: GenBank en USA y EMBL en Europa (Taylor, et al, 1997).
FASTA, desarrollado por Lipmann y Pearson en 1985, es empleado mayormente por el EMBL - EBI (European Molecular Biology Laboratories - European Bioinformatics Institute), resulta notablemente ms lento, empleando para bsquedas equivalentes hasta varias horas. Por esta razn, sus resultados slo pueden recibirse va correo electrnico. Sin embargo este algoritmo posee algunas ventajas:
a) Posibilidad de comparacin contra secciones del GenBank como de secuencias de Mamferos, Plantas, Bacterias, etc.
b) Mayor precisin bajo ciertas configuraciones iniciales de sus parmetros.
El FASTA resulta conveniente para bsquedas avanzadas de mayor precisin, ambos algoritmos proveen como primer resultado una medida cuantitativa de la similaridad de la secuencia problema contra cada una de las secuencias de la bases de datos. BLAST y FASTA son adems herramientas de alineamiento local por pares (pairwise), que dan como resultado un alineamiento de nuestra secuencia problema con cada una de las secuencias resultantes de alta similitud. Este segundo resultado
28 es una medida cualitativa de la similitud de la secuencia problema con las secuencias de las bases de datos (Gaeta, 1995).
De acuerdo con Kumar y Filipski (2001), el alineamiento es una herramienta cualitativa que permite dar los primeros pasos hacia la conclusin de que dos o ms secuencias son homlogas y consiste en hacer coincidir las secuencias en aquellas regiones en las que se repitan el mayor nmero de monmeros (caracteres) posibles, como se muestra a continuacin.
Esta tcnica, aparentemente sencilla se hace ms compleja en la medida en que el tamao de las secuencias a comparar es mayor y ms an, cuando se comparan ms de dos secuencias, por ello se emplean computadores y distintos programas que dadas las secuencias, generan el mejor alineamiento (Kumar y Filipski, 2001).
El alineamiento global intenta hacer coincidir las secuencias en el mayor nmero posible de caracteres, a lo largo de toda la banda, en cambio, el alineamiento local busca conseguir pequeas regiones de secuencias consenso. El alineamiento local, adems de ser ms efectivo desde el punto de vista computacional, tiene mayor sentido biolgico, pues es sabido que slo una regin, relativamente pequea de la secuencia de aminocidos de una protena es la que constituye su sitio activo y por ende la que le confiere su funcin, los algoritmos BLAST y FASTA, as como la mayora de los programas de alineamiento emplean el enfoque de alineamiento local (Gaeta, 1995)
Como el nombre lo indica, el alineamiento por pares, consiste en hacer coincidir un par de secuencias. El alineamiento mltiple lo hace con un conjunto de secuencias mayor de dos. Los algoritmos BLAST y FASTA, slo producen
29 alineamientos por pares de la secuencia problema con cada una de las secuencias de la base de datos con las que muestra alta similitud.
El alineamiento mltiple resulta provechoso para encontrar secuencias consenso entre un grupo de genes distintos. En algunos casos estas secuencias consenso pueden orientar hacia la exploracin de nuevas estructuras relacionadas con cierta funcin o para aplicaciones prcticas como la de encontrar secuencias comunes para su donacin en organismos transgnicos (Gaeta, 1995)
La complejidad en la realizacin de un alineamiento mltiple es funcin geomtrica del nmero de secuencias sumadas al proceso; por lo cual se requieren programas especializados ms exigentes en cuanto a capacidad de cmputo que aquellos que slo realizan alineamientos por pares. Una vez obtenidas las secuencias similares a la de estudio, resulta importante realizar un alineamiento mltiple entre todas ellas, en busca de secuencias consenso. Existen diversas herramientas en Internet disponibles para ello, as como un buen nmero de herramientas comerciales. Una de las herramientas estndares ms empleadas para la generacin de alineamientos mltiples es el CLUSTAL-W (Thompson et al, 1994) disponible gratuitamente para fines acadmicos va FTP en el URL: http://www.csc.fi/molbio/progs/clustalwlclustalw.html .
sta es una aplicacin que debe ser instalada localmente y que requiere como datos de entrada, las secuencias (en formato FASTA) que se desean alinear. CLUSTAL-W genera adems los datos necesarios para dibujar un rbol filogentico entre los organismos estudiados respecto a la secuencia comparada. El rbol no es dibujado por CLUSTAL W, slo genera los datos necesarios para hacerlo. Con estos datos, el rbol puede ser dibujado manualmente o con otro programa, como el PHYLIP (Jeanmougin, 1996).
30 Para comparar dos o ms secuencias, es necesario alinear los residuos conservados y no conservados de todas las secuencias (la identificacin de lugares de inserciones y deleciones que han ocurrido desde la divergencia de un antepasado comn). Estos residuos forman un patrn a partir del cual las relaciones entre las secuencias puede determinarse con los programas filogenticos. Cuando las sucesiones se alinean, es posible identificar situaciones de inserciones o deleciones desde su divergencia de su antepasado comn. (Kumar y Filipski, 2001); existen tres posibilidades:
1) Las bases se emparejan: esto significa que no hay ningn cambio desde su divergencia.
2) Las bases desigualan o emparejan mal: esto significa que hay una substitucin desde su divergencia.
3) Hay una base en una secuencia, ninguna en el otro: hay una insercin o una delecin desde su divergencia.
Una buena alineacin es importante para el prximo paso: la construccin de rboles filogenticos. La alineacin afectar las distancias entre las 2 especies diferentes y esto influir en la filogenia inferida (Stackebrandt, 1998).
2.1.4. Marcadores moleculares
Avise (1994), menciona que el inters de estudio en la evolucin molecular se puede centrar en dos reas: (a) la caracterizacin de las bases moleculares de la variacin en sistemas genticos particulares o (b) la aplicacin de datos genticos a preguntas sobre historia natural y evolucin de organismos y se hace la pregunta por qu emplear marcadores genticos moleculares? Y responde: porque la filogenia es "el flujo de la herencia," solo los rasgos genticamente transmitidos son informativos para la estimacin de la filogenia.
31 Con el descubrimiento de la estructura de DNA y el RNA, los pasos en la sntesis de las protenas y otros grandes descubrimientos de la biologa molecular, se revolucion el estudio de las plantas a todos los niveles desde las clulas a los ecosistemas, con el uso de las tcnicas moleculares se estn descubriendo muchas respuestas y mecanismos que no fueron accesibles en el pasado (Filipski, 2001). Ahora es posible identificar con precisin genes particulares responsables de algunos rasgos o caractersticas, introducir o eliminar genes, alterar la taxonoma presente y la filogenia, el hombre puede crear nuevas especies (Bazzaz, 2001). Y las bases de ello se encuentran en los cidos nucleicos como a continuacin se describe:
2.1.4.1. Marcadores moleculares en plantas. Las tres grandes reas de aplicacin de la sistemtica molecular son: 1) la estructura gentica de poblaciones (como variacin geogrfica, heterocigosidad), 2) delimitacin de especies (incluyendo hbridos) y 3) inferencia filogentica (Baverstock y Moritz, 1996). El uso de marcadores moleculares para resolver problemas taxonmicos en plantas se inici en la dcada de los setenta con tcnicas de electroforesis de enzimas (Gottlieb, 1971), y hacia los ochenta las tcnicas de manipulacin y anlisis de ADN y ARN haban avanzado lo suficiente como para poder estudiar la variacin (Moritz y Hillis, 1996; Filipski, 2001).
La popularidad de estos mtodos se basa en que cualquier carcter utilizado para un anlisis sistemtico debe reflejar cambios genticos. La eficacia sistemtica del carcter utilizado ser mayor si no es el resultado de la influencia del medio sobre el fenotipo, por lo que el uso directo del material gentico debe aportar los caracteres ms fundamentales para una clasificacin (Crawford, 1990), con la ventaja adicional de que el nmero de datos que se pueden obtener est limitado slo por el tamao del genoma (Lafontaine y Tollervey, 2001b). Estos datos, debido en parte al gran nmero de caracteres involucrados, se analizan por mtodos de distancia, parsimonia o mxima similitud con los que se obtiene una filogenia (Swofford et al., 1996).
32 La incorporacin de nuevos tipos de datos, particularmente los caracteres moleculares, han sido necesarios en taxa donde los caracteres morfolgicos, por s solos, no han resuelto los problemas taxonmicos. Estos datos pueden provenir de biomolculas como protenas y cidos nucleicos, e incluyen reacciones inmunolgicas, isoenzimas, las secuencias de protenas, la hibridacin de ADN, las enzimas de restriccin del ADN ("RFLPs" [polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin] y mapas gnicos), los "RAPDs" (polimorfismo del ADN amplificado al azar), el "fingerprinting" (huella digital) del ADN y las secuencias de genes particulares. Los mritos intrnsecos del uso de este tipo de datos en sistemtica ya se ha discutido en la literatura (Buth, 1984; Pauterson, 1987; Hillis y Moritz, 1990; Bruns et al., 1991; Soltis et al., 1992; Doyle, 1993).
Para Sunnucks (2000), tres componentes importantes han venido ha eficientizar los estudios sobre gentica de poblaciones: 1) tcnicas eficientes para examinar los segmentos informativos del DNA, 2) estadsticas para analizar datos del DNA y 3) la disponibilidad de paquetes computacionales de fcil uso, con lo cual se podr dar respuesta a las preguntas biolgicas ms eficientemente. El progreso de la gentica evolucionaria, es una novedad cientfica en la cual se asume que el desarrollo del control de genes, es el aspecto principal de los cambios evolucionarios en la morfologa y comprendiendo la filogenia del desarrollo del control de genes se podr comprender la forma de la evolucin de plantas y animales (Theissen et al., 2000).
2.1.4.2. Caracteres moleculares. En los ltimos aos el uso de caracteres moleculares en estudios taxonmicos ha aumentado considerablemente y las tcnicas ms comnmente utilizadas provienen de las enzimas de restriccin y la secuenciacin de genes o regiones particulares de ADN (Wats 2000). El estudio de las secuencias de genes presentan potencialmente ventajas sobre otros caracteres moleculares. Entre los procedimientos para secuenciar, destacan la aplicacin generalizada de los mtodos enzimticos y la tendencia hacia el uso de marcadores
33 no radiactivos, as como la secuenciacin automatizada (Kumar y Filipski, 2001). Algunas de las razones para usar secuencias gnicas en estudios sistemticos son:
1) Representan una fuente abundante de caracteres (potencialmente cada nucletido de la secuencia); 2) tienen diferentes propiedades estructurales y funcionales y 3) presentan diferentes tasas evolutivas.
Estas tres propiedades se han podido observar tanto en plantas como en animales (Ritland y Clegg, 1987; Field et al., 1988; Soltis et al., 1990; Giannasi et al., 1992).
2.1.4.3. Secuencias. Los recientes adelantos espectaculares en las tecnologas y estrategias para la secuenciacin del ADN han acelerado el anlisis detallado del genoma de miradas de organismos, el ms notablemente, el humano (Green, 2001). El uso de secuencias es actualmente uno de los mtodos ms comnmente utilizados, a diferencia de las enzimas de restriccin, con las que se muestrean partes del genoma, las secuencias analizan todas las unidades bsicas de informacin de un organismo (Hillis et al., 1996; Lafontaine y Tollervey, 2000).
Los caracteres estn representados por la posicin en la secuencia del gen, mientras que los estados de carcter son los nucletidos que se encuentran en esa posicin (Swofford et al., 1996; Dragon y Filipowics, 1999). Por eso es muy importante alinear las secuencias obtenidas lo mejor posible antes de utilizarlas y descartar las zonas dudosas (Giannasi et al., 1992; Bult y Zimmer, 1993).
2.1.4.4. La regin de ITS del ADN Ribosomal del ncleo (nrADN). Los genes ribosomales y sus regiones espaciadoras asociadas, que en conjunto son llamados ADN ribosomal nuclear (nrADN) tienen un amplio rango de aplicacin, desde el origen de la vida hasta los eventos evolutivos ms recientes (Hllis y Dixon, 1991; Lafontaine y Tollervey, 2000). El nrADN ha sido ampliamente utilizado, ya que
34 permite la inferencia de relaciones filogenticas entre taxa muy distantes, debido a que presentan secuencias de bases altamente conservadas con tasas de evolucin muy lentas (Hillis y Dixon, 1991; Hamby y Zimmer, 1992; Baldwin et al., 1995; Lafontaine y Tollervey, 2000).
De acuerdo con Hillis y Dixon (1991); Baldwin et al., (1995) y Planta y Rau (1999), el arreglo del ADN ribosomal nuclear (nrADN) de un genoma eucaritico, tpicamente consiste de algunos cientos de copias repetidas en tndem. Cada una de estas copias se compone de la unidad transcrita y de la regin de los espaciadores externos no transcritos (Planta y Rau, 1999).
En procariontes existen de una a varias copias de genes de ADN ribosomal y estos genes pueden estar organizados en un opern nico (junto a cada gen bacteriano existe un segmento de ADN conocido como promotor). Este es el lugar sobre el cual la ARN polimerasa, enzima responsable de la produccin de ARNm, se adhiere al ADN e inicia la trascripcin. Entre el promotor y el gen existe con frecuencia otro segmento de ADN que recibe el nombre de operador, donde otra protena -el represor- puede adherirse. Cuando el represor se une al operador, detiene el desplazamiento de la ARN polimerasa a lo largo del cromosoma y la produccin de ARNm, por lo tanto el gen se inactiva (Baldwin et al., 1995).
Sin embargo, la presencia en la clula de una sustancia qumica determinada puede provocar que el represor se separe y el gen se active. Otras sustancias pueden afectar el grado de actividad del gen al alterar la capacidad de la ARN polimerasa de unirse al promotor. Un gen que recibe el nombre de regulador produce la protena represora. En las bacterias, varios genes pueden estar controlados de forma simultnea por un promotor y uno o ms operadores. El sistema completo se denomina entonces operon) o pueden estar dispersos por todo el genoma (Planta y Rau, 1999).
En eucariontes, generalmente existen tres o cuatro subunidades de nrADN (18S,
35 5.8S 26S (tres) en plantas; 18S, 5S y 28S (tres) en animales y 16S, 5S, 5.8S y 25S (cuatro) en Hongos, por lo que se dice que hay 3 o 4 subunidades en eucariotes). Estas subunidades son caracterizadas por su velocidad de sedimentacin que se representa por la letra S (S, por Svedburg), y consisten en: a) la subunidad larga cuyo rango en tamao va desde 16S (alrededor de 1500 nucletidos) hasta 28S (mas de 4000 nucletidos); b) la subunidad pequea 5.8S (de 160 nucletidos); c) la subunidad 18S (1800 nucletidos); y en algunos organismos d) la subunidad 5S (con 120 nucletidos). En eucariontes, dos espaciadores internos transcritos (ITS) separan las subunidades 18S, 5.8S y 28S (o sus homlogos), el ITS1 y el ITS2. Copias adyacentes de la unidad repetida de nrADN ("nrDNA repeat") son separadas por la regin del espaciador no transcrito (NTS), tambin llamado espaciador intergnico (IGS) por algunos autores.
La de los ITS contiene elementos que sirven como estimuladores de la transcripcin (Hillis y Dixon, 1991; Baldwin et al., 1995; Planta Y Rau, 1999). La regin de los espaciadores internos transcritos (ITS) ha sido ampliamente usada para el esclarecimiento de las relaciones entre taxa a niveles inter e intragenricos, as como intraespecficos en angiospermas (Hamby y Zimmer, 1992; Baldwin et al., 1995; Buckler y Holtsford 1996; Liston et al., 1996).
2.1.4.5. La regin de los espaciadores internos transcritos (ITS) del nrADN en angiospermas y gimnospermas. Las copias de nrADN en el genoma de las plantas, estn distribuidas en uno o varios loci cromosmicos denominados regiones organizadoras nucleares (NORs) (Hamby y Zimmer, 1992; Brown et al., 1993; Planta Y Rau, 1999; Shaw, 1999). El nmero de NORs determina de alguna manera la velocidad de los procesos de homogenizacin. En angiospermas se encuentran entre uno y dos, mientras que el nmero de NORs en algunas gimnospermas es de 10 a 12 (Karvonen y Savolainen, 1993). La familia de genes repetidos experimenta una homogenizacin rpida en sus secuencias de bases, un proceso conocido como evolucin concertada (un mecanismo gentico no mendeliano) y cuyos mecanismos principales lo constituyen el entrecruzamiento
36 desigual y la conversin gnica (Baldwin et al., 1995, Wendel et al., 1995). La evolucin concertada y la recombinacin sexual tienden a promover la uniformidad de los ITS dentro de individuos y entre individuos de poblaciones (Hillis et al, 1991; Soltis y Kuzoff, 1993; Shaw, 1999), por lo que en teora basta muestrear solo algunos individuos para establecer las relaciones filogenticas entre distintas especies, debido a que la regin de los ITS se encuentra relativamente homognea dentro del genoma, por lo que puede decirse que una sola secuencia sirve para caracterizar a los individuos de una determinada especie (Baldwin et al., 1995; Planta y Rau, 1999).
La variacin en las secuencias de genes en familias multignicas y su distribucin entre y dentro de poblaciones es determinada por las tasas de mutacin y el efecto de fuerzas evolutivas (flujo gnico, seleccin natural, deriva gnica y sistemas de apareamiento), que actan a nivel poblacional (Charlesworth, et al., 2001). Sin embargo, el proceso de evolucin concertada, un mecanismo gentico no Mendeliano, afecta la variabilidad de las familias multignicas a nivel molecular. La tasa de homogenizacin de las unidades repetidas del nrADN mediante evolucin concertada, depende del nmero de copias, el nmero de loci y cromosomas en los cuales se encuentran las copias de estos genes, la localizacin de los loci en los cromosomas y la tasa de intercambio dentro y entre cromosomas (Hillis et al., 1991; Suh et al., 1993; Wendel et al., 1995; Lafontaine y Tollervey, 2000). Se conocen poco los factores que afectan la evolucin de los ITS en gimnospermas, pero la evidencia encontrada en pinos (Pinus spp) sugiere que tanto el nmero de copias del nrADN como de loci es mayor que en angiospermas, por lo que se espera encontrar tasas de homogenizacin relativamente bajas en gimnospermas (Karvonen y Savolainen, 1993).
2.1.4.6. ITSs en angiospermas
La filogenetica molecular de las angiospermas se ha efectuado a partir de la inferencia de tres genes (rbcL, atpB, 18S rDNA) lo que ha permitido una
37 reclasificacin de las angiospermas y esta reclasificacin es quizs lo ms importante que ha sucedido en la taxonoma de las angiospermas en los ltimos 200 aos (Soltis y Soltis, 2000).
La regin de los ITS ha sido considerada como una fuente muy til de caracteres para estudios filogenticos en angiospermas (Baldwin et al. 1995), dado que los ITS se encuentran altamente representados en el genoma, se pueden amplificar con cantidades pequeas de ADN y las secuencias altamente conservadas dentro de la mayora de los genes del nrADN son muy tiles en el diseo de oligonucletidos ("primers") "universales", lo que facilita la amplificacin de los ITS mediante el uso de la reaccin en cadena de la polmerasa (PCR) (Liston 1992; Planta Y Rau, 1999). Los espaciadores internos transcritos (ITS) son la parte ms variable de la regin de los ITS, la regin de los ITS comprende el ITS2, la subunidad 5.8S y el ITS1, debido a que se encuentran flanqueando a la subunidad 5.8S, que es ms conservada y se posibilita la alineacin no ambigua de esta regin (Baldwin et al., 1995)
Una limitacin en la utilidad de los ITS en la sistemtica de angiospermas, es que este locus presenta una cantidad relativamente pequea de nucletidos. En angiospermas, los ITS tienen de 565 a 700 pares de bases (bp) en longitud (Baldwin el al.. 1995). Puesto que la subunidad 5.8S (163-164 bp) exhibe niveles muy bajos de variacin en su secuencia, solamente los 400-535 bp del ITS1 y el ITS2 son tiles para la reconstruccin filogentica entre gneros y especies relacionadas.
En contraste, la regin de los ITS de gimnospermas es considerablemente ms larga y tiene un mayor rango de variacin que va desde 750 bp en Welwitschia mirabilis hasta 3125 bp en Pcea abies (Qu et al., 1993; Liston et al., 1996). Recientemente se realiz un estudio detallado sobre la variacin en la longitud de la regin de los ITS en gimnospermas, incluyendo 32 especies de gimnospermas, en catorce familias y cuatro rdenes, y se construyeron mapas de sitios de restriccin de los ITS amplificados con PCR (PCR-RFLP) (Liston et al., 1996). El anlisis de los
38 sitios de restriccin indica que el ITS2 junto con la subunidad 5.8S est compuesto de 350-425 bp, y es relativamente constante para todas las especies estudiadas. Por lo tanto el ITS1 es el responsable de la mayor parte de la variacin en la longitud de los ITS en gimnospermas.
39 2.1.5. Satureja macrostema (Labiatae) como modelo de estudio.
El propsito de utilizar modelos de estudio es obtener conocimiento partiendo de lo general, a lo particular, y para ello se utilizan ciertos organismos especficos como modelo de todos los dems. As, Mendel us chcharos, Morgan us Drosophila; Anand (1992) menciona que casi toda la informacin disponible sobre cmo es fsica y genticamente el genoma de los hongos proviene de estudios realizados usando levaduras o ascomicetos como modelos.
El Proyecto Genoma Humano tiene como objetivo descubrir y localizar los ms de 30.000 genes del hombre y poner toda esta informacin a disposicin de la comunidad de investigadores en biomedicina y paralelamente, se estn secuenciando otros organismos modelo (ratn, bacterias, levadura), como ayuda al desarrollo de tecnologa y a la interpretacin de la funcionalidad de los genes humanos. http://biotic.isciii.es/informacion/biosalud/biosalud.html. En la mayora de los estudios sobre evolucin y diversidad floral, se han utilizado las plantas de Arabidopsis thaliana que son miembros de la familia Brassicaceae (Coen y Meyerowitz, 1991).
Kellogg y Shaffer (1993), argumentan que utilizar organismos modelo es prctico dado que no se tiene el tiempo ni recursos para estudiar todas las especies, y para muchas interrogantes, sera una prdida de recursos innecesaria. Sealan, que la meta principal de la mayora de los estudios en biologa: es entender los procesos de cmo funciona el organismo y las partes que lo forman, por lo tanto, cualquier organismo puede ser utilizado como modelo de estudio. De acuerdo con estos autores, un organismo puede ser elegido si en l se pueden cumplir al menos las siguientes causas:
a) Que sea accesible, es decir que exista disponibilidad y variabilidad. b) Que sea de fcil manejo tanto en laboratorio como en ciertas condiciones especiales.
40 c) Que sea fcil de generalizar a otros organismos.
Con base en las consideraciones anteriores, en el presente estudio se eligi a Satureja macrostema como organismo modelo para realizar estudios de especiacin y relaciones filogenticas cuando la planta se desarrolla en hbitat naturales pero con intervencin del hombre, manifestada a travs de la actividad de recoleccin, funcionando sta ltima como una fuerza de seleccin artificial.
Por evidencias empricas reportadas, como las de McVaugh y Schmid (1967) quienes mencionan que hay dos especies en Mxico pertenecientes a la seccin Gardoquia: S. macrostema y S. jaliscana y una especie asociada con bosques en barrancas es descrita como nueva. Mencionan tambin que existen dos variedades aloptricas, reconocibles por las diferencias en pubescencia y son; S. macrostema var. macrostema y S. macrostema var. laevigata, sin embargo los rangos de distribucin de las dos variedades se aproximan una a otra y quizs actualmente se traslapan en algunas reas del centro de Michoacn, ya que algunos especimenes parecen ser tpicamente de la var. laevigata y otros que se han referido dudosamente a la var. macrostema, porque las ramillas son escasamente hirsutas, pero considerablemente menos que algunos especimenes del Valle de Mxico. En otros individuos de Michoacn las hojas jvenes y las ramillas son escasamente vellosas, ms de lo usual que en la var. laevigata, pero menos que macrostema. Estos mismos autores sugieren que ms trabajo de campo es necesario en las reas donde las dos variedades se traslapan (se aproximan tanto que se mezclan) y no es improbable que las dos hibriden donde ellas estn ocurriendo juntas y los individuos de Michoacn pueden ser indicativo de esto. Tambin mencionan que algn flujo de genes entre las dos variedades parece probable.
S. macrostema, ya ha sido utilizado como organismo modelo en estudios de variacin gentica (Aguilar, 2001), fenologa, (Aguilar, 2001), organognesis y embriognesis somtica (Aguilar, 2001), y en la determinacin de nuevas propiedades y usos de S. macrostema (Aguilar, 2001).
41 2.1.6. Clasificacin botnica de Satureja macrostema (Benth) Briq. Reino Divisin Vegetal Espermatofitas
Magnoliophyta Subdivisin II Clase Angiosperma Dicoteledneo
Magnoliopsida Subclase Asteridae Orden Tubiflorales Labiales Familia Labiateaeo Lamiaceae Genero Especie Satureja macrostema
(Watson and Dallwitz, 1992) (http://biodiversity.uno.edu/delta/.)
2.1.6.1. Descripcin de la especie Satureja macrostema (Benth) Briq. (Calamintha macrostema Benth.) Planta arbustiva, con olor a menta al estrujar, de 1 a 2 (3) m de alto; tallos erectos, ramas arqueadas, pubescentes; hojas con pecolos de 2 a 5 mm de largo, limbo ovado u oblongo a lanceolado, de 1 a 4cm de largo por 0.6 a 1.5 cm de ancho, pice agudo, aserradas, base redondeada; flores solitarias o en grupos de 2 a 3 en las axilas de las hojas, pedicelos de 2 a 6(10) mm de largo, pubescentes; cliz 5-dentado, bilabiado, de 7 a 10 mm de largo con la garganta pilosa; corola roja o anaranjada (cambiando a blanquecina o rosada en el secado), de 2 a 3.5 cm de largo; estambres exsertos, tecas de las anteras divergentes; estilo saliente de la corola; mericarpios ovoides, lisos o reticulados. (Rzedowski, 1985).
Nombre vulgar o comn que recibe: Nurite, tabaquillo, hierba del borracho, tuche, Garaona, t de monte, Atchietl, poleo, Cuencuenzpatli (Nhuatl), Guie- zaa (Oaxaca, Zapoteco), Nurhitini t (purpecha), Tragorigano quauhnahuacense, toronjil, Tunch, tarepe, etc. "T de monte", "tabaquillo", "toronjil".
Es una especie vegetal que crece silvestre en las regiones de clima templado. Cuajimalpa a Tlalpan y Milpa Alta; Tialmanalco y Amecameca. Alt. 2450-3500 m.
42 Principalmente en bosques de pino, de encino y de oyamel, a veces en matorrales cercanos a los bosques. Fuera del Valle de Mxico, se le localiza de Jalisco a Veracruz y Oaxaca. Planta medicinal, utilizada localmente contra algunas molestias de los conductos digestivos (Rzedowski, 1985).
2.1.6.2. Distribucin geogrfica. En Mxico se le localiza de Jalisco a Veracruz y Oaxaca (Standley, 1924), a lo largo de la Cordillera Neovolcnica, en bosques de pino, encino y oyamel en alturas de 2400-3200 m.s.n.m.; en Michoacn (Figura 1) se distribuye en los Municipios de Uruapan, Paracho, Nuevo San Juan Parangaricutiro, Zinapcuaro, Zitcuaro, Coalcomn, Aguililla, Charo, Chiltota, Cd. Hidalgo, Angangueo, Nahuatzen, Ocampo, Ptzcuaro, Salvador Escalante, Senguio y Tncitaro. De acuerdo con el estudio complementario realizado como parte de esta investigacin y con base en la temperatura (9 a 16 C); precipitacin (1,200 a 1,600 mm); altura sobre el nivel del mar (2,000 a 3,200 msnm); suelos andosoles y una pendiente del 0 al 35%, se elaboraron mapas mediante Sistemas de Informacin Geogrfica (SIG), en los cuales se localizan las reas homogneas y que presentan las mejores condiciones medio ambientales para la presencia natural o introducida del te nurite (Satureja macrostema) en las que puede expresar todo su potencial veaetal en el estado de Michoacn (Aguilar, Indito)
43 2.1.6.3. Importancia, usos y propiedades curativas del t nurite (S. macrostema). Planta de gran importancia en la medicina tradicional de los pueblos P'urhpecha, quienes la consideran un smbolo de fertilidad y por ello es usada en las Bodas; el nurite es utilizado como un eficiente aperitivo si se toma en ayunas o antes de los alimentos. Se utiliza para combatir las infecciones intestinales como estomtico, excitante de los movimientos gstricos o gastrointestinales y favorece la digestin cuando esta es lenta y dolorosa. Es utilizado como un carminativo poderoso y se utiliza tambin para evitar o eliminar los clicos. Es un agente digestivo eficaz si se toma despus de los alimentos tambin se toma el t nurite para eliminar las molestias producidas por a ingestin de bebidas alcohlicas: agruras y nauseas, de este uso le viene el nombre de "hierba del borracho". Otro uso que se le d al nurite es el de aliviar un tipo de diarrea denominada " diarrea de Tierra Caliente"; como remedio y buen tnico despus de sufrir malaria y otras fiebres. Tradicionalmente se toma un atole de Nurite para aumentar la fertilidad y lograr la concepcin en algunas mujeres que padecen cierto tipo de esterilidad, (Martnez, 1986), de este uso se le conoce con el nombre de "garaona" (Standley, 1924; Rodrguez, 1997; Rezedowski, 1985).
En sntesis, el gnero Satureja ha sido tradicionalmente usado como estimulante, estomtico, carminativo, expectorante, antidiarreico y afrodisaco. La esencia del aceite ha demostrado actividad antimicrobial y antidiarreica por los fenoles del aceite y ha sido usada en el tratamiento del cncer (Simon, et al., 1984; http://www.hort.purdue.edu.Newcrop/med.aro/savory.), como antioxidante (Lagouri y Boskou, 1996); tambin ha mostrado actividad contra los virus HSV-1 y VSV (Abad et al., 1999) y actividad anti-HIV-1 (Yamasaki et al., 1998.
2.1.6.4. Usos actuales y potenciales. En recientes estudios fotoqumicos se ha encontrado que el "t nurite" contiene una mezcla de compuestos qumicos llamados flavonoides los cuales han sido extensamente estudiados en los ltimos 10 aos (Catapano, 1997), dado que entran en la conocida categora de los antioxidantes de origen natural (Maridonneau-Parini, 1986; Chen, 1990; Facino,
44 1990). Entre los antioxidantes mas conocidos estn las vitaminas E y C, que son los antioxidantes "clsicos" pero en los ltimos aos se han descubierto otros, tales como los flavonoides, que estn ampliamente distribuidos en los tejidos vegetales. Satureja incana; S. brevicalix; S. pulchela y S. sericea, son utilizadas en la etnomedicina andina para tratar las vas respiratorias, como digestivos, relajantes y antiflatulentos (Chumacero, et al., 2001). Satureja hortensis ha sido utilizada en el tratamiento de algunos desrdenes gastrointestinales, como antiespasmdico y antidiarreico (Hajhashemi et al., 2000); S. Thymbra, como antioxidante y carcingeno (Lagouri y Boskou, 1996); S. boliviana tiene actividad contra los virus HSV-1 y VSV (Abad et al., 1999); efectos vasodilatorios a partir del ingrediente activo de S. obovata (Snchez et al., 1999); S. brownwi ha sido comprobada para ser utilizada contra infecciones respiratorias provocadas por bacterias Gram positivas como Staphylococcus aureus, Streptoccus pneumoniae y Streptococcus pyogenes (Cceres et al., 1991). En un estudio de las hierbas de la familia Labiatae sobre su actividad anti-HIV-1, S. montana, mostr potente actividad contra anti-HIV-1 (Yamasaki et al., 1998); S. parvifolia, mostr actividad antimicrobial contra microorganismos Gram positivos y Gram negativos (Hernndez et al., 2000).
Por lo anterior, Satureja macrostema puede considerarse como una planta con uso potencial tanto la industria alimentaria como en la farmacutica, que se desarrolla en las zonas Templado-Fras, por lo que obtener informacin sobre sta planta, es de gran relevancia, dada la necesidad de contar con modelos de estudio de los ambientes ecolgicos donde se desarrolla y por otro lado, generar conocimiento sobre plantas de inters social y econmico. Asimismo, con base en la literatura sealada, es probablemente que exista hibridacin y flujo gentico entre poblaciones presentes en el estado de Michoacn, y posiblemente est presente un proceso de especiacin del modo recombinacional o rpido.
45 III. PROBLEMA ESPECFICO, HIPTESIS Y OBJETIVOS
Problema especfico:
Una pregunta fundamental en biologa evolucionarla es: la especiacin es gradual o puntuada?, es decir, el proceso evolutivo se presenta de manera gradual (que ocurre a un ritmo ms o menos constante, y no se observa en la secuencia de los fsiles porque sta es incompleta),o de manera punteada (cuando el registro fsil refleja con fidelidad la manera en que ocurri la evolucin: largos periodos de rpida especiacin y cuando se rompe el equilibrio por la acumulacin de mutaciones, estos periodos relativamente cortos de evolucin activa son seguidos por largos periodos de estasis), esta pregunta ha sido difcil de responder principalmente porque la historia evolucionarla de la mayora de las especies de plantas y animales es pobremente conocida (Rieseberg y Ungerer, 2001)
As, la biologa evolutiva tiene como un tema de estudio principal el proceso de especiacin, y como parte del mismo los diferentes mecanismos que participan en el proceso. En cuanto al modo de especiacin conocida como especiacin hbrida o "recombinacional" la teora predice que el proceso evolutivo que origina esta cladognesis es del tipo puntuado, pero a la fecha existe poca evidencia emprica para apoyarla (Ungerer et. al.,1998). Las tcnicas moleculares aplicadas a estudios evolutivos permiten la obtencin de datos para apoyar posibles explicaciones del proceso biolgico (especiacin), as como la propuesta de las relaciones filogenticas que se han establecido durante el proceso mismo.
Con base en lo anterior, las preguntas planteadas en este estudio fueron: Qu tipo de especiacin est presente en Satureja macrostema var. laevigata? y Si la especiacin recombinacional est presente, sta es de tipo puntuada como lo predice la teora?. 46 Hiptesis
"Es probable que en Satureja macrostema var. laevigata se encuentre presente un proceso de especiacin recombinacional y que ste sea de tipo puntuado"
Objetivos
1.- Determinar el probable modo de especiacin en poblaciones de Satureja macrostema var. laevigata presentes en el estado de Michoacn.
2.- Establecer las relaciones filogenticas de poblaciones de Satureja macrostema var. laevigata presentes en el estado de Michoacn.
47 IV. MATERIALES Y MTODOS
Para el logro de los objetivos y metas del presente estudio se plantearon cuatro etapas bien definidas: 1) la colecta e identificacin tradicional del material vegetativo de Satureja macrostema de las diferentes localidades en estudio, 2) aplicacin de las diferentes tcnicas de biologa molecular al material vegetal obtenido, 3) la aplicacin de las tcnicas computacionales para el manejo y anlisis de las secuencias obtenidas por biologa molecular y 4) la obtencin y descripcin de los resultados anteriores para inferir la filogenia de los especmenes en estudio. La primera y cuarta fase se llev a cabo en las instalaciones del Campo experimental Uruapan del INIFAP en la ciudad de Uruapan, Michoacn. La segunda y tercera fase se realizaron en los laboratorios del Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados (CIVESTAV-IPN) Unidad Irapuato, en Irapuato, Guanajuato. El desarrollo de cada fase se describe a continuacin:
4.1. Colecta e Identificacin del material vegetal
Las colectas de los materiales de la especie S. macrostema se realizaron en tres localidades de la Sierra Puhrepecha, Estado de Michoacn, Mxico, en el cuadrol se mencionan las caractersticas generales de las localidades.
Cuadro 1.- Caractersticas de las localidades donde se colect material botnico de S. macrostema.
Localidad A (m N () W () Exposicin suelo Clima Vegetacin asociada Fecha de colecta Bosque Pinus Nov 2000 San Juan 2100 102 15" 19 27" E Andosol Templado subhmedo y Abies sp. Uruapan 1611 102 11" 19 46" Z Andosol Templado Jardn botnico Nov 2000 Paracho 10208' 19 39 S Andosol Templado subhmedo Bosque Pinus Nov 2000 y Abies sp
A= Altura sobre el nivel del mar. N= Latitud
Norte. W= Longitud Oeste
48 Se colectaron 5 ejemplares por cada localidad, cada localidad (4) se consider como representante de una poblacin diferente de S. macrostema y la denominacin de los ejemplares tratados en este estudio se resumen en el cuadro 2: Cuadro 2.- Ejemplares de Satureja macrostema utilizados en el estudio Localidad Nombre comn en la localidad Nomenclatura para este Estudio INIFAP, Uruapan Blanco T Nurite Blanco (SATIB) INIFAP, Uruapan Negro Te Nurite Negro (SATIN) San Juan ? T Nurite San Juan (SATSJ) Paracho ? T Nurite Paracho (SATPA) INIFAP= Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrcolas y Pecuarias.
4.2. Extraccin y limpieza del ADN
De los especmenes colectados, se seleccionaron dos ejemplares al azar por localidad, con la finalidad de obtener por duplicado los resultados de cada localidad, y de cada uno de ellos se separaron las hojas para la extraccin de ADN.
4.3. Extraccin del ADN
Los procedimientos para extraccin de ADN genmico de plantas incluyen tratamientos que rompen las paredes y membranas celulares para liberar los constituyentes celulares dentro de un buffer de extraccin que contiene compuestos para proteger al ADN de la actividad de nucleasas endgenas (Griffin et al., 1994).
Todas las muestras fueron congeladas con nitrgeno lquido y finamente maceradas. El ADN total fue aislado de tejido verde de cada una de las localidades tratadas por el mtodo propuesto por Doyle y Doyle (1990).
49 Se prepararon los siguientes reactivos de acuerdo al protocolo de Doyle y Doyle (1990).
Soluciones para extraccin de ADN.
Buffer de extraccin: CTAB 2% PN, NaCI 1.4 M, EDTA 20 mM pH 8.0, a mercaptoetanol 0.2% v/v. ( Doyle y Doyle, 1990. cita al 0.1 %; en el presente caso se utiliz al 0.2%)
* EDTA0.5MpH8.0 * Tris-HCI 1 M pH 7.5 *cido maleico 1 M *Acetato de sodio 2.5 M * Fosfato de sodio monobsico * SDS 20 % (p/v) * Cloruro de litio 4 M * Etanol absoluto * Etanol al 70% (v/v) * NaCI 5 M * MgC12 2 M * N-Lauril-Sarcosina 1 M * SSC 1Ox pH 7.0 * Tween 20 al 20% * Citrato de sodio 1 M * Fosfato de sodio dibsico.
El protocolo se describe a continuacin (Sambrock, 1989; Garca et al., 2001):
1. Moler de 0.5 a 2.0 g de material fresco o congelado con nitrgeno lquido en un mortero con pistilo, hasta obtener un polvo fino.
50 2. Transferir directamente a un tubo de 30 ml (nalgene o falcon) y esperar a que todo el nitrgeno se evapore. Agregar 10 ml de buffer de extraccin precalentado a 60C, mezclar bien, tapar el tubo e incubar por 30 min. a 60C con agitacin ocasional. 3. Extraer con 10 ml de cloroformo-alcohol isoamlico 24:1, centrifugar a 10,000 r.p.m. por 10 min. y recuperar la fase acuosa (superior). 4. Colocar la fase superior en un tubo eppendorf, agregar 2/3 partes del volumen de la muestra de alcohol isoproplico y agitar suavemente para precipitar los cidos nucleicos (se puede dejar precipitar toda la noche a 20C o por 3 horas mnimo durante el da). Centrifugar a 10,000 r.p.m. por 10 min. y decantar el sobrenadante (si se forma como hebra este se puede retirar con una asa de vidrio). 5. Lavar el pastilla con etanol al 80% y dejar secar a temperatura ambiente. (Doyle menciona realizar un solo lavado, en el presente estudio se realizaron dos) 6. Despus de secar el pastilla, disolverlo en 500 ?l de TE y agregar 4 ?l de ARNasa (a una concentracin de 10 pg/?l). 7. Incubar a 37C por 1 h con la ARNasa. 8. Centrifugar por 5 min a 12000 r.p.m, y recuperar el sobrenadante. 9. Agregar 10 % de acetato de sodio 3 M pH 5.2 y 2/3 partes del volumen de isopropanol. 10. Reposar por 5 min. 11. Transferir el ADN a tubos eppendorf. 12. Decantar todo el sobrenadante, dejando solo el ADN en el tubo y luego se deja secar. 13. Enjuagar con 1 ml de una solucin de etanol al 75% y 10 mM de acetato de amonio por 1 min. 14. Si se desea se puede dejar a -20C hasta su uso. (Doyle y Doyle, 1990).
Una vez obtenido el ADN se realiz la limpieza del ADN por el mtodo de GenClean utilizando los reactivos del Biorad (kit Prep-A-Gene DNA Purification Systems) y siguiendo las instrucciones citadas por los fabricantes. 51
Las concentraciones de ADN fueron determinadas midiendo la absorbencia a X260 nm con un espectrofotmetro Cary3 de la Compaa Varan. El ADN se almaceno a -20C hasta su uso.
4.4. Determinacin de la concentracin del ADN
De acuerdo con Maniatis (1989), para calcular la concentracin de ADN de tejido fresco se utiliz la ecuacin 1 en donde los resultados se expresan en g/l.
[ ]= Abs 260 nm * Factor de dilucin / 20 1
4.5. Determinacin de la calidad del ADN
El clculo de la calidad del ADN involucra las absorbancias a 260 y 280 nm y se utiliz la ecuacin 2. Si el resultado est dentro del rango de 1.8 a 1.9, significa que el ADN es de buena calidad. (Maniatis, 1989)
Calidad = Abs 260 / Abs 280 2
Una vez determinada la concentracin del ADN de cada muestra se procedi a su amplificacin como se describe a continuacin:
4.6. Espacios transcritos internos (ITS).
El desarrollo de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) potenci, entre otras cosas, el uso de secuencias gnicas en el estudio de las relaciones filogenticas entre poblaciones o especies. Las secuencias gnicas ms utilizadas actualmente incluyen a los genes ribosomales, en especial a los espaciadores transcritos internos (ITSs) (Walsh, 1998). Para la amplificacin de estos espaciadores existe un protocolo ampliamente generalizado y es el que a continuacin se describe:
52 Para la amplificacin se utiliz el mismo ADN de la seccin anterior mostrado en la figura 2 y con la limpieza con fenol-cloroformo y el GenClean con el kit Prep-AGene DNA Purification Systems de BIO-RAD
4.7. Primera amplificacin del ADN
Se mandaron sintetizar a la compaa Gifco BRL los iniciadores ITS1 e ITS4, que permiten la amplificacin de la regin ITS1-5.8S-ITS2 de los genes ribosomales de eucariotes. La secuencia de estos iniciadores se muestra a continuacin:
ITS1 5'tccgtaggtgaacctgcgg 3' 10 nucletidos
ITS4 5'tcctccgcttatttgatatgc 3' 10 nucletidos
Las condiciones de reaccin se muestran a continuacin:
Para preparar 1 reaccin de PCR bajo las condiciones anteriores se requirieron: 14.8 ?l de H2O mQ, 2.5 l de buffer 1OX+Mg 10x, 0.5 l de dNTP 10 mM, 1 l de iniciador ITS1 10 pM/l, 1 l de iniciador ITS4 10 pM/?l, 0.2 l de Taq 2.5 U/ ?l, 0.5 ?l de DNA geonmico por tubo y 50 ?l de aceite mineral (Williams, et al., 1995).
Los productos amplificados se aplicaron en geles de agarosa al 1.2 % a 85 V, luego se visualizaron las bandas en una fuente de luz UV.
4.8. Limpieza
Estos fragmentos se cortaron para someterse a una nueva limpieza con el kit Prep-A-Gene DNA Purification Systems de BIO-RAD, siguiendo las instrucciones de los fabricantes, para corroborar que se encontraban limpios y que la amplificacin corresponda, efectivamente, al fragmento de ITS, ITS1-5.8S-ITS2 y fueron
53 observados nuevamente en un gel de agarosa al 1.2% produciendo nuevamente fragmentos de 700 pb. Estos fragmentos fueron cortados y limpiados nuevamente de la misma manera como se describe en prrafo anterior y mandados a secuenciar.
4.9. Segunda amplificacin
Los productos amplificados se aplicaron en geles de agarosa al 1.2 % a 85 V, luego se visualizaron las bandas en una fuente de luz UV. Antes de ser secuenciados dichos productos fueron limpiados usando el Kit de Purificacin Nuclen Phytopure de BIO-RAD, siguiendo las instrucciones provistas por este kit.
4.10. Purificacin de ADN
protocolo segundo: ? Cortar el fragmento del gel que contiene la banda de DNA deseada y poner en un tubo de 1.5 ml. No usar ms de 250 ml en cada tubo. ? Adicionar de 2 a 3 volmenes de KI - Nal (500 l) e incubar a 50C por 5' hasta que se disuelva completamente la agarosa. ? Adicionar 30 l de la suspensin de glass milk (1 l por cada 0.5 pg de DNA) e incubar a 4C por 10'. ? Centrifugar por 30" (un pulso en la microcentrifuga). Guardar el sobrenadante. ? Lavar la pastilla tres veces con 500 l de la solucin de etanol 50 %, resuspendiendo la pastilla con una pipeta Pasteur sellada. Para cada lavado centrifugar 30" y guardar todos los sobrenadantes. ? Resuspender la pastilla final con 30 l de H2O dd para eluir el DNA desde el glass milk. Esta pastilla fcilmente se resuspende en un volumen de agua que es igual al volumen de la pastilla. Incubar el tubo a 45-55C por 10' y luego centrifugar por 30" para producir una pastilla slida. Remover cuidadosamente el sobrenadante que contiene el DNA eluido y colocar en tubo nuevo (aqu se obtiene un 70 % de DNA, una segunda elucin libera el 30 % restante). 54 Soluciones: (el kit trae preparadas estas soluciones, si no se pueden preparar como se describe a continuacin)
* Glass milk.- Se prepara a partir de pipetas Pasteur molidas en un vaso pulverizador. El polvo resultante se suspende en H2O dd y se deja precipitar en una probeta de cristal durante 15'. La solucin "lechosa" sobrenadante (las partculas ms pequeas que no se precipitaron) se pasa a tubos Falcon y se centrifuga de 2-3' a 3000 rpm. Desechar el sobrenadante y resuspender la pastilla en un volumen mnimo de H2O dd (20 mi).
* KI.-Se disuelven 180g de KI - Nal en 95 ml de H2O dd caliente filtrada en papel Whatman No. 1 (...se forman cristales). Se agregan 0.5g de Na SO3 como antioxidante. La solucin resultante se guarda en la oscuridad a 4C.
* Etanol 50 %.- 50 ml de etanol absoluto en 50 ml de la solucin: Tris HCI 20 mM (1 ml de 1M) pH 7.4, EDTA 1 mM (0.1 mi de 0.5 M) y NaCI 0.1 M (5ml de 1 M). Guardar a -20C (Sambrook, et al., 1989).
4.11. Secuenciacin
Las reacciones de secuenciacin fueron realizadas por amplificacin con PCR en un volumen final de 20 l usando 100 ng de los productos amplificados de ITS, 10 pmol de cada iniciador y 9.5 l de DyeTerminators premix part No 402079 de acuerdo al protocolo de Applied Biosystems, para cada muestra. Despus de calentar a 94C por 2 minutos, la reaccin consisti de 30 ciclos de 94C un minuto, 55C un minuto y 72C un minuto, con 72C por 7 minutos en el ultimo ciclo (9600 thermal cycler Perkin Elmer). Se removi el exceso de Dye Terminators usando columnas Quick Spin (Boehringer Mannheim). Las muestras fueron directamente secadas en centrfuga al vaco y disueltas con 4 l de EDTA formamida desionizada a pH 8.0. Las muestras fueron cargadas dentro del secuenciador ABI Prism TM 377 55 ADN Sequencer y corridas por 12 horas en gel de acrilamida al 4.5% en condiciones desnaturalizantes. Todas las secuencias se obtuvieron por duplicado, a partir de dos ejemplares diferentes para cada taxa (White et al., 1990)
4.12. Alineacin de secuencias
Una vez obtenidas las secuencias, estas fueron recortadas individualmente en la regin 5' del ITS1 y 3' del ITS2, se retiraron las secuencias correspondientes a los iniciadores decameros usados para su amplificacin en cada extremo y se uso el gene 5.8s como anclaje, basndose en la secuencia reportada para Labiatae en el GenBank para este gene.
Para esto se utilizaron los programas DNASIS de DNASIS Inc. y MegAlign de DNASTAR 3.0 SOFTWARE Co. bajo el mtodo Clustal de mxima parsimonia (Thompson et al. 1994).
4.13. Bsqueda y reporte de secuencias en el GenBank
Con la finalidad de construir un rbol filogentico y del cual se puedan realizar inferencias filogenticos ms confiables, se procedi a bajar secuencias de especies similares reportadas por internet en el Genbank del mismo gnero y gneros relacionados, las cuales se alineaban entre s para la determinacin de distancias genticas y su filogenia. El tipo de anlisis empleado fue el de la bsqueda de similaridad, que consiste en efectuar una comparacin de una secuencia problema con la totalidad de secuencias existentes en una base de datos. Estas bsquedas se realizan con distintos programas que aplican algoritmos de comparacin y como resultado generan un listado de organismos cuyas secuencias resultan similares a la de estudio. Los algoritmos ms comunes disponibles en la Internet son el BLAST y el FASTA. En el presente caso se uso el algoritmo de Blast como se describe a continuacin:
56 * Las bsquedas de similaridad a travs del BLAST del NCBI se hicieron en el URL: http://www.ncbi.nim.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-blast?Jform=0
Una vez conectados a este URL se especific lo siguiente:
1. La secuencia problema (cada una de las secuencias obtenidas). 2. El programa a ejecutarse, segn sea el caso de las secuencias a comparar, entre blastp, blastn, blastx, tblastn, tblastx. (en este caso tblastn). 3. La base de datos contra la cual se desea hacer la comparacin. Se recomienda para empezar la no-redundante (nr). 4. El formato de los resultados: HTML (con lo cual aparecer el resultado en pantalla en tanto est listo) o por correo electrnico (para lo cual se especific nuestra direccin electrnica). En ambos casos, la operacin puede durar algunos minutos.
Se Introduce cada secuencia y se configuran los parmetros segn sea cada caso y se pulsa el botn Submitt Query. Con base en lo elegido en el formato del resultado, apareci el resultado en pantalla o se recibi por correo electrnico. En ambos casos, se almacenaron los resultados en un archivo local, para anlisis posteriores.
Las secuencias bajadas- de internet se cargaron en el programa Editseq de DNASTAR con el propsito de convertirlas en archivos legibles para el programa MegAlign. El programa MegAlign fue usado para alinear las diferentes secuencias obtenidas y as obtener la filogenia de tales secuencias por medio del anlisis Neighbor-Joining y bootstrapping utilizando el mtodo CLUSTAL W (Thompson et al. 1994).
57 4.14. Determinacin de la distancia gentica
Las distancias genticas fueron calculadas por el programa DNADIST en PHYLIP v. 3.5 usando el modelo de parmetro'2 de Kimura de base de substitucin. El anlisis UPGM de la distancia gentica fue tambin realizado usando el programa DNADIST con el mtodo NEIGHBOR, (Felsenstein, 1993)
4.15. Determinacin de la distancia gentica y filogenia por medio de cladogramas.
Una de las herramientas ms interesantes en el anlisis de secuencias, es el dibujo de dendogramas que permitan tener una idea relativa de las distancias y filogenia que separan a las secuencias estudiadas. En una primera instancia, se pueden dibujar dendogramas basados en el grado de similaridad entre las secuencias y un rbol filogentico podr ser dibujado al considerarse un nmero estadsticamente significativo de caracteres (que para este caso pueden ser varios nucletidos polimrficos) y contemplar otros factores como genomas completos, registros fsiles, caractersticas fenotpicas, entre otros, destacando una vez ms que, un rbol filogentico es una hiptesis que se plantea como primera aproximacin a la relacin evolutiva entre los organismos estudiados (Thompson et al. 1994).
El MegAlig, es un programa que permite entre otras cosas, calcular distancias entre caracteres y dibujar dendogramas basados en estas distancias. Para lograr esto, el MegAlig requiere como data de entrada un archivo con las distancias y relaciones entre las secuencias. Este archivo puede ser generado con herramientas de alineamiento mltiple como el CLUSTAL-W, tal como se seala en la seccin de anlisis de secuencias. En este estudio se emple el software Editseq para la generacin de cada archivo correspondiente a cada secuencia en estudio. (Thompson et al. 1994).
58 4.16. Filogenia de las secuencias obtenidas
El dendrograma fue ilustrado por MegAlign, la longitud de las secuencias, el contenido de % de GC y el nmero de diferencias de base fue calculado por EditSeq de DNASTAR 3.0. El software de estos programas est disponible de manera gratuita en Internet. (el DNASTAR no lo esta, pero los mtodos que usa como el CLUSTAL s estn en otros software de Internet), (Thompson et al. 1994).
59 V. RESULTADOS
La determinacin del modo de cmo probablemente se este realizando algn evento de especiacin en Satureja macrostema var. laevigata en el estado de Michoacn y el establecimiento de sus relaciones filogenticas fue establecido con base en la secuenciacin de sus espacios transcritos internos ITS de su ADN ribosomal, con el cual se defini que se encuentra en un proceso de especiacin rpida, hbrida o recombinacional, que se refuerza con la inferencia de sus relaciones filogenticas, las cuales se han realizado en un perodo corto de tiempo geolgico (20-30,000 aos), observndose adems en sus secuencias internas de su ADN, que se continan realizando en las plantas actuales mutaciones de punto (perdida o ganancia de una o dos bases), las cuales a menudo son suficientes para recorrer la informacin gentica y se encontr que las hay de dos tipos (transversiones: sustituciones de purina por pirimidina, y transiciones: purina por purina y pirimidina por pirimidina que son las formas ms simples de mutacin) (Ennis, 2000).
5.1. Extraccin del ADN.
La calidad del ADN genmico, aislado de tejido fresco, evaluado por electroforesis en gel de agarosa al 1.2% teido en bromuro de etidio (figura 2) result adecuada para los anlisis llevados a cabo.
La concentracin total promedio de DNA, medida con la absorbencia en un espectrofotmetro, estuvo en un rango de 102 a 900 ng/l de solucin, distribuidos de la siguiente manera: SATIB 102 ng/l, SATPA 295 ng/l, SATIN 430 ng/l y SATSJ 927 ng/pl de promedio de dos repeticiones. 60
La calidad del ADN result adecuada para los anlisis llevados a cabo. 5.5 Amplificacin.
La amplificacin de la regin de los ITS gener bandas de aproximadamente 690 pb, visualizados en un gel de agarosa al 1.2%, corrido a 80 volts por una hora, variando la intensidad de las bandas con base en su peso molecular entre los diferentes individuos representantes de poblaciones diferentes (Figura 3). Esto podra interpretarse como la variacin gentica existente entre las plantas en estudio.
61 A pesar de que en la figura 3 no todos los carriles muestran la banda correspondiente a la amplificacin de la regin ITS1-5.8s-ITS2, con los primers ITS 1-4 de aproximadamente 700 pb, s se observa que para cada "te nurite" hay por lo menos un carril con fragmento amplificado.
Los fragmentos que amplificaron fueron cortados y limpiados con GenClean, tal y como se describe en la seccin de materiales y mtodos, y secuenciados, esto es: el tratamiento de GenClean permiti obtener ADN limpio, sin residuos de carbohidratos y RNA; al ser cortados resultaron aptos para secuenciacin.
5.3. Secuencias.
La secuenciacin de los 4 fragmentos correspondientes a los ADN de diferentes plantas, se muestra en la cuadro 3. En todos los casos se obtuvieron las secuencias ITS1, 5.8S e ITS2, as como sus reversos y complementos (estos ltimos no mostrados). Cuadro 3.- Secuencias obtenidas por espcimen de Satureja macrostema con los primers ITS1-4. ITS1 SATIB (253 b) cctgcaaagcagaccgccgaacacgttcaacacaaaacccggcgccgcggagtgggggcgaccccccggccggcgtgtgcgctcgcgtcgcgtcc gtgtcggtctaacaaacttgggcgcggcgcggaatgcgcgcaaggaaatcgaaaattgagcatccccctccccagacgcgcccggttcgcgggcgac ggggagacaggatgcctatcgaaatgtctaaacgactctcggcaacggatatctggctctc ITS1 SATIN (250 b) cctgcaaagcagaccgcgaacacgttcaaacacaaaacccggcgccgcggagtgggggcgacccccccgccggcgtgtgcgctcgcgtcgcgccg tgcggtctaacaaacttgggcgcggcgcggaatgcgccaaggaaaacgaaattgagcatccccctccccgacgcgccccgttcgcggggcgacggg gagaaagggatgcctatcgaatgtctaaacgactctcggcaacggatatctcggctctc ITS1 SATPA (254 b) cctgcaaagcagaccgccgaacacgttcaacacaaaacccggcgccgcggagtgggggcgacccccccgccggcgtgtgcgctcgcgtcgcgtccg tgtcggtctaacaaacttgggcgcggcgcggaatgcgcgcaaggaaatcgaaaattgagcatccccctccccagacgcgccccgttcgcgggcgacg gggagacagggatgcctatcgaaatgtctaaacgactctcggcaacggatatctggctctc ITS1 SATSJ (252 b) cctgcaaagcagaccgccgaacacgtttcaaacacaaaacccggcgccgcggagtgggggcgacccgcccgccggcgtgtgcgctcgcgtcgcgc cgtgcggtctaacaaacttgggcgcggcgcggaatgcgccaaggaaaacgaaattagcatccccctccccgacgcgccccgttcgcggggcgacgg ggagaaagggatgcctatcgaaatgtctaaacgactctcgacaacggatatctcggctctc 5.8S SATIB (166 b)
62 Gcatcgatgaagaacgtacgaaatgcgatacttggtgtgaattgcagaatcccgtgaaccatcgagtcttagaacgcaagttgcgcccgaagccatt agcccgagggcacgcctgcctgggcgtcacgcatcgcgtcgccccctcctcccactcgactaactccgg 5.8S SATIN (166 b) gcatcgatgaagaacgtacgaaatgcgatacttggtgtgaattgcagaatcccgtgaaccatcgagtctttgaacgcaagttgcgcccgaagccatta ggccgagggcacgcctgcctgggcgtcacgcatcgcgtcgccccctcctcccactcgactaactccgg 5.8S SATPA (166 b) Gcatcgatgaagaacgtacgaaatgcgatacttggtgtgaattgcagaatcccgtgaaccatcgagtcttagaacgcaagttgcgcccgaagccatt agcccgagggcacgcctgcctgggcgtcacgcatcgcgtcgccccctcctcccactcgactaactccgg 5.8S SATSJ (166 b) gcatcgatgaagaacgtacgaaatgcgatacttggtgtgaattgcagaatcccgtgaaccatcgagtctttgaacgcaagttgcgcccgaagccatta ggccgagggcacgcctgcctgggcgtcacgcatcgcgtcgccccctcctcccactcgactaactccgg ITS2 SATIB (190 b) gagaaggcggggccggagattggccccgggccggcccaaatgcgatcctcggcggcgcacgtctcgaccagtggtggttgaacgatcaactcgc gtgctgtcgtgcctcaaggcgccgccgtcagggaaatcgaagccgtccggagaagaccgcaggacccaacggagcgatcccgcaacgctccca cga ITS2 SATIN (192 b) gggaaggcgggggcggagattggccccccgccggcccaaatgcgatcctcggcggcgcacgtcacgaccagtggtggttgaacgatcaactcgc gtgcttcgtgcctcaaggcgccgccgtcagggaaatcgaaggccgtccggagaagaccgcaaggacccaacggagcgatcgcgcatcgctccca cga ITS2 SATPA (190 b) gggaaggcggggccggagattggcccccggccggcccaaatgcgatcctcggcggcgcacgtcacgaccagtggtggttgaacgatcaactcgc gtgctgtcgtgcctcaaggcgccgccgtcagggaaatcgaagccgtccggagaagaccgcaggacccaacggagcgatcccgcaacgctccca cga ITS2 SATSJ (194 b) Gggaaggcgggggcggagattggcccccggccggcccaaatgcgatcctcggcggcgcacgtcacgaccagtggtggttgaacgatcaactcg cgtgctgtcgtgcctcaaggcgccgccgtcagggaaatcgaaggccgtccggagaaagaccgcaaggacccaacggagcgatcgcgcattcgct cccacga
La longitud de las secuencias obtenidas de la regin ITSI-5.8S-ITS2 vari de entre 658 pb para SATIN hasta 661 pb de SATPA, que indica nuevamente la variabilidad existente entre las plantas en estudio.
5.4. Recorte de secuencias
Una vez ubicado el gen 5.8S en las secuencias obtenidas se procedi a "quitar" los decmeros correspondientes a los iniciadores en los extremos 5' y 3'de cada secuencia, esto provoc una disminucin en la longitud de las secuencias, que al ser recortadas para su correcta alineacin, quedaron de la siguiente manera: SATIB 609 pb, SATIN 608 pb, SATSJ 612 pb y SATPA 610 pb, observndose que la variacin en la longitud de las cuatro secuencias vari de 608 a 612 pb.
La longitud del ITS1, 5.8S e ITS2 se observa en el cuadro 4, la variacin significativa en la longitud del ITS1 ocurri de 250 a 254 bases y la relacin G+C en 63 el ITS1 vari de 64.3 a 65.2 % con un promedio de 64.6%; La longitud del gen 5.8S fue constante en el nmero de bases de 166 pb y la relacin G+C tambin fue constante de 58.4 %, mientras que el ITS2 vari de 190 a 194 pb con una relacin G+C que vari de 67.0 a 67.9%, con un promedio de 67.5 %; mientras que el promedio de ITS1-5.8S-ITS2 vario de 63.2 a 63.8%. lo que corrobora nuevamente la variabilidad existente entre las plantas en estudio.
5.5. Alineacin
Las secuencias presentaron una longitud de 620 pb por planta (cuadro 19); comparando nicamente los ITS1 e ITS2 de la manera siguiente: la comparacin SATIN contra SATIB (cuadro 7); en el cuadro 8, SATSJ contra SATIB; en el cuadro 9, SATSJ contra SATPA; en el cuadro 10, SATIN contra SATPA; en el cuadro 11, SATIN contra SATSJ y en el cuadro 12, SATPA contra SATIB.
Cuadro 4.- Longitud del ITS1, 5.8S e ITS2; promedio y contenido de G+C.
En los cuadros 7 a 12 se presentan las secuencias ITS1 e ITS2 alineadas por planta y su comparacin entre s, marcndose los residuos comunes con una barra vertical, y donde no son comunes, es decir, que existe delecin o insercin en alguna de las secuencias se indica con rectngulos verticales de color verde o azul y con rectngulos de color rojo las mutaciones (transversiones/transiciones), las cuales se indican en los cuadros 7 a 12 en azul y violeta, observndose en el cuadro 7, tambin el uso de "palabras (una palabra es un conjunto de residuos contiguos en la misma posicin que se consideran como una unidad y su longitud es variable). 64 En el cuadro 5 se observan entre otras, las palabras; "AGA" (color rojo), que se presenta 2 veces en IN y 3 veces en IB; "AAA" (color negro), se, presenta 11 veces en SATIN y 8 veces en SATIB; "CTC" se presenta 9 veces en SATIN y 9 veces en SATIB; "CCG" se presenta 13 veces en SATIN y 13 veces en SATIB; "CGC" se presenta 18 veces en SATIN y 16 veces en SATIB, y "CG" (color violeta dentro de rombos rojos), que se presenta 62 veces en SATIN y 61 en SATIB, y que en realidad son, "motivos" es decir, series de repeticiones de secuencias cortas de nucletidos no codificantes, de los cuales no se tiene clara su origen y funcin. Su variabilidad es alta y difieren de un individuo a otro, por lo que con el anlisis de estas regiones es posible identificar individuos.
En el cuadro 6 se observa el nmero y porcentaje de purinas (adeninastiminas) y piridiminas (citosinas-guaninas), de SATIN-SATIB y SATSJ-SATPA.
Cuadro 5.- Nmero de veces que aparecen las "palabras" formadas por trinucletidos y dinucletidos en los ITS1 e ITS2 al comparar SATIN contra SATIB.
observndose que el nmero de Adeninas, Timinas, Guaninas y Citocinas es muy variable por ITS, pero se acenta ms en los ITSI-ITS2 de PA, sin embargo en cuanto a porcentaje son muy similares. La relacin GC vari de 63.3 a 67.9 %. Lo anterior permite establecer diferencias entre las secuencias, las cuales al analizarse por su distancia gentica permiten establecer sus divergencias y similitudes. 65 En los cuadros 11 y 12 se observa que precisamente el mayor porcentaje de emparejamiento de las secuencias se da entre las plantas ms estrechamente relacionadas de acuerdo al rbol filogentico resultante, tenindose para la relacin SATIN-SATSJ un 97 y 98 % de emparejamiento de bases en sus ITS1 e ITS2 respectivamente y un nmero de solo 9 mutaciones de nucletidos; mientras que la relacin SATPA-SATIB muestra un 98% de emparejamiento y tan solo 6 cambios, lo que define ms lo estrechamente relacionados que se encuentran. Sin embargo dichos cambios son indicadores de un probable evento de especiacin y el rbol generado a partir de estos datos es indicativo de ello, al separar a las plantas en estudio como descendientes de un ancestro comn.
Cuadro 6.- Nmero y porcentaje de purinas (adeninas-timinas) y piridiminas (citosinas-guaninas), de SATIN-SATIB y SATSJ-SATPA.
A % T % G % C % G+C ITS 1 I N 54 21.6 33 13.2 78 31.2 85 34 65.2 ITS2 IN 39 20.3 23 12 67 34.9 63 32.8 67.7 TOTAL 93 21 56 12.7 145 32.8 148 33.5 63.3 ITS1 IB 54 21.3 36 14.2 79 31.2 84 33.3 64.4 ITS2 IB 39 20.5 23 12.1 65 34.2 63 33.2 67.4 TOTAL 93 21 59 13.3 144 32.5 147 33.2 65.7 ITS1 SJ 56 22.2 34 13.5 77 30.6 85 33.7 64.3 ITS2 SJ 39 20.5 22 11.6 65 34.2 64 33.7 67.9 TOTAL 95 21.5 56 12.7 142 32.1 149 33.7 65.8 ITS1 PA 39 17.9 39 17.9 66 30.3 74 33.9 64.2 ITS2 PA 40 20.6 24 12.4 68 35 62 32 67 TOTAL 79 19.2 63 15.3 134 32.5 136 33 65.5
66 67 68
69
70 71
72 En el cuadro 13 se observa, el por ciento de emparejamiento con respecto a la secuencia consenso resultante de alinear todas las secuencias, y el nmero de deleciones, mutaciones e inserciones por comparacin; aclarando que la primera Cuadro 13.-Porcentaje de emparejamiento, alineamiento, deleciones, inserciones y mutaciones (transversiones y transiciones)
0 % de emparejamiento y alineamiento. D= delecin. M= mutacin. 1= insercin.
73 columna de deleciones siempre pertenece a la primera planta en comparacin y la segunda delecion pertenece a la segunda planta en comparacin.
Por otro lado, en el cuadro 14 se observan los sitios en los cuales se presentaron mutaciones puntuales de tipo transversin (purina por pirimidina) y transicin (purina por purina pirimidina por pirimidina), por ITS, observndose para la comparacin SATIN-SATIB, 11 sitios polimrficos de los cuales 4 estn en ITS1 y 7 en el ITS2, tratndose por. lo tanto de las plantas ms divergentes y ms distantes, siguindole en ese orden la relacin SATSJ-SATPA con 6 sitios polimrficos, que permiten establecerse como especies derivadas de un ancestro comn de acuerdo al rbol filogentico resultante (figura 6). Cuadro 14.- Tipo de mutacin (transversin-transicin) y su nmero de sitio por ITS.
Nmero de sitio Tipo de transversin Tipo de transicin 70 CxG 145 AxT ITS 1 SATIN-SATIB 180 C x G 202 A x C 2 GxA 13 GxC 28 CxG ITS2 SATIN-SATIB 29 C x G 64 AxT 176 G x C 181 TxA 67 GxC ITS1 SATSJ-SATPA 146 A x T 203 A x C 238 A x G ITS2 SATSJ-SATPA 13 G x C 177 GxC 74 En el cuadro15 se observa el reporte de alineamiento del gen 5.8S de las cuatro plantas de Satureja macrostema, observndose, como se esperaba, que se trata de una regin conservada, con excepcin de los sitios 71 y 100 (rombo color violeta) en los cuales se observan inserciones de Adenina y Citosina respectivamente y solamente presentes en el gen de las plantas correspondientes a SATIB y SATPA.
En el rbol filogentico (figura 4), obtenido para este gen 5.8S con ClustalW y Jotun Hein, se observan los mismos valores de similaridad y divergencia de 98.8 y 100% y 1.2 respectivamente (Cuadro 16), separando en dos pares de clados a cada una las secuencias obtenidas.
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En el cuadro 17 se observa el reporte del alineamiento del ITS1 de las cuatro plantas de Satureja, en el cual existen 20 sitios polimrficos, mientras que en el cuadro 18 se observa el alineamiento del ITS2 de las cuatro plantas de Satureja en el cual solo existen 11 sitios polimrficos lo que manifiesta la variabilidad gentica entre las plantas en estudio, mostrando un mayor polimorfismo los ITS1 uno que los ITS2.
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En el cuadro 19 se reporta el alineamiento de la regin ITS1-5.8s-ITS2 de Satureja macrostema, en el cual se observan los mismos cambios descritos anteriormente de el ITS1 e ITS2 con la nica salvedad de que el nmero de sitio cambia, ya que se inserto el gene 5.8S el cual muestra cambios de recorte por motivo de lograrse el mejor alineamiento posible, de tal manera que en el sitio 265 existe delecin de Guanina en SATIN, SATPA e SATIB y en el sitio 278 existe delecin de Guanina en SATPA e SATIB que no aparecen en el alineamiento del 5.8S; en el sitio 331 y 360 se observan las transversiones correspondientes a los sitios 71.
Tambin en el cuadro 19 se observa el alineamiento de las secuencias de las cuatro plantas en estudio, detectndose un total de 36 sitios polimrficos, de los cuales algunos son coincidentes, los coincidentes son regiones de variacin de 77 reciente aparicin y donde seguramente sigue el evento de divergencia/especiacion, y por tanto las no coincidentes son regiones conservadas que, s presentan un cambio, este debe tener mayor tiempo; por planta se tienen las siguientes mutaciones: 8 para SATSJ; 5 para SATPA; 4 para SATIN y 10 para SATIB; los Indels (deleciones/inserciones) se consideraron aparte debido a que estos son necesarios solo para lograr la mejor alineacin y lograr obtener el rbol ms parsimonioso y para SATI B se necesitaron 11; para SATI N, 12; para SATPA, 11; y para SATSJ, 7, de tal manera que SATSJ necesito menor nmero de Indels ya que sus secuencias tienen mayor nmero de bases (612), mientras que las secuencias de menor nmero de bases (SATIB-SATPA) de 609 y 608 pares de bases necesitaron el mismo nmero de Indels y SATIN fue el que necesit mayor numero (12) porque es el que tiene el menor nmero de bases (608). En la figura 5 se observan los rboles resultantes de este alineamiento y en el cuadro 20 sus porcientos de similaridad y divergencia.
78
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80 5.7. Comparacin con algunos Gneros de la misma Familia.
En el cuadro 21, se aprecia la comparacin de las plantas de Satureja macrostema contra siete especies de otros gneros de la misma familia y Heliopsis longipes como organismo externo (familia Asteraceae) y son; Faradaja Iehuentei; Ipomea pestidigris; Nepeta sibirica; Oxera rugosa; Oxera vanuctensis; Sideritis algarviensis y Stachys hirta. Al comparar las plantas de Satureja con otras especies de otros gneros de la misma familia y con Helipss longipes como organismo externo para comparacin; se observan bsicamente las inserciones, deleciones y mutaciones descritas anteriormente en Satureja, pero adems, un mayor nmero de Indels que son necesarios para alinear satisfactoriamente a todas las secuencias, observndose en los sitios 14 y 15 deleciones en todas las especies excepto en Heliopsis longipes; lo que sugiere que esta ausencia de bases es caracterstica de la familia Lamiaceae; en el sitio 20 sucede lo mismo; en los sitios 53 y 54 hay dos deleciones en todas las especies excepto en Heliopsis longipes; en los sitios 68 a 73 sucede lo mismo; en los sitios 78 al 82 hay delecin en Satureja lo que sugiere que esta ausencia de bases puede ser caracterstica del gnero Satureja; en los sitios 98 y 99 hay delecin en todas las especies excepto en Heliopsis longipes; en los sitios 112 a 120 se observa lo mismo; igualmente en los sitios 147 a 149; en el sitio 167 se observa insercin de Guanina solo en IB y PA.
En el sitio 201 a 205 se observa la palabra "AGACG" en SATIB y SATPA y la palabra "GACD" en SATIN y SATSJ que puede ser utilizada como marcador especifico para las especies de Satureja y para elaborar uprimers de las mismas; lo mismo sucede con la palabra "AGA" del lugar 222 a 224, caracterstico de Satureja; en el sitio 452 al 454 se observa la palabra "ACT" caracterstico solo de Satureja; en los sitios 487 al 505 se observan deleciones muy particulares solo de las Satureja en los sitios 603 al 606 se presenta la palabra "TCAG" solo en Satureja; en el sitio 600 al 604 se presenta la palabra "AATCG" solo en Satureja; en el sitio 523 al 527 se observa la palabra "TCCGG" solo en Satureja; en el sitio 529 al 531 se observa la palabra "GAA" solo en Satureja; la palabra "GA" se 81 observa solo en Satureja en los sitios 633 a 634; "CG" en los sitios 636 a 637; en los sitios 644 al 649 se observa la palabra "ACCCAA" solo en Satureja.
En los sitios 652 al 654 y 656 al 658, se observan las palabras "GAG" y "GAT" respectivamente y en los sitios 662 al 665 las palabras "GCAA" para IB Y PA y las palabras "GCAT' para SATIN y SATSJ; estas ltimas pueden ser utilizadas para la identificacin de la Satureja SATPA-SATIB y SATIN-SATSJ especficamente. Las palabras anteriores sirven para identificar exclusivamente a Satureja, y se encuentran dentro del cuadro de color violeta.
En el cuadro 22, se observan los porcentajes de similitud (97.5 y 93.6%) entre las plantas de Satureja comparadas, observndose que las de mayor porcentaje corresponden precisamente a las ms estrechamente relacionadas de acuerdo con el fenograma de la figura 6, adems de que las mismas plantas (SATPA-SATIB y SATIN-SATSJ) respectivamente, tambin muestran los porcientos de divergencia entre ellas solo en una cantidad menor de (0.7 y 0.5%), corroborndose lo estrechamente relacionadas que se encuentran. Tambin se observan los porcentajes entre Satureja al compararse contra otras ocho especies de otros gneros de la misma familia Labiatae, usando a Ipomea y a Heliopsis como grupos externos.
Es necesario sealar que entre ms especies sean comparadas ms se fortalecer el rbol filogentico resultante, ya que la secuencia consenso es la mas cercana al origen, hasta completar el Arbol de la vida.
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83 5.7 Dendrogramas.
El rbol filognetico obtenido con base en las secuencias reportadas en el cuadro 21, de acuerdo al programa MegAling y bajo el mtodo de Clustal, se muestra en la Figura 6, en el cual se observa con ms claridad la distancia gentica y la filogenia entre las diferentes especies y en la figura 7 el cladograma resultante.
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5.8 Nmeros de accesin en el GenBank
Las secuencias generadas en el presente estudio fueron enviadas para ser indexadas al GenBank (NCBI, USA) por medio del software Sequin y en respuesta se les dieron los nmeros de accesin que abajo se describen y aparecieron en el mes de mayo del 2002, y se encuentran en la Web para su uso y consulta a partir del 6 de mayo de 2002.
Nmeros de accesin. AY094152 al ITS1 de SATIB, AY094153 al ITS2 de SATIB AY094154 al ITS1 de SATIN, AY094155 al ITS2 de SATIN AY094156 al ITS1 de SATPA, AY094157 al ITS2 de SATPA AY094158 al ITS1 de SATSJ, AY094159 al ITS2 de SATSJ
85 VI. DISCUSIN
Uno de los principios centrales en biologa evolutiva sostiene que toda la biodiversidad comparte una historia evolutiva comn; esto significa que existe una sola genealoga para todos los organismos y todos los individuos existentes y extintos estn unidos por relaciones de descendencia en un patrn jerrquico de grupos anidados en otros grupos ms inclusivos (Wiley, 1981).
De acuerdo con Dobzhanzky (1982), la evolucin consiste en una serie de de transformaciones parciales o completas e irreversibles de la composicin gentica de las poblaciones, basadas principalmente en interacciones con el ambiente, mientras que actualmente Eldredge y Gould (1972), postulan en su teora del equilibrio puntuado, que la anagnesis (los cambios morfolgicos experimentados por un mismo linaje) y la cladognesis (la divi sin de una especie en dos) estn relacionadas, y mantienen adems, que se da una breve aceleracin del cambio morfolgico precisamente cuando una poblacin de censo reducido diverge de su especie original para formar otra nueva, con largos periodos de rpida especiacin (surgimiento de una o ms especies). Estos periodos de rpida especiacin pueden ser causados por grandes cambios en el ambiente, cuando se rompe el equilibrio por la acumulacin de mutaciones. La nocin contraria, que los puntualistas atribuyen a la teora sinttica, consiste en que el cambio morfolgico gradual lleva consigo su divisin en razas y subespecies mucho antes de que pueda afirmarse que han surgido especies nuevas.
Por otro lado, la especiacin hbrida o "recombinacional" se refiere al origen de nuevas especies va hibridacin entre especies paternales divergentes cromosmica o genticamente y de acuerdo con los estudios de simulacin realizados por Ungerer et. al., (1998), sugieren que este tipo de especiacin es puntuado, es decir con largos perodos de estasis, en los cuales la mayora de las especies no exhibe cambio direccional alguno durante sus estancia, seguido por abruptas transiciones en las 86 cuales las especies paternales individuales son desplazadas rpidamente por las neoespecies hbridas (McCarthy, 1995; Ungerer et al., 1998).
Con base en los resultados obtenidos en el presente estudio, se sugiere que el tipo de especiacin presente en Satureja macrostema var. laevigata es recombinacional de tipo puntuado, y sus relaciones filogeneticas tambin apoyan esta sugerencia ya que los perodos de divergencia entre las plantas en estudio es de relativamente pocos aos, que podran ser insignificantes respecto al tiempo geolgico, lo que sugiere que actualmente esta ocurriendo una especiacin rpida en esta especie.
Con la determinacin de la variabilidad genmica de S. macrostema por medio de un anlisis filogentico, utilizando para ello los genes ribosomales y sus espaciadores, fue posible detectar las regiones variables informativas, los marcadores moleculares para la identificacin y resolucin entre diferentes especimenes de S. macrostema a distintos niveles, la filogenia, sus relaciones de parentesco y el tipo de especiacin.
Con relacin a la regin de los ITS, sta ha sido considerada como una fuente muy til de caracteres para estudios filogenticos en angiospermas (Baldwin et al., 1998), dado que los ITS se encuentran altamente representados en el genoma y se pueden amplificar con cantidades pequeas de ADN (White et al., 1990) En este estudio, cantidades tan pequeas como 100 a 300 ng/ml resultaron adecuadas para la amplificacin de los ITS.
Las secuencias altamente conservadas dentro de la mayora de los genes del nrADN son muy tiles en el diseo de oligonucletidos (iniciadores) "universales", lo que facilita la amplificacin de los ITS mediante el uso de la reaccin en cadena de la polmerasa (PCR) (Thompson, et al., 1997). Los espaciadores internos transcritos son la parte ms variable de la regin de los ITS, debido a que se encuentran flanqueando a la subunidad 5.8S, que es ms conservada y se posibilita la alineacin
87 no ambigua de esta regin (Walsh, et al., 1997). El hecho de que se presenten cientos de copias por clula de los nrDNA, facilita su amplificacin con los iniciadores especficos, por esta razn la amplificacin de la regin ITS1-5.8s-ITS2 por medio de los iniciadores especficos ITS1 e ITS4 se llev a cabo sin dificultad, una vez encontradas las condiciones adecuadas para la reaccin en cadena de la polimerasa.
Hershkovitz y Zimmer (1996) proponen que el espaciador ITS2, contiene la informacin suficiente para diagnosticar linajes a diferentes niveles jerrquicos y argumentan que el anlisis de la composicin de las bases muestra que el ITS2 de las angiospermas es rico en GC, lo cual coincide con lo encontrado en las secuencias de este trabajo; no as la proporcin de Timina, la cual mencionan estos autores como muy variable. La situacin anterior est ausente en Satureja en donde la proporcin de timina se comporta de manera constante (cuadro 6). Los autores antes sealados proponen como modelo general al ITS2 de angiospermas, sin embargo, lo encontrado en Satureja y los ITSs2 de las plantas con las que se compararon (cuadro 7) se concluye que no se puede generalizar su uso, al menos es inadecuado para las especies aqu reportadas.
Por otro lado, con la utilizacin de algoritmos estndares para la comparacin de las secuencias obtenidas en aquellos segmentos de alta similitud se logr un correcto alineamiento de las mismas. El alineamiento es una herramienta cualitativa que permite dar los primeros pasos hacia la conclusin de que dos o ms secuencias son homlogas; permitiendo detectar el polimorfismo presente (Swofford, 1999). Todo esto con la finalidad de realizar los anlisis relacionados con el ensamblaje, edicin, alineamiento global, bsqueda de secuencias homlogas, relaciones filogenticas, deteccin de motivos, (series de repeticiones de secuencias cortas de nucletidos), anlisis de uso de codones, comparacin de la secuencia problema con las publicadas en las bases de datos, (Genebank), etc. (Panero, et al., 1999), como se observa en el cuadro 7.
88 Esta tcnica, aparentemente sencilla se hace ms compleja en la medida en que el tamao de las secuencias a comparar es mayor y, ms an, cuando se comparan ms de dos secuencias. Por ello se emplean computadores y distintos programas que dadas las secuencias, generan el mejor alineamiento, y por lo tanto resultados ms confiables (Panero, et al., 1997).
Los resultados obtenidos de divergencia y disimilitud, sugieren que hay al menos dos especies estrechamente relacionadas SATPA-SATIB e SATIN-SATSJ, lo cual se corrobora con los valores del cuadro 15 y figura 4, donde se observa que las secuencias de SATPA-SATIB e SATIN-SATSJ son en este gene 5.8S, 100 similares, mientras que SATIN-SATIB, SATIN-SATPA y SATSJ-SATPA son solamente similares en 98.8 % y 1.2 % divergentes, valor suficiente para algunos autores para considerarlas como especies diferentes, ya que el 5.8S es un gen altamente conservado y la mas mnima variacin representa gran variabilidad gentica (Panero, et al., 1999).
Se destaca el hecho de que al comparar las 4 secuencias de 166 bases del gen 5.8S se observen solo dos cambios de bases, ya que las secuencias de SATIB y SATPA, as como SATSJ-SATIN son idnticas, y los dos cambios detectados entre estos dos pares de secuencias son, que mientras las secuencias de SATIN y SATSJ presentan una Timina en la posicin 71, IB y PA presentan la base complementaria Adenina; el otro cambio se da en la posicin 100 con una Citosina en las secuencias de SATIB y SATPA mientras que SATIN y SATSJ presentan la complementaria Guanina.
Si se toma como base este argumento se tienen dos especies diferentes, lo cual se refleja en variabilidad gentica observada que manifiesta Cladognesis y cuya principal evidencia de especiacin es el cambio en la composicin gentica observada en los ITS de S. macrostema, y principalmente en el gen 5.8S que es una secuencia altamente conservada, donde la primera esta formada por las plantas de SATPA, al presentar entre ellas exactamente la misma secuencia en el gen 5.8S; y la
89 segunda formada por las plantas de SATIN y SATSJ que de igual manera presentan entre ellas la misma secuencia. Hay que hacer notar que al alinear las cuatro secuencias en el MegAling la secuencia consenso resultante es idntica a las secuencias SATIN y SATSJ, por lo que se puede argumentar que esta es la especie ms ancestral y que SATIB y SATPA forman una especie de ms reciente aparicin, lo cual se corrobora con lo observado en los rboles filogenticos (figura 5)
Con los datos obtenidos de la secuencia del gen 5.8S donde se define la existencia de dos especies, se puede argumentar que de estas dos especies la ms ancestral es la especie SATIN y la ms reciente es SATIB. A su vez la ms ancestral (SATIN) da origen a SATSJ y SATPA que origina a SATIB. Tanto SATSJ como SATIB se pueden considerar como subespecies, pues con base al gen 5.8S, SATSJ es idntico a SATIN, y SATIB es igual a SATPA; donde ocurre variacin es en los ITSs, tanto en el ITS1 como el ITS2. Esta variacin, al considerarla globalmente, arroja una disimilitud de 0.5% entre SATIN y SATSJ y de 0.7% entre SATPA y SATIB, valores entre el 0.5% y 1 % que es rango comn considerado para subespecies en angiospermas (Urbatch, et al., 1997).
(Urbatch, et al., 1997) considera un mximo de 1 % de disimilaridad entre taxa de la misma especie, valores mayores de hasta 5 % de disimilaridad se pueden considerar especies diferentes y valores superiores indican gneros diferentes (Urbatch, et al., 1997). Por otro lado, el rango de subespecies esta entre los valores entre 0.5 y 1 % de disimilaridad y valores menores a 0.5% de disimilaridad son variedades o isoformas.
El anlisis de tales secuencias est siendo empleado por algunos investigadores para construir nuevos rboles filogenticos en una gran diversidad de especies, lo que est revolucionando la sistemtica de los organismos vivos.
90 Se considera que el gen 5.8s es una secuencia altamente conservada, por lo que ligeras variaciones en su secuencia pueden interpretarse como especies diferentes (Panero, et al., 1999).
La filogenia obtenida se presenta de la siguiente manera: como se observa en el rbol filogentico de la figura 4 del gen 5.8s, se infiere que de un ancestro comn, que representa la secuencia concenso, se originaron las dos lneas de descendencia hace aproximadamente 20,000 aos, ya que segn Scrotch (1996), se considera que un cambio de base en el gen 5,8S refleja un aproximado promedio de divergencia de 10,000 aos y en los ITS1 e ITS2 dependiendo del lugar varia entre 1000 y 5000 aos, en angiospermas.
Para determinar la divergencia de cada lnea hay que recurrir a la variabilidad observada en los ITS1 e ITS2. De esta manera la primera lnea form un ancestro, que dio origen a SATIN. Siendo SATIN la que presenta la secuencia ms similar a ese ancestro comn, e hipotticamente esto ocurri hace aproximadamente 30,000 aos por lo que aparece ms cercano a la raz del rbol. SATSJ presenta mayor disimilitud con ese ancestro comn por lo que aparece mas alejada de la raz y sera un derivado de SATIN, evento que podra haber ocurrido hace aproximadamente "18,750" aos, ya que entre SATIN y SATSJ hay una distancia de 11,250 aos. Estos valores se calculan teniendo el nmero total de cambios del ITS1 e ITS2 de la especie de mas reciente aparicin (SATIB), contra la secuencia en dilema SATIN.
Para lograr lo anterior se desarroll la siguiente frmula matemtica: D=(n12)(p) Donde: d= distancia gentica en aos n= nmero total de diferencias de nucletidos entre dos secuencias p= promedio en aos del rango de sustitucin de nucletidos
Con base en lo anterior, las relaciones que se establecen entre las especies se observan de manera aproximada en la figura 8, estos valores concuerdan de 91
manera aproximada con los valores obtenidos en la variabiliad del 5.8S (dos bases = a 20, 000 aos). Ya que la aparicin de SATSJ probablemente ocurri hace aproximadamente 18,750 aos y la de SATPA hace aproximadamente 22,500 aos.
As, si el ancestro que dio origen a Satureja spp. surgi hace ms de 30,000 aos. Este divergi y dio origen a dos especies: Una linea se dividi hace 30,000 92 aos dando origen por un lado a la especie SATIN, que mantuvo el linaje del ancestro de Satureja, y por otro lado dio origen a la subespecie, en posible proceso de especiacin, a SATSJ. La otra linea divergi hace 22,500 aos, dando origen a la especie SATPA; actualmente esta especie presenta un notable evento de especiacin que se manifiesta en la aparicin hace aproximadamente 15,000 aos, de su subespecie SATI B.
La figura 7 muestra la estrecha relacin entre SATIN y SATSJ y entre SATPA y SATIB, grficamente se observa la naturalidad con que estos taxa pueden estar hibridizados, lo cual es evidenciado tambin por la existencia de algunos ejemplares que no pueden ser clasificados como S. macrostema var. laevigata, pero que segn la clave pertenecen a esta variedad, a pesar de no poderse identificar completamente como tal, dadas las caractersticas morfolgicas diferentes reportadas por Aguilar (2001). La figura 7 muestra claramente la diferenciacin en dos "especies", SATIN y SATPA, lo que se apoya con las diferencias encontradas en el gene 5.8s, lo cual no coincide con la clave morfolgica de satureja, ya que esta indica que se trata de una sola variedad (laevigata). La misma figura 7 muestra que SATSJ y SATIB podran haber evolucionado a partir de SATIN y SATPA respectivamente. El anlisis de los sitios polimrficos como se mostr arriba tambin conduce a esta conclusin.
Por lo tanto, se argumenta que se tienen dos especies con base a las diferencias del gen 5.8s y son: SATIN y SATPA; la especie SATIN tiene una subespecie que es SATSJ y SATPA tambin tiene una subespecie SATIB, Con los datos observados en el rbol filogentico se resume tericamente que la especie SATIN es la ms ancestral; en ella esta ocurriendo un evento de especiacin que da origen a la subespecie SATSJ, tanto la especie SATIN como la subespecie SATSJ se encuentran en la actualidad; SATSJ por el mayor nmero de cambios esta divergiendo a mayor velocidad que SATIN, lo que sugiere una especiacin rpida de tipo puntuado (Eldredge y Gould, 1972).
93 De acuerdo con el cladograma de la figura 7, la especie SATPA es la de mas reciente aparicin; en ella tambin esta ocurriendo un evento de especiacin que da por origen a la subespecie SATIB, en esta subespecie el proceso de especiacin es mas dinmico que el de la subespecie SATSJ, ya que es la que presenta mayor disimilitud con el ancestro comn (secuencia consenso); tanto la especie SATPA como la subespecie SATIB se encuentran en la actualidad; SATIB es el taxa que presenta la mayor divergencia con respecto al ancestro comn. Esto sugiere que s entre las plantas de Satureja se llevan a cabo procesos de hibridacin, estos estaran ocurriendo, seguramente, entre la subespecie SATSJ y su especie SATIN. Esta hibridacin, y por tanto flujo gentico entre las plantas en estudio, explicara la estabilidad y similitud de secuencias que a pesar del tiempo, y por tanto eventos de diversificacin gentica, mantiene a las secuencias altamente similares y homogneas (Avise, 1994).
Para el caso de SATPA se encuentra, evolutivamente hablando, en un punto intermedio, ya que presenta similaridades genticas con los dems taxa y presenta un gene 5.8S idntico al de SATIB (misma especie), pero sus ITSs son variables y al comparar sus secuencias, SATPA mantiene mas similaridad con el ancestro comn (secuencia consenso) que SATIB, lo que acerca ms a SATPA a dicho ancestro. SATIN y SATSJ son las que ms se parecen a tal ancestro.
Por otro lado, las plantas en estudio presentan divergencia molecular en sus secuencias ITS de su ADN, para considerarlas como especies (figura 7); SATIN con respecto a SATIB presenta 24 cambios; SATSJ-SATIB presenta 26 cambios; SATINSATPA=18; SATSJ-SATPA=20; y los de ms ntima relacin; SATIN-SATSJ =9 cambios y SATPA-SATIB solamente 6 cambios; y es en estas dos ltimas relaciones donde surge el dilema cuntas diferencias de nucletidos se requieren para confirmar la distincin entre especies?; de acuerdo con Dubouzet y Shinoda (1999), menos de 7 cambios son suficientes para caracterizar a las subespecies y es el caso de las relaciones ms ntimamente relacionadas SATIN-SATSJ y SATPA-SATIB; ya que se infiere que SATSJ y SATIB son subespecies de SATIN y SATPA, sin 94 embargo la evidencia molecular apoya la hiptesis de que se les puede calificar como especies independientes, derivadas de SATIN y SATPA y no como subespecies. Leclerc (1997), encontr que en Fucus (Phaeophyceae) dos especies se diferenciaron por solamente cinco nucletidos.
En otros resultados, al efectuar, la alineacin de la secuencia del gen 5.8S de S. macrostema la cual se realiz por comparacin de 32 secuencias similares de Lamiaceae reportadas en el GenBank usando el programa BLAST del GenBank. Los resultados obtenidos la distancia gentica (que es una medida del nmero medio de sustituciones de codones por locus gnico, electroforticamente detectables, que se han acumulado desde que dos poblaciones se han hecho divergentes a partir de un antepasado comn (Dobzhsansky, 1980), observada en este estudio, los porcientos de similaridad y divergencia que se dan entre las diferentes secuencias, obtenidas sobre la base del total de cambios (deleciones, mutaciones, inserciones, etc) variaron (cuadro 22). Los valores observados son de 93.6 % para SATIN-SATSJ y 97.5% de similaridad para SATPA-SATIB que son las plantas mas similares o menos divergentes; mientras que las ms divergentes SATSJ-SATIB muestran (82.9%); SATIN-SATIB (84.4%); SATSJ-SATPA (85.4%); e SATIN-SATPA (86.8%).
Al observar los datos del cuadro 22 se puede detectar cmo se refleja en el rbol, las dos especies y su respectiva subespecie de Satureja bien definidas, incluso en este rbol, el ancestro que dio origen a cada subespecie es prcticamente la misma especie, esto es, que SATIN dio origen a SATSJ y SATPA a SATIB.
Al analizar el cuadro de los valores de divergencia, se observa que son de 0.5 entre SATIN y SATSJ y de 0.7 entre SATPA e SATIB, rangos, que a pesar de integrar otros gneros y varias las secuencias consenso, se mantiene, aun dentro de los valores considerados para una misma especie, sin embargo al comparar SATIN y SATPA (que son las especies) su valor de divergencia es de 1.2 valor suficiente para considerarlas como especies diferentes. Este ltimo valor se encuentra en el rango de 1 a 5 considerado para especies de un mismo gnero (Avise, 1994). De hecho es 95 menor al observado entre las dos especies de Oxera donde el valor de divergencia es de 2.2.
A pesar de que SATIN y SATSJ surgieron primero evolutivamente hablando, primero hace 30,000 aos que SATPA y SATIB (figura 7), mantienen desde su surgimiento solo un 0.5% de disimilitud; caso contrario, el valor de disimilitud mayor observado entre SATPA y SATIB (cuadro 22) es de 0.7% y el que SATIB sea el taxa de mas reciente aparicin (15,000 aos) indica que est en un proceso dinmico de especiacn, ajeno a los dems taxa de Satureja estudiados. Esto se corrobora en la alta cantidad de sitios polimrficos en los ITSs de este taxn con respecto a los dems.
En las secuencias obtenidas se lograron detectar diversos puntos. El primero destaca que la cantidad promedio de G y C observada entre todas y cada una de las secuencias fue del 67%, lo que corresponde con lo reportado por Maxam y Col. (1977) que han encontrado que la relacin de adenina a timina, y la relacin de guanina a citosina, estn siempre muy cerca de la unidad para el cido- cido y de esta relacin el total de G/C es cercano al 60-70 % y de A/T del 30-40%. Lo que significa que la relacin G/C esta dentro de los parmetros esperados, lo que corrobora que la amplificacin de las secuencias fue correcta y que no fue debida a polimerizaciones de los "primers" que suelen ser comunes y que cuando se presentan reflejan un valor menor al 60% de G/C.
El segundo punto destacable es que observndose las denominadas "palabras" o "motivos" (series de repeticiones de secuencias cortas de nucletidos), se observa que varias de estas repeticiones son muy caractersticas y muy especficas para elaborar "primers" de identificacin al separar claramente al gnero Satureja de los otros gneros, as como a los taxa en estudio, es decir, se podr lograr la identificacin rpida de los taxa con tan solo utilizar su marcador especifico o huella gentica.
96 Por otro lado, el polimorfismo observado se manifiesta de manera especfica; en el ITS1 de SATIN-SATIB (cuadro 7), donde se tuvieron 15 sitios polimrficos coincidentes y en el ITS2 hubo 9; en la comparacin SATSJ-SATPA, se tuvieron 14 sitios polimrficos coincidentes en el ITS1 y 6 en el ITS2; el mayor nmero de deleciones, mutaciones, inserciones (cambios)_ (cuadro 6) se encontr al comparar las plantas SJ-IB, con 7 deleciones en SJ y 26 cambios en SATIB; SATIN-SATIB (724); SATSJ-SATPA (6-20); SATIN-SATPA (7-18); SATIN-SATSJ (5-9) y SATPASATIB (0-6), coincidiendo la mayor variabilidad entre las ms ancestrales contra las ms recientes y observndose los menores cambios entre las ms estrechamente relacionadas.
Para confirmar de manera ms especfica la variabilidad existente entre los taxa en estudio, se, recurri al programa RNA draw 1.1 (http://isis.cbg.ipn.mx/down tools/Rnadraw.html) para realizar el ejercicio de visualizar la prediccin del posible RNAm que se formara si las secuencias codificaran, tal como se observa en la figura 9. En dicha figura se observan las diferencias entre las secuencias de los ITSs y se plantea la posible estructura terciaria; aunque los ITSs no son secuencias que transcriben, por lo que la prediccin de su estructura terciaria (RNAm), es hipottica y nicamente se usa con fines didcticos para visualizar de manera ms sencilla, las diferencias encontradas entre las secuencias en estudio. El RNA draw tiene la capacidad de representar cualquier secuencia en forma de RNAm, prediciendo la estructura ms estable posible desde un punto de vista molecular y de mxima estabilidad.
En la figura 9 se observa que la estructura terciaria del SATIN es muy similar a la de SATSJ, lo que corresponde a la secuencia nucleotdica observada y de donde se sugiere que SATSJ desciende de SATIN. Un caso similar es el de SATPA y SATIB donde tambin la secuencia nucleotdica evidencia que SATIB proviene de SATPA y esto se refuerza al observar la figura 9, donde SATPA y SATIB presentan una estructura casi idntica. Si se considera al tiempo evolutivo deducido con base en las secuencias nucleotdicas es de esperar mayor similitud en estructura terciaria 97
98 entre SATPA y SATIB que entre SATIN y SATSJ, ya que los primeros son de ms reciente aparicin y su posible estructura tendra, en teora menos tiempo para adquirir caractersticas estructurales diferentes.
Para el caso de las estructuras correspondientes a los ITS2 se observa el mismo patrn de similitud entre SATIN y SATSJ y entre SATPA y SATIB, sin embargo a diferencia de los ITS1, donde se observa una notable diferencia estructural entre las figuras de sus ITS, en las figuras de los ITS2 se observa una estructura ms consistente y menos variable entre si.
Es necesario sealar que las mutaciones observadas corresponden a mutaciones gnicas o puntuales, las cuales se producen espontneamente, es decir, son debidas a causas naturales, No obstante, la frecuencia de incidencia de las mutaciones puntuales puede aumentar por exposicin a radiaciones de alta frecuencia y por tratamiento con una variedad de sustancias qumicas denominadas mutgenos (Cupples, 2001). Una mutacin puntual se produce cuando un nucletido es alterado y la nueva secuencia de nucletidos pasa a la progenie (Johnston, 1999). El cambio puede ser debido a la sustitucin de uno o ms nucletidos por otros o a la adicin o delecin de uno o ms nucletidos y las sustituciones que tienen lugar en la secuencia de nucletidos del ADN de un gen estructural pueden dar como resultado cambios en la secuencia de aminocidos del polipptido codificado por el gen, si bien ste no es siempre el caso debido al carcter degenerado del cdigo gentico. Por ejemplo si se considera el triplete del ADN TCG (que corresponde a AGC en el RNA mensajero) que codifica el aminocido serina. Si el tercer nucletido cambia y pasa a ser A (U en el RNAm), el triplte seguir codificando la serina; pero si cambia y pasa a ser C, el codn resultante (TCC en el ADN, AGG en el RNAm) codificar, en cambio, la arginina ((Cupples, 2001).
De acuerdo con Ennis (2000) y Cupples (2001), las sustituciones de punto ms simples son las llamadas transiciones y transversiones. Las primeras son sustituciones de una pirimidina por otra pirimidina (T o C) o una purina por otra purina 99 (A o G) y las transversiones que tambin son relativamente sencillas y que consisten en el reemplazo de una purina (A o G) por una pirimidina (T o C), como las encontradas en S. macrostema (cuadro 14)
Sin embargo, Knight (2002), menciona que actualmente y aunque todava son los das tempranos de la nueva biologa, las comparaciones de sucesiones de las especies diferentes sugieren que los eventos como los estallidos de actividad de "genes saltadores", duplicaciones genticas y fusiones del cromosoma juegan un papel importante en la evolucin y Los elementos mviles conocidos como transposons estn entre las fuerzas ms poderosas que forman la evolucin del cromosoma. stos "genes saltadores' llevan las instrucciones para su propia excision, duplicacin e insercin en el genoma. Parece que, en ciertos perodos en la historia evolutiva, la actividad del transposon hizo extenderse como los acordeones a los cromosomas. Como resultado, la mayora de los cromosomas est ahora lleno con los remanentes silenciosos de transposons. Transposons no son el nico tipo de ADN que puede reproducirse. Si hay una cosa buena es que el ADN est copindose. Y como resultado, las duplicaciones que van de los centenares de bases al complemento entero de la clula de cromosomas han figurado pesadamente en la evolucin de los genomas modernos. Las duplicaciones ms simples producen sucesiones repetidas adyacentes que son todos orientadas de la misma manera. Las longitudes de stos 'tndem repetidos' puede variar grandemente, y a menudo se reproducen los genes enteros. La copia extra puede aumentar las mutaciones entonces; a menudo stos lo darn intil, pero una nueva y til funcin tambin puede surgir. Y por ltimo se ha encontrado que los Pericentromeros y subtelomeros pueden ser las incubadoras para los nuevos genes y las duplicaciones pueden ayudar generar la variacin gentica.
Por otro lado en el informe cientfico sobre el desciframiento del genoma humano, (Nature, 2001) est plagado de trminos como "misterioso", "funcin desconocida", "enigma no resuelto"... A sus autores les resultan sorprendentes las "ms de doscientas secuencias de origen bacteriano" que han encontrado, as como las
100 evidencias de transferencia horizontal de genes "relativamente frecuentes ", es decir, genes "transmitidos por vectores como virus". Tambin han resultado sorprendentes las enormes cantidades de elementos mviles (transposones y retrotransposones), secuencias genticas que pueden "saltar" de una parte a otra del genoma, bien mediante insercin directa en otra zona, o bien mediante una duplicacin previa de su secuencia. Este ltimo fenmeno es el responsable de una enorme cantidad de secuencias repetidas (que constituyen el 45% del genoma) y que antes se consideraban "ADN basura", pero que segn la opinin de los autores del informe: "Como agentes activos, las repeticiones han remodelado el genoma causando reordenamientos, creando genes enteramente nuevos, modificando y barajando genes existentes y modulando el contenido total de Guanina-Citosina ".
En diciembre del ao 2000, Nature public "el primer genoma completo de una planta que se libera a la comunidad cientfica": Arabidopsis thaliana. Una herbcea elegida por su genoma pequeo (5cromosomas), pero con un nmero de genes prximo a los 25.000, de los que casi el 80% estn duplicados. Adems de la existencia de una gran cantidad de "elementos mviles", se ha podido constatar que cerca del 60% de los genes de Arabidopsis los comparte con otras plantas, animales y hombre (entre estos el "famoso" gen BRCA2, considerado "uno" de los responsables del cncer de mama). Y es slo el primer genoma vegetal "liberado" por las empresas privadas a la comunidad cientfica.
Con base en todo lo anterior, se puede hipotetizar que se esta llevando a cabo una especiacin "recombinacional" o hbrida, la cual se refiere al origen de nuevas especies homoploides va hibridacin entre especies paternales o maternales divergentes cromosmica o genticamente (Ungerer, 1998), Este modo es puntuado (largos periodos de stasis es decir, donde la mayora de las especies no presenta cambio direccional alguno durante su estancia y es seguido por abruptas transiciones en las cuales las especies paternales o maternales individuales son desplazadas rpidamente por las nuevas especies hbridas (McCarthy, 1995). La especiacin recombinacional representa solamente uno de los varios o sospechosos caminos 101 conocidos para una especiacin rpida (Avise, 1994). Adems, de acuerdo con Setoguchi y Wuatanabe (2000), la hibridacin y la introgresin entre varias especies, frecuentemente ocurre en las regiones de simpatra (formacin de nuevas especies por rangos de distribucin, aislamiento en el mismo sitio y por variacin de nichos) o en los lmites de las zonas donde la distribucin de las especies entran en contacto una con otra. Y Fritsche y Kaltz (2000), mencionan que muchas de las especies ntimamente relacionadas particularmente en las plantas, la separacin reproductiva no es completa y la hibridacin ocurre donde sus rangos geogrficos se traslapan, tal y como ocurre en centro de Michoacn con S. macrostema.
Condiciones medioambientales en el desarrollo de la filogenia de los especimenes de S. macrostema
Al observar la filogenia de las cuatro plantas en estudio, destaca el hecho que los cuatro presentan una historia evolutiva que puede alinearse con los eventos geolgicos registrados para la regin de colecta de los ejemplares de S. macrostema. Pero para realizar tal alineacin es necesario describir los eventos all ocurridos, que se describen a continuacin: Michoacn desde el punto de vista bitico, es uno de los estados ms diversos del pas; resultado de su gran diversidad orogrfica y heterogeneidad climtica. El estado tiene adems una gran variedad de tipos de vegetacin con sus propias floras, que van desde la tropical selvtica, pasando por las zonas ridas, para subir a los pastizales y luego a la montaa con sus pinares y bosques espesos de abetos. (Moreno, 1998)
Gran parte de esta riqueza bitica es debida a la especial configuracin que presenta el Eje Neovolcnico Transversal o Faja Volcnica Transversal. Se sabe que la Faja Volcnica Transversal es una regin del centro de Mxico con una historia geolgica reciente. Se trata de una zona altamente volcnica en la que predominan una serie de cuencas endorreicas que dieron lugar a la formacin de grandes extensiones lacustres y en donde la vegetacin predominante la constituyen los 102 bosques de pino y encino. Adems, en esta regin, importantes culturas prehispnicas se desarrollaron (Albert y col., 1987) .
A partir del anlisis de los registros palinolgicos que se han realizado diversos estudios en diferentes puntos de la Faja Volcnica Transversal, se establecen en este trabajo las tendencias climticas del fin del Pleistoceno y Holoceno.
Segn Boer (1994) hace unos 70 000 aos antes del presente (AP) se inici la glaciacin de Wisconsin, el ltimo gran avance glacial del Cuaternario, el cual lleg a su mximo desarrollo aproximadamente hace 20 000 aos AP. Durante este largo perodo, las masas de hielo fluctuaban, avanzando y retrocediendo al tiempo que oscilaba el clima y el nivel del mar. Este ltimo, al acumularse grandes casquetes de hielo que cubran parte de la tierra, bajaba notablemente, pero en cambio suba cuando, durante pocas ms templadas (interglaciares), se derretan los glaciares; estas oscilaciones modificaban las lneas costaneras y hacan salir o sumergirse islas o puentes terrestres. La variacin del nivel medio del mar, aunado a los cambios de temperatura, provoca en todos los continentes una alteracin en los ecosistemas existentes.
Mientras ms avanzaban los hielos los biomas de tundra y confieras prevalecan hacia las latitudes meridionales; por el contrario al retroceder las masas de hielo, provocaban un abatimiento de los bosques de conferas y un consecuente incremento en las reas con praderas y estepas para las mismas latitudes (Boer, 1994).
Para el centro de Michoacn se han identificado evidencias geomorfolgicas y estatigrficas de dos glaciaciones ocurridas despus del pleistoceno tardo; se registran por lo menos en dos ocasiones tales eventos, una vez entre 40,000 50,000 aos AP y otra vez entre 28,000 10,000 aos AP, en ambos casos, el nivel de la temperatura descendi de tal modo, que la zona central de Mxico cambi, progresivamente en ese lapso de tiempo, de ser una regin principalmente esteparia 103 (con grandes ungulados que pastaban en las planicies) a una regin con predominancia de bosques de conferas (incluso en valles y mesetas donde los grandes ungulados no pudieron sobrevivir) (Chcon, 1991). Para los fines de este trabajo se resaltan las caractersticas del segundo perodo con inicio hace 28,000 aos y una duracin de casi 20,000 aos.
En la regin de la cinega de Zacapu se han encontrado morrenas originadas hace ms de 11,900 aos (probablemente hacia 12,500 aos AP) y provenientes del cerro del Tecolote. Tal glaciacin dej huellas en algunas laderas arriba de 2,6003,200 msnm, y estuvo muy influida por condiciones de relieves locales. La morfologa de los depsitos sugiere una edad holocnica, y en ciertos casos sta podra ser de apenas unos miles de aos (Chcon, 1991).
Se sealan climas secos, de fros a templados de 19,000 hasta 13,000 aos AP con la existencia de bosques abiertos de pino y encino. Del final del Pleistoceno hasta 8,000 aos AP, hay evidencias de aumento de humedad, con el probable establecimiento de climas hmedos, de semifros a templados. De 8,000 a 6,000 aos AP. La tendencia climtica es hacia climas templados subhmedos. Entre 6,000 a 4,000 aos AP. los registros indican la existencia de eventos volcnicos y una probable reduccin en la precipitacin. Finalmente, los ltimos 4,000 aos, adems de registrarse el impacto humano, se percibe una tendencia hacia climas templados hmedos/subhmedos ( White y Heine 1992)
La comparacin de la secuencia glacial del Tecolote con las elaboradas por White y Heine para diversas montaas del centro de Mxico (en particular el Iztacchuatl) permite proponer algunas correlaciones que evidencian, que hace ms de 12,000 aos AP ocurri un evento climtico (la glaciacin) de considerables proporciones que, repercuti, seguramente en los organismos presentes.
Hoy da se sabe que los cambios climticos bruscos son un fenmeno natural que se ha producido en toda la historia geolgica. Esto provoc las migraciones de 104 flora y fauna, incluyendo a los homnidos, en el periodo Cuaternario, hacia regiones ms favorables, y tambin la extincin de especies o su adaptacin a un ambiente distinto.
Las condiciones actuales del planeta tienen sus antecedentes en un cambio brusco del clima ocurrido hace 28,000 aos, cuando empez a volverse ms clido, especialmente en el hemisferio norte. W. Tanner (1983) calcula que los glaciares retrocedieron durante 10 000 y 15 000 aos, con una velocidad promedio de 10 cm/ao. Diversos estudios han demostrado una estabilidad climtica en los ltimos 5,000 aos, aunque, como es natural, con breves periodos ms fros o clidos y de ascensos y descensos del nivel del mar.
Se ha calculado que los glaciares iniciaron su retroceso, con alternancia de avances, hace unos 18,000 aos AP. Pero el mximo retroceso se alcanz hace 10,000 aos AP, al inicio del Holoceno. Como resultado del retroceso de los hielos las tierras habitables se ampliaron y fueron ocupadas gradualmente por vida vegetal y animal. En los ltimos 10,000 aos AP. ha habido una aparente estabilidad del clima. La hiptesis sobre el desplazamiento que parece ms lgica indica que inicialmente el movimiento debi haber sido ms lento, de 3 km/100 aos. El gran retroceso de los hielos debe haber durado unos 2,000 aos, lapso en que el espesor se redujo hasta en un kilmetro. El retroceso de los hielos se ha mantenido estable desde hace 8,000 AP. De manera que las condiciones medioambientales reinantes desde esa poca a la actualidad son relativamente similares (Milnichuk y Arabagi, 1979)
Hace seis-siete mil aos se produjo un ptimo climtico, esto es, de alta temperatura. Posteriormente se han dado alternancias de ascenso y descenso, pero con una tendencia general al descenso de la temperatura (Palmere, 1984) Si se relaciona el ptimo de temperatura alcanzado hace 7,000 aos AP con los resultados obtenidos en este trabajo con los ITSs de los especimenes de SATIB y SATPA, se observa que coincide el tiempo filogentico para la divergencia de estos ejemplares con el tiempo geolgico de ptima temperatura. Desde el punto de vista 105 evolutivo las condiciones medioambientales de hace 7,000 aos AP provocaron, probablemente, la especiacin de S. macrostema, de la que en este trabajo se detectaron dos casos IB y PA.
Los 10,000 aos del Holoceno son insignificantes en la escala geolgica, con respecto del periodo Cuaternario definido precisamente por las glaciaciones. La opinin ms comn de los especialistas es que la ltima glaciacin no ha terminado y nos encontramos muy posiblemente en un lapso interglaciar, consistente en un calentamiento general iniciado hace 18 000 aos y que no podra durar muchos miles de aos ms, con la gran posibilidad de un nuevo avance de los hielos, especialmente sobre Europa y Norteamrica, volviendo a las condiciones del pasado no muy remoto. (Palmere, 1984)
En el periodo Cuaternario se produjeron cuatro grandes glaciaciones que duraron cada una algunas decenas de miles de aos. Hubo etapas de retroceso de los hielos que no significaron el fin de la glaciacin en s; duraron algunos miles de aos para despus volver a condiciones semejantes a las actuales. Es probable, y esto lo sostienen la mayora de los especialistas, que vivimos una breve etapa interglaciar y hay quienes afirman que la tendencia es ya al enfriamiento. Este es un proceso natural que de ser real, se producira el avance de los hielos sobre las tierras habitadas del norte en decenas de aos, cientos o miles. Este dinamismo geolgico pudo sustentar el dinamismo filogentico encontrado en la actualidad en diversas especies, como lo es el caso de los especimenes de S. macrostema tratados en este estudio, que denotan una marcada especiacin al presentar cuatro taxa, que a pesar de divergir recientemente, son genticamente diferentes al presentar un alto polimorfismo.
Con lo anterior y conociendo los resultados de la filogenia de las Satureja se pueden hipotetizar algunos eventos:
A) Es posible que el inicio de la ltima glaciacin (hace 28,000 aos AP) fuera el detonante de la radiacin especiativa observada en las Satureja y cuya evidencia se observa en al rbol filogentico obtenido con las secuencias de ITS, donde se 106 observa que un ancestro comn ubicado cerca de esta fecha dio origen a cuatro taxa diferentes encontrados en el presente.
B) El hecho de que las clades del filograma se separen hace 30.000 aos AP en dos especies distintas (SATIN y SATPA) y posteriormente cada clade de especie en dos taxa inferiores hace 18,750 (SATIN y SATSJ) y hace 22,500 (SATPA-SATIB) aos evidencian que el cambio climtico acontecido provoc el proceso de especiacin que a la fecha no terminado.
C) Es coincidente el hecho que de las tres filognesis observadas (30,000 aos AP (SATIN), SATPA, 22,500, SATSJ, 18,750 y hace 15,000 (PA-IN) en dos de ellas se den con el inicio y trmino de la etapas interglaciares (hace 28,000 y 18,000 aos AP). Esto dara pauta a pensar que tales eventos potencian, al haber cambio en el medio ambiente y actuar como selector natural, la diversidad gentica.
D) Es de destacar que la variabilidad encontrada en cuatro taxa de tan cercana distribucin y de un hbitat relativamente estable en los ltimos 8,000 aos, indica el gran polimorfismo que se puede encontrar en estas plantas. Por ltimo, la influencia del hombre a travs de todas sus acciones (prcticas agrcolas, alimentacin, seleccin de materiales, contaminacin, etc.), han impactado en mayor o menor grado en la evolucin de las especies, las cuales se han extinguido a travs de la historia a un ritmo constante o por catstrofes naturales, sin embargo actualmente, la velocidad a la que las especies se extinguen es superior al ritmo al que aumenta la evolucin, y Myers y Knoll (2001) argumentan que las extinciones de especies alteraran no solamente la diversidad biolgica sino tambin los procesos evolucionarios, los cuales generan diversidad, y se cuestionan en cuanto a Cmo funcionaran los ecosistemas en un mundo disminuido de su biodiversidad?,la funcin de los ecosistemas necesariamente decaer cuando la diversidad decline y si esto es as, como , cuanto y de que manera?, Puede la biodiversidad y los humanos del mismo modo prosperar en un mundo donde la mayora de la biodiversidad biolgica ser confinada en parques y reservas relativamente pequeos?, si la biodiversidad es en realidad critica para la funcin 107 de un ecosistema hemos conocido suficiente acerca de los principios de la evolucin para intervenir en los procesos de su recuperacin?, Conocemos lo suficiente para mitigar la perdida de la biodiversidad biolgica?. A ese respecto Hedrick (2001) se pregunta Cmo puede la nueva informacin gentica ser usada en la conservacin?
Todos los indicadores medioambientales sugieren que el medio ambiente ser ms variable que el presente (el incremento de la temperatura, el aumento del CO2, etc.), y por lo tanto la relacin genotipo-fenotipo, ser ms complicada ya que esa interaccin ya no ser ms (G x E) sino que ser mucho ms complicado y podra ser G x E 1 E2 2 E 3. E n dependiendo de los cambios ambientales que las plantas experimenten a travs de si ciclo de vida (Bazzaz, 2001).
108 VII. CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en el presente estudio sugieren que S macrostema var. laevigata, se encuentra actualmente en perodo de especiacin rpida la cual es de tipo puntuado, con ello se fortalece la teora de la especiacin recombinacional y se aporta ms evidencia emprica para apoyar este modo de especiacin.
El anlisis de las secuencias de la regin de los ITS de S. macrostema var. laevigata ha permitido vislumbrar que las plantas en estudio pueden ser consideradas como especies; de aqu que el uso de S. macrostema var. laevigata para referirse a esta variedad podra ser descontinuado. Los resultados de este estudio, indican que existe suficiente divergencia molecular entre SATIN y SATPA para apoyar su establecimiento como especies separadas, al igual que SATSJ y SATIB, las cuales pueden ser tambin consideradas como especies. Los resultados indican la validez del anlisis de secuencias cclicas para proveer huellas moleculares de especies de S. macrostema. Por lo tanto, la tcnica puede ser usada para determinar la relaciones entre organismos y las secuencias ITS pueden adems utilizarse para verificar las. relaciones filogenticas obtenidas de los anlisis morfolgicos tradicionales, y por ultimo los marcadores moleculares determinados especficamente por cada taxa podrn ser utilizados para su identificacin molecular.
La gran utilidad de las tcnicas moleculares es que permiten observar diferencias directamente en el ADN, es decir en la molcula qumica que contiene toda la informacin gentica del organismo, este es el mximo nivel de resolucin posible y as pueden encontrarse las diferencias en especies, subespecies o variedades, que seran idnticas con base en la observacin de las caracteres fenotpicos.
Con todo lo anterior y con los resultados obtenidos en el presente trabajo se considera que existe evidencia para argumentar que los especimenes hasta ahora colectados en Michoacn son de dos especies diferentes y no dos variedades como 109 se argumenta (McVaugh y Schmid, 1967). Ambas especies presentan un proceso de especiacin reciente y el que diferentes autores mencionen la posibilidad de hibridacin se perfilara ms hacia que, dado que es un proceso reciente de especiacin, ambas especies y sus respectivas subespecies presentan caractersticas comunes, ya que presentan un ancestro comn de reciente aparicin.
El hecho que las localidades muestreadas representen 4 poblaciones diferentes y el que el proceso de especiacin sea dinmico, indica que probablemente existen ms individuos diferentes, por lo menos a nivel de subespecie y variedad, presentando a Michoacn como un centro de diversificacin para estas especies. Por lo que posteriores colectas y estudios similares son necesarios para completar el proceso de especiacin y divergencia de estos taxa.
Existe evidencia de la probable presencia de otras especies y subespecies, en el presente caso se realizaron estudios de marcadores moleculares con ITSs, los cuales podran complementarse con estudios de hibridacin manual que permitieran confirmar los resultados obtenidos.
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UNIVERSIDAD DE COLIMA CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIN Y DESARROLLO AGROPECUARIO
Oficio No. 078/02
ING. RODOLFO MORENTIN DELGADO DIRECTOR DE LA F.C.B.A. PRESENTE.
En atencin a que el M. C. JOSE MARIO AGUILAR RAMIREZ, alumno e- osado del Doctorado cn Ciencias, rea de ciencias agrcolas y forestales, ha rcazado todas las correcciones al manuscrito de tesis que present para su revisin, me dirijo respetuosamente a usted para informarle que el documento titulado " Especiaein recombinacional y relaciones iiloger ticas en SaturEja mRCr~>,Stezna var, laevigara.", rene todas las caractersticas necesarias para obtener el grado de Doctor en Ciencias.
Sin otro particular aprovecho la oportunidad para enviarle Un cordial saludo.
C.C.P. DR. ROBERTO GOMEZ AGUILAR, SECRETARIO TCNICO DEL PICAF, UNIVERSIDAD AUTNOMA DE NAYARIT C.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE. C.C.P. ARCHIVO.
APR/Anglica*
UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SAN NICOLS DE HIDALGO INSTITUTO DE INVESTIGACIONES QUMICO BIOLGICAS Lab. de Biotecnologia Vegetal EdHicfo B-3, Clndad Univenitarfa sal8arcle8a~hotwil oom 58030, M~ Mico. MEXICO. Tel-Fax.- (443) 3 265788
DR ALFONSO PESCADOR COORDINADOR DEL POSGRADO (PICAF) UNIVERSIDAD DE COLIMA PRESENTE.
Por este conducto me dirijo a Ud. de la manera ms atenta, con el fin de informarle que he revisado el trabajo escrito de tesis del estudiante Jos Mario Aguilar Ramrez titulado "ESPECIACIN RECOMBINACIONAL Y RELACIONES FILOGENTICAS EN Satureja macrostema var. laevigata", con correcciones menores, el cual para mi opinin est listo para ser defendido ante el examen doctoral.
Sin otro particular, agradezco su atencin y reciba un cordial saludo.
ATENTAMENTE
UNIVERSIDAD DE COLIMA CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIN Y DESARROLLO AGROPECUARIO
ING. RODOLFO MORENTIN DELGADO DIRECTOR DE LA F. C. B. A. PRESENTE.
De la manera ms atenta me dirijo a usted, para informarle que el M. C. JOSE MARIO AGUILAR RAMIREZ, alumno egresado del Doctorado en Ciencias, ,tres de Ciencias Agrcolas y Forestales, realiz las correcciones al manuscrito de tesis que present para su revisin, titulado "Especiacin recombinacional y relaciones tilogenticas en Sature la rnacrostema var, laevigata, documento que rene los requisitos para obtener el grado de Doctor en Ciencias.
Sin otro particular, le envio un cordial saludo.
C.C.P. DR. ROBERTO GOMEZ AGUILAR, SECRETARIO TCNICO DEL PICAF, UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NAYARIT C.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE. ARCHIVO.
UNIVERSIDAD DE COLIMA CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIN Y DESARROLLO AGROPECUARIO
ING. RODOLFO MORENTIN DELGADO DIRECTOR DE LA F. C. B. A. PRESENTE
En atencin a que el M. C. JOSE MARTO AGUILAR RAMIREZ, alumno egresado del Doctorado en Ciencias, rea de ciencias agrcolas y forestales, ha realizado todas las coi-recciones al manuscrito de tesis que present para su revisin, me dirijo respetuosamente a usted para informarle que el documento titulado "Especiacin recombinacional y relacio :es filogenticas en Satureja macrostema var, laevigata,", rene todas las caractcristicas necesarias para obtener cl grado de Doctor en Ciencias.
Sin otro particular aprovecho la oportunidad para enviarle aun cordial saludo.
C.C.P. DR. ROBERTO GOMEZ AGUILAR, SECRETARIO TCNICO DEL PICAF, UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NAYARIT. C.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE C.C.P. ARCHIVO. APR/Anglica*
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ING. RODOLFO MORENTIN DELGADO DIRECTOR DE LA F. C. B. A. PRESENTE.
De la manera ms atenta me dirijo a usted, para informarle que el M. C. JOSE MARIO AGUILAR RAMIREZ, alumno egresado del Doctorado en Ciencias. rea de Ciencias Agrcolas y Forestales, realiz las correcciones al manuscrito de tesis que present para su revisin, titulado " Especiacin recombinacional y relaciones filogenticas en Satureja na.:rustemir var. luevigata,' documento que rene los requisitos para obtener el grado de Doctor en Ciencias.
Sin otro particular, le envo un cordial saludo.
C.C.P. DR. ROBERTO GOMEZ AGUILAR, SECRETARIO TCNICO DEL PICAF. UNIVERSIDADAUTONOMA DE NAYARIT C.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE. C.C.P. ARCHIVO.
Aislamiento y Caracterizacion Preliminar de Genes de Policetido Sintasas Tipo I en Actinomicetos Aislados A Partir de Hormigas Cortadoras de Hojas Alta Cephalotes
Transferencia De Conocimiento Multidisciplinario Con Enfoque Sustentable: Trabajo Colaborativo De Cuerpos Académicos E Investigadores De Puebla, Tlaxcala, Oaxaca Y Veracruz, México Y Carabobo, Venezuela De La Red De Investigación Multidisciplinaria Para El Desarrollo Regional