PRCTICA N-3

METODOS DE CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS

2.- OBJETIVOS:
Aislar BACTERIAS AEROBICAS por los mtodos de ESTRIADO, DISEMINACIONY DIFUSIN.

Reconocer los diversos parmetros que se toman en cuenta para describir una colonia
bacteriana.
Relacionar la morfologa de la colonia con capacidad tintorial

El objetivo clsico del aislamiento es la separacin de los microorganismos en grupos,
que puedan identificarse siguiendo los principios de la microbiologa.

3.- MARCO TEORICO:
Un medio de cultivo intenta el crecimiento y reproduccin in vitro de las bacterias, para
observar sus propiedades y conseguir un mejor estudio bioqumico e inmunolgico, al
contar con material en cantidad suficiente. Por ello constare de lagunas propiedades (pH
adecuado, sales, nutrientes, condicione de aero-anaerobiosis, etc.), que sern las ms
idneas para la bacteria que deseamos estudiar y se citan en cada una de ellas en
particular, en la bacteriologa sistemtica.
Los medios de cultivo se dividen por su finalidad en: medios de enriquecimiento que
tratan de aumentar el nmero de bacteria existentes , si consideramos que se encuentran
en cantidad muy exigua, a la vez que inhiben la flora de asociacin acompaante( y de
aislamiento ( que tienen por fin conseguir una colonia o clon, es decir, grupo de bacterias
procedentes de una sola, con todas sus propiedades); los dos primeros son principalmente
lquidos y los segundos, slidos. Los medios selectivos son aquellos que poseen algn
componente que permite o no le crecimiento de una especie bacteriana, carcter de
importancias para su identificacin, y los diferenciales, aquellos que las diversas especies
que hay que testar alteran de forma distinta, por lo que suelen llevar indicadores
(sustancias que varan su coloracin segn el pH del medio) u otros ndices de reacciones
qumicas definidas.( Microbiologa General, Tema 2.- Cultivo de microorganismos)

Entendemos por crecimiento microbiano el aumento del nmero de microorganismos
a lo largo del tiempo. Por tanto, no nos referimos al crecimiento de un nico
microorganismo que denominaremos ciclo celular, sino al demogrfico de una poblacin.
En este tema nos centraremos en el crecimiento de bacterias, el estudio que se hace
puede servir tambin para entender el crecimiento de levaduras y de otros hongos.
Denominamos ciclo celular al proceso de desarrollo de una bacteria aislada. A lo largo del
ciclo celular tiene lugar la replicacin del material gentico, la sntesis de componentes
celulares, la elongacin de la bacteria para alcanzar un tamao doble del inicial y su
divisin por biparticin para dar lugar a dos clulas hijas. La duracin del ciclo celular
coincide con el tiempo de generacin y depende, en general, de los mismos factores de
los que depende este.
Los cultivos de microorganismos de los que hemos hablado son asincrnicos puesto que
en ellos cada microorganismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular.
Por consiguiente, en un momento determinado en un cultivo se encuentran clulas que
acaban de dividirse, otras que estn replicando su ADN, otras que estn creciendo, otras
que estn iniciando la divisin celular, etc.
En un cultivo sincrnico todas las clulas se encuentran simultneamente en la misma fase
del crecimiento celular.( Manual de Laboratorio para la Identificacin y Prueba de
Susceptibilidad a los Antimicrobianos de Patgenos Bacterianos de Importancia para la
Salud Pblica en el Mundo en Desarrollo)

CULTIVO DE MICROORGANISMOS
1. SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

Gracias a la aplicacin de los medios de cultivo, se ha llegado a conocer ampliamente el
comportamiento cultural y fisiolgico de la variada flora microbiana que pulula en los ambientes
permitindose la identificacin especfica. Para ello es necesario considerar la metodologa que
conduzca a la exacta determinacin de la especie en el laboratorio.
a. Siembra y Aislamiento de microorganismos

Siembra: Acondicionamiento de un microorganismo en un medio de cultivo, de acuerdo a sus
exigencias vitales, para que en condiciones ptimas de temperatura y tiempo de incubacin,
pueda desarrollar y multiplicarse in vitro. Se siembra con dos finalidades: a) Para hacer un
aislamiento y b) para hacer un trasplante. Es la separacin de un determinado
microorganismo del resto de microorganismos que le acompaan. El mtodo ms usual es la
siembra por estriado sobre un medio de cultivo slido adecuado dispuesto en una placa Petri
Aislamiento: Permite la separacin del microorganismos a un estado de pureza a partir de
una muestra problema. Se requiere un medio slido con gran superficie para que los
microorganismos al ser diseminados sobre el medio, genere su progenie formando colonias
separadas. Si se aslan colonias distintas, cada colonia tendr caracteres especiales. La
morfologa bacteriana ser tambin distintiva.
Trasplante: Separacin primaria de la cepa a un medio de cultivo apropiado en tubo, que
puede ser lquido o slido. Se conserva la cepa pura y por tanto trasplantes en medios
especiales, se logran conocer las propiedades culturales y bioqumicas y como resultado la
identificacin especfica. Los trasplantes pueden ser:

- De lquido a lquido
- De lquido a slido
- De slido a lquido
- De slido a slido


4.- MATERIALES Y METODOS:
4.1-. MUESTRA BIOLOGICA:
Leche Natural
Abono
Bebida Fermentada (chicha de jora)
4.2.-MATERIALES:
Asa de siembra
Alambre de nicrom en aro
Agua destilada plumn marcador
Encendedor
Mascarilla
Guantes
Leja
Pao
Gradilla

4.3.-METODOS:

AISLAMIENTO DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA PETRI

Todo aislamiento implica el agotamiento de una muestra sobre la superficie del medio slido. Se
va descargando gradualmente el inculo para que en los ltimos planos del medio queden escasas
clulas que en el ambiente nutricio se irn multiplicando logartmicamente hasta formar colonias
puras.
Los mtodos de siembra varan segn el dispositivo de siembra y la forma de distribuir el inculo.
Cualquiera que sea el mtodo ensayado se aprovecha al mximo la superficie del medio,
logrndose aislar el mayor nmero de cepas microbianas.


a. Aislamiento por el Mtodo del Estriado
Con el asa de siembra se distribuye el inculo por ESTRIA en ZAG, con escasa separacin unas de
otras (1-3) mm). La distribucin puede ser por estra simple (inculo descrito en un solo plano por
todo el medio) y estra en tringulo, cuadrado o pentgono (estras en 3, 4 5 planos en el
mismo medio respectivamente). El nmero de estras depende de la cantidad de inculo y los
planos de siembra
ensayados. Se evita romper el
medio.





b. Aislamiento por Diseminacin
Se practica mediante la pipeta Pasteur estril para la toma del inculo. Esta, por la capilaridad,
permite el ascenso del inculo a discrecin el cual es depositado en un margen del medio y
esparcido sobre el medio de cultivo con una esptula de Drigalsky.
La placa Petri del cultivo debe destaparse lo suficiente como para permitir la estrecha
penetracin de la esptula de siembra; as se evita la contaminacin. Ver los pasos de la tcnica en
la parte experimental.

NOTA: En caso de cultivo muy turbio, el inculo debe ser muy pequeo. Si est diluido, inocular en
el medio ms de una gota.






c.- Aislamiento por Difusin

Se practica de preferencia en ANALISIS CUANTITATIVOS BACTERIANOS. Por ejemplo, una muestra
de agua en la que se desea conocer el nmero de microorganismos por mL.
Una variedad del mtodo consiste en depositar los inculos en tubos de prueba conteniendo agar
fundido. Se agita vigorosamente cada tubo entre las palmas de las manos y el medio se vierte
sobre cada una de las placas estriles antes que solidifique. Otra modificacin: se toma de la
muestra una cantidad conocida del inculo, se vierte en el primer tubo con el agar fundido, se
agita para difusin uniforme, de ste se toma igual cantidad y se vierte en el segundo tubo, se
agita, se toma igual cantidad de inculo y se vierte en el tercer tubo, se agita y con movimientos
rpidos se vierten los 3 tubos sembrados sobre las respectivas placas estriles. Se obtienen as las
diluciones seriadas y el nmero de colonias ser mayor en las ltimas diluciones. Las placas de
cultivo para incubacin se colocan invertidas para evitar que el agua de condensacin de la cara
interna de la tapa humedezca la superficie. Se asegura el crecimiento de colonias aisladas.


NOTA: Hacer esquemas de cada uno de los mtodos de aislamiento y anotar cualquier otra
observacin no estipulada en la gua.