68 Queiroz et al. Quim.

Nova
MTODOS DE EXTRAO E/OU CONCENTRAO DE COMPOSTOS ENCONTRADOS EM
FLUIDOS BIOLGICOS PARA POSTERIOR DETERMINAO CROMATOGRFICA
Sonia C. N. Queiroz, Carol H. Collins e Isabel C. S. F. Jardim
Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13083-970 Campinas - SP
Recebido em 13/12/99; aceito em 25/10/00
METHODS OF EXTRACTION AND/OR CONCENTRATION OF COMPOUNDS FOUND IN
BIOLOGICAL FLUIDS FOR SUBSEQUENT CHROMATOGRAPHIC DETERMINATION. When
organic compounds present in biological fluids are analysed by chromatographic methods, it is generally
necessary to carry out a prior sample preparation due the high complexity of this type of sample,
especially when the compounds to be determinated are found in very low concentrations. This article
describes some of the principal methods for sample preparation in analyses of substances present in
biological fluids. The methods include liquid-liquid extraction, solid phase extraction, supercritical
fluid extraction and extraction using solid and liquid membranes. The advantages and disadvantages of
these methods are discussed.
Keywords: sample preparation; biological fluids; extraction methods.
Reviso Quim. Nova, Vol. 24, No. 1, 68-76, 2001.
INTRODUO
As reas que tm interesse em anlises de compostos en-
contrados em fluidos biolgicos so muitas: ambiental, farma-
cutica, anlises clnicas, medicina legal, etc
1-3
. A anlise
cromatogrfica de substncias presentes nestes tipos de matri-
zes (soro, plasma, urina, etc), em geral, requer um pr-trata-
mento da amostra. As razes para isso so inmeras, destacan-
do-se a complexidade das matrizes biolgicas, das quais os
compostos so obtidos, a existncia de protenas que so in-
compatveis com as colunas cromatogrficas
3
e a concentrao
das substncias a serem analisadas, a nvel de trao. As tcni-
cas de extrao e/ou pr-concentrao permitem que a anlise
dos componentes de interesse se torne possvel. A meta final
a obteno de uma sub-frao da amostra original enriquecida
com as substncias de interesse analtico, de forma que se
obtenha uma separao cromatogrfica livre de interferentes,
com deteco adequada e um tempo razovel de anlise.
As tcnicas mais comumente utilizadas para extrao e/ou
pr-concentrao de compostos presentes em fluidos biolgi-
cos so: extrao lquido-lquido, extrao em fase slida, ex-
trao com fluido supercrtico e extrao com membranas s-
lidas (dilise e ultrafiltrao) ou lquidas. Estas tcnicas de
preparao de amostras tm sido automatizadas para uso em
anlises de rotina, pois eliminam erros humanos de manipula-
o, diminuem o tempo de assistncia do analista durante a
anlise, evitam o risco de contato com substncias prejudiciais
sade e aumentam, significativamente, o nmero de anlises
de amostras por tempo. Estas tcnicas podem ser subdivididas
em dois modos: off-line e on-line
4
. No off-line, a etapa
de extrao e/ou concentrao do analito realizada separada-
mente do sistema cromatogrfico. Aps o preparo, a amostra
introduzida no sistema cromatogrfico por meio de um injetor,
como qualquer outra amostra. Hoje em dia, muitos equipamen-
tos para extraes mltiplas so disponveis comercialmente.
Alguns deles fazem o processo de extrao automaticamente,
mas a transferncia da amostra para o injetor cromatogrfico
manual (sistema semi-automtico), enquanto outros, alm de
extrao automatizada, so tambm capazes de transferir a
amostra ao sistema cromatogrfico (sistema completamente
automtico). No sistema on-line, a etapa de extrao e/ou
concentrao do analito realizada no prprio sistema
cromatogrfico, onde so inseridos alguns acessrios.
Existem muitas publicaes especializadas descrevendo os
processos de preparao de amostras para anlise de analitos
individuais ou classes de compostos, de forma que descrever
todos eles seria impossvel. Dessa maneira, neste artigo sero
discutidos os mtodos de extrao e/ou pr-concentrao mais
utilizados em anlises de compostos presentes em fluidos bio-
lgicos, as suas caractersticas e aplicaes.
EXTRAO LQUIDO-LQUIDO (ELL)
Na extrao lquido-lquido ocorre a partio da amostra
entre duas fases imiscveis (orgnica e aquosa). A eficincia
da extrao depende da afinidade do soluto pelo solvente de
extrao, da razo das fases e do nmero de extraes. Para
alguns sistemas, o valor da constante de distribuio, K
D
, en-
tre as fases pode ser aumentado pelo ajuste do pH, para preve-
nir a ionizao de cidos ou bases, pela formao de par inico
com solutos ionizveis, pela formao de complexos lipoflicos
com ons metlicos ou pela adio de sais neutros, para dimi-
nuir a solubilidade de compostos orgnicos na fase aquosa
5
.
A ELL apresenta as vantagens de ser simples (na configu-
rao mais comum usa-se um funil de separao ou tubos de
centrfuga) e poder utilizar um nmero grande de solventes,
puros e disponveis comercialmente, os quais fornecem uma
ampla faixa de solubilidade e seletividade. Alm disso, as pro-
tenas presentes nas amostras so denaturadas, eliminando a
contaminao da coluna cromatogrfica. Por outro lado, esta
tcnica possui uma srie de desvantagens, tais como: as amos-
tras com alta afinidade pela gua so parcialmente extradas
pelo solvente orgnico, resultando em perda do analito; impu-
rezas do solvente so concentradas junto com a amostra, im-
plicando no uso de solventes ultrapuros; pode ocorrer a forma-
o de emulses, o que resulta em grande consumo de tempo;
volumes relativamente grandes de amostras e de solventes so
requeridos, gerando problemas de descartes; alguns solventes
orgnicos so txicos; pode ocorrer adsoro dos analitos na
vidraria; decomposio de compostos instveis termicamente,
na etapa de pr-concentrao; o processo suscetvel a erros e,
relativamente, de difcil automao. Apesar destas desvantagens,
e-mails: soniacnq@iqm.unicamp.br; chc@iqm.unicamp.br;
icsfj@iqm.unicamp.br
Vol. 24, No. 1 Mtodos de Extrao e/ou Concentrao de Compostos Encontrados em Fluidos Biolgicos 69
a ELL considerada uma tcnica clssica de preparao de
amostra e tem sido ainda muito utilizada em anlises de diver-
sos tipos de substncias presentes em fluidos biolgicos, pois
extratos bastante limpos podem ser obtidos com alta seletivi-
dade para alguns analitos.
Aplicaes de ELL em fluidos biolgicos
A escolha adequada do solvente orgnico e o ajuste de pH
da amostra so necessrios para assegurar uma boa recupera-
o do analito. A extrao de substncias bsicas , normal-
mente, realizada a pH maiores que 7 e a extrao de substn-
cias cidas feita em pH menores que 5. Vrios tipos de
solventes orgnicos tm sido empregados na extrao de dro-
gas cidas e bsicas presentes em amostras de fluidos biolgi-
cos, tais como, ter dietlico
6-10
, acetato de etila
11-13
, hexano
14
, tolueno
15, 16
, diclorometano
17-19
, acetato de butila
20
, mis-
turas de solventes
21-24
, etc. Quanto maior a afinidade do analito
pelo solvente orgnico maior a recuperao.
Yoshida e Akane
25
descreveram, recentemente, a extrao
de benzodiazepnicos em soro, por meio de um mtodo de
extrao novo denominado extrao lquido-lquido tempe-
ratura sub-zero. Os autores utilizaram acetonitrila a -20
0
C
como solvente de extrao, pois nesta temperatura h uma se-
parao entre as fases. Aps a extrao, a fase contendo
acetonitrila foi injetada diretamente no sistema cromatogrfico
e boa reprodutibilidade entre as extraes foi obtida.
A ELL foi empregada para a determinao de 25 pesticidas
organofosforados, em soro humano, por meio de extrao com
n-hexano/acetato de etila (75:25, v/v) seguida por cromatogra-
fia em camada delgada de alta eficincia. Neste mtodo utili-
zaram-se 1 mL de amostra, 1 mL de solvente orgnico e 1 mL
de soluo aquosa de cloreto de sdio saturada, sendo que o
sal foi empregado para diminuir a solubilidade do analito na
fase aquosa e tambm para evitar a formao de emulses. Os
limites de deteco foram suficientemente baixos para detectar
os pesticidas em pacientes intoxicados
26
.
Uma metodologia para anlise de bifenilas policloradas
(PCB) em soro usando ELL para subseqente anlise por cro-
matografia gasosa, com detector espectromtrico de massas,
foi descrita por Pauwels e Schepens
27
. Aps a ELL foi feita
uma etapa de remoo dos interferentes atravs da percolao
do extrato atravs de uma coluna de adsoro de slica gel
desativada. O sistema de solventes consistiu de 30 mL de n-
hexano, seguido de 10 mL de n-hexano:diclorometano (80:20,
v/v) e 10 mL de n-hexano:diclorometano (40:60, v/v).
Marques et al
28
publicaram uma metodologia para anlise
de estriquinina, que um alcalide altamente txico para os
seres humanos. Os autores empregaram uma mistura de
tolueno/n-heptano/lcool isoamlico (67:20:4, v/v/v) para ex-
trair a substncia txica de amostras biolgicas, para fins de
investigaes clnicas e forense, com determinao por croma-
tografia gasosa acoplada espectrometria de massas.
Outros exemplos representativos da ELL em amostras bio-
lgicas incluem a extrao de frmacos de leite materno
29, 30
e
em fluido crebro-espinhal
31
.
Automao
Atualmente, com o surgimento de tcnicas modernas de se-
parao, tal como a cromatografia lquida de alta eficincia
acoplada espectrometria de massas (CL/EM ou CL/EM/EM),
anlises muito rpidas podem ser realizadas devido alta sele-
tividade alcanada pelo detector (EM) quando se utiliza o modo
SIM (Monitoramento Seletivo de ons). Entretanto, a prepara-
o de amostra pode ser um fator limitante na velocidade total
da anlise, uma vez que a ELL envolve vrias etapas. Deste
modo, numerosos esforos tm sido feito para melhorar as tc-
nicas de ELL em funo do consumo de solvente, do volume de
amostra e do tempo de anlise. Tcnicas modernas, que possu-
em alta sensibilidade, empregam 50 - 100 L de plasma ao
passo que 10 anos atrs usavam-se 5-10 mL de amostra biol-
gica
32,33
. Volumes pequenos de amostra requerem volumes pe-
quenos de solventes para extrao. Na tentativa de aumentar a
velocidade total de anlise foi necessrio que a ELL fosse
automatizada. Jemal et al.
34
publicaram um trabalho comparan-
do a ELL manual com a automatizada e mostraram que pos-
svel uma diminuio significativa no tempo de preparo de
amostra com o uso de sistemas automatizados, sem comprome-
ter a exatido e a preciso. Vrias tcnicas de ELL automticas
ou semi-automticas tm surgido
35, 36
possibilitando que nme-
ros elevados de anlises, at 2000/24h, sejam realizadas
37, 38
.
EXTRAO EM FASE SLIDA (EFS)
Hoje em dia a extrao em fase slida uma das ferramentas
mais poderosas e mais empregadas para a extrao e/ou pr-con-
centrao de analitos presentes em matrizes complexas. Esta tc-
nica foi revisada recentemente por Hennion
39
e por Majors
40
.A
EFS emprega sorventes recheados em cartuchos, nas formas de
barril ou seringa, e os mecanismos de reteno so idnticos que-
les envolvidos em cromatografia lquida em coluna. Um cartucho
tpico formado por um tubo de polipropileno contendo cerca de
50 a 500 mg de sorvente, com 40-60 m de tamanho de partcu-
la, fixado no tubo atravs de dois filtros. Em geral, os procedi-
mentos de EFS contm 5 etapas: i) ativao do sorvente para
deixar os stios ativos disponveis; ii) condicionamento do sorvente
com solvente adequado para ajustar as foras do solvente de
eluio com o solvente da amostra; iii) introduo da amostra,
quando ocorre a reteno do analito e s vezes de alguns interfe-
rentes; iv) limpeza da coluna para retirar os interferentes menos
retidos que o analito; v) eluio e coleo do analito
41
.
Atualmente um nmero grande de sorventes so disponveis
comercialmente. Em geral, os materiais de recheio, emprega-
dos para EFS, so similares aos usados em cromatografia l-
quida. Assim, carvo ativado, alumina, slica gel, silicato de
magnsio (Florisil), fases quimicamente ligadas e polmeros,
por exemplo, o copolmero de estireno entrecruzado com
divinilbenzeno, tm sido empregados (Tabela 1). Dependendo
do solvente de condicionamento e de eluio, os grupos mais
frequentemente usados como sorventes base de slica quimi-
camente ligada podem ser divididos em 3 categorias: i) fase
reversa (FR) quando o sorvente menos polar que o solvente
de eluio; ii) fase normal (FN) quando o solvente menos
polar que o sorvente e iii) troca inica (TI). A Tabela 2 mostra
um guia para seleo de sorventes a serem utilizados na EFS
41
.
Para aumentar a seletividade da extrao os sorventes po-
dem ser combinados das seguintes maneiras:
i) Dentro de um mesmo cartucho de extrao, usando as
chamadas fases mistas com vrios grupos funcionais de ca-
ractersticas diferentes ligados ao mesmo suporte;
ii) Fazendo sucessivas extraes com cartuchos de diferen-
tes recheios, passando o material eluido do primeiro cartu-
cho para o segundo no modo on-line ou off-line;
iii) Recheando o mesmo cartucho com diferentes sorventes,
em camadas, resultando em uma coluna de extrao tipo
sanduche.
Os recentes desenvolvimentos em EFS tm sido
direcionados para a sntese de sorventes mais seletivos e para
novas configuraes cromatogrficas. Alguns exemplos esto
citados a seguir.
Novos sorventes
Fases mais seletivas, quimicamente ligadas slica (ou a outro
suporte), tm sido preparadas. Um exemplo a fase fenilboro-
nato, Tabela 1, que seletivamente retm 1,2 cis-diol. Esta fase
pode ser utilizada em anlises de nucleosdeos, nucleotdeos,
70 Queiroz et al. Quim. Nova
Tabela 1. Exemplos de sorventes utilizados em EFS.
NO POLARES
C18 Octadecilsilano ( )
3 17 2
CH CH Si
C8 Octilsilano ( )
3 7 2
CH CH Si
C2 Etilsilano
3 2
CH CH Si
C1 Metilsilano
3
CH Si
PH Fenilsilano
Si
CH Cicloexilsilano
Si
POLARES
FL Florisil MgO
3
Si
AL Alumina Al
2
O
3
Si Slica OH Si
CN Cianopropilsilano CN CH CH CH Si
2 2 2

2OH Diolsilano
OH OH
CH CH CH O CH CH CH Si
2 2 2 2 2

NH2 Aminopropilsilano
2 2 2 2
NH CH CH CH Si
PSA N-Propiletilenodiaminossilano
2 2 2 2 2 2
NH CH CH NH CH CH CH Si
TROCA INICA
SCX Benzenossulfonilpropilsilano
2 2
CH CH Si
+
H SO
3
PRS Sulfonilpropilsilano
+
Na SO CH CH CH Si
3 2 2 2
CBA Carboximetilsilano COOH CH CH Si
2 2

DEA Dietilaminopropilsilano ( )
2 3 2 2 2 2
CH CH N CH CH CH Si
SAX Trimetilaminopropilsilano ( )
+
Cl CH N CH CH CH Si
3 3 2 2 2
PSA N-Propiletilenodiaminossilano
2 2 2 2 2 2
NH CH CH NH CH CH CH Si
COVALENTE
PBA cido fenilbornico NH CH CH CH Si
2 2 2
( )
2
OH B
Tabela 2. Guia para seleo de sorventes a serem utilizados em EFS
41
.
Aplicaes Grupo funcional do analito Matriz Sorventes Solvente de eluio
Extrao no-polar Grupos hidrofbicos Aquosa Octadecil Metanol
Abuso de drogas Anis aromticos gua Octil Acetonitrila
Peptdeos Cadeias alquil Tampes Etil Acetato de etila
Pesticidas Fluidos biolgicos Cicloexil Clorofrmio
Monitoramento de droga Fenil Metanol acidificado
teraputica Cianopropil Hexano
Extrao polar Grupos hidroflicos No polares Cianopropil Metanol
Metablitos de Vitamina D Hidroxilas Hexano Diol Isopropanol
Separaes de lquidos Aminas leos Slica Acetona
Carboidratos Heterotomos Clorofrmio Aminopropil
Fenis Lipdeos Amina
Extrao por troca catinica Ction Aquosa Trocador fortemente ou Tampes bsicos
Catecolaminas Aminas gua fracamente catinico Tampes com alta
Herbicidas Pirimidinas Tampes cidos fora inica
Frmacos Fluidos biolgicos
Extrao por troca aninica nions Aquosa Trocador fortemente ou Tampes cidos
cidos orgnicos cidos Carboxlicos gua fracamente catinico Tampes com alta
Vitaminas cidos Sulfnicos Tampes bsicos fora inica
cidos Graxos Fosfatos Fluidos biolgicos
Fosfatos Aquoso
Vol. 24, No. 1 Mtodos de Extrao e/ou Concentrao de Compostos Encontrados em Fluidos Biolgicos 71
carboidratos e catecolaminas. Este sorvente foi aplicado na ex-
trao seletiva de nucleosdeos modificados em soro e urina de
pacientes portadores de diversos tipos de cncer
42,43
.
A fase slida tambm pode ser quimicamente modificada
com um grupo reativo ou pode ser carregada com uma soluo
contendo um composto reativo para derivatizar o analito. Um
exemplo a reao de fenobarbitona com brometo de penta-
fluorbenzila impregnado previamente na fase slida
44
.
Recentemente, extraes altamente seletivas baseadas em
colunas recheadas com suportes contendo um anticorpo ou com
polmeros impressos molecularmente, conhecidos como MIP,
tm sido desenvolvidas. As etapas de extrao, concentrao e
isolamento so possveis em um nico passo. As fases de
imunoafinidade, onde um anticorpo especfico imobilizado
em um suporte slido, tal como agarose ou slica, tambm tm
sido utilizadas em anlises de amostras de importncia biol-
gica. Um exemplo a determinao de insulina em amostras
de plasma, onde a extrao seletiva realizada em uma coluna
recheada com o seu anticorpo anti-insulina (nome original
AE9D6)
45
. Os MIP so obtidos atravs da preparao de
polmeros com stios de reconhecimento sintticos e tm uma
seletividade pr-determinada para um ou mais analitos
46-50
.
Estes stios de reconhecimento so obtidos pelo arranjo de
monmeros funcionais polimerizveis ao redor das molculas
do analito. Assim so formados complexos, atravs de interao
molecular, entre o analito e o monmero precursor. Os com-
plexos so fixados atravs de reaes de entrecruzamento de
polmeros. A remoo do analito da matriz polimrica forma
lacunas (stios de reconhecimento) que iro exibir afinidade
pelo analito. O potencial deste tipo de material alto, uma vez
que oferece resistncia mecnica alta temperatura e presso
e inerte frente a condies extremas de cidos, bases, ons
metlicos e solventes orgnicos. Estas caractersticas so alta-
mente favorveis para serem utilizadas em anlises de rotina.
Entretanto a aplicao deste material em anlises biolgicas
ainda limitada; alguns exemplos de aplicaes deste material
so anlise de drogas em plasma e urina
51-55
.
Um outro material, denominado fase de acesso restrito,
possui uma superfcie hidroflica biocompatvel na parte exter-
na e hidrofbica no interior dos poros da partcula do sorvente.
O mecanismo de separao baseado em uma combinao de
excluso e partio. As molculas grandes, tais como prote-
nas, no conseguem penetrar nos poros e eluem rapidamente,
enquanto as molculas pequenas entram nos poros e so retidas,
para posterior eluio e anlise, Figura 1. Este tipo de material
tem sido usado para anlise direta, sem remoo prvia de
protenas, de amostras de plasma e soro
56, 57
.
A extrao em discos foi originalmente introduzida para
extrao de traos de materiais orgnicos em gua
58
. Um disco
tpico, 47 mm de dimetro e 0,5 mm de espessura, contm 500
mg de sorvente, por exemplo, partculas de C-8 ou C-18, de
8 m de dimetro de partcula e 6 nm de poro, imobilizadas
no suporte
59
. O dimetro do disco escolhido de acordo com
o volume de amostra. Os discos so disponveis em vrios
dimetros, 4 a 90 mm. Dimetros de 25 a 47 mm so particu-
larmente teis na anlise de urina, pois volumes relativamente
grandes podem ser extrados (10 a 50 mL). Dimetros menores
so usados para determinao de drogas em plasma ou soro,
onde a evaporao do efluente no aconselhvel.
Os discos possuem uma srie de vantagens devido ao seu for-
mato, tais como leito mais homogneo, presses menores durante
a aplicao da amostra e na eluio, ausncia de caminhos prefe-
renciais, maior capacidade para o analito, melhor repetibilidade e
reprodutibilidade, vazes mais altas e menores volumes de
eluentes para a dessoro. O melhor desempenho dos discos
devido ao tamanho menor da partcula, que proporciona uma
transferncia de massa mais rpida. Uma das desvantagens do uso
de discos que a etapa de condicionamento mais crtica. Dife-
rente da EFS em cartuchos, a secagem do disco deve ser evitada,
pois, devido grande rea superficial, uma interface ar/gua
formada facilmente, resultando em um decrscimo das recupera-
es. Da mesma forma que os cartuchos, os poros dos discos
podem ser obstrudos quando se extrai amostras contendo uma
concentrao relativamente alta de macromolculas ou de materi-
al particulado. Assim, aconselhvel filtrar as amostras aquosas
antes da extrao ou usar pr-filtros inertes.
Para aumentar a seletividade ou a capacidade dos discos,
pode utilizar a tcnica de empilhamento. Empilhando vrios
discos de mesmo sorvente ir aumentar a capacidade e se os
sorventes forem diferentes, tem-se a reteno de compostos
com caractersticas diferentes.
O processo de extrao pode ser realizado de duas maneiras:
i) A mais comum empregar o mesmo aparelho utilizado
em CLAE para filtrao de solventes e passar a amostra
atravs do disco sob vcuo. Os analitos so retidos e so
removidos com um volume adequado de solvente;
ii) O disco suspendido na amostra lquida, por um per-
odo de tempo controlado, em seguida seco e os analitos
so dessorvidos em um outro solvente apropriado.
Nos ltimos tempos, os discos esto tendo uma grande acei-
tao em anlises biomdicas. Isto se deve necessidade de
mtodos que usem quantidades reduzidas de amostra; possuam
poucas etapas de extrao/pr-concentrao e no consumam um
tempo excessivo. O volume de eluio baixo (30 a 100L) per-
mite, em alguns casos, fazer a injeo direta no sistema
cromatogrfico. Em outros casos uma simples diluio com gua
destilada suficiente para injeo. Isto no somente elimina o
tempo requerido para evaporao do solvente, mas tambm evi-
ta qualquer perda devido transferncia de amostra. Os avanos
recentes desta tcnica so descritos por Blevins e Hall
60
.
Tcnicas de extrao on-line
Os processos de EFS podem ser realizados em dois modos:
off-line ou on-line. Na configurao on-line, o sistema
de extrao em fase slida faz parte de um sistema de CLAE,
e frequentemente inserido na ala de amostragem, sendo,
aps a coleta, conectado diretamente na linha de alta presso
da fase mvel que atua como eluente da amostra.
Faz parte da extrao on-line uma tcnica chamada de
comutao de colunas, que inclue todos os mtodos nos quais
a direo do fluxo da fase mvel alterado por meio de uma
vlvula rotatria, onde o efluente de uma coluna desviado
para uma outra coluna aps um certo intervalo de tempo. A
primeira coluna frequentemente de baixa eficincia e faz um
enriquecimento ou pr-concentrao da amostra. A frao con-
Figura 1. Fase de acesso restrito.
Novas configuraes experimentais para EFS
Extrao em Discos
O segundo formato de EFS mais utilizado depois do cartu-
cho o disco (ou membrana carregada de partcula). Neste
tipo de EFS, as partculas ativas so imobilizadas em uma
matriz inerte e estvel de microfibrilas de politetrafluoretileno
(PTFE) ou vidro.
72 Queiroz et al. Quim. Nova
tendo o analito transferida para uma segunda coluna que
possui alta eficincia. O arranjo mais comum est mostrado na
Figura 2. Quando o injetor est na posio carregar, a amos-
tra bombeada pela bomba 1 atravs da pr-coluna, onde os
analitos so retidos. Simultaneamente, a fase mvel bombe-
ada pela bomba 2 passando diretamente para a coluna analti-
ca. Quando a etapa de pr-concentrao termina, a vlvula de
injeo colocada na posio injetar e ento a fase mvel
passa pela pr-coluna e remove os analitos, enviando-os para a
coluna analtica, onde so separados. Uma reviso sobre o uso
desta tcnica aplicada em anlises de drogas presentes em flui-
dos biolgicos foi publicada por Campns-Falc et al.
61
. Um
exemplo do uso de comutao de colunas a determinao de
cido rico e creatinina em fluidos biolgicos
62
.
Uma outra configurao para tratamento de amostras on-line
o acoplamento de cromatografia lquida com cromatografia ga-
sosa (CL-CG). A CL usada para fazer uma pr-concentrao ou
enriquecimento de traos, enquanto a separao de alta resoluo
(em coluna capilar) e a deteco so feitas por CG. Neste proce-
dimento o tempo gasto na preparao de amostras mnimo. Um
exemplo de aplicao desta tcnica a determinao de beta
bloqueadores em amostras de plasma e em urina
63,64
.
Microextrao em fase slida (MEFS)
A microextrao em fase slida uma tcnica moderna
desenvolvida por Arthur e Pawliszyn
65
. Neste procedimento
empregada uma fibra tica, de slica fundida, recoberta com
um filme fino de um polmero (e.g., polidimetilsiloxano,
poliacrilato ou carbowax) ou de um adsorvente slido (e.g.,
carvo ativo microparticulado). Esta fibra tica, que uma
fase extratora, acondicionada dentro da agulha de uma
microseringa, para a extrao dos analitos
66
.
A extrao pode ser feita de duas maneiras:
i) Mergulhando a fibra diretamente na soluo da amostra.
Durante a extrao a amostra agitada e o tempo contro-
lado. Os analitos so concentrados por 2 a 15 min; aps
esta etapa a fibra recolhida para dentro da agulha;
ii) Atravs da tcnica de headspace, na qual a amostra
frequentemente aquecida e os componentes volteis so
adsorvidos na fibra, conforme Figura 3.
Aps a extrao os analitos presentes na fibra so
dessorvidos termicamente pela sua introduo no injetor aque-
cido de um cromatgrafo a gs.
As vantagens do mtodo de MEFS so que o procedimento
analtico mais simples e mais rpido que ELL e EFS, em
geral extratos mais limpos so obtidos, no usa solventes para
a eluio. Por outro lado o analito necessita ser voltil e termi-
camente estvel para ser dessorvido e determinado por CG.
Este mtodo tem sido revisado
67
e vrios artigos tm sido
publicados reportando o uso deste sistema em matrizes biol-
gicas. Alguns exemplos so anlise de etanol em sangue
68
,
pesticidas em urina e sangue
69
, entorpecentes em urina
70
e
antidepressivos em sangue
71
.
EXTRAO COM FLUIDO SUPERCRTICO (EFSC)
O fluido supercrtico o estado da matria acima da tempera-
tura crtica e da presso crtica onde o vapor e o lquido tm a
mesma densidade e o fluido no pode ser liquefeito pelo simples
aumento da presso. Dentro de uma variedade de fluidos
supercrticos, o CO
2
o mais utilizado, pois no caro, relati-
vamente no-txico, no-inflamvel, tem, comparativamente a
outros fluidos, baixa temperatura crtica, 31,3
o
C, e presso crti-
ca, 7,4 MPa, alm de ser facilmente removido aps a extrao
72
.
Em EFSC o fracionamento pode ser feito atravs de mu-
dana de presso e/ou temperatura. Modificadores, tal como
metanol, tambm podem ser empregados para mudar a seleti-
vidade de um fluido supercrtico. Comparados com solventes
lquidos, fluidos supercrticos tm viscosidades mais baixas e
maiores coeficientes de difuso de solutos, o que facilita a
transferncia de massa durante a extrao.
A extrao pode ser feita em matrizes slidas, semi-slidas
ou lquidas. A extrao com fluido supercrtico tem mostrado
Figura 2. Diagrama do sistema comutao de colunas. A) Pr-concentrao e B) Dessoro e separao cromatogrfica.
Figura 3. Ilustrao esquemtica do mtodo MEFS Headspace.
Vol. 24, No. 1 Mtodos de Extrao e/ou Concentrao de Compostos Encontrados em Fluidos Biolgicos 73
ser uma alternativa vivel aos mtodos tradicionais de extra-
o, ELL e EFS, para anlises de fluidos biolgicos. As van-
tagens desta tcnica so que a EFSC elimina o tempo gasto
com a remoo de solventes, que so utilizados nas tcnicas
convencionais de preparao de amostras; no utiliza solventes
orgnicos, que so normalmente txicos, diminuindo assim os
riscos de manipulao e minimizando os custos. Entretanto, as
desvantagens so que o analito deve ser solvel no fluido
supercrtico, o que pode ser contornado atravs da adio de
aditivos no eluente, e que a etapa de remoo do analito da
amostra pelo fluido supercrtico a etapa mais problemtica
do processo. As estratgias para a extrao seletiva de analitos
em amostras slidas foram descritas por Levy
72
.
A EFSC de drogas em plasma pode ser feita combinada com
EFS
73
ou diretamente na amostra
74
. Tambm tem sido reportada
na literatura a extrao de compostos organoclorados (PCB) em
leite materno ou soro atravs de EFSC combinada com EFS
acopladas, de forma on-line, com CG (EFSC-CG)
75
.
TCNICAS DE EXTRAO COM MEMBRANAS
Membranas slidas
Esta tcnica foi recentemente revisada por van der Merbel
76
.
Uma membrana uma barreira seletiva entre duas fases, confor-
me mostra a Figura 4, sendo que a fase 1 chamada de doadora
e a fase 2 de receptora. A separao obtida devido capaci-
dade da membrana de transportar alguns componentes da fase
doadora para a receptora mais rapidamente que outros. Em geral
a membrana nunca uma barreira semi-permevel perfeita. As
membranas podem ser classificadas baseadas na estrutura e no
mecanismo de separao. Quanto estrutura, as membranas
podem ser porosas ou no porosas e simtricas ou assimtricas,
como pode ser visualizado na Figura 5. O fenmeno que ocorre
quando uma espcie passa atravs de um meio chamado de
permeao. Os mecanismos envolvidos na permeao baseiam-
se em foras dirigidas: diferena de concentrao, diferena de
potencial eltrico ou diferena de presso. Neste trabalho sero
descritas apenas as tcnicas que levam ao fluxo molecular base-
adas em foras dirigidas de concentrao (dilise) e de presso
(ultrafiltrao), pois foram encontradas pouqussimas aplicaes
em amostras biolgicas da tcnica baseada em diferena de po-
tencial eltrico (eletrodilise) e os trabalhos publicados
77-80
no
apresentaram aplicao para uso em anlises de rotina.
Dilise
Na dilise os solutos difundem do lado doador para o lado
receptor da membrana como resultado de um gradiente de con-
centrao e principalmente utilizada para a separao de
solutos de massa molar baixa dos de massa molar alta.
Para a obteno de recuperaes elevadas por unidade de
tempo deve-se ter uma membrana com grande rea superficial,
um grande coeficiente de difuso, uma camada fina e uma baixa
tortuosidade. Entretanto, a maior desvantagem desta tcnica
que, com o aumento do tempo, o gradiente de concentrao e,
consequentemente, o fluxo decrescem lentamente at se torna-
rem zero. Alm de ser lento, as recuperaes so de somente
50% para volumes iguais de doador e receptor. Portanto ela
deve ser usada quando a concentrao do analito alta ou
quando a deteco no constitui um problema.
Para contornar este problema, a dilise contnua aplicada. Neste
caso o soluto que atravessa a membrana retirado continuamente
do compartimento receptor, mantendo, consequentemente, o gradi-
ente de alta concentrao e, portanto, um fluxo maior obtido. A
dilise contnua mais rpida e, em princpio, o analito pode ser
transferido quantitativamente para o sistema cromatogrfico. Uma
desvantagem inerente ao processo contnuo a alta diluio do
analito que requer que uma coluna de pr-concentrao seja inclu-
da na ala de amostragem do injetor cromatogrfico.
Polmeros hidroflicos so os mais utilizados como material
para dilise, especialmente celulose regenerada e acetato de ce-
lulose, que so manufaturados em diferentes configuraes, so
resistentes a vrios modificadores orgnicos e podem ser utili-
zados no intervalo de pH de 2 a 8. Entretanto, estes materiais
no so muito estveis qumica e termicamente e esto sujeitos
a ataques de bactrias. Tem sido mostrado tambm que essas
membranas interagem com diversas classes de solutos orgnicos
em solues aquosas
81
. Um outro parmetro importante o cha-
mado corte de massa molar nominal, que definido como a
menor massa molar do soluto que retida 90% ou mais na
soluo doadora. O termo nominal usado porque a forma e a
carga do soluto iro afetar a sua velocidade de migrao. Mem-
branas com cortes de 100 a 500.000 so comercialmente dispo-
nveis e alguns exemplos esto mostrados na Tabela 3. A espes-
sura da membrana normalmente de 10 a 200 m.
Figura 4. Representao esquemtica de uma membrana: 1) fase
doadora e 2) fase receptora.
Figura 5. Representao esquemtica de: A) membranas porosas e
no porosas e B) membranas porosas simtricas e assimtricas.
Tabela 3. Exemplos tpicos de membranas para dilise disponveis comercialmente.
Material Nome Comercial Fornecedor Estrutura Corte de Massa
Molar Nominal
acetato de celulose - Gilson (Frana) MP
*
15.000
ster de celulose Spectra/Por Spectrum (EUA) MP
*
100
celulose regenerada Spectra/Por Spectrum (EUA) MP
*
1000-500.000
celulose regenerada Visking Reichelt (Alemanha) MP
*
10.000-20.000
celulose regenerada Spectra/Por Spectrum (EUA) bolsa 6.000-500.000
* MP = membrana planar
74 Queiroz et al. Quim. Nova
Um exemplo interessante citado na literatura a anlise
enantiosseletiva de drogas em plasma humano atravs de
dilise, pr-concentrao em uma coluna curta, seguido de
separao por CLAE em coluna quiral
82
.
Um equipamento para enriquecimento sequencial automtico
de traos de dialisados (ASTED, Gilson), combinando a forma
on-line de dilise com CLAE, tem sido usado com sucesso na
anlise de compostos presentes em matrizes biolgicas comple-
xas
83-85
. Este sistema, Figura 6, consiste de um amostrador auto-
mtico equipado com dois diluidores (1 e 2) adaptados a uma
seringa de 1 mL, uma vlvula rotatria de 6 portas e uma cela de
dilise que usa uma membrana de acetato de celulose de 15.000
Da. Antes de chegar na cela de dilise, a amostra pode sofrer
diluies, adio de padro interno ou reaes qumicas
(derivatizao). A amostra carregada para o compartimento
doador da cela de dilise por meio do diluidor 1. O solvente
receptor e os compostos de massa molar baixa se difundem atra-
vs da membrana e so enviados continuamente para a coluna de
enriquecimento de traos (CET) atravs do diluidor 2. A dilise
pode ocorrer nos modos: mvel, estagnada ou pulsada. Aps o
trmino da etapa de enriquecimento de traos, aciona-se a vlvula
injetora para a posio injetar e os compostos, que ficaram re-
tidos na CET so eluidos para a coluna analtica do sistema
cromatogrfico (CLAE), onde so analisados. Durante a anlise
cromatogrfica a cela de dilise purgada e a CET regenerada
para que possa injetar a amostra seguinte. Este sistema permite
que mais de 100 amostras sejam analisadas em um perodo de 24
h. Embora este mtodo fornea menor tempo de dilise, o proble-
ma de interao de drogas com a membrana um fator limitante
86
.
Ultrafiltrao
Na ultrafiltrao tanto o soluto como o solvente so permeados
na membrana atravs de um gradiente de presso. Baseados no
tamanho do poro, as membranas podem ser subdivididas em
hiperfiltrao ou osmose reversa (0,1-1nm), ultrafiltrao (1-
100nm) e microfiltrao (100-1.000 nm).
A ultrafiltrao tem sido largamente utilizada para a remo-
o de protenas e de outras macromolculas em anlises de
amostras biolgicas
87-89
, pois tem uma srie de vantagens:
uma tcnica simples, as membranas so disponveis comercial-
mente (Tabela 4) e no possui problemas de diluio da amos-
tra e nem de troca de solvente.
Um problema comum que ocorre quando a soluo a ser
filtrada contm solutos que no podem passar pela membrana.
Neste caso, h a formao de uma camada de gel devido ao
acmulo de solutos retidos, que fornece uma resistncia adici-
onal transferncia de massa. Este problema pode ser
minimizado pela remoo constante destes solutos da superf-
cie da membrana. Outro inconveniente que pode ter
interaes indesejveis das molculas com a membrana
86
, tais
como protena-protena e protena-membrana
90
.
Membranas lquidas
Tcnicas de extrao atravs de membranas lquidas tm
sido descritas recentemente na literatura
91-96
. Estes sistemas so
particularmente interessantes para o preparo de amostras, que
so analisadas posteriormente por CLAE com fase reversa,
onde no recomendado injetar amostras dissolvidas em
solventes apolares. Os dois modos principais de extrao atra-
vs de membranas lquidas esto descritos a seguir:
Microextrao com solvente com extrao posterior
simultnea (MES/EPS)
A microextrao com solvente com extrao posterior simul-
tnea (MES/EPS) utiliza uma membrana lquida orgnica no
suportada ( 80 L), mantida dentro de um anel de PTFE, situ-
ado entre duas fases aquosas, uma doadora (onde se aplica a
amostra) e a outra receptora (de menor volume que a doadora).
A fase doadora agitada, por meio de um agitador magntico,
para facilitar o processo de transferncia de massa. Neste siste-
ma os analitos no-carregados so extrados da fase doadora
para a fase orgnica, e simultaneamente a fase receptora extrai
os compostos da fase orgnica. H vrios parmetros que gover-
nam estas extraes sendo mais importante o pH. Aps a extra-
o, uma alquota da fase receptora injetada diretamente no
sistema de CLAE para quantificao. Extrao quantitativa, com
um fator de enriquecimento de cinco vezes ou mais, pode ser
Figura 6. Representao esquemtica de um sistema ASTED da
Gilson. CET = coluna de enriquecimento de traos.
Tabela 4. Exemplos de membranas disponveis comercialmente para ultrafiltrao.
MEMBRANA CITC
1
PEPSINA
2
OVOALBUMINA
3
ASB
4
Whatman 10.000 80-95% 90-95% >95% >95%
MEMBRANA CITC AQTG
5
OVOALBUMINA ASB GG
6
Whatman 30.000 50-70% 45-60% 70-95% >95% >95%
MEMBRANA OVOALBUMINA ASB GG APO
7
TIRO
8
Whatman 50.000 25-60% 80->95% >95% >95% >95%
Whatman 100.000 0-20% 0-20% >95% >95% >95%
Whatman 300.000 - 0-20% 70-90% 40-70% >95%
Whatman 500.000 0-10% 0-20% 0-20% 0-20% >95%
onde: 1-CITC = Citocromo C (12.500); 2-Pepsina (34.500); 3- Ovoalbumina, (42.000); 4-ASB = Albumina Soro Bovina (67.000);
5-AQTG = Alfa Quimotripsinognio (24.500); 6-GG = Gama Globulina (160.000); 7-APO = Apoferritina (480.000); 8-TIRO=
Tiroglobulina (660.000).
Vol. 24, No. 1 Mtodos de Extrao e/ou Concentrao de Compostos Encontrados em Fluidos Biolgicos 75
obtida facilmente. Esta tcnica, por empregar pequenos volu-
mes de amostra, de 0,3 a 1,5 mL, muito interessante para
fluidos biolgicos
91,92
.
Extrao em lquido suportado em membrana (ELSM)
A tcnica de extrao em lquido suportado em membrana
consiste de um lquido orgnico sorvido sobre uma membrana
porosa fina, a qual forma uma barreira entre duas fases aquosas.
O princpio desta tcnica o mesmo descrito no item anterior,
entretanto a fase orgnica suportada por uma membrana.
O uso de ELSM para a remoo de compostos orgnicos
ionizveis de solues aquosas uma alternativa promissora
em relao ELL e EFS, devido seletividade alta e s
vazes relativamente rpidas que podem ser obtidas. Compara-
da a membranas polimricas, esta tcnica oferece velocidades
de transferncia de massa mais rpidas e a possibilidade de
utilizao de grande variedade de lquidos orgnicos e aditivos,
sem comprometimento da estabilidade da membrana
93
. Esta tc-
nica foi revisada recentemente por Jnsson e Mathiasson
94,95
.
Um exemplo da aplicao desta tcnica em fluidos biolgicos
a extrao de drogas anestsicas em urina com posterior
determinao por CLAE com detector eletroqumico
96
.
CONCLUSES
Apesar do surgimento de tcnicas modernas de separao,
onde se pode obter alta seletividade e sensibilidade, em termos
de deteco, para um dado analito (ou classe), presente em
matrizes complexas, o preparo de amostra ainda necessrio e
a etapa mais problemtica da anlise. H um nmero enorme
de publicaes nesta rea e este artigo apresenta o estado da
arte em termos de tcnicas de extrao e/ou concentrao de
compostos presentes em fluidos biolgicos.
Em geral, mais de um tipo de tcnica de extrao e/ou con-
centrao pode ser empregada para uma certa amostra. A esco-
lha da tcnica de extrao e/ou concentrao a ser utilizada
deve levar em conta as seguintes caractersticas: i) ser simples;
ii) ser rpida; iii) ter custo baixo; iv) fornecer extratos relati-
vamente livres de interferentes; v) ter recuperaes altas, com
boa exatido e preciso, para os analitos de interesse.
As inovaes nos mtodos de preparo de amostra esto vol-
tadas, principalmente, para a automao e miniaturizao e v-
rios fabricantes tm disponibilizado sistemas automticos de
preparo de amostra, particularmente na rea de extrao em
fase slida, que a tcnica mais utilizada atualmente
97
. Estas
tcnicas automatizadas so teis quando um volume grande de
amostras deve ser processado ou quando o analista fica expos-
to a algum tipo de risco ao manipular as amostras. Entretanto
equipamentos automticos so, relativamente, caros e deve-se
levar em conta o custo/benefcio.
O mtodo de preparao de amostra selecionado juntamente
com a etapa de anlise cromatogrfica devem ser validados para
assegurar a sua qualidade e confiana.
Os vrios mtodos de extrao e/ou concentrao de analitos
encontrados em fluidos biolgicos apresentam as suas vanta-
gens e desvantagens, cabendo ao usurio analis-los e optar
por aquele que mais lhe convier.
REFERNCIAS
1. Drummer, O. H.; J. Chromatogr. B. 1999, 733, 27.
2. Polettini, A.; J. Chromatogr. B. 1999, 733, 47.
3. Hubert, Ph.; Ceccato, A.; Chiap, P.; Toussaint, B.;
Crommen, J.; STP Pharma Prat. 1999, 9, 160.
4. Berrueta, L. A.; Gallo, B.; Vicente, F.; Chromatographia
1995, 40, 474.
5. Snyder, L. R.; Kirkland, J., J.; Glajch, J. L.; Practical
HPLC Method Development, John Wiley and Sons, New
York, 1997, p. 110.
6. Badcock, N. R. e Zoanetti, G. D.; Ann. Clin. Biochem.
1996, 33, 75.
7. Meng, Q. C.; Kramer, T. H.; Arhur, G. R.; Kim, P. S.;
Ferrante, F. M.; Region Anesth. Pain M. 1999, 24, 242.
8. Le Solleu, H.; Demotes-Mainard, F.; Vincon, G.;
Bannwarth, B.; J. Pharm. Biomed. Anal. 1993, 11, 771.
9. Mariot, R.; Zanglirolami, L.; J. Chromatogr. B 1996,
677, 190.
10. Benhaumou-Batut, F.; Demotes-Mainard, F.; Labat, L.;
Vincon, G.; Bannwarth, B.; J. Pharm. Biomed. Anal.
1994, 12, 931.
11. Beal, J. L; Tett, S. E.; J. Chromatogr. B 1998,
715, 409.
12. Lo, D.; Chao, T.; Ng-Ong, S; Yao, Y.; Koh, T.; Forensic
Sci. Int. 1997, 90, 205.
13. Ojanper, I.; Rasanen, J.; Vuori, E.; J. Anal. Toxicol.
1991, 15, 204.
14. Theurillat, R.; Thormann, W.; J. Pharm. Biomed. Anal.
1998, 18, 751.
15. Koves, E. M.; Wells, J.; J. Forensic Sci. 1992, 37,42.
16. Koves, E. M.; J. Chromatogr. A 1995, 692, 103.
17. Rieck, W.; Platt., D., J. Chromatogr. B 1992, 578, 259.
18. Chiba, K.; Horii, H.; Chiba, T; Kato, Y.; Hirano, T.;
Ishizaki, T.; J. Chromatogr. B 1995, 668, 77.
19. Turcant, A.; Premel-Cabic, A.; Cailleux, A.; Allain, P.;
Clin. Chem. 1991, 37, 1210.
20. Dawling, S.; Ward, N.; Essex, E. G.; Widdop, B.; Ann.
Clin. Biochem. 1990, 27, 473.
21. Maurer, H. H.; Arlt, J. W.; Kraemer, T.; Schimitt, C. J.;
Weber, A. A.; Arch. Toxicol. Suppl. 1997, 19, 189.
22. Lillsunde, P.; Michelson, L.; Forsstrom, T.; Korte, T.;
Schultz, E.; Ariniemi, K.; Portman, M.; Sihvonen, M. L.;
Seppala, T.; Forensic Sci. Int. 1996, 77, 191.
23. Berthault, F.; Kintz, P.; Mangin, P.; J. Chromatogr. 1996,
685, 386.
24. Song, D. M.; Zhang, S.; Kohlhof, K.; J. Chromatog. B
1994, 658, 142.
25. Yoshida, M.; Akane, A.; Anal. Chem. 1999, 71, 1918.
26. Fugatami, K.; Narazaki, C.; Kataoka, Y.; Shuto, H.; Oishi,
R.; J. Chromatogr. B 1997, 704, 369.
27. Pauwels, A. N.; Schepens P. J. C.; Int. J. Environ. Anal.
Chem. 1998, 71, 105.
28. Marques, E. P.; Gil, F.; Proena, P.; Monsanto, P., Oli-
veira, M. F.; Castanheira, A.; Vieira, D. N.; Forens. Sci.
Int. 2000, 110, 145.
29. Stebler, T.; Guentert, T. W.; J. Chromatogr. 1991,
564, 330.
30. Zavitsanos, A. P., MacDonald, C., Bassoo, E.; Goupaul,
D.; J. Chromatogr. B 1999, 730, 9.
31. Kimiskidis, V., K.; Kazis, A. D.; Niopas, I.; J. Liq.
Chromatogr. Relat. Technol. 1996, 19, 1267.
32. Van Gijn, R.; Havik, E.; Boven, E.; Vermorken, J. B.;
ten Bokkel Huinink, W. W.; van Tellingen, O.; Beijnen,
H.; J. Pharm. Biomed. Anal. 1995, 14, 165.
33. Henion, J.; Brewer, E.; Rule, G.; Anal. Chem. 1998,
70, 650.
34. Jemal, M.; Teitz, D.; Ouyang, Z.; Khan, S.; J. Chromatogr.
B 1999, 732, 501.
35. Zhang, N. Y.; Hoffman, K. L.; Li, W. L.; Rossi, D. T.;
J. Pharm. Biomed. Anal. 2000, 22, 131.
36. Ramos, L.; Bakhtiar, R.; Tse, F. L. S.; Rapid Commun.
Mass Spectrom. 2000, 14, 740.
37. Zweigenbaum, J.; Heinig, K.; Steinborner, S.; Wachs, T.;
Henion, J.; Anal. Chem. 1999, 71, 2294.
38. Zweigenbaum, J.; Henion, J.; Anal. Chem. 2000, 72, 2446.
39. Hennion, M. C.; J. Chromatogr. A 1999, 856, 3.
40. Majors, R. E.; LC-CG Supplement 1998, Maio, 8.
41. Lingeman, H.; Hoekstra-Oussoren, S. J. F.; J. Chromatogr.
B 1997, 689, 221.
76 Queiroz et al. Quim. Nova
42. Liebich, H. M.; Di Stefano, C.; Wixforth, A.; Schimid,
H. R.; J Chromatogr. A 1997, 763, 193.
43. Mitchell, E. P.; Evans, L.; Schultz, P.; Madsen, R.;
Yarbro, J. W.; Gehrke, C. W.; Kuo, K.; J. Chromatogr.
1992, 581, 31
44. Shen, H.; Aspinwall, C. A.; Kennedy, R. T.; J. Chromatogr.
B 1997, 689, 265.
45. Rosenfeld, J. M.; Moharir, Y.; Hill, R.; Anal. Chem. 1991,
63, 1536.
46. Andersson, L. I.; J. Chromatogr. B 2000, 739, 163.
47. Stevenson, D.; Trends Anal. Chem. 1999, 18, 154
48. Karlsson, L., Owens, P. K.; Lutz, E. S. M.; Andersson,
L. I.; Trends Anal. Chem. 1999, 18, 146.
49. Ensing, K.; Boer, T.; Trends Anal. Chem. 1999, 18, 138.
50. Brje, S.; Trends Anal. Chem. 1999, 18, 164.
51. Andersson, L. I.; Paprica A.; Arvidsson, T.; Chromatographia
1997, 46, 57.
52. Martin, P., Wilson, L. D.; Morgan, D. E.; Jones, G. R.;
Jones, K.; Anal. Commun. 1997, 34, 45.
53. Sellergren, B.; Anal. Chem. 1994, 66, 1578.
54. Rashid, B. A.; Briggs, R. J.; Hay, J. N.; Stevenson, D.;
Anal. Commun. 1997, 34, 303.
55. Wlashe, M.; Horwarth, J.; Kelly, M. T.; OKennedy, R.;
Smyth, M. R.; J. Pharm. Biomed. Anal. 1997, 16, 319.
56. Unger, K. K., Chromatographia. 1991, 31, 507.
57. Boos, K. S.; Grimm,C. H.; Trends Anal. Chem. 1999,
175, 18.
58. Hagen, D. F.; Markell, C. G.; Schmitt, G. A.; Anal. Chim.
Acta 1990, 286, 157.
59. Wells, D. A.; Lensmeyer, G. L.; Wiebe, D. A.; J.
Chromatogr. Sci. 1995, 33, 386.
60. Blevins, D. D.; Hall, D. O.; LC-CG Supplement 1998,
Maio, 16.
61. Campns-Falc, P.; Herrez-Hernndez, R.; Sevillano-
Cabeza, A.; J. Chromatogr. 1993, 619, 177.
62. Seki, T.; Yamaji, K.; Orita, Y.; Moriguchi, S.; Shinoda,
A.; J. Chromatogr. A 1996, 730, 139.
63. Hyotylainen, T.; Andersson, T.; Riekkola, M-L.;
J. Chromatogr. Sci. 1997, 35, 280.
64. Hyotylainen, R.; Pilvio, R.; Riekkola, M-L., J. High
Resol. Chromatogr., 1996, 19, 439.
65. Arthur, C. L.; Pawliszyn, J.; Anal. Chem. 1990, 62, 2145.
66. Valente, A. L. P.; Augusto, F.; Quim. Nova 2000, 23, 523.
67. Lord, H.; Pawliszyn, J.; J. Chromatogr. A 2000, 885, 153.
68. Kumazawa, T.; Seno, H.; Lee., X-P.; Ishii, A.; Suzuki,
O.; Sato, K.; Chromatographia 1996, 43, 393.
69. Lee, X-P.; Kumazawa, T.; Sato, K.; Suzuki, O.;
Chromatographia 1996, 42, 135.
70. Ishii, A.; Seno, H.; Kumazawa, T.; Watanabe, K.; Hattori,
H.; Suzuki, O.; Chromatographia 1996, 43, 331.
71. Lee, X-P.; Kumazawa, T.; Sato, K.; Suzuki, O.;
J. Chromatogr. Sci. 1997, 35, 302.
72. Levy, J. M.; LC-GC 1999, 17, 14.
73. Liu, H.; Cooper, L. M.; Raynie, D. E.; Pinkston, J. D.;
Wehmeyer, K. R.; Anal. Chem. 1992, 64, 802.
74. Liu, H.; Wehmeyer, K. R.; J. Chromatogr. B 1994,
657, 206.
75. Johansen, H. R.; Thorstensen, C.; Greibrokk, T.; Becher,
G.; J. High Resol. Chromatogr. 1993, 16, 148.
76. van der Merbel, N. C.; J. Chromatogr. A 1999, 856, 55.
77. Debets, A. J. J.; Kok, W. Th.; Hupe, K. P.; Brinkman, U.
A. Th.; Chromatographia 1990, 30, 361.
78. Buscher, B. A. P.; Hofte, A. J. P.; Tjaden, U. R.; van der
Greef, J.; J. Chromatogr. A 1997, 777, 51.
79. Buscher, B. A. P.; Tjaden, U. R.; van der Greef, J.;
J. Chromatogr. A 1997, 764, 135.
80. Buscher, B. A. P.; Tjaden, U. R.; van der Greef, J.;
J. Chromatogr. A 1997, 788, 165.
81. van de Merbel, N. C.; Hageman, J. J.; Brinkman, U. A.
Th.; J. Chromatogr. 1993, 634, 1.
82. Ceccato, A.; Toussaint, B.; Chiap, P.; Hubert, P.;
Crommen, J.; J. Pharm. Biomed. Anal. 1997, 15, 1365.
83. Johansen, K; Krogh, M.; Rasmussen, K. E.; J. Chromatogr.
B 1997, 690, 223.
84. Shintani, H.; J. Chromatogr. Sci. 1996, 34, 92.
85. Chiap, P.; Hubert, Ph; Boulanger, B.; Crommen, J.; Anal.
Chim. Acta 1999, 391, 227.
86. Oravcov, J.; Bohs, B.; Lindner,W.; J. Chromatogr. B
1996, 677, 1.
87. Rossi, D. T.; Wright, D. S.; J. Pharm. Biomed. Anal.
1997, 15, 495.
88. Su, Y.; Hen Y. Y.; Chu, Y. Q.; van der Poll, M. E. C.;
Relling, M. V.; J. Chromatogr. B 1999, 732, 459.
89. Bantan, T.; Milacic, R.; Mitrovic, B.; Pihlar, B.; J. Anal.
At. Spectrom. 1999, 14, 1743.
90. Koehler, J. A.; Ulbricht, M.; Belfort, G.; Langmuir 1997,
13, 4162.
91. Ma, M. H.; Cantwell, F. F.; Anal. Chem. 1998, 70, 3912.
92. Pedersen-Bjergaard, S.; Rasmussen, K. E.; Anal. Chem.
1999, 71, 2650.
93. Chimuka, L.; Megersa, N.; Norberg, J.; Mathiasson, L.;
Jonsson, J. A.; Anal. Chem. 1998, 70, 3906.
94. Jnsson, J. A.; Mathiasson, L.; Trends Anal. Chem. 1999,
18, 318.
95. Jnsson, J. A.; Mathiasson, L.; Trends Anal. Chem. 1999,
18, 325.
96. Trocewicz, J.; Suprynowics, Z.; Markowics, J.; J. Chromatogr.
B 1996, 685, 129.
97. Smith, G. A.; Lloyd, T. L.; LC-GC Supplement 1998,
Maio, S22.