QFL-5922

Espectrometria de Massa

Luiz Henrique Catalani

Data Tpicos
30/03 Espectrometria de massas Tcnicas bsicas
06/04 Espectrometria de massas Teoria de fragmentao
13/04 Espectrometria de massas Teoria de fragmentao
20/04 Resoluo de problemas
27/04 1 Prova
04/05 Seminrios
Perodicos especializados em
espectrometria de massas:

1. International Journal of Mass Spectrometry
2. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes
3. Journal of Chromatography. A, Including Electrophoresis, Mass
Spectrometry and other Separation and Detection Methods
4. Journal of Mass Spectrometry
5. Journal of the American Society for Mass Spectrometry
6. Mass Spectrometry for Biotechnology
7. Mass Spectrometry Reviews
8. Rapid Communications in Mass Spectrometry
Histrico
1897: J.J. Thompson descobre eltron e determina m/z
1912: J.J. Thompson constri o primeiro espectrmetro de massas
1942: Demster desenvolve a fonte de impacto de eltrons
1942: Primeiro instrumento comercial para anlise orgnica
1953: Quadrupolo e ion trap (W. Paul e H.S. Steinwedel, Nobel 1989)
1956: Primeiro GC-MS
1974: Primeiro HPLC-MS
1987: Demonstrao de MALDI
1988: Demonstrao de ESI
1990s: Crescimento explosivo de MS, devido a ESI e MALDI
2002: Nobel para inventores ESI (Fenn e Tanaka)
A massa molecular
A frmula molecular
Detalhes estruturais do
composto
Informaes Obtidas da
Espectrometria de Massa
A massa de fragmentos
Espectrometria de Massas
Tcnica analtica para:
identificao de compostos desconhecidos
quantificao de compostos conhecidos.

Sensibilidade: Substncias podem ser detectadas com
quantidades mnimas de amostra (10
-12
g, 10
-15
moles pra
um composto de massa 1000 Daltons.

Seletividade: Substncias podem ser identificadas e
quantificadas em concentraes muito baixas (uma parte
em 10
12
) em misturas complexas.
Definio IUPAC
Espectrometria de Massas:

Estudo de sistemas pela formao de ons em fase gasosa, com ou sem
fragmentao, que so caracterizados por suas relaes massa carga e
abundncias relativas
Fonte
Ionizao
Analisador
Separao dos ons
Detector
Deteco dos ons
Sistema de
dados
Manipulao
dos dados
Entrada
Introduo
da amostra
Sada dos
dados
Espectro de massas
m/z
0 50 100 150 200 250
Io
n
A
b
u
n
d
a
n
c
e
(%
)
0
20
40
60
80
100
Em que consiste EM
Espectro de massas
m/z
I
o
n

a
b
u
n
d
a
n
c
e

(
%
)

100
60
40
80
20
Pico base (ion 100%)
Pico do on molecular
(Precursor)
ons fragmentrios
Istopos
Remoo de eltrons
M M
+

e
-
Captura de eltrons
M M


+ e
-
Protonao
M + H
+
[MH]
+

Cationizao
M + Na
+
[MNa]
+

Desprotonao
M H M

H
+
Reaes de produo de ons em EM
Necessidade de vcuo
Passo livre mdio
percorrido por uma
molcula entre colises
mTorr) em (
95 , 4
cm) (em
p
L =
Sugere presses da ordem de 10
-5
torr para mover
uma molcula um metro sem coliso
Espectrmetro de massas
Fonte de ons Analisador Detector
Quadrupolo
TOF
Ion trap
FT-ICR
Setor Magntico
Alto vcuo 10
-5
-10
-8
mbar
Fotomultiplicador
Multiplicador de eltrons
Microchannel Plate
Sistema de dados
ESI*
APCI*
MALDI
EI
CI
*Fonte de ons a presso atmosfrica
Sistema
de
insero
HPLC
GC
Bomba
seringa
Mtodos de produo de ons em EM
Mtodos de produo de ons em EM
EI (electron impact)
CI (chemical ionization)
FAB (fast atom bombardment)
MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization)
API (atmospheric pressure ionization)
ESI (electrospray ionization)
APCI (atmospheric pressure chemical ionization)
ICP (inductively-coupled plasma)
TIS (thermal ionization source)
Como ocorre a ionizao por EI?
Fonte de Impacto Eletrnico (EI)
70 eV e
-
A-B-C
Eltrons de
baixa energia
<70 eV e
-

A-B-C
+.

A
+
+ B-C
.
A
.
+ B-C
+
B + C
+
A-B
.
+ C
+
A-B
+
+ C
.

B
+
+ C A + B
+
A
+
+ B
ction radicalar
Mtodo robusto e simples
Fragmentao fornece informaes estruturais;
Espectros so facilmente reprodutveis;
Existncia de biblioteca de impresses digitais;
Vantagens
Limitaes
Requer volatilizao da amostra ou derivatizao;
Para substncias de massa molar <800 uma
Amostra deve ser termicamente estvel;
on molecular pode ser de difcil identificao;
Fragmentao pode ser extensa (molculas maiores).
Vantagens e desvantagens de EI
Ionizao qumica - CI
Como ocorre a ionizao qumica?
Modificao de EI
Resulta em pouca ou nenhuma fragmentao
Gs e amostra entram junto
Amostra tipicamente 1% da mistura
Maior presso do gs gera ionizao preferencial
Espcie inica gerada transfere carga para o analito
Mecanismos de ionizao qumica
Troca de carga (hlio como reagente)
Reaes cido-base
Adio de grupo alquila
He
+
+ M ! He + M
+

Com metano: CH
5
+
+ M ! CH
4
+ M
+
(P elevadas)
Com gua: OH
-
+ MH ! H
2
O + M
-

C
2
H
5
+
+ M ! MC
2
H
5
+

Como ocorre a ionizao qumica?
A fonte CI uma fonte EI modificada
O gs reagente pode ser:
Introduzido diretamente na fonte
Misturado com a amostra antes de
entrar na fonte.
Requer coliso, logo, as presses so
mais altas
mTorr 495
4,95
01 , 0
95 , 4
=
=
=
p
p
cm
p
L
Determinao do peso molecular (on molecular)
Baixa fragmentao
Vantagens
Limitaes
Vrios parmetros (gs, reagente e presso relativa) dificultam a
reprodutibilidade
Ausncia de espectros de referncia
Perda de informaes estruturais devido baixa fragmentao
Vantagens e desvantagens de CI
Bombardeamento rpido de tomos (FAB)
Tcnica rpida e simples para anlise de compostos de 300 a
6000 Da;
Amostra dissolvida numa matriz lquida, viscosa e com baixa
presso de vapor (glicerol ou lcool 3-nitrobenzlico);
Matriz bombardeada com feixe de tomos (xennio ou
argnio) ou ons (csio) de alta energia cintica;
Molculas so removidas da superfcie da matriz, entram na
fase gasosa e se ionizam por protonao ou desprotonao;
on resultante estvel e fragmenta pouco.
Como ocorre a ionizao por FAB?
Rapidez e simplicidade
Tolerante s variaes na amostra
Corrente intensa de ons (bom para altas resolues)
Vantagens
Limitaes
Requer que o analito seja solvel na matriz lquida
Requer pureza e boa quantidade de amostra
No adequado para compostos com mais de duas cargas
Vantagens e desvantagens de FAB
EM via FAB de
5 peptdeos
ons (M+H)+;


Seqenciamento
do m/z 872
Preparao de amostra: analito dissolvido junto com uma
substancia orgnica, matriz, que possui absoro intensa
no " do laser (" = 337 nm para laser de N
2
);
Dessoro da soluo slida por um laser pulsado (ns) de
alta intensidade;
Matrizes tpicas: cido 2,5-dihidroxibenzico; cido 3,5-
dimetxi-4-hidroxicinmico; cido 5-clorosaliclico;
Espectro resultante inclui ons (M+H)
+
, e outros com prtons
adicionais, retirados da matriz.
Deve ser usado com analisadores compatveis com mtodos
pulsados (TOF ou FT-ICR)
Dessoro/ionizao a LASER
assistida por matriz - MALDI
MALDI
Placa de amostras para MALDI
100 poos padro
Matrizes tpicas
Utilizadas em MALDI
Baixa concentrao do analito
Velocidade
Anlise de polmeros e macromolculas polares e no-
polares (M>50.000)
Vantagens
Limitaes
No compatvel com LC/MS
Difcil obteno de espectros de MS/MS
Deve ser usado com analisadores compatveis com mtodos
pulsados (TOF ou FT-ICR)
Vantagens e desvantagens de MALDI
EM via MALDI de um
anticorpo monoclonal




EM via MALDI de
poli(metil metacrilato)
M
w
= 7100 Da
MW mero = 100
Ionizao por electrospray - ESI
Substncia dissolvida numa mistura, p.ex. agua-metanol,
injetada diretamente, ou por HPLC, ou por eletroforese capilar.
ons so formados a partir das gotas a presso atmosfrica e
formam um jato por expanso livre. O mecanismo exato ainda
objeto de especulaes. Amostragem ocorre atravs de um
skimmer, e introduzidos no alto vcuo do espectrmetro.
ons com nmero elevado de cargas.
ons com carga mltipla podem ser detectados mesmos com
instrumentos menos sofisticados.
O nmero de cargas pode depender do pH, da presena de sais,
desnaturao da protena, quebra de ligaes S-S, etc.
Ionizao por electrospray
Amostras no-volteis
Ionizao branda a presso atmosfrica
Anlise de compostos de elevado peso molecular
Acoplamento com HPLC e eletroforese capilar
Vantagens
Limitaes
Espcies multiplamente carregadas exigem transformaes matemticas
para interpretao do espectro
Complementar APCI. No boa para compostos no carregados, no
bsicos e de baixa polaridade, como esterides
Muito sensvel a contaminantes, tais como metais alcalinos ou compostos
bsicos
Corrente de ons relativamente baixa
Vantagens e desvantagens de ESI
EM da lisozima: MW calculado = 17828 2.0 Da
Mioglobina de cavalo
MW = 16.951,5 Da

A. ons de carga +12 a +24 em
baixa resoluo
B. Ampliao do +17
mostrando picos isotpicos
(resoluo 15.000)
Determinao do nmero de cargas e de M em
espectros contendo ons com cargas mltiplas
a) Em espectros electrospray, a massa de um on m
1
com carga z
1
pode ser
equacionada com a massa da molcula (M) e da massa do prton (m
p
)
) ( ) (
1 1 2
j z m M j z m
p
! + = !
) (
1 1
1 1 1
p
p
m m z M
z m M z m
! =
+ =
b) Escolhendo outro pico no espectro, separado por (j-1) picos em ordem crescente
de m/z, podemos equacionar a massa m
2
como
c) Da combinao de (1) e (2):
(2)
(1)
) (
) (
1 2
2
1
m m
m m j
z
p
!
!
=
(3)
Ionizao qumica a presso atmosfrica (APCI)
Ionizao similar electrospray, com exceo de que:

Ocorre em uma coroa de descarga e no no capilar
Capilar encontra-se aquecido e no est submetido alta
voltagem
As molculas de solvente so ionizadas primeiramente
.
NATUREZA DA AMOSTRA MTODO DE IONIZAO EXEMPLO
Amostras gasosas, volteis e
termicamente estveis
EI, CI CO2, NO, solventes,PAH, dioxinas
Molculas pequenas (< 1000 u),
puras e suficientemente estveis e
volteis para serem dessorvidas de
uma sonda
EI, CI
(Em EI o pico do on molecular pode
no aparecer)
Muitas molculas orgnicas
Molculas pequenas (< 1500 u) que
no so volteis ou termicamente
estveis. Devem ter um grau de
afinidade de prton
FAB (se pura),
ESI ou APCI (infuso ou via HPLC,
se necessrio).
Aminocidos, carboidratos, lipdios
Molculas como as acima, mas que
podem ser derivatizadas para dar
produtos volteis e estveis
EI ou CI usando CG/MS. cidos como steres, lcoois como
silil-teres
Peptdeos, protenas e
oligonucleotdeos
ESI (via bomba de infuso ou
acoplada com micro-CLAE).
Protenas intactas.
Protenas, peptdeos e misturas do
mesmos
MALDI PPG, PEG
Interaes no-covalentes ESI (nanoflluxo) com MS-MS. Interaes droga-droga ou droga-
protena
Anlise elementar ICP ou TIS Solo
Mtodos de anlise de ons em EM
Mtodos de anlise de ons em EM
Deflexo eltrica
Deflexo magntica
Quadrupolo
Tempo de vo TOF (time of flight)
Aprisionamento de ons IT (Ion trap)
Ressonncia ciclotrnica de ons FT-ICR (Fourrier-
transform ion cyclotron resonance)
Deflexo magntica
Deflexo magntica
Deflexo eltrica
Deflexo eltrica
Foco duplo alta resoluo
Modelo Nier-Johnson - E constante H varivel
Quadrupolo
-
+
-
++
--
+
Quadrupolo
2 2
2
! D
V
z
M
=
D
Para um determinado V, D e ! s existe um M/z que tem
uma oscilao estvel atravs do quadrupolo sem chocar-
se com os polos.
TOF (tempo de vo)
TOF tipo Reflectron
TOF (tempo de vo)
TOF = t
0
+ t
a
+ t
D
+ t
d

Onde:
t
0
= tempo de formao do on
t
a
= tempo de acelerao
t
D
= tempo de percurso
t
d
= tempo de resposta do detector
TOF (tempo de vo)
Aprisionamento de ons (Ion trap)
ons so presos atravs da ao de trs eletrodos (2 end-cap e um anel)
Voltagens aplicadas geram uma cavidade onde os ons oscilam em uma
trajetria estvel
A trajetria exata dos ons dependente das voltagens aplicadas e da razo
m/z
A alterao dos potenciais destabiliza a trajetria resultando em sua ejeo
atravs do endcap de sada, em ordem crescente de m/z
possvel isolar um valor particular de m/z e, assim, permitir experimentos
CID (collision induced dissociation), para anlise de ons-filho e MS
n
Aprisionamento de ons (Ion trap)
Ressonncia ciclotrnica de ons
FT-ICR (Fourrier-transform ion cyclotron resonance)
ons se movem em um movimento circular em um campo magntico
A freqncia ciclotrnica do movimento circular dependente da massa
Sob excitao externa de mesma freqncia (ressonante), a orbita aumenta
e, quando se aproxima do receiver plate, induz uma corrente imagem que
amplificada e digitalizada
Um unico pulso contendo todas as freqncias gera uma corrente-imagem
contendo informaes sobre todos os ons de diferentes massas (diferentes
freqncias)
Transformada de Fourrier do sinal da corrente-imagem gera espectro de
massa
Ressonncia ciclotrnica de ons
Ressonncia ciclotrnica de ons
Tcnica de grande resoluo (maior entre TOF, IT e anteriores)
Adequado para tcnicas pulsadas como MALDI
Magneto supercondutor provm calibrao estvel
Faixa dinmica de trabalho baixa
Apresenta artefatos como harmonicas e bandas laterais
Ressonncia ciclotrnica de ons
Orbitrap
- Similar ao FT-ICR
- Maior resoluo (~200.000)
- Maior faixa dinmica de trabalho
(~5000 Da)
Anlise em srie Tandem MS
Anlise em srie Tandem MS
Combina dois ou mais analisadores diferentes ou do mesmo tipo
O primeiro analisador isola o on de interesse (on parente)
ons so fragmentados entre o primeiro e segundo analisador atravs
de colises ou irradiao
O ltimo analisador obtm o MS dos fragmentos (ons filho)
Detectores
Detectores - Fotomultiplicadoras
Detectores Multiplicadora de dindo
contnuo
Detectores Microchannel plate
12,5 m de dimetro
Fim