ANLISIS DE PROTENAS EN GRNULOS Y HOJAS DE Acacia hindsii Y EN

HORMIGAS DE LA REGIN DE IRAPUATO

Ramrez Ramrez, G.
(1)
; Heil, M.
(2)
; Orona Tamayo, D.
(2)
; Adame lvarez R.
M.
(2)
; Ramrez Ramrez, D.T.
(3)
; Durn Flores, F.D.
(1)
(1)
Facultad de Qumica
Universidad Autnoma de Quertaro
(2)
Departamento de Ingeniera Gentica
Centro de Investigacin y Estudios Avanzados, Campus Guanajuato
(3)
Facultad Ciencias Qumicas
Universidad de Guanajuato

RESUMEN
Se extrajeron protenas de hojas, grnulos de Acacia hindsii y hormigas de la regin por
dos mtodos (fenol y TCA/Acetona) posteriormente se corri un gel SDS-PAGE al 13%
para evaluar la calidad de las extracciones. El mtodo TCA/Acetona fue el que presento
mayor limpieza y mejor calidad de protena. Se corrieron geles en dos dimensiones (2-
DE) para grnulos con gradiente de pH 3-10 y 4-7, de los perfiles obtenidos, a las
protenas se les asigno funcin e identidad por medio de bsquedas bioinformaticas en
donde se uso como referencia el frijol soya (Glycine max), encontrando protenas de
reserva que contienen aminocidos esenciales para insectos, con lo que podemos
presuntivamente decir que esto ayuda a la interaccin planta-hormiga.

INTRODUCCIN
Algunas plantas para defenderse cuentan con sistemas especializados como las espinas,
produccin de gomas otras son venenosas o demasiados altas para los depredadores, a
este tipo de defensa se le conoce como Defensa Directa, sin embargo existen a su vez
las llamadas Defensas Indirectas, el termino se introdujo en la literatura hace 20 aos
segn resume Heil, M. (2008) de Dicke y Sabelis, (1988). En la Defensa Indirecta la
planta utiliza insectos para ahuyentar herbvoros o vegetacin competitiva que pueda ser
daina para esta, a su vez proporciona al insecto algn tipo de recompensa, lo cual nos
lleva a un mutualismo planta-insecto. En Mxico una de las plantas estudiadas que
utiliza defensa indirecta es Acacia hindsii. Las Acacias son arboles o arbustos
espinosos; son plantas mirmecoflicas (relacin planta-insecto, en este caso hormiga), a
su vez existen Acacias mirmecoflicas que pueden ser mirmecofticas que son aquellas
en la que existe un mutualismo planta-hormiga permanente (la planta proporciona
alimento y casa y la hormiga a su vez defiende a la planta) o no mirmecoftica aquellas
en las que el mutualismo se da solamente cuando la planta es atacada.
Acacia hindsii es una planta mirmecoftica, la planta se encarga de proporcionar a la
hormiga casa (espinas) y alimento (grnulos y nctar extrafloral), y a cambio la hormiga
defiende a la planta contra herbvoros y vegetacin
competitiva.
Los grnulos (Food Bodies) son un tipo de hoja
modificada que utilizan las hormigas para
alimentarse, se encuentran en la punta de la hoja
(Fig. 1). Los grnulos de Acacia contienen todos los
aminoacidos y cidos grasos que son esenciales para
los insectos; el contenido de lipidos y proteinas es
mayor que en las hojas (Heil, M. y col. 2004) por
lo que las hormigas prefieren este tipo de hoja
modificada en lugar de la hoja normal. Para abordar esta idea, nos dimos a la tarea de
Fig. 1. Grnulos en Acacia hindsii
1

separar extractos proteicos de granulos de A. hindsii por medio de 2-DE e identificar
aquellas proteinas por medio de analisis bioinformatico y relacionar si existen proteinas
con alguna relacion importante entre la interaccion planta-hormiga.

PARTE EXPERIMENTAL
Extraccin de proteina. El material fresco fue molido en un mortero en presencia de
nitrgeno lquido, se pesaron 15 mg de grnulos, 97 mg de hojas tomadas de A.hindsii
cultivada en invernadero y 13 mg hormiga y se resuspendieron en 1 ml de buffer de
extraccin fro (0.7 M de sucrosa; 0.1 M KCl; 0.5 M Tris-HCl, pH 7.5 y 50 mM EDTA,
-mercaptoetanol al 2% y 1% de inhibidores de proteasas) y se adiciono un volumen
igual de fenol saturado con Tris-HCl, pH7.5, se agito por 30 min a 4C y se
centrifugaron a 7000 rpm por 30 min a 4C. A la fase superior se le adiciono un
volumen igual de buffer de extraccin y se repitieron los pasos anteriores dos veces. Las
protenas precipitaron con 5 volmenes de acetato de amonio en metanol 0.1 M fro, y
se almacenaron a -20C. se centrifug por 30 minutos a 7000 rpm a 4C, la pastilla se
lavo con 2 volmenes de metanol fro dos veces y se centrifugaron 10 minutos a 7000
rpm a 4C. Para el mtodo TCA/Acetona, el mismo peso de cada tejido fue extrado con
el mismo buffer de extraccin (como arriba), se agito 30 min y se centrifugaron a
14000 rpm por 30 min a 4C, se colectaron los sobrenadantes y fueron precipitados com
1 ml de TCA/Acetona 10% y se incubo por toda la noche a -20C, se volvieron a
centrifugar a 14000 rpm en frio, las pastillas fueron lavadas 5 veces con acetona/DTT
(0.1%) y se corrieron en un SDS-PAGE al 13% .

Electroforesis en dos dimensiones. Aproximadamente 90-120 g de protena fueron
solubilizadas en 125 L de buffer de rehidratacin (Urea 7M, Thiourea 2 M, CHAPS
2%, IPG Buffer 2%, Azul de bromofenol 0.0002%), la mezcla se coloco en una tira de 7
cm con gradiente de pH de 3-10 y 4-7 y se rehidrataron por 16 h continuas, despus de
este tiempo, se corri el IEF a 12kVh. Para el SDS-PAGE, las tiras fueron equilibradas
15 min con Buffer de equilibrio (6 M urea, 75 mM Tris-HCl pH 8.8, 29.3% glicerol, 2%
SDS, 0.002% azul de bromofenol y DTT 64 mM) y otros 15 min con el mismo buffer
pero ahora con iodoacetamida 18.4 mM, posterior a esto, las tiras fueron corridas en un
SDS-PAGE al 13%.

RESULTADOS









2

Fig.2. Comparacin de los dos mtodos de extraccin de protenas de grnulos (FBs), hojas (L)
y hormiga(A) en un SDS-PAGE al 13%. Carriles: 1(FBs), 3(L) y 5(A) protenas extradas con
fenol y 2(FBs), 4(L), 6(A) extradas con TCA/Acetona.

Gy1
Gy









Fig. 4. Gel de 2-DE de grnulos con gradiente
pH 3-10 mostrando protenas de reserva
(almacenamiento).
Fig.3. Gel de 2-DE de grnulos con gradiente pH
4-7.





Fig. 5. Categorizacin funcional de protenas de grnulos de A.
hindsii


















DISCUSIN DE RESULTADOS
A. hindsii es una planta mirmecoftica y con altos componentes recalcitrantes en sus
diferentes tejidos, por lo tanto en nuestra investigacin, utilizamos dos mtodos para la
extraccin de protenas de hojas y grnulos de la misma planta y de hormiga, como se
puede observar en la figura 2, la comparacin de los extractos de protenas obtenidos
con el mtodo con fenol, no fue viable, debido a que no pudimos apreciar patrones de
bandeo en ninguno de los tejidos (carriles 1, 3 y 5), por otro lado, con el mtodo de
TCA/Acetona, obtuvimos patrones de bandeo de buena calidad, cantidad y limpieza
(carriles 2, 4 y 6). Nuestros resultados no son sorprendentes, debido a que Saravanan y
col. (2004) extrajeron protenas con el mtodo de fenol de tejidos altamente
recalcitrantes como jitomate, pltanos, naranjas y uvas, y obtuvieron buena calidad en la
protena analizada, por lo tanto esto nos puede indicar que A. hindsii es una planta con
mayores componentes recalcitrantes (polisacridos, sales, lpidos, compuestos fenlicos
etc.) que las plantas mencionadas. Hasta la fecha, no se haba realizado un anlisis de
protenas en A. hindsii, por lo que nos dimos a la tarea de separar los extractos
obtenidos por medio de 2-DE (figuras 3 y 4), donde obtuvimos perfil y buena
3

separacin electrofortica de las protenas de grnulos de A. hindsii, sin embargo, las
muestras separadas con pH de 3-10, fue imposible realizar un anlisis debido a la gran
cantidad de protenas encontradas, para solucionar esto, las protenas fueron separadas
por un gradiente de pH de 4-7, obtenindose manchas individuales de protenas lo que
nos ayudo para realizar la bsqueda bioinformatica de las protenas ms abundantes,
con esta bsqueda pudimos asignar la identidad y la categorizacin de las protenas de
los grnulos (Figura 5) por medio de la base de datos de ExPASY, observando protenas
involucradas en diferentes procesos celulares, resaltando aquellas protenas que son de
almacenamiento, las cuales se creen que contienen los principales aminocidos y que
concuerda con lo reportado por Heil, M. y col.(2004), que los grnulos contienen
aminocidos esenciales para los insectos, sin embargo, se necesitan hacer mas estudios
para apoyar completamente esta especulacin.

CONCLUSIONES
Es importante que en la protemica comparativa puedan utilizarse protocolos que sean
los idneos para la extraccin de protenas, por lo tanto cuando utilizamos el mtodo de
extraccin por fenol y TCA/Acetona, el mtodo TCA/Acetona fue el ms efectivo para
eliminar contaminantes, como lpidos, componentes fenlicos, pigmentos, polisacridos
etc, y obtener una protena de calidad. Una segunda conclusin es que el protocolo de
extraccin genero una buena separacin electrofortica de protenas en 2-DE y por
ultimo existen circuitos bioqumicos que interaccionan propiamente en la produccin de
protenas de reserva de los grnulos de A. hindsii y que son aprovechadas por las
hormigas para su alimentacin.
BIBLIOGRAFA
Artculos:
Heil, M., y col. Main nutrient compounds in food bodies of Mexican Acacia ant-
plants, Chemoecology, 14, 45-52, 2004

Heil, M., Indirect defence via tritrophic interactions, New Phytologist, Vol. 178, Num.1, 41-
61(21), 2008.

Saravanan, R. S. and Rose, J.K.C., A crititical evaluation of sample extraction
techniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues, Proteomics
4:2522-2532, 2004.

Internet:
Base de datos ExPASY. http://ca.expasy.org/cgi-bin/tagident0.pl

Manuales:
Humana Press, Handbook of Proteomics Methods. 409-416. 2003

GE Healthcare, Handbook 80-6429-60AC,2-D Electrophoresis, Principles and
Methods, 2004
4