INGENIERA BIOQUMICA

MATERIA:
Microbiologa

DOCENTE:
IBQ. Csar David Lara Coll

ALUMNO:
ngel de Jess Dzul Beh

NOMBRE DEL TRABAJO:
Reporte tcnico de tincin

Oxkutzcab, Yucatn a lunes 18 de Febrero de 2013







INSTITUTO TECNOLGICO SUPERIOR DEL
SUR DEL ESTADO DE YUCATN
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Tcnicas de tincin
Fundamentos
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de
ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la
clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es
la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos
diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes
celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de
actividad respiratoria, etc.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de
teirlas, proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms
corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como
formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el colorante,
no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijacin se
realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un portaobjetos.
Tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el
proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el encogimiento de las
clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo
que son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas
o teidas no pueden realizarse con mucha precisin.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna
afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con
frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con
intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como
los cidos nuclicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos
son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son
molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los
constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas.
Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de
colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan
con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la
localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante
liposoluble es el negro Sudn.
Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada
con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia
se denomina mordiente; un mordiente habitual es el cido tnico. El mordiente se
combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr
atacar el colorante. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las
clulas para la microscopa, son suficientes los procedimientos simples de tincin.
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EI azul de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las clulas
bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los
detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en
muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie.
La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se
dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve,
por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa
es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que
simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de
partculas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en
agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de
las clulas en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la
presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas.
Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con
precaucin, ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman
en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares
autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el
mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse
muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos
equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

Preparacin de un frotis
Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que
se va a teir (si es lquido) o se hace rodar el hisopo con que se tom la muestra.
Una vez que el hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no est estril,
ya no puede ser empleado para inocular los medios de cultivo. Puede usarse una
aguja estril para transferir una pequea cantidad de un cultivo bacteriano a la
superficie del portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de agua o
solucin salina previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se trata de
colonias muy pequeas que pueden perderse en una gota de lquido se emplea
una varilla delgada de madera estril con la cual se toca la colonia obtenindose
as una fraccin apreciable del desarrollo. El material se frota directamente sobre
el portaobjetos, donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el
portaobjetos se deja secar al aire o ben se pasa varias veces por la zona azul de
la llama de un mechero de Bunsen hasta que el vidrio est tan caliente que
moleste al tacto pero no queme.



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Examen de muestras al microscopio
Segn la manipulacin que efectuemos sobre la muestra a observar y segn los
colorantes que empleemos durante el proceso, podemos hablar de diferentes
modalidades de tincin.

Examen microscpico directo de las muestras clnicas sin tincin.
No se utiliza ningn tipo de colorante.
Es el montaje directo hmedo o examen en fresco: las muestras se extienden
directamente sobre la superficie de un portaobjetos para su observacin. El
material que es demasiado espeso para permitir la diferenciacin de sus
elementos puede diluirse con igual volumen de solucin salina fisiolgica estril.
Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la superficie del material.
Este tipo de preparacin se emplean para detectar trofozotos mviles de parsitos
intestinales como Giardia, Entamoeba, huevos y quistes de otros parsitos, larvas
y gusanos adultos, Trichomonas, hifas de hongos, etc.

En la imagen: Candida sp en un examen en fresco.

Examen microscpico de las muestras clnicas levemente modificadas.
Tincin simple
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien con
la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).
El Hidrxido de potasio al 10% (solucin de KOH) permite ver elementos de
hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por
ejemplo de la clula husped, pero no acta sobre los polisacridos de las
paredes celulares de los hongos.
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La tinta china o Nigrosina permite observar clulas levaduriformes capsuladas
(Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacridos capsulares rechazan la tinta
china y la cpsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos.
Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de
heces para observar la presencia de leucocitos.

En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tincin con tinta china.

Examen microscpico de las muestras clnicas muy modificadas. Tincin
diferencial
Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian
en funcin de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia
constitucin qumica.
Los ejemplos clsicos seran la tincin de GRAM o la de Ziehl-Neelsen
En la imagen: BGN y levaduras en una tincin GRAM

Microfotografa

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Examen de muestras al microscopio: la tincin GRAM
La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el
laboratorio bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente
familiarizado. Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de
rutina del Laboratorio de Microbiologa las referencias a la morfologa celular
bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la
tincin de GRAM

Descrita en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente: el Frotis fijado
con calor se tie 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin
Yodada durante 1 min y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol
etlico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 seg.
Lavar y secar.
Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la
desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las
bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este
caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico,
sino simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias).
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a
las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de
la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para
prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere
rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula gram-positiva es gruesa y
consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como algo de
cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es
peptidoglicano. La pared de la clula gram-negativa, por otro lado, contiene una
capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una
membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas.
Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es peptidoglicano.

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Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias
fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu
con algn detalle la tincin de Gram y las interpretaciones que actualmente se
hacen sobre el porqu de su funcionamiento.
Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una
solucsn de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son
lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las
clulas, tanto las grampositivas como las gramnegativas, estn teidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El
ingrediente activo es aqu el I
2
; el KI simplemente hace soluble el I
2
en agua. El
I
2
entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta.
De nuevo tanto las clulas grampositivas como las gramnegativas se encuentran
en la misma situacin.
Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona,
sustancias en las que es soluble el complejo I
2
-cristal violeta. Algunos organismos
(grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La
diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia
a la decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el
caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente
lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede
daar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa
de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la
clula se decolora. Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares
ms espesas (tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al
disolvente ya que ste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo
as el espacio entre las molculas y provocando que el de complejo cristal violeta-
yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Despus de la decoloracin las
clulas grampositivas son todava azules, pero las gramnegativas son incoloras.

Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de
contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la
fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas gramnegativas
son rojas, mientras que las grampositivas permanecen azules.
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Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:
1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo
por s solo tiene poca afinidad con las clulas.
2) La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la
tincin las clulas grampositivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es
esencial un clculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios.
3) Cultivos ms viejos de 24 horas puede perder su habilidad de retener el
complejo cristal violeta-yodo.
El carcter de grampositivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. Algunos
organismos son ms grampositivos que otros y algunos son gram-variables, es
decir, unas veces grampositivos y otras gramnegativos.

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Positivas
Cocos Gram-positivos
Racimos: forma tpica de Staphylococcus sp, como S.
aureus

Cadenas: forma tpica de Streptococcus sp, como S.
pneumoniae, Streptococcus grupo B

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Tetradas: forma tpica de Micrococcus sp

Bacilos Gram-positivos
Gruesos: forma tpica de Clostridium sp, como C.
perfringens, C. septicum

Finos: forma tpica de Listeria sp

Ramificados: forma tpica
de Actinomycetes y Nocardia, como A.
israelii

grficos obtenidos de: http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm
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Tincin GRAM: Bacterias Gram-Negativas
Cocos Gram-negativos
Diplococos: forma usual de Neiseria sp, como N.
meningitidisTambin Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen
con morfologa de diplococos.
Acinetobacter puede ser pleomrfico, y a veces aparece como coco
Gram-positivo.

Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter sp, que puede ser
Gram-positivo o Gram-negativo, y, a menudo, Gram-variable.

Bacilos Gram-negativos
Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli

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Cocobacilos: forma usual de Haemophilus sp, como H. influenzae

Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V. cholerae,
y Campylobacter sp, como C. jejuni

Forma de aguja fina: forma usual de Fusobacterium sp

grficos obytenidos de: http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm




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Otras tinciones de uso habitual
Rodamina-Auramina
Los cidos miclicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen
afinidad para los fluorocromos Auramina y Rodamina. Estos colorantes se fijan a
las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo
verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la
fluorescencia inespecfica. Todos los microorganismos cido-alcohol resistentes,
incluyendo los esporozoarios parsitos, se tien con estos colorantes.
Un aspecto importante de la coloracin rodamina-auramina es que luego los frotis
pueden ser reteidos con la coloracin de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente
sobre la tincin con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersin. De
esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones
tradicionales, que adems permiten la diferenciacin morfolgica.
Naranja de acridina
El fluorocromo naranja de acridina se une al cido ncleico ya sea en su forma
nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el
color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentracin.
El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una
fluorescencia verde si el microorganismo est vivo y roja si est muerto. De todos
modos, como el colorante se intercala en el cido ncleico, el germen viable se
inactivar poco tiempo despus de la tincin.
El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los
hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de
estudios han demostrado que la tincin de hemocultivos con naranja de acridina
es tan sensible como el subcultivo ciego para la deteccin inicial de hemocultivos
positivos.
ZiehlNeelsen (BAAR)
Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias. Contienen cidos grasos
(cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren
la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin
con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistente. Las
micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parsitos coccdeos
como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol
resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para
que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.
Se ha desarrollado una coloracin de cido-alcohol resistencia modificada que
diferencia las especies de Nocardia (bacterias ramificadas filamentosas cuyas
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paredes celulares contienen cidos-grasos de unos 50 tomos de carbono), de los
actinomiceos (muy semejantes pero no cido-alcohol resistentes).Nocardia
spp son decoloradas por la mezcla cido-alcohol estndar pero no por un
tratamiento ms suave con cido sulfrico 0,5 a 1%. Estos microorganismos se
denominan cido-alcohol resistentes parciales o dbiles.
El frotis se tie durante unos 5 min con Carbolfucsina aplicando calor suave. Lavar
con agua. Decolorar con alcohol etlico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar
y teir durante 30-60 segundos con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y
secar

Blanco de Calcoflor
Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflor
aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras.
Segn fue descrito por Hageage y Harrington, este colorante se emplea en lugar
de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clnicos. Tambin se
emplea para aumentar la visualizacin de los elementos morfolgicos de los
cultivos puros de los hongos. En algunos laboratorios ha suplantado al azul de
lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescentes con luz blanco-
azulada o verde manzana, segn la fuente luminosa que se utilice.


Bibliografa:
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm
Microbiologa de Prescott
Introduccin a la microbiologa de Mandigan