La i nvesti gaci n de Entamoeba hi stol yti ca comenz cuando el parsi to
fue i denti fi cado en muestras de heces y en tej i dos humanos i nfectados, l o
que permi ti hacer una detal l ada descri pci n de sus componentes. Se l ogr entonces estudi ar su morfol og a y l a estructura i nterna de sus dos etapas bi ol gi cas: l a ami ba o trofozo to y el qui ste. 42 ciencia abril-junio 2013 ntamoeba histolytica, causante de la amibiasis invasora humana, es un orga- nismo unicelular con ciclo de vida bifsico; es decir, presenta dos etapas biolgicas en las cuales su forma es diferente. Una de ellas es el trofozoto, comnmente llamado amiba, que habita, se nutre y multiplica dentro del intestino del hospedero humano, y es capaz de destruir cualquier tipo de clula y casi cualquier tejido. La otra es el quiste, que asegura la persistencia del parsito en el ambiente ex- terno y es la forma responsable de iniciar la infeccin en nuevos hospederos cuando los quistes son ingeridos al consumir agua o alimentos contaminados con ellos. Numerosos estudios han analizado la estructura de las dos formas de este parsi- to. Por ser tan pequeo, su anlisis ha requerido el uso de diversos tipos de micros- copios. Desde que se identificaron tanto las amibas como los quistes, una pregunta importante ha sido, cmo es que este organismo causa dao a su hospedero? La investigacin comenz identificando al parsito en muestras de heces y en tejidos humanos infectados, y observando las muestras por microscopa, los que permiti hacer una descripcin detallada de sus componentes que se pudieron identificar por su morfologa y se compararon con aquellos ya caracterizados en otras clulas. Se logr as obtener una visin de la estructura interna tanto de los trofozotos como de los quistes. Una sorpresa fue descubrir que las amibas presentan pocas estructuras y organelos celulares, pero tienen una gran cantidad de vacuolas de E Bi bi ana Chvez Mungu a y Ar t ur o Gonzl ez Robl es nnnnnnn la estructura interna de un Entamoeba histolytica: destructor por naturaleza destructor Entamoeb l y a histolytic la estructu por naturaleza destructor ca: ura interna d por naturaleza la estructura interna de un por naturaleza 07_814_EntamoebaHistolytica.qxp9_.qxp7 11/03/13 19:12 Pgina 42 07_814_EntamoebaHistolytica.qxp9_.qxp7 11/03/13 19:12 Pgina 43 diferente tamao y un ncleo bien definido. Sin em- bargo, cuando fue posible utilizar el microscopio elec- trnico para analizar amibas fijadas qumicamente y deshidratadas con disolventes, se logr un adelanto im- portante en identificar otras estructuras y apreciar me- jor aquellas que se haban descrito con microscopios de menor resolucin. El inconveniente de estos mtodos de preparacin es que se pueden crear artificios, y eventualmente algunos componentes citoplsmicos pueden desaparecer. Por el contrario, la fijacin mediante congelacin ultrarr- pida, seguida de deshidratacin a muy baja temperatu- ra, aumenta la posibilidad de una mejor preservacin de la estructura biolgica. En este artculo se muestran imgenes obtenidas con estas tcnicas que han permitido apreciar y describir en forma muy precisa la estructura interna de los trofo- zotos y los quistes de este parsito. Estas metodologas, junto con los avances obtenidos a varios niveles que se examinan en otros artculos de este nmero de la re- vista, han permitido establecer la presencia de organe- los cuya existencia se negaba hace apenas unos aos, y que permiten a las amibas sobrevivir e invadir los teji- dos de su hospedero. E s t r u c t u r a de l t r o f o z o t o El trofozoto o amiba (Figura 1A) mide entre 20 y 40 micrmetros (1 micrmetro = 0.001 milmetros), es pleiomrfico, es decir, cambia su forma continuamen- te debido a la fluidez de su citoplasma, a la plasticidad de su membrana plasmtica y a la capacidad de rees- tructuracin de ciertos organelos internos que en con- junto se conocen como el citoesqueleto. Estas carac- tersticas no slo le permiten moverse y desplazarse eficientemente sobre cualquier superficie formando proyecciones del citoplasma llamadas seudpodos, sino que tambin son determinantes para su nutricin. Los seudpodos participan en la captura de alimento me- diante los mecanismos celulares conocidos como pino- citosis, para ingerir lquidos, y fagocitosis, para capturar slidos. Estas propiedades permiten a los trofozotos una gran motilidad y desplazamiento, lo cual, aunado a un alto contenido de enzimas proteolticas (que des- 44 ciencia abril-junio 2013 Amibiasis Figura 1. Trofozo tos de Entamoeba hi stol yti ca. A) Trofozo to observado a travs del mi croscopi o el ectrni co de barri do. Fotos B a D: mi croscop a el ectrni ca de transmi si n. B) Corte fi no de un trofozo to en el que se apreci a el ncl eo ( N) y al gunas vacuol as ( V) . C) Numerosos pol i rri bosomas ( Pr) y perfi l es de del gados tbul os ci topl asmti cos ( T) . D) Numerosos grnul os de gl ucgeno ( G) y un grupo de ci sternas apl anadas ( C) si mi l ares al Gol gi . Barra = 1 mi crmetro. 07_814_EntamoebaHistolytica.qxp9_.qxp7 11/03/13 19:12 Pgina 44 truyen protenas) en la membrana y el citoplasma, confieren al parsito un sorprendente potencial inva- sivo. Varios estudios de biologa celular y molecular han demostrado que estos procesos son determinantes en el dao que ocasionan las amibas a los tejidos del hospedero. Los trofozotos presentan un ncleo esfrico (Figu- ra 1B) que mide de 4 a 7 micrmetros de dimetro. A diferencia de otras clulas que tienen un ncleo bien formado (eucariontes), en la periferia del ncleo de las amibas se localiza el cido ribonucleico (ARN, cido nucleico que lleva la informacin gentica del ncleo a la maquinaria celular que fabrica protenas), mientras que el cido desoxirribonucleico (ADN), que constituye el material gentico, se encuentra en posicin central y aparentemente no se forman cromosomas tpicos. Dentro del ncleo es frecuente observar un nme- ro variable de pequeas esferas que al microscopio de luz se observan refringentes, miden de 0.2 a 0.5 micr- metros de dimetro y son denominadas esfrulas nuclea- res. Su funcin an se desconoce. En cultivos de este parsito, que es la forma en que se mantiene regular- mente a las amibas para su estudio en el laboratorio, pueden observarse con frecuencia dos o ms ncleos; no obstante, en condiciones naturales el trofozoto tiene slo un ncleo. El citoplasma de los trofozotos de E. histolytica pre- senta numerosas vacuolas limitadas por una membrana que tiene caractersticas moleculares muy especficas para su funcin en el transporte de diversos materia- les que se internalizan durante los mecanismos llamados fagocitosis, pinocitosis o por la fusin de varias vacuo- las. Tambin se encuentran abundantes grnulos de glucgeno y numerosos agregados en forma de bastn formados por ribosomas dispuestos helicoidalmente, en donde se lleva a cabo la sntesis de las protenas. En estudios realizados en amibas fijadas qumica- mente no se haban podido identificar los organelos celulares presentes en la mayora de las clulas, como mitocondrias, retculo endoplsmico y sistema de Golgi. Estos resultados eran sorprendentes, pues los estudios de biologa molecular han identificado en las amibas a algunas de las protenas que participan en funciones caractersticas de las citadas estructuras. Por ello, se es- perara que estuvieran presentes para llevar a cabo estas funciones. La congelacin ultrarrpida ha permi- tido identificar un sistema de pequeos canalculos que podra corresponder a un retculo endoplsmico liso (Figura 1C). Tambin se han identificado grupos de cisternas aplanadas muy similares al Golgi (Figura 1D). Estos datos hacen pensar que tales organelos s existen en las amibas, pero que son particularmente sensibles a las tcnicas de fijacin qumica usadas comnmente. Una de las estructuras que ms se ha estudiado uti- lizando varias metodologas es la membrana plasm- tica que limita a cada amiba. Aunque la composicin molecular es muy semejante a la de las membranas plasmticas de otras clulas, los lpidos que la forman son especficos para el parsito, y se encuentran recep- tores y otras molculas involucradas en la adhesin de las amibas a clulas blanco y a sustratos proteicos para su destruccin. La membrana tiene un espesor de aproximadamen- te 10 nanmetros (un nanmetro es la millonsima parte de un milmetro), y para poder observarla se re- quiere hacer cortes transversales del cuerpo de la ami- ba y utilizar una amplificacin alta (30 000 veces). En estas condiciones se observa como una lnea doble (Figura 2A). En especmenes criofijados y criosustitui- dos la superficie externa de la membrana plasmtica muestra una capa muy fina de apariencia aterciopela- da. Esta capa es la cubierta celular, llamada tambin glicoclix, constituida por carbohidratos que forman complejos con las protenas que se han integrado a esta membrana, como los receptores. abril-junio 2013 ciencia 45 Ent amoeba hi s t ol yt i ca: l a es t r uct ur a i nt er na de un des t r uct or por nat ur al eza 07_814_EntamoebaHistolytica.qxp9_.qxp7 11/03/13 19:13 Pgina 45 La fluidez de la membrana plasmtica de las amibas, dada por sus componentes lipdicos, permite una gran movilidad de estos componentes en el plano de la mem- brana, y su translacin a diferentes regiones de la misma como respuesta a un estmulo o seal del exterior. Esto sucede cuando la amiba se desplaza en una direccin definida y el movimiento requiere la polarizacin de componentes en la parte posterior del cuerpo para im- pulsar el citoplasma hacia el frente. Este procedimien- to permite a las amibas dirigirse hacia molculas o c- lulas que las atraen y llegar a sitios definidos en el organismo hospedero para poder invadir sus tejidos. Otra accin muy caracterstica de las amibas es la formacin de un casquete membranal, en el cual mo- lculas ancladas a la membrana tanto por la parte ex- tracelular como por la parte interna se concentran en la parte posterior del trofozoto, de donde se despren- den. Se considera que este proceso ayuda a las amibas a escapar de la respuesta inmunitaria del hospedero, al librarse de los anticuerpos que se hubiesen generado contra molculas amibianas y que se han logrado unir a la superficie del parsito. La formacin del casquete ayuda tambin a las amibas a desprenderse de molcu- las que pudieran daarlas (Figura 2B). En la cara interna de la membrana plasmtica fre- cuentemente se observan pequeos grnulos a los que, por su apariencia oscura cuando son vistos a travs del microscopio electrnico de transmisin, se les llam grnulos electrondensos (Figura 2C). Miden de 10 a 200 nanmetros de dimetro y pueden encontrarse dis- persos en el citoplasma o asociados a la cara interna de la membrana plasmtica. En ellos se han identificado molculas con actividad proteoltica, como las enzimas colagenasa y gelatinasa. Se ha demostrado que estos grnulos se desprenden de la membrana y salen al exte- rior cuando las amibas interactan con clulas en cul- tivo o con protenas de la matriz que rodea y sostiene a los tejidos en el organismo hospedero. Se ha propuesto que algunas de las enzimas que las amibas utilizan para destruir clulas y para abrirse camino dentro de los te- jidos del husped estn contenidas en estos grnulos. En los trofozotos es frecuente observar estructuras con una morfologa que se asemeja a partculas virales de diferentes tipos cuando stas son observadas a tra- vs del microscopio electrnico. Estas estructuras pue- den encontrarse aisladas o formando grupos circulares (Figura 2D). Su identidad y su posible funcin en los trofozotos se desconocen, aunque se ha especulado sobre la posibilidad de que fuesen partculas virales que infectan a las amibas y que podran destruirlas. sta es una posibilidad muy interesante, ya que se podran uti- lizar estos virus como vectores para acarrear genes le- tales al interior de las amibas mediante mtodos de biologa molecular. Al expresarse las protenas letales codificadas en estos genes, las amibas moriran. Sin embargo, esta posibilidad no se ha estudiado a fondo. 46 ciencia abril-junio 2013 Amibiasis Figura 2. A) Membrana pl asmti ca ( MP) con el gl i cocl i x ( G) . B) Casquete. C) Sobre l a cara i nter- na de l a membrana pl asmti ca ( MP) del trofozo to se observan dos grnul os el ectrondensos ( GED) . Uno de el l os ocupa una proyecci n de l a membrana. D) Grupo de vi rus ( V) formando una roseta ci rcul ar en el ci topl asma. Barra = 100 nanmetros. 07_814_EntamoebaHistolytica.qxp9_.qxp7 11/03/13 19:13 Pgina 46 En clulas eucariontes en general, el complejo es- tructural llamado citoesqueleto se encuentra formado principalmente por actina (protena que forma estruc- turas fibrilares en el citoplasma), as como por miosina (otra protena fibrilar que se asocia con actina y otras molculas para producir movimiento) y por tubulina (protena que forma microtbulos). Como se mencio- n previamente, el citoesqueleto es un elemento di- rectamente relacionado con la capacidad motriz e in- vasiva de los trofozotos. En este parsito se han identificado ya los genes que codifican a varias formas de estas tres protenas, y se conoce mucho sobre cmo se regula la sntesis de muchas de ellas. Tambin se han identificado varias de las protenas que se asocian a la miosina y a la actina, y para regular diferentes funciones que dependen de la motilidad ce- lular. Si bien los microtbulos slo han sido observados durante la mitosis formando un haz dentro del ncleo pues a diferencia de otras clulas eucariontes, la mito- sis en las amibas se lleva a cabo sin que se desorganice la membrana nuclear (Figura 3A), se han identificado ya los genes correspondientes a diferentes formas de la tubulina. Es posible que los microtbulos citoplsmicos sean particularmente sensibles a los fijadores, por lo que no se han podido observar. Protenas fibrilares como la actina y la miosina tam- bin interactan y participan continuamente en la for- macin de estructuras transitorias como los seudpodos y estructuras para la fagocitosis y la pinocitosis. Estas protenas fibrilares participan adems en la formacin de las llamadas placas de adhesin, que son requeridas para que las amibas puedan adherirse al sustrato du- rante su desplazamiento, as como en la formacin del casquete. Durante el proceso de divisin celular, la ac- tina y la miosina intervienen tambin en la formacin de un cinturn alrededor del cuerpo de la amiba que, al contraerse por la interaccin de las dos protenas, ayuda a la separacin de las clulas hijas resultantes de la mitosis (Figura 3B). La microscopa electrnica de transmisin ha permi- tido observar que en el cinturn contrctil la miosina y la actina presentan una organizacin similar a la que se abril-junio 2013 ciencia 47 Ent amoeba hi s t ol yt i ca: l a es t r uct ur a i nt er na de un des t r uct or por nat ur al eza Figura 3. A) Ncl eo en proceso de mi tosi s que muestra numerosos mi crotbul os en corte l ongi - tudi nal . Recuadro A, mayor aumento. B) Agregado fi bri l ar observado durante l a di vi si n cel ul ar. C) Corte transversal de un agregado fi bri l ar. Barra = 20 nanmetros. 07_814_EntamoebaHistolytica.qxp9_.qxp7 11/03/13 19:13 Pgina 47 observa en las fibras musculares (Figura 3C). La organi- zacin y funciones de los elementos contrctiles en las amibas se consideran fundamentales para llevar a cabo sus actividades destructoras e invasoras, ya que se ha demos- trado que las amibas que no expresan o que sobreexpre- san estas protenas en el citoplasma se comportan como no invasoras, debido a sus movimientos defectuosos. E s t r u c t u r a de l q u i s t e El quiste es la forma del parsito mediante la cual se disemina la infeccin. Por ello es muy resistente, ya que al ser arrojado al medio ambiente exterior tiene que sobrevivir en condiciones hostiles hasta encontrar un nuevo hospedero. Los quistes son expulsados en gran nmero tanto por los pacientes con sntomas como por los individuos que son portadores y no presentan una infeccin inva- sora. Ya en el exterior, pueden contaminar alimentos y agua que, al ser consumidos, reiniciarn la infeccin. En el tracto digestivo los jugos gstricos favorecen que los quistes se rompan, dando lugar a los trofozotos que causan la sintomatologa conocida de una infeccin amibiana. Los quistes son completamente esfricos y miden de 10 a 20 micrmetros (Figura 4A). Durante el pro- ceso de enquistamiento en el intestino grueso, en la superficie de la amiba se forma la pared del quiste. Esta gruesa capa lo proteger de la desecacin y de otras con- diciones adversas cuando sea arrojado ya como quiste al medio ambiente. La pared es una capa fibrosa que mide de 120 a 150 nanmetros de espesor y cuyo principal componente es la quitina, un polmero de carbohidra- tos formado por unidades de N-acetil-D glucosamina. 48 ciencia abril-junio 2013 Amibiasis Figura 4. A) Qui stes de Entamoeba hi stol yti ca. Se observa l a superfi ci e rugosa de l a pared del qui ste por mi croscop a de barri do. B) En el ci topl asma de un qui ste tratado con roj o de ruteni o se observan vacuol as, el ncl eo ( N) , dos cuerpos cromatoi des y l a pared del qui ste ( PQ) . Barra = 1 mi - crmetro. C) Cuerpos cromatoi des a mayor ampl i fi caci n, que muestran pol i rri bosomas cortados transversal y l ongi tudi nal mente. D) y E) Pared del qui ste ( PQ) con roj o de ruteni o ( D) y si n roj o de ruteni o ( E) . Barra = 100 nanmetros. 07_814_EntamoebaHistolytica.qxp9_.qxp7 11/03/13 19:13 Pgina 48 Tradicionalmente se consider a la pared del quiste como una estructura impermeable que mantena al pa- rsito completamente aislado del medio exterior. Sin embargo, cuando los quistes son tratados con una solu- cin que contiene un colorante denso a los electrones, la pared se observa obscura, por el paso del colorante al interior (Figura 4B, C), a diferencia de quistes no tratados con el colorante en los que la pared se observa casi transparente (Figura 4D). Este hecho demuestra que la pared del quiste es permeable al agua y a par- tculas muy pequeas, lo que les permite mantener el mnimo de humedad e intercambio selectivo necesa- rios para su supervivencia en el exterior. En el citoplasma del quiste (Figura 4B) se presentan de 1 a 4 ncleos, dependiendo de su estado de madurez. La poblacin de vacuolas es notablemente menor que en los trofozotos. Destacan tambin uno o varios agre- gados de polirribosomas dispuestos ordenadamente y de apariencia cristaloide, denominados cuerpos croma- toides (Figura 4E). Estos agregados no estn limitados por una membrana y por su tamao son fcilmente vi- sibles en el microscopio ptico. Son considerados como un marcador caracterstico de una infeccin amibiana cuando se hace un examen de las heces de un indivi- duo con sntomas que sugieren esta condicin. Todos los estudios indican que los quistes slo se forman en el ambiente del colon, para de ah ser ex- pulsados e iniciar la infeccin en nuevos hospederos, completando as su ciclo vital. A pesar de la importancia del quiste en la disemi- nacin de la amibiasis, an se conoce muy poco sobre el proceso de enquistamiento. Una dificultad ha sido la carencia de un mtodo para la produccin masiva de quistes in vitro (es decir, en condiciones de labora- torio), necesaria para hacer estudios bioqumicos y moleculares. Un mejor conocimiento del quiste de E. histolytica, as como de los procesos de enquistamiento y desen- quistamiento, es uno de los retos por resolver, ya que al impedir la transmisin del parsito se podra avanzar rpidamente hacia el control de la amibiasis humana. Bibiana Chvez Mungua es doctora en patol og a experimen- tal por el Centro de Investigacin y Estudios Avanzados del Instituto Pol itcnico Nacional (Cinvestav), del que actual mente es profesora titul ar en el Departamento de Infectmica y Patogne- sis Mol ecul ar. Util izando microscop a el ectrnica estudia diversas parasi tosi s que afectan al ser humano, como l a ami bi asi s y l a giardiasis. Ha publ icado numerosos art cul os en revistas cient ficas de difusin internacional . bchavez@cinvestav. mx Arturo Gonzlez Robles es doctor en patol og a experimental por el Centro de Investigacin y Estudios Avanzados (Cinvestav). Es i nvesti gador ti tul ar del Departamento de I nfectmi ca y Patognesis Mol ecul ar. Ha col aborado en numerosos proyectos de investigacin rel acionados con diversas infecciones que afec- tan al ser humano, producidas principal mente por protozoarios parsitos. Ha intervenido en l a publ icacin de ms de 70 art cul os rel acionados con el tema. goroa@cinvestav. mx abril-junio 2013 ciencia 49 Ent amoeba hi s t ol yt i ca: l a es t r uct ur a i nt er na de un des t r uct or por nat ur al eza L e c t u r a s r e c o me n da da s Chvez-Mungua, B., P. Talams-Rohana, A. Ros, M. Gon- zlez-Lzaro y A. Martnez-Palomo (2008), Entamoeba Histolytica: Fibrilar Aggregates in Dividing Trophozoi- tes, Experimental Parasitology, 118, 280-284. Chvez-Mungua, B., G. Castan, V. Hernndez-Ramrez, M. Gonzlez-Lzaro, P. Talams-Rohana y A. Martnez- Palomo (2012), Entamoeba Histolytica Electrodense Granules Secretion in Vitro and in Vivo: Ultraestructural Study, Microscopy Research and Technique, 72, 189-196. Martnez Palomo, A. (1982), The Biology of Entamoeba Histolytica, en Brown, K. N. (compilador), Tropical Medicine Research Studies Series, Chichester, Research Studies Press. Martnez-Palomo, A., A. Gonzlez-Robles, B. Chvez, E. Orozco, S. Fernndez-Castelo y A. 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