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Les mthodes chromatographiques

I. Gnralits
Des 1903 quelques essais montrrent quil tait possible de mettre
profit les phnomnes dadsorption pour sparer les constituants dun
mlange, mais ce nest rellement quen 1906 la suite des travaux du
botaniste russe Tswett que naquit la mthode laquelle cet auteur
donna le nom de chromatographie, tymologie: Chroma = couleur.
En faisant des essais de filtration dune solution de pigments vgtaux
chlorophylle et xanthophylle dans lther de ptrole sur une
colonne remplie de carbonate de calcium finement pulvris, il constate
que ceux-ci sadsorber au sommet de la colonne sous forme dune
troite zone colore.
Les diffrents pigments peuvent alors tre isols, soit par
fragmentation des diffrentes zones et lavage de chacune dentre elles
avec un solvant appropri, soit en poursuivant laddition du solvant


et en recueillant lextrmit de la colonne les fractions correspondant
lentrainement de chaque zone.
Par la suite on dsign sous le terme dlution la rcupration du
solut laide dun solvant appropri appel luant et lut la solution
recueillie.
Le phnomne mis en uvre est bien dfini.
Proprits adsorbantes de la phase stationnaire dite parfois fixe.
Proprits luantes de lther de ptrole phase mobile.
Les tapes successives de lopration chromatographique.
Fixation initiale des substances sur la phase stationnaire au sommet
de la colonne.
Dplacement de celle-ci par lluant entrainant leur sparation.
Identification des diffrentes fractions.


II: Classification des mthodes chromatographiques.
Selon la nature physique des phases
Principe du phnomne mis en jeu
Procd opratoire.
1: Selon la nature physique:
Phase mobile = fluide (liquide ou gaz ltat normal), phase
stationnaire peut tre un solide
finement pulvris, ou un liquide immobilis sur une phase fixe.
On dsigne couramment les diffrents types de chromatographie en
fonction de la nature de la phase mobile.
Chromatographie liquide ou CL
Chromatographie gazeuse ou CG
Chromatographie en phase supercritique CPS ou CS

2: Selon le phnomne chromatographique:
Chromatographie dadsorption: phase stationnaire doue de
proprits adsorbantes
Chromatographie de partage: phase stationnaire est une phase
liquide non miscible la phase mobile fixe sur un solide
Chromatographie par change dions: phase stationnaire est forme
de macromolcules portant des groupements fonctionnels acides ou
basiques qui permettent lchange de certains de leurs ions avec des
ions de mme signe du mlange chromatographier
Chromatographie dexclusion strique: phase stationnaire
constitue par un gel qui se
comporte comme un tamis vis--vis des molcules ayant des masses et
des structures diffrentes.

3: Classification daprs le procd utilis:
Chromatographie sur colonne: phase stationnaire est contenue dans
une colonne en verre ou en mtal.
Chromatographie planaire ou chromatographie de surface ou la
phase stationnaire est de faible paisseur et de grande surface.
Chromatographie sur couches mince: phase stationnaire est retenue
sur une surface plane, verre polymre ou feuille daluminium
recouverte de gel de silice, cellulose, alumine ou de grains de rsines
changeuses dions.
Chromatographie par dveloppement: les substances lues restent
sur la phase stationnaire.
En fonction de la migration on parle de ,chromatographie ascendante,
descendante, circulaire.
III: Principes gnraux de la chromatographie.
les composs se rpartissent dans deux phases insolubles ou trs
peu solubles entre elles jusqu tablissement dun quilibre.
Le renouvellement continu de la phase mobile dplace cet quilibre
et entraine la migration.
Sparation dun mlange en ses composs est du au fait que chacun
prsente une rpartition entre les deux phases qui lui est propre et migre
avec une vitesse qui lui est propre.
1: Dpt de la solution. La solution contenant la substance est
dpose au sommet de la colonne par petites fractions. Laddition dun
volume provoque le dplacement de la substance.
2: Dveloppement. Le solvant pur introduit entraine la rupture des
quilibres dtage en tage et de nouveaux quilibres stablissent. La
phase mobile senrichit lorsquelle est en contacte dune phase
stationnaire charge en substance ou au contraire sappauvrit dans le
cas inverse.



3: Elution. laddition de solvant, fait migrer la substance de plus en
plus loin lintrieur de la colonne jusqu ce quelle sorte de lcolonne.
Lcoulement dun fluide peut tre du la rsultante de diffrentes
forces.
La gravit
La pression exerce sur la phase mobile
4: Distribution des soluts entre les deux phases. La distribution
thermodynamique dun solut entre la phase stationnaire et la phase
mobile est suppose tre rgulire et indpendante des quantits des
substances prsentes.
Lquation gnrale est linaire
Cs = KCm ou K est le coefficient de distribution
a: Dplacement slectif dun solut: courbe de Gauss.
Aprs un certain parcours dans la colonne, le profil de la concentration
du solut dans la phase mobile pouvait tre assimil une courbe de
Gauss c..d. qu un moment donn de la migration
chromatographique, la substance est localise sur une faible tranche de
la colonne et se distribue symtriquement autour dune valeur
maximale dordonne Y
0
et dabscisse X
0

IV: Elution dun solut: Pic Chromatographique.
Le but des techniques chromatographiques est de recueillir la substance
aprs sa migration complte travers la phase stationnaire provoque
par lintroduction continue de la phase mobile.
Cette migration dpends non seulement de laffinit de la phase
stationnaire pour la substance et des caractristiques de la colonne mais
aussi du volume V de la phase mobile.
Substance non retenue par la colonne faire passer V
M
pour
recueillir celle-ci faible.
La substance se dplace lentement si laffinit pour la phase
stationnaire est grande V
M
lev.


1: Informations apportes par le trac chromatographique.
d
R
= distance entre le dbut de la chromatographie et le maximum
du pic
= base du triangle dans lequel la courbe de Gauss est en grande
partie.
S = Surface comprise entre laxe des abscisse et la courbe de Gauss
h = Hauteur du pic chromatographique
a: Grandeur de rtention.
Temps de rtention t
r
= temps coul entre lintroduction du solut
dans la colonne et le moment ou il en sort la concentration maximale.
t
R
= temps de rtention corrig ou rduit t
R
= t
R
t
M
Volume de rtention: V
R
= volume de phase mobile ncessaire
pour amener la substance sa concentration maximale.
Vr = V
R
V
M
volume de rtention corrig




Rapport de rtention: U
A
Rr =
U
M
U
A
= vitesse moyenne de dplacement du solut


U
M
= vitesse moyenne de dplacement de la phase mobile

L
U
A
= L t
M
t
R
Rr = X
t
R
L

L

U
M
=
t
M


t
M
d
M
V
M
R
R
= = =
t
R
d
R
V
R



t
M
= temps mort
V
M
= volume mort

Facteur de rtention ou facteur de capacit. Le facteur de rtention
ne dpend ni du dbit de la phase mobile ni de la longueur de la
colonne. Il savre ainsi plus intressant que les paramtres prcdents
pour identifier un solut


















t
R
t
R
- t
0
t
R
K = = = - 1
t
0
t
0
t
0

V
R
V
R
- V
M
KV
S
K = = =
V
M
V
M
V
M

C
S
C
S
V
S
Q
S
K = donc K = =
C
M
C
M
V
M
Q
M

Lorsque K = 0: V
R
= V
M
le compos nest pas retenu par la phase
stationnaire. Plus K est grand plus le compos est car V
R
augmente
proportionnellement

b: Efficacit dune colonne. Comme pour lextraction contre
courant, lefficacit dune colonne est dautant plus grande que le
nombre de plateaux thoriques est lui-mme lev.


L
N =
H








Calcul du nombre de plateaux thoriques:
d
2
R
V
2
R
t
2
R

N = 16 = 16 = 16

2

2

2





























16d
2
R
5,54d
2
R
N = =



2

H.E.P.T = Hauteur quivalente un plateau thorique
L
H =

N

Une colonne est dautant plus efficace que le nombre de plateaux thorique et donc que est plus
troits qui permettent une bonne sparation des diffrents soluts.
Le nombre de plateaux thoriques permet de comparer entre elles les caractristiques des
diffrentes colonnes condition que la phase stationnaire, la substance tudie et les conditions
chromatographique soient identiques. Dans une mme colonne avec les mmes phases, la
distribution des deux soluts sparables est videmment diffrente et donc le nombre de plateaux
est lui aussi diffrent pour chaque solut .
c: Facteurs influant sur H:
: Vitesse dcoulement de la phase mobile: Equation de Van Deemter. Propose pour la
CPG, tablit une relation entre la vitesse linaire dcoulement U et H.
B
H = A + + CU
U
A = Diffusion turbulente due lcoulement irrgulier de la phase mobile travers la phase
Stationnaire
B = Diffusion longitudinale et rend compte de linfluence de la diffusion des molcules dans la
direction de lcoulement de la phase mobile.
C = Coefficient de rsistance aux transfert de masse = les ingalits de passage des molcules
dune phase lautre = fixation ou lution
d: Sparation chromatographique: la rsolution. La rsolution est laptitude que possde un
La rsolution R
S
dpend de deux paramtres.
la distance sparant les sommets des deux pics
la largeur de chacun des pics
d
RB
d
RA
t
RB
- t
RA
R
SAB
= 2

ou R
SAB
= 2

A
+
B

A
+
B

Plus la rsolution est leve plus la sparation est meilleure.
Afin de prvoir les modalits qui permettent dobtenir le meilleur degrs de sparation on fait
appel au facteur de slectivit
S
celui-ci rend compte de la diffrence de comportement des
deux substances dans les systme chromatographique.
t
RB
- t
M
d

RB
V

RB
K
B
K
DB

S
= = = ou
S
= =
t
RA
- t
M
d

RA
V

RA
K
A
K
DA


1
S
- 1 K
B

R
SAB
= N
B
=
4
S
1 + K

B

La rsolution dpend donc de trois paramtres N,
S
, K
B
Le nombre de plateaux thoriques N dpend du compos considr. On pourra donc amliorer N
soit en augmentant la longueur de la colonne, soit en diminuant H.
Le facteur de slectivit
S
dpend essentiellement de la diffrence existant entre les coefficients
de distribution, exprimant laffinit des substances vis--vis des phases. Lorsque les coefficients
de
distribution sont gaux
S
= 1 la valeur de R
S
est nulle et il devient impossible quel que soit le
nombre de plateaux dobtenir une sparation.
Le facteur de rtention K ou de capacit est nul le produit nest pas retenu sur la colonne.
IV: Application.
1: Analyse qualitative.
Les dterminations des grandeurs de rtention ou les caractristiques spectrales des pics
chromatographiques fournie par les dtecteurs (spectrophotomtres UV-Vis, barrette de
diodes, IR transformer de fourrier ou spectromtre de masse) permettent lidentification des
substances avec une probabilit diffrente selon les procdes utiliss et en se rfrant si besoin
des substances de rfrence.
La meilleur manire de chiffrer la rtention dun compos consiste donner sa rtention
relative() ou facteur de slectivit par rapport un compos talon.
Les conseils suivants permettent damliorer la fiabilit de la dtermination des valeurs de
rtention relative utilises en pratique.
ltalon doit, dans la mesure du possible, faire partie de lchantillon analys. Si le compos
talon nexiste pas dans lchantillon de dpart, il doit lui tre incorpor avant le dbut de
lanalyse.
ltalon doit tre choisi pour que son pic tombe peu prs au centre des pics des composants
dont on veut dterminer les rtention relatives.
La quantit dchantillon doit tre aussi faible que possible, car les temps de rtention peuvent
tre influencs par la quantit dchantillon injecte.
Les temps de rtention doivent tre utiliss en se rappelant quils sont caractristiques, mais non
spcifiques des composs.
Un temps de rtention peut correspondre plusieurs composs.

2:Analyse quantitative.
La surface du pic chromatographique (ou parfois sa hauteur h lorsque le pic est troit) est
proportionnelle la quantit de substance lue. La dtermination de cette surface est effectue de
manire automatique par un enregistreur ou par simple mesure de la hauteur et de la largeur du
pic.
Si est nettement infrieur la hauteur de la courbe
S = 1,032 X aire du triangle AGI
Sachant que h = 1,214h S = 1,032 X 1/2 X 1,214h = 0,627 h
Lorsque la colonne nest pas sature, la largeur du pic dpend seulement du nombre N et du
comportement de la substance sur la colonne. Cette valeur est donc indpendante de la quantit de
la substance, par consquent la hauteur h du pic est proportionnelle cette quantit.
Les volumes quelques microlitres sont extrmement faibles, ils ne peuvent tre rigoureusement
reproductibles et une incertitude existe toujours sur le volume exact inject. Il savre quen
analyse chromatographique, relier le signal la concentration de la substance injecte pose deux
problmes.
La connaissance du facteur de proportionnalit K entre la surface du pic et la quantit
injecte.
La connaissance du volume exact inject pour en dduire la concentration.
Lorsque les volumes injects sont suprieurs 100 l il est possible de considrer lerreur sur le
Volume comme ngligeable. Ce nest pas le cas lorsque les volumes injects sont plus faibles.
Pour liminer cette source derreur, il est souhaitable de faire appel la mthode de ltalon
interne.
a: Mthode dtalonnage interne.
Cette mthode repose sur lutilisation du coefficient de rponse relatif de chaque compos doser
vis--vis dun marqueur introduit comme rfrence.
Ltalon interne est un compos dont les grandeurs de rtention sont diffrentes de celles de la
substance doser et qui est introduit en proportion rigoureusement dfinie dans lchantillon
avant linjection dans le chromatographe.
Ce mlange se traduit par la prsence de deux pics sur le trac chromatographique.
On commence par prparer une solution de concentration C
1
en 1, C
2
en 2 et C
E
en E.
Appelons A
1
, A
2
, A
E
, les aires des pics dlution reprs sur le chromatogramme obtenu partir
dune prise dessai de cette solution. Si m
1
, m
2
et m
E
sont les quantits introduites dans la
colonne, on aura les trois relations suivantes.
m
1
= K
1
X A
1
m
2
= K
2
X A
2
m
E
= K
E
X A
E

Soit m
1
K
1
X A
1
m
2
K
2
X A
2
= et =
m
E
K
E
X A
E
m
E
K
2
X A
2

Ces rapports permettent de calculer les coefficients de rponse relatifs de 1 et de 2 vis--vis de E
choisi comme talon, et dsigns par K
1
/E et K
2
/
E
:
K
1
m
1
X A
E
K
2
m
2
X A
E


K
1
/
E
: = et K
2
/
E
: =
K
E
m
E
X A
1
K
E
m
E
X A
2

Sachant que les masses mi rellement injectes sont proportionnelles aux concentrations
massiques correspondantes C
i
(m
i
= c
i
v) on en dduit les deux expressions suivantes.
C
1
X A
E
C
2
X A
E
K
1
/
E
= et K
2
/
E
=
C
E
X A
1
C
E
X A
2
La seconde tape de lanalyse consiste chromatographier un volume quelconque dune solution
faite avec lchantillon tudier et dans laquelle a t ajoute une quantit connue du compos E.
Soit A1, A2 et AE les aires du nouveau chromatogramme obtenu dans les mmes conditions

Opratoires. Si m
1
, m
2
et m
3
dsigne les masses de 1, 2 et E rellement introduites dans la
colonne, on aura:

m
1
K
1
/
E
X A
1
et m
2
K
2
/
E
X A
2
= =
m
E
A
E
m
E
A
E

tant donn que C
E
est connue
C
1
= C
E
K
1
/
E
A
1
et C
2
= C
E
K
2
/
E
A
2

A
E
A
E

En gnralisant n constituants on peut calculer la concentration massique du solut i

Ci = C
E
K
i/E
A
i

A
E
Et en dduire sa teneur dans lchantillon, exprim en %
C
i
X
i
% = X 100
masse de lchantillon prlev
Cette mthode est encore plus prcise si on fait plusieurs injections de ltalon ou de lchantillon
doser. Cette mthode gnrale et reproductible exige nanmoins un bon choix de ltalon interne
dont les caractristiques peuvent se rsumer ainsi.
Il doit tre pur et ne pas se trouver initialement dans lchantillon.
Son pic dlution doit tre bien rsolu par rapport tous ceux qui forment le
chromatogramme de lchantillon.
Son temps de rtention doit tre proche de celui (ou de ceux) du (ou des) soluts doser.
Sa concentration doit tre proche ou suprieure celle des autres soluts pour tre dans les
conditions dune rponse linaire du dtecteur.
Il doit tre inerte vis--vis des composs de lchantillon.
b: Mthode dtalonnage externe.
Cette mthode permet de calculer la teneur dun ou plusieurs constituants apparaissant spars sur
le chromatogramme, mme en prsence dautres composs donnant des pics non rsolus.
Le procd repose sur la comparaison de deux chromatogrammes obtenus successivement sans
changer les conditions de rglage de lappareil. Le premier est un chromatogramme de rfrence
acquis partir dune solution de rfrence dans un solvant du compos qui fait lobjet du dosage.
On injecte un volume de cette solution et on repre sur le chromatogramme laire A
rf
du pic
correspondant. Le second rsulte de linjection dun volume identique V de lchantillon en


Solution, contenant le compos doser (con, C
cha
). Soit A
cha
laire du pic correspondant.
puisque les volumes injects sont gaux, il y proportionnalit entre les aires, qui dpendent des
masses injectes et les concentrations correspondantes (m
i
= C
i
V
i
)
m
rf
= C
rf
X V = K X A
rf
et m
cha
= C
cha
X V = K X A
cha

Soit C
cha
= C
rf
X A
cha

A
rf
Cette mthode faisant appel aux coefficient de rponse absolus, donne des rsultats trs fiables.
Mthode par normalisation interne.
Cette mthode galement appele 100% normalise est rserve aux mlanges dont on a
identifi tous les constituants par autant de pics dlution spars sur le chromatogramme.
On procde en deux tapes.
calcul des coefficients de rponse relatifs:
On prpare une solution dtalonnage contenant les composs (exemple 3 composs) dont les
concentrations massiques sont respectivement C
1
, C
2
, C
3
Le chromatogramme correspondant linjection dun volume V, prsente trois pics daires A1,
A
2
, A
3
. Ces aires seront relies aux masses injectes m
1
, m
2
, m
3
par trois expressions.
On choisit lun des composs comme substance de normalisation interne, le compos 3 par
exemple, afin de dterminer les coefficients de rponse relatifs K
1/3
et K
2/3
des composs
1 et 2 par rapport 3
K
1
m
1
X A
3
et K
2
m
2
X A
3

K
1/3
= = K
2/3
= =
K
3
m
3
X A
1
K
3
m
3
X A
2


tant donne que m
i
= C
i
X V
i
on aboutit

C
1
X A
3
et C
2
X A
3
K
1/3
= K
2/3
=
C
3
A
1
C
3
A
2

Calcul des concentrations.
On procde ensuite linjection dune prise dessai du mlange doser contenant les constituants
1, 2 et 3. En dsignant les surfaces des pics dlution par A
1
, A
2
et A
3
on aura accs
directement la composition centsimale massique du mlange par X
1
, X
2
et X
3


K
i
% X A
i

Xi% = X 100

K
1/3
X A
1
+ K
2/3
X A
2
+ A
3

Les conditions de normalisation tant que X
1
+ X
2
+X
3
= 100
En extrapolant n soluts normaliss par rapport un solut j, lexpression gnrale des facteurs
de rponse est la suivante.
Ci X A j
K
i/j
=
C
j
X A
i
Il est galement possible de dterminer des K
i/j
moyen par trac du graphe concentration rponse
pour chaque solut.
Pour lchantillon contenant n soluts, si A
i
dsigne laire du pic dlution du compos i, le
compos servant de rfrence interne tant j, la teneur en compos i obira la relation.

K
i/j
X A
i
Xi% = X 100

n
K
i/j
X A
i
i = 1
La chromatographie liquide haute performance: C.L.H.P
H.P.L.C en anglais
La chromatographie liquide haute performance est trs utilise dans tous les domaines de la
chimie analytique.
Son succs est du au fait quil est possible de modifier la rsolution en jouant sur la composition
de la phase mobile.
Elle utilise des colonnes remplies dune phase stationnaire constitue de particules sphriques de
trs petites dimensions de diamtre couramment compris entre 2 et 5m ce qui conduit de
grandes fficacit et rsolution.
Linconvnient est que plus les particules sont petites et plus il est difficile de faire couler le
solvant, on doit donc utiliser des pompes spciales qui poussent le solvant sous des pressions trs
leves.
A lorigine le P de C.L.H.P correspondait donc au mot pression.
La grande efficacit de la technique font que le P dsigne actuellement le mot performance.
Les caractristiques fondamentales de lH.P.L.C sont en relation directe avec la nature liquide de
la phase mobile et sopposent celles dune phase mobile gazeuse sur trois points.
la viscosit des liquides est environ cent fois suprieure celle des gaz
les liquides sont incompressibles jusqu 600 bars
les coefficients de diffusion des molcules dans les liquides sont faibles (de lordre de 10
-9
m
2
S
-1
contre 10
-4
m
2
.S
-1
dans les gaz)
ces caractristiques interviennent .


Au niveau de lcoulement de la phase mobile dans la colonne (viscosit, compressibilit)
Au niveau de la valeur H
I: Ecoulement de la phase mobile dans la colonne.
Lincompressibilit des liquides supprime le gradient de vitesse observ en chromatographie en
phase gazeuse. Les variations de la vitesse de la phase mobile sont uniquement lies aux
htrognits de remplissage de la colonne, on peut considrer que la phase mobile parcourt
celle- ci avec une vitesse constante.
II: Appareillage.
Lappareillage utilis doit tre capable de supporter les pressions leves par la trs fine
granulomtrie des phases stationnaires. Il est pour cela en acier inoxydable rsistant la corrosion
chimique des phases mobiles liquides.
Il est constitu essentiellement de:
Un ou plusieurs rservoirs de phase mobile
Un systme de pompe.
Un systme dintroduction des chantillons.
Un systme de dtection et denregistrement.
II:1. Rservoirs de phase mobile.
La premire caractristique du rservoir est son volume utile, dont dpend le nombre danalyses
ralisables sans interruption. Le volume de phase mobile ncessaire est ici relativement rduit 20
ou 50ml selon les cas sont suffisants pour effectuer une bonne sparation analytique. Un volume
au moins de 1litre est satisfaisant dans la plupart des cas.
Lorsque la phase mobile conserve pendant toute la chromatographie la mme composition
(rgime isocratique) elle peut tre pralablement prpare et dispose dans un seul rservoir.
Certains appareils permettent cependant de lobtenir instantanment par mlange de solvants
provenant de rservoirs diffrents.
Lutilisation de rservoirs de solvants tanches prsente plusieurs avantages.
lutilisation dun vase clos vite toute vaporation, ce qui est important dans le cas ou la
phase mobile est constitue par un mlange de solvants de volatilits diffrentes et ou des
modifications de composition sont craindre.
On vite la dissolution dans le solvant de vapeur deau (ou de gaz) de latmosphre; or
certains temps de rtention non reproductibles, dans le cas de sparations par chromatographie
dadsorption, sont imputable une activit variable de ladsorbant lie une teneur en eau non
constante de la phase luante.
Aprs dsoxygnation du solvant par barbotage dun gaz inerte ou mise sous vide, empche
la redissolution dans la phase mobile de gaz plus solubles, tel loxygne, ce qui limine les risques
de dgradation des chantillons ou des phases stationnaires facilement oxydables ou encore la
formation de bulles gazeuses dans la cellule du dtecteur. Celle-ci entraine un bruit inacceptable
de mme llimination de loxygne dissous est primordiale dans le cas de lutilisation dune
dtection absorptiomtrique faible longueur donde, fluorimtrique ou lectrochimique.
II:2. Pompe.
Elle a pour rle de provoquer dans la colonne un coulement de la phase mobile compatible avec
la sparation chromatographique. Ces pompes doivent tre trs puissantes car la viscosit des
solvants et les trs fines granulomtries des phases stationnaires entrainent une diffrence de
pression ou perte de charge entre le sommet et lextrmit des colonnes qui peut parfois tre
important (50 ou 100 bars).
Les plus usuelles permettent dobtenir des pressions de 420 bars (600 psi) et certaines peuvent
aller jusqu 600 bars.
Un systme de pompage idal runirait les qualits suivantes.
Rendement de la pompe (rapport du dbit effectivement dlivr au dbit demand)
Dbit constant et reproductible.
Absence de pulsation.
Grande gamme de dbit (tout en maintenant, pour les forts dbits, une pression de
refoulement leve)
Faible volume de la chambre du piston pour permettre un changement ais de solvant.
Maintien de la pression maximale de refoulement dans le corps de pompe afin dviter le
dgazage des solvants et pour compenser les diffrences de compressibilit entre les solvants.
On distingue deux sortes de pompes: les pompes pression constante et les pompes dbit
constant.
a:Pompe pression constante.
Ce sont des pompes pneumatiques, qui par lintermdiaire dun gaz inerte, imposent une pression
constante la phase mobile. Elles utilisent un dispositif amplificateur de pression.
On peut atteindre des pressions leves.
Moins couteuses que les suivantes, elles prsentent par contre, linconvnient de ne pouvoir
corriger les modifications de dbit dues aux changements de la permabilit des colonnes au cours
de leur vieillissement ou aux variations de viscosit des solvants. Elles sont actuellement
rserves au remplissage des colonnes.
b: Pompes dbit constant ou lectrique.
La rgularit des dbits qui peuvent aller de 0,01ml 10ml/min est essentielle la reproductibilit
des chromatographies et est trs souvent obligatoire pour certains systmes de dtection. Les
pompes dbit constant assujettissent la pression la permabilit des colonnes. Elles ncessitent
des pressions leves. On distingue deux types de pompes:
Pompe du type seringue dans lesquelles un piston se dplace laide dune vis sans fin
actionne par un moteur pas pas. Ont lavantage de refouler le liquide vitesse constante sans
pulsation et ceci trs fortes pression (600bars). Elles ont linconvnient de ne pouvoir dlivrer
quun volume limit de solvant et de ncessiter un rinage soign de la seringue lors du
changement de la nature du solvant.


Pompes piston ou diaphragme: utilisent un piston dont le mouvement alternatif assure
laspiration et le refoulement de la phase luante. Le piston peut agir soit directement sur lluant
(pompe piston) soit sur un rservoir dhuile spar de la phase luante par une membrane
dformable (pompe diaphragme). Dans ce dernier cas le piston nest pas en contact avec
lluant, ce qui limine les problmes de corrosion et de joint dtanchit de la pompe.
Lutilisation de pompes piston tend se gnraliser car elles prsentent plusieurs avantages.
le volume de solvant dlivr nest pas limit.
Le volume de la chambre est trs faible ce qui permet la mise en uvre aussi bien des
techniques de recyclage que du mlange de solvant en amont de la pompe dans le cas de llution
gradue.
La rgulation du dbit est aise car elle peut se raliser en modifiant la frquence du
mouvement du piston et / ou le volume de la chambre.
Mais ce type de pompe, ncessite une filtration soigne des solvants afin dviter la dtrioration
rapide des pistons et des clapets. De mme il prsente linconvnient de fournir un dbit puls.
II.3: Introduction des chantillons:
Les procdes utiliss dpendent des volumes de solution chromatographier et des pressions
auxquelles seffectuent les sparations. Ils peuvent tre regroups en deux catgories

a: Procd par injection directe.
Lorsque les quantits sont peu importantes et les pressions infrieures 150bars, il est possible
dintroduire lchantillon directement laide dune micro-seringue. Son aiguille traverse un
septum, membrane en lastomre, et arrive directement au sommet de la colonne (injecteur
dpt direct) ou dans une chambre de mlange dans laquelle circule la phase mobile qui lentraine
sur la colonne (injecteur entrainement).
Linconvnient de linjection par dpt direct tient au risque dobturation de la seringue par la
phase stationnaire, celui de linjecteur entrainement est de favoriser llargissement des bandes.
Si le facteur de capacit K est suprieur 1, c..d. lorsque le compos est bien retenu, les deux
systmes conviennent, mais lorsquil est infrieur 1 linjecteur dpt direct est prfrable. Il
est aussi possible de raliser une injection la pression atmosphrique par arrt de la phase mobile
(procde dit du stop flow).
Procds par boucles. Ils permettent linjection de volumes variables allant du microlitre au
millilitre et peuvent fonctionner sous fortes pressions.
Lchantillon est introduit la pression ordinaire dans une boucle, petit volume clos qui peut tre
mis en communication par un systme de vannes avec le rservoir de la phase mobile et avec la
colonne.
La boucle isole par la fermeture des vannes de lensemble de lappareil est tout dabord remplie
entirement par lchantillon. Louverture des vannes par simple translation, met cette boucle en
communication avec le systme chromatographique et son contenu est entrain sur la colonne.

Ce systme vite les brusques variations de pression dans lappareil et en diminuant les
obligatoirement celle du volume de la boucle.
II.4: Colonne.
Les colonnes utilises e H.P.L.C se caractrisent par leur gomtrie et par la nature des quelles
contiennent. Elles sont remplies par voie humide sous pression. Elles sont gnralement en acier
inoxydable de longueur moyenne de 10 25 cm (lutilisation des colonnes courtes de 10cm est
justifie par un remplissage par des particules de 3m qui amliorent lefficacit mais augmente la
perte de charge).
b: Phase stationnaire.
La recherche dune bonne rsolution chromatographique et donc une efficacit leve, a conduit
la cration de phases stationnaires de nature et de structure varis. Pour raccourcir les temps
danalyse, il faut tenter dacclrer dans la colonne le transfert entre les phases mobiles et fixe.
Elles sont essentiellement constitues par de trs fines particules poreuses (silice ou alumine), de
forme irrgulire ou homogne. Elles peuvent galement tre recouvertes par imprgnation ou
greffage. La phase stationnaire est retenue lintrieur de la colonne par un disque poreux en acier
inoxydable fritt, dont la porosit est suffisamment faible pour retenir les plus fines particules.
Outre sa nature, sa caractristique essentielle est sa granulomtrie exprime par le diamtre moyen
des grains en micromtres.
Le gel de silice est la matire de base des phases actuelles et tient une place prpondrante.



Cest un solide amorphe ayant pour formule de composition SiO
2
(H
2
O)n avec n trs proche de
zro. Cest un polymre inorganique rticul. Il comporte des groupements silanes, Si-OH.
Ces groupements sont responsables des proprits catalytiques acides de ce matriau trs polaire
car Si-OH un pk de 10 comparable celui du phnol.
les microsphres ont un diamtre constant dans une mme colonne mais il en existe
plusieurs types allant de 1 12m.
les monolithes, apparus plus rcemment. Sont ainsi nomms parce qu'il sagit dun gel de
silice form dune seule pice dans la colonne mme .
La reproductibilit des caractristiques de ce second type de colonne est plus difficile maitriser.
Lemploi de particules de trs faible diamtre (2m) augmente la surface de contact et diminue
lH.E.P.T, mais produit une perte de charge beaucoup plus importante que pour les plus grosses
particules. On est donc amen rduire la longueur de la colonne, ce qui va lencontre des
performances. On gagne cependant en temps danalyse. Les phases monolithiques offrent une
alternative intressante la fois parce que la perte de charge est beaucoup plus faible et que les
performances ne sont pas altres par des dbits levs.
Le gel de silice dou de capacits adsorbantes est hydrophile par nature entrainant un manque de
reproductibilit des sparations. Pour diminuer sa polarit juge excessive dans de nombreux cas
on le rend essentiellement hydrophobe. Le gel de silice ainsi modifi devient assimilable un
liquide immobilis, la sparation mettant en jeu le coefficient de partage et non plus



coefficients dadsorption. Ces phases greffes, dont la polarit peut tre ajuste avec prcision,
sont lorigine de la chromatographie de partage polarit inverse, utilise dans quasiment
toutes les sparations.
II.5: Phase mobile.
Gnralement, une phase stationnaire polaire on oppose une phase mobile peu ou pas polaire et
vice-versa. La chromatographie est dite en phase normale dans le premier cas et polarit
inverse dans le second cas. Sachant que la plupart des applications actuelles font appel des gels
de silice transforms, peu polaires, de nature plutt hydrophobe, on choisit comme phases mobiles
des mlanges deau et dun modifiant tel le mthanol ou lactonitrile. En changeant la
composition de la phase mobile, donc sa polarit, on agit par lintermdiaire des coefficients de
distribution (KC
S
/C
M
) sur les facteurs de rtention K des composs.
Avec un luant polaire, un compos polaire migre plus vite quun compos apolaire. Dans ces
conditions les hydrocarbures sont fortement retenus. En revanche, les composs polaires sont
assez difficiles sparer entre eux. Il faut raliser des gradients dlution en diminuant
progressivement au cours du temps la concentration en eau (polaire) au profit du modifiant choisi
(moins polaire). On commencera par exemple avec un mlange 80/20% eau/ actonitrile pour
terminer la composition de 40/60%. Cest le domaine de la chromatographie dinteraction
hydrophile.
On reconnait quatre type dinteraction entre les molcules de solvant et de solut.

Ionique quand solut et solvant ont tous deux des moments dipolaires:
De dispersion due lattraction entre elles des molcules voisines:
Dilectriques, qui favorisent la dissolution des soluts ioniques dans les solvants polaires:
Par des liaisons hydrogne, quand sont runis un solut et un solvant dont lun est donneur et
lautre accepteur de protons.
Le choix de la phase mobile est guid par un certain nombre de contraintes pratiques imposes par
leur comportement vis--vis des soluts chromatographier, des phases stationnaires et de
lappareillage utilis.
Dans la mesure du possible, on vite les solvants trop volatils la temprature ambiante, car il
peut se produire alors un phnomne de dgazage dans les micro cuves circulation du systme
de dtection, ce qui rend la dtection impossible.
a: vis--vis des soluts.
Linertie chimique des solvants lgard des substances sparer est une condition indispensable
leur emploi. Ils doivent, en outre, tre capables de dissoudre la totalit des composs prsents
dans le mlange analyser.
Si la phase mobile est constitue par plusieurs solvants ceux-ci doivent tre totalement miscibles.
b: Vis--vis de la phase stationnaire.
Elle ne doit pas tre modifie par le passage de la phase mobile. Ceci implique non seulement une
inertie chimique, mais aussi une insolubilit rciproque des deux phases aussi rigoureuses que

possible .
Le pouvoir de fixation de la phase stationnaire, est souvent li la prsence dun petit nombre de
molcules deau fixes sa surface. Afin quelles ne soient pas limines progressivement par
lluant, il est souvent ncessaire de procder avant la chromatographie la saturation des deux
phases ou laddition deau en quantit exactement connue dans lluant.
c: Compatibilit avec lappareillage.
Les exigences sont diffrentes selon les procdes chromatographiques employs. Le systme de
dtection intervient de manire trs importante.
Lutilisation dun dtecteur spectrophotomtrique en mode direct, ou labsorbance des analytes est
mesure, exige que les solvants nabsorbent pas aux longueurs donde retenues, alors quen mode
indirect, la phase mobile doit prsenter une absorbance notable permettant de visualiser par un pic
ngatif llution des substances dpourvues de proprits spectrales.
d: Gradient dlution:
Le dveloppement dun chromatogramme seffectue en utilisant parfois le solvant qui a permis de
fixer lchantillon sur la colonne ou mieux en prenant un luant de force lgrement suprieur.
Dans les deux cas, lorsque les substances sont trs retenues les oprations sont longues.
Aussi prfre- t- on quand cela est possible, augmenter graduellement la force dlution en
mlangeant deux solvants de polarit diffrente. Le choix de ces solvants est dtermin en faisant
des essais prliminaires en chromatographie sur couches minces dont les rsultats sont ensuite
transposables en chromatographie liquide sur colonne.
Pour sparer un mlange de substances polaires fixes sur une phase galement polaire, on
commence par utiliser un solvant apolaire auquel on ajoute des quantits croissantes dun solvant
plus polaire. La polarit croit alors, non dune manire linaire mais logarithmique:
une trs faible addition de solvant polaire 0,5 ou 2% la fait varier de manire souvent
Considrable.
II.6: Systme de dtection et denregistrement.
Lanalyse par chromatographie a rarement pour but de dterminer la composition totale de
lchantillon, mais plutt de reprer la prsence ou doser un compos prsent, pour lequel on
a choisi un dtecteur bien adapt. Il pour rle de suivre en continu la prsence des composs
dans la phase mobile au fur et a mesure de leur lution.
Pour quun dtecteur puisse permettre une analyse quantitative faible, il doit satisfaire plusieurs
critres.
Fournir une rponse stable, rapide et reproductible.
Prsenter une bonne sensibilit.
Ne pas modifier la qualit de la sparation apporte par la colonne
Les systmes utiliss pour la dtection sont rpartis en deux groupes.
Ceux qui ont un caractre universel et qui exploitent une modification par les soluts dune
proprit de la phase mobile.
Ceux qui sont dits slectifs parce quils utilisent les proprits physico-chimiques
particulire des soluts.
Pour tous ces dtecteurs, sont dfinis:
Le bruit de fond qui doit tre le plus faible possible.
le domaine de linarit.
La limite de sensibilit lie au facteur de dilution.
Le volume mort de lordre de 3 20l.
La concentration minimale dtectable.
a: Dtecteur par absorption dans lultra-violet, le visible et infra- rouge:
Ultra- violet et visible:
La dtection est base sur la loi de Ber- Lambert ( A= l c). Labsorbance A de la phase mobile
est mesure en sortie de la colonne, la longueur donde ou plusieurs longueurs dondes dans
lUV ou le visible. Leur facilit demploi, leur relative indiffrence aux fluctuations de dbit et de
temprature et le bonne transparence dun grand nombre de solvants dans lUV en font les
dtecteurs les plus couramment utiliss en chromatographie liquide ce qui correspond une
dtection slective. Le signal donn par ces dtecteurs est proportionnel la concentration du
solut dans leffluent de la colonne chromatographique.
Les mesures dans lUV sont les plus nombreuses. On se limite en gnral aux phases mobiles
nabsorbant pratiquement plus des longueurs dondes suprieurs 250nm

Trois type dappareils quipent les chromatographes: les photomtres a filtres interfrentiels
(lampe vapeur de mercure a basse pression donnant une raie a 254nm ou a pression moyenne
donnant une raie a 280nm) et les spectrophotomtres a prisme ou a rseau dont la source couvre
toute la gamme de 200 800nm utilisant soit des dtecteurs classiques monochromatiques qui se
composent dune source au deutrium ou vapeur de mercure, dun monochromateur pour isoler
une bande passante troite(10nm).
Soit dtection polychromatique, de plus en plus des barrettes de diodes qui permettent soit
denregistrer labsorbance plusieurs longueurs dondes quasi-simultanment, soit de capter en
une fraction de seconde tout un domaine de longueurs donde sans interrompre la circulation dans
la colonne. Il possde une cellule de lecture ncessaire petite de 5 10l.
Tous ces dtecteurs prsentent un certain nombre davantage en dehors de leur spcificit sur les
prcdents. Ils sont cent fois plus sensibles que le rfractomtre. Ils peuvent, dautre part tre
employs lorsque lon utilise des gradients dlution.
Coupls une informatique ils permettent:
De rendre une identification plus spcifique et de vrifier la puret des chantillons.
De rendre possible le dosage de produits daltration dans des prparations
mdicamenteuses.
De faire une analyse simultane de plusieurs principes actifs dans un produit.
Infra rouge:
Les spectrophotomtres infra rouges micro cellules circulation viennent complter la gamma
des dtecteurs photomtriques. Le choix de la phase mobile est dlicat (tous les solvants absorbent
Dans linfra rouge). Il faut choisir un solvant prsentant une fentre de transmission la frquence
de dtection des soluts. Les solvants les plus utiliss sont (CHBr
3
, CHI
3
, CHCl
3
,CCl
4
,CS
2
) mais
ne couvrent quune faible gamme de polarit.
De plus la dtection par spectrophotomtrie infrarouge manque de sensibilit, ce qui limite son
couplage avec la chromatographie phase liquide. Ce dfaut a t surmont par la mise en uvre de
la spectrophotomtrie infrarouge par transforme de fourrier (IRFT).
b: Dtection spectrofluorimtrique.
Ce mode de dtection est caractris par sa grande slectivit et sa bonne limite de dtection
(10
-15
moles pour des drivs trs fluorescents). Il exploite les proprits quon certaines
molcules en solution dabsorber des radiations dans lultraviolet et de rmettre un rayonnement
de longueur donde suprieure, dintensit proportionnelle lintensit lumineuse absorbe et
donc leur concentration.
La slection des longueurs donde des rayonnements incidents et mis est ralise laide de
filtres ou de monochromateurs.
Le domaine dapplication de la spctrofluorimtrie peut tre largi par la synthse de drivs
fluorescents, soit avant linjection dans le systme chromatographique, soit en sortie de la colonne

Actuellement il y tendance remplacer la source dexcitation (lampe) par un faisceau laser
(parfaitement monochromatique et dintensit stable) ou par une raction chimique susceptible
dexciter le fluorophore.
La rponse de ce type de dtecteur nest donc linaire en fonction de la concentration quaux
faibles valeurs de celle-ci, ce qui justifie lemploi de ce mode de dtection pour lanalyse de
traces, ou la sensibilit est suprieure celle de labsorptiomtrie. En effet, en fluorimtrie, on
opre par mesure directe de lintensit lumineuse, tandis quen absorptiomtrie, on effectue une
mesure relative log (I
0
/I). Ainsi, les quantits minimales dtectables des composs prsentant une
forte fluorescence peuvent tre de lordre de quelques femto moles (10-
15
moles) injectes.
c: Dtection lectrochimique.
Cette dtection met profit les proprits oxydo- rductrices des soluts. Il faut que leffluent de
la colonne chromatographique soit suffisamment conducteur pour permettre le passage du courant,
ce qui est souvent le cas en chromatographie de partage polarit de phase inverse directe ou
aprs formation de paires dions, ou lon utilise des phases luantes naturellement conductrices ou
qui le deviennent par addition dune faible concentration dlectrolyte indiffrent.
Son principe repose sur la mesure du courant qui circule dans une cellule dlectrolyse lors de
loxydation ou de la rduction du solut contenu dans la phase mobile.
Le champ dapplication de la dtection lectrochimique est trs vaste, elle permet par exemple la
dtection par rduction des drivs nitrs ou par oxydation damines aromatiques, de drivs de
lindole, du carbazole, de la quinoline et surtout de drivs phnoliques


(catcholamines) avec une sensibilit de lordre de 10-14 moles injecte. Comme en
spectrophotomtrie ou en spectrofluorimtrie, son application peut tre largie par la mise en
uvre de ractions chimiques de transformation laide de marqueurs lectro actifs.
d: Dtection par spectromtrie de masse.
Le couplage chromatographie en phase liquide spectromtrie de masse (CPL-SM) est un puissant
moyen didentification et de dtection. Les principaux avantages de cette dtection sont les
suivants.
le spectromtre de masse est un dtecteur sensible, universel et autorisant une identification
des soluts (permet lidentification de traces au niveau de la nano mole, composs connus au
niveau de la pico mole).
Gain de temps considrable pour lobtention des donnes de la spectromtrie de masse.
Pas de difficults particulires avec les pics dlution de faible volume.
La quantit de phase mobile utilise est beaucoup plus grande que celle pouvant tre
introduite dans la chambre du spectromtre de masse.
e: Dtection par diffusion de lumire (DDL).
Le principe de ce dtecteur est fond sur lvaporation partielle de leffluent de la colonne
chromatographique de faon obtenir un brouillard de particules solides ou liquides du solut qui
traverse un faisceau lumineux. La lumire diffuse sous un angle dtermine, est dtecte par un
photomultiplicateur.
f: Dtection par radioactivit:
Elle utilise un scintillateur liquide: Elle est utilise principalement pour la dtection des molcules
marques au tritium et au carbone.
g: Dtection par rfractomtrie:
Ce type de dtecteur mesure en continu la diffrence dindice de rfraction (RI) entre la phase
mobile et leffluent de la colonne chromatographique. La limite de dtection dpend la fois de la
nature du solut et celle de la phase luante. En effet, la rponse R1 du rfractomtre est donne
par la relation.
R
1
= Z(n n
0
)
Avec:
Z: constante caractristique de lappareil
n: Indice de rfraction de lfluent:
n
0
: Indice de rfraction de la phase luante.
Chromatographies planaires
I: Principe.
I.1: Chromatographie sur papier.
Elle t introduite par Consden, Gordon et Martin en 1944 pour analyser de trs petites
quantits de mlange. Il sagit dune chromatographie de partage liquide-liquide dans laquelle une
feuille de papier servait de support la phase liquide stationnaire gnralement aqueuse. Leau se
lie aux molcules de cellulose constituant le papier et il se forme un gel qui est la vritable phase
stationnaire.
La feuille est parcourue par la phase mobile et le partage des substances seffectue entre celle-ci et
le gel.
Cest une mthode qualitative inscrite la pharmacope Europenne. Chaque substance est
identifie par son Rf.
I.2: Chromatographie sur couche mince.
Mise au point en 1938 par Ismailov et Scheiber qui ont constitu la suite de la rupture de la
colonne chromatographique que la sparation des composs se poursuivait plat sur la paillasse
du laboratoire.
Actuellement elle est ralise sur une plaque de verre (ou daluminium, de polymre ou sur une
baguette de quartz) recouverte dune fine couche de phase stationnaire. Les substances sparer
sont dposes la surface de ce film solide. On plonge lextrmit infrieure de la plaque dans
Une cuve contenant le solvant de migration et sature en celui-ci.
Suivant la nature des phases stationnaires et mobiles, la sparation est due:
Soit un phnomne dadsorption
Soit un phnomne de partage.
Ou la superposition des deux phnomnes.
Cest une mthode danalyse qualitative inscrite la Pharmacope.
II. Aspect pratique.
II.1: Appareillage.
II.1.1: Chromatographie sur papier.
Papiers: papiers spciaux de grains parfaitement homognes.
Cuves: enceinte close pour maintenir une atmosphre sature en eau ou en solvant
organique.
II.1.2: Chromatographie sur couche mince.
Les plaques: phase stationnaire ou couche mince. De nombreuses substances peuvent tre
utilises comme phases stationnaires polaires.
Silice: adsorption et partage.
Aluminium : adsorption, partage
poudre de cellulose: partage

Terre siliceuse de diatomes: adsorption- partage
Dithyl amino thyl cellulose: change dions.
Polyamide: partage
Comme phases stationnaires peu polaires, on utilise des silices greffes.
Alkyle (C
2
, C
8
, C
18
): partage
Diphnyle: partage
Ou des celluloses actyles, 10, 20, 30, 40 (partage) ou mme des phases stationnaires chirales,
silice greffe C18 imprgne dun slecteur chiral.
II.1.3: Dpt des chantillons:
Les chantillons sparer sont dissous dans un solvant. Les volumes dposs sont trs faibles
(l).
Dpt par capillarit
Dpt manuel par remplissage de capillaire en verre
Dpt mcanique
Dpt par vaporisation:
Dpt automatique ralis par nbulisation sous gaz comprim de lchantillon au dessus
de la surface de la couche mince.


II. 2.1.4: Phase mobile:
Chromatographie sur papier: la phase mobile est constitue de deux phases:
Deau sature de solvant organique
De solution organique sature deau
Chromatographie sur couche mince. On utilise des mlanges monophasiques de plusieurs
solvants de polarit diffrente, de constitution extrmement variable,
chloroforme/dithylamine/actone (50/10/40)
II.2.1.5: Techniques de dveloppement.
Chromatographie sur papier. Aprs dpt la feuille de papier est dveloppe en mode
vertical (ascendant ou descendant) ou circulaire.
Chromatographie sur couches minces: par capillarit ou par mthode en flux forc
II.2.1.6: Dtection.
Dtection visuelle:
chimique directe pour les composs colors.
Aprs pulvrisation dun ractif capable de ragir avec les molcules spares pour donner
des substances colores ou fluorescentes
Physique:
Observation sous lumire UV- Visible

Instrumentale: permet une identification et une quantification plus prcise que la visuelle.
On utilise des densitomtres, des dtecteurs par spectromtrie de masse aprs remise en solution
de la tache, des compteurs de radio-isotope.
III: Etude thorique:
Chacun des constituant migre aves une vitesse qui dpend de son coefficient de partage. On
introduit la notion de : distance parcourue par la substance
Rf =
distance parcourue par le front solvant
Les distances sont mesures partir du centre du dpt initial du mlange.
IV: Applications
Cest une technique peu couteuse dont les applications sont trs varies: agroalimentaire,
pharmaceutiques, toxicologiques, biologiques, environnementales.
Dans le domaine pharmaceutique, identification des matires premires, principes actifs,
recherche dimpurets, contrle de prparations radio pharmaceutiques, valuation des
interactions contenant-contenu, valuation des rsidus aprs nettoyage des racteurs de
fabrication.
En toxicologie les molcules recherches sont les antidpresseurs, neuroleptiques, hypnotiques,
anxiolytiques, antalgiques, antipaludens.

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