Discusso de artigo cientfico

Grupos de 6 pessoas
Discusso de artigo cientfico
Atividade 1 trabalho (at 2 pginas manuscritas)
Entregar dia 11/06, 5 pontos
Um tema por grupo, a ser sorteado

Temas para trabalho (metodologia):
- escolha e caractersticas do vetor de expresso
- adio da tag FLAG. como foi incorporada e qual a funo?
- processo de transfeco transitria
- lise e fracionamento das clulas
- purificao de protenas
- espectrometria de massas
- sequenciamento de peptdeos da protena
- eletroforese e Western Blot


Discusso de artigo cientfico
Atividade 2 discusso em sala, dia 11/06, 5 pontos

Temas de perguntas:

Objetivo e motivao do artigo

Figuras:
Por que o experimento foi realizado?
Detalhes experimentais e concluses de cada figura

Discusso dos resultados
Sequenciamento, genomas, diagnstico
e medicina personalisada
Profa. Rafaela Ferreira
Biologia Molecular - UFMG

Construo de bibliotecas de DNA
bibliotecas genmicas
bibliotecas de cDNA
DNA

Fragmentao

Insero em vetores

Transformao
mRNA

Sntese de cDNA

Insero em vetores

Transformao
Bibliotecas de DNA
Genmica

A partir de DNA genmico
fragmentado de qualquer tecido

Freqncia do clone independe do
nvel de expresso

Pode conter promotores e ntrons

No pode ser usada para expresso
heterloga em bactria


Utilizada para seqenciamento de
genoma, mapeamento,estudo de
seqncias regulatrias, etc

de cDNA

A partir de transcrio reversa de
mRNA de um tecido especfico

Freqncia do clone depende da
expresso do mRNA no tecido utilizado

No contem promotores ou ntrons

Pode ser usada para expresso em
bactria se o vetor tiver promotor
e outros sinais adequados

Utilizada para seqenciamento de
seqncias expressas (ESTs), estudos
de funo do gene, expresso de
protenas em bactrias
ORIGEM DO DNA

DIFERENAS ENTRE CLONES DE CLULAS DIFERENTES OU EM
MOMENTOS DIFERENTES?
PRESENA DE PROMOTORES E NTRONS
APLICAO PARA EXPRESSO DE PROTENAS EM BACTRIAS?

EXEMPLOS DE APLICAO



Bibliotecas de DNA
Genmica

A partir de DNA genmico
fragmentado de qualquer tecido

Freqncia do clone independe do
nvel de expresso

Pode conter promotores e ntrons

No pode ser usada para expresso
heterloga em bactria


Utilizada para seqenciamento de
genoma, mapeamento,estudo de
seqncias regulatrias, etc

de cDNA

A partir de transcrio reversa de
mRNA de um tecido especfico

Freqncia do clone depende da
expresso do mRNA no tecido utilizado

No contem promotores ou ntrons

Pode ser usada para expresso em
bactria se o vetor tiver promotor
e outros sinais adequados

Utilizada para seqenciamento de
seqncias expressas (ESTs), estudos
de funo do gene, expresso de
protenas em bactrias
Construo de bibliotecas genmicas
DNA
total
Sequenciamento completo
dos clones e montagem
do genoma
Screening dos clones de interesse:
- com sondas de DNA
- com anticorpos
Fragmentao
enzimtica ou mecnica
Ligao a
um vetor
BACs e YACS

para construo de
bibliotecas genmicas
com insertos de
grandes tamanhos
Construo de bibliotecas de cDNA
mRNA total
Ligao a um vetor
Screening
de clones

ou anlise
de ESTs
Sequenciamento de DNA: o mtodo de Sanger
primer
polimerase
dNTPs
template
F-ddNTPs
Sequenciamento Automtico em Capilar
Sequenciamento Automtico em Capilar
Programas
base calling
Programas
phred
Do sequenciamento a montagem do genoma
Desafios das tcnicas tradicionais de
sequenciamento
Necessidade de clonagem (e at subclonagem)

Poucas bases lidas por corrida (500 bp para mtodo de Sanger;
750 bp para cada capilar no sequeciamento automtico)

Alto custo
Tcnicas de sequenciamento de nova gerao

Sequenciamento direto dos fragmentos, sem necessidade de
clonagem (amplificao por PCR)

Automatizadas, diversas regies so sequenciadas em paralelo
(milhes de bps sequenciadas)

Mais rpidas e baratas

Maior cobertura de cada posio do genoma
Sequenciamento com o sistema 454
Totalmente automatizado
(construo da biblioteca, amplificao dos
fragmentos, sequenciamento, montagem)

PicoTiter plate
(860 mil ou 1,6 millhes de wells)

20 milhes de bases/corrida
http://www.454.com
Sequenciamento com o sistema 454
Sequenciamento com o sistema 454
Sequenciamento com o sistema 454
Sequenciamento com o sistema 454
Sequenciamento de genoma
e medicina personalisada
Diferentes pessoas respondem diferentemente a terapias



possvel relacionar mutaes a respostas teraputicas?


possvel prever a resposta teraputica?
Sequenciamento de genoma
e medicina personalisada
Cenrio: pacientes japoneses respondem melhor
a terapia com gefitinib (cancer de pulmo)
do que pacientes americanos

possvel encontrar as razes moleculares dessa
diferena teraputica?

Busca a partir do receptor EGFR (alvo do gefitinib)
Razes moleculares para a diferena de
resposta a gefitinib
Genes do receptor EGFR sequenciados
em clulas cancergenas e em tecido
normal (Japo e nos EUA )
Mutaes somticas encontradas em
15 de 58 tumores de japoneses
e 1 de 61 tumores de americanos
Mutaes encontradas em
americanos que respondem a
terapia com gefitinib, mas no em
pacientes insensveis a gefitinib
As mutaes favorecem a
resposta teraputica?
Japoneses respondem melhor
a terapia com gefitinib
Como este conhecimento pode ser aplicado a
medicina personalisada?
Novo paciente: como prever a resposta a gefitinib?


E se houver mltiplas terapias?
A biologia molecular no diagnstico
A biologia molecular no diagnstico
Principais tcnicas utilizadas:

- PCR
-PCR em tempo real
- sondas de DNA
- sequenciamento



Hibridizao de DNA - Southern blot
A biologia molecular no diagnstico
Infeces virais: teste qualitativo,
deteco de carga viral, genotipagem
A biologia molecular no diagnstico e
prognstico de doenas
Marcadores oncognicos
- Identificao de mutaes especficas

Compatibilidade para transplantes

Propenso a diversas doenas
- Oligonucleotdeos para hibridao