UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CHIHUAHUA

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

TANASA




Tecnologa de Enzimas


Rubn Mrquez Melndez





Mnica Alcntar Lechuga 257523


Contenido
INTRODUCCIN .............................................................................................................................. 1
MECANISMO DE ACCIN. ............................................................................................................ 1
FUENTES DE OBTENCIN........................................................................................................... 3
EXTRACCIN Y PURIFICACIN ................................................................................................. 4
Fermentacin Lquida Sumergida .............................................................................................. 4
Fermentacin en Estado Slido. ................................................................................................ 4
PURIFICACIN DE LA MUESTRA ............................................................................................... 4
Produccin ..................................................................................................................................... 5
Concentracin y purificacin de la TAH .................................................................................... 5
Dilisis. ........................................................................................................................................... 5
Concentracin. .............................................................................................................................. 5
Cromatografa de filtracin en gel. ............................................................................................. 6
Cromatografa de intercambio inico. ....................................................................................... 6
Determinacin de Km y Vmax .................................................................................................... 6
Parmetros cinticos ................................................................................................................... 6
BASE DE DATOS ............................................................................................................................. 7
INMOVILIZACIN ............................................................................................................................ 8
APLICACIONES Y USOS POTENCIALES .................................................................................. 8
REFERENCIAS ................................................................................................................................ 9

1

INTRODUCCIN
La tanin acil hidrolasa (TAH), comnmente conocida como tanasa, es la enzima
(EC. 3.1.1.20) que cataliza la hidrlisis de los enlaces ster presentes en
galotnicos, elagitaninos, taninos complejos y steres del cido glico. Sus
principales usos se encuentran en la elaboracin de t helado, licor de bellota y en
la produccin de cido glico a partir de fuentes vegetales con alto contenido de
taninos. (Rodrguez, Valdivia, Contreras., Rodrguez y Aguilar, 2010).
La TAH se utiliza como agente clarificante en la elaboracin de ciertos jugos y
bebidas refrescantes con sabor a caf. Adems se ha propuesto tratar desechos
agrcolas con tanasa o con algn microorganismo productor de esta enzima, para
disminuir el contenido de taninos y as poder utilizarlos en alimentacin animal.
(Rodrguez, Rodrguez, Rodrguez, Hernndez, Aguilar, 2007)
MECANISMO DE ACCIN.

La TAH cataliza la hidrlisis del cido tnico dando como productos nueve
molculas de cido glico y una de glucosa por cada molcula de sustrato (Figura
1). Los compuestos intermediarios en esta reaccin son: 1, 2, 3, 4,6 penta-galoil-
glucosa, 2, 3, 4,6 tetra-galoil-glucosa y dos tipos de mono-galoil-glucosa. Cuando
el sustrato de la reaccin es un metil-ster del cido glico, la TAH produce cido
glico y metanol (Rodrguez y col., 2010).
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El ms comn de los taninos es el cido tnico, puede o no estar metilado, est
compuesto por un mol de glucosa y nueve moles de cido glico. En la Figura 2,
se observan las estructuras de una molcula de cido tnico metilado y no
metilado, cuando el cido tnico no est metilado, la molcula de glucosa se unir
por medio de enlaces de tipo ster a el radical R2 (cido diglico) en los carbonos
1, 2, 3 y 4 y al radical R1 (cido glico) en el carbono 6. Si el cido tnico esta
metilado el radical R2 ser reemplazado por R3 (m-digalato metilado).













Se logr detectar dos tipos de actividades enzimticas en el extracto obtenido del
cultivo de A. orizae. La deteccin de los dos tipos de actividades permiti el
fraccionamiento de dos grupos de isoenzimas, mediante cromatografa de
afinidad. El primer grupo se denomin Tanasa I, esta fraccin es responsable de la
degradacin de cido tnico que posee grupos metilo y el segundo grupo se llam
Tanasa II, present una fuerte afinidad por el cido diglico e hidroliz
especficamente derivados poliglicos que tienen enlaces con carbohidratos.
Los taninos se fueron fraccionando en tres compuestos; cido tnico, el cual no
presenta migracin en los anlisis de cromatografa, pentagaloilglucosa y
tetragaloilglucosa. Despus de una incubacin de 12 horas la cantidad del ltimo
compuesto se incrementa y empiezan a aparecer cidos glicos y di glico,
3

despus de 24 h de incubacin la cantidad de intermediarios se incrementa; estn
presentes digaloilglucosa y trazas de monogaloil glucosa. Hacia el final de la
hidrlisis, predominan el cido glico y el digaloil glucosa, quedando finalmente
solamente cido glico. Lo anterior podra sugerir que la actividad tanasa es
mayor al inicio de la incubacin, con la degradacin de cido tnico y la formacin
de cidos glico, diglico e intermediarios. La actividad esterasa se nota a partir
de las 24 h de incubacin transformando los intermediarios en cido glico.
(Garca E.I.1996)
Su actividad podra resumirse de la siguiente forma:








El sitio activo de la tanasa contiene una serina, lo cual la hace una tpica enzima
esterasa.
FUENTES DE OBTENCIN.
Es conocido que la produccin de tanasa y la degradacin de taninos
hidrolizables, se da en medios fngicos de especies de Aspergillus, incluyendo A.
flavus, A. orizae, A joponicus, A. niger y tambin Penicillium sp. Las bacterias son
generalmente consideradas como altamente sensibles a los taninos, pero al aislar
algunas se observ que son capaces de sobrevivir en presencia de taninos e
incluso degradarlos. La produccin de tanasa fue lograda en Bacillus pumilus, B.
polymyxa, Corinebacterium sp y Kleibsiella pneumoniae en extractos de corteza
de castao como nica fuente de carbono: la rpida degradacin de la estructura
de los taninos fue relacionada con la produccin de tanasa extracelular. El cido
glico fue el nico producto de degradacin observado con las cepas de Klebsiella
pneumoniae, Corinebacterium sp y Bacillus polymyxa. (Garca E.I 1996)
4


EXTRACCIN Y PURIFICACIN
Durante mucho tiempo la produccin industrial de tanasa se llev a cabo
exclusivamente en sistemas de Fermentacin Lquida Sumergida (FLS), sin
embargo, en los ltimos aos una serie de investigaciones han demostrado las
ventajas de la Fermentacin en Estado Slido (FES) para produccin de sta y
otras enzimas. (Garca E.I 1996).

Fermentacin Lquida Sumergida
La tanasa se encuentra en el micelio de Aspergillus flavus o Nger, crecidos en
medio que contiene cido tnico como nica fuente de carbono, en fermentacin
en medio lquido. La formacin de la enzima puede ser inducida y es mayor al
inicio del crecimiento del microorganismo. Tambin se logr detectar algo de
actividad extracelular, lo cual indica que una pequea cantidad de enzima se
excreta. Aparentemente la produccin est asociada al crecimiento (Garca E.I
1996).

Fermentacin en Estado Slido.
Lenkha y Lonsane en 1994, publicaron un estudio comparativo de la produccin
de tanasa en fermentacin slida, sumergida y superficial, mostrando que en
fermentacin slida se obtuvo 2.5 y 4.8 veces mayor actividad que en
fermentacin superficial y lquida, respectivamente, en aproximadamente la mitad
del tiempo de produccin. La enzima producida en medio slido fue
completamente extracelular a diferencia de la tanasa producida en medio lquido y
superficial que fue intra y extracelular, adems la tanasa extracelular mostr una
buena estabilidad a altos valores de temperatura y pH. (Garca E.I 1996).

PURIFICACIN DE LA MUESTRA
Existen varios mtodos de purificacin, que varan dependiendo del
microorganismo que producir la Tanasa. Se mostrara un ejemplo, donde el
organismo de donde extraeremos la enzima ser Aspergillus niger.

5

Produccin
Para la produccin de la enzima tanasa en FES se utiliz la cepa GH1
de Aspergillus niger perteneciente a la coleccin UAdeC-DIA.

El medio de cultivo para la FES consisti en una solucin acuosa de cido tnico
(25 g/L) y las sales del medio Czapek-dox. El medio se inocul con la suspensin
de esporas hasta dar una concentracin de 8.57 10 6 esp./mL de medio lquido.
Se utilizaron cubos de 0.5 cm de arista de esponja de Poliuretano (PUF) como
soporte inerte para la Fermentacin en Estado Slido (FES). Se agreg el medio
lquido previamente inoculado hasta obtener una humedad del 70 % y una
concentracin de 2 10 7 esporas/g de PUF, se homogeniz el material y se
incubo a 35C.

Para determinar las condiciones adecuadas para la produccin de la enzima se
realizaron fermentaciones en matraz ajustando el pH inicial del medio a diferentes
valores (4, 4.5 y 5). Se monitore el comportamiento de cada fermentacin cada
12 h durante 60 h. Se determin actividad tanasa, protena soluble, azcares
totales y fenoles hidrolizables totales con el reactivo Folin-Ciocalteu.
Para obtener el extracto enzimtico crudo (EEC) se agreg buffer de cido
actico-acetato de sodio (50 mM, pH = 5.0), se homogeniz y se exprimi el
lquido con ayuda de una jeringa de plstico de 60 mL. El EEC se filtr primero con
papel filtro Watman 40 y luego por membrana de celulosa MILLIPORE de 45 m.

Concentracin y purificacin de la TAH
Para obtener el extracto enzimtico para la caracterizacin de la tanasa de A.
niger GH1, el EEC fue sometido a un proceso de purificacin.
Dilisis.
Se dializ el extracto contra Buffer de cido actico-acetato de sodio 50 mM, pH=
5.0 durante 48 h, con agitacin a 4 C, una membrana de celulosa (SIGMA) para
12 kDa cambiando el buffer de dilisis cada 12 h.
Concentracin.
Se evaluaron tres tcnicas para la concentracin de protena: Precipitacin con sal
con solvente inorgnico y concentracin con polietilen-glicol (PEG).



6


La precipitacin con sales se consigui con sulfato de amonio ((NH4)2SO4) al
60% de la concentracin de saturacin. Para la concentracin con solvente se
utiliz acetona en proporcin 1:1 (v/v). En el mtodo del PEG se utiliz en una
membrana de celulosa (SIGMA) para 12 kDa, se cubri con polietilenglicol (PM =
6000) durante 48 h hasta que el volumen del lquido dentro de la membrana se
redujo considerablemente al 10% del volumen original del extracto.
Cromatografa de filtracin en gel.
Se utiliz una mini columna Hi Trap TM Desalting de 5 mL de volumen y un flujo
de 1 mL/min. Se equilibr la columna con 15 mL de buffer de cido actico-acetato
de sodio 50 mM, pH = 5.0. Se inyectaron 1.5 mL de muestra y se efluy con 16.5
mL de buffer, recuperando 9 fracciones de 2 mL cada una.
Cromatografa de intercambio inico.
La fraccin de la cromatografa de desalado que present ms actividad fue
sometida a una cromatografa de intercambio inico de la siguiente manera: Se
probaron dos mini columnas de intercambio anicnico Hi Trap TM de 1 mL de
volumen (DEAE-FF y Q-XL). La columna se eluy con un gradiente escalonado de
NaCl 0 a 1.0 molar en buffer de acetato. Las fracciones con mayor actividad fueron
tomadas como extractos purificados. (Rodrguez y Col., 2007)
Determinacin de Km y Vmax
Km y Vmax se determinaron mediante una grfica de velocidad frente a la
concentracin de sustrato S. Km es igual a S cuando la velocidad inicial (V) es
igual a Vmax. Km es una propiedad del complejo ES; que no depende de la
concentracin de enzima o sustrato. (Sabu, Kiran, and Pandey, 2005)
Parmetros cinticos
El efecto de la concentracin de sustrato en la actividad de la tanasa crudo y
purificado se determin mediante el uso de diferentes concentraciones de cido
tnico, en la mezcla de reaccin y la actividad de la enzima se estim en cada
caso X y Y e Y max se determinaron por el trazado de la velocidad de reaccin en
contra de la concentracin de cido tnico en el sustrato. (Gayen and Ghosh,
2013)



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BASE DE DATOS
Organismo Localizaci
n
T optima
(C)
pH
optimo
Peso
molecular
(kDa)
Km
Value
Actividad
especific
a
Purificacin Inhibidores Aplicacin
Aspergillus
oryzae
Pared
Celular
30 4.5 45000 0.7 14.65 2 isoenzimas
1,4-
dihidroxibe
nceno
Biotecnolo
-ga
Lactobacillus
sp
Extracelu
-lar
30 5 5000 0.62 7.5
Precipitacin con
sulfato de amonio,
cromatografa en
columna Q-Sepharose,
cromatografa en
columna de
hidroxilapatito y
cromatografa en
columna Mono-Q
1-Propanol
Biotecnolo
-ga
Verticillium
sp.
Extracelu
-lar
25 5.5 15500 1.05 61.8
Isoenzimas nativos
TAH TAH I y II 7,9
veces y 10,5 veces,
respectivamente, a la
homogeneidad
Ag
+

Penicillium
sp.
Intracelu-
lar
30 5.5 _ _ _ - Heptano
Biotecnolo
-ga
Aspergillus
aculeatus
Membra-
na
30 5 _ _ _ - NaCl Nutricin
Aspergillus
Niger
Intracelu-
lar
30 4 18600 0.41 0.43
Precipitacin con
acetona y G25
sephadex gel
filtracin
1-Propanol
Industria
Alimenti-
cia
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INMOVILIZACIN
Lainmovilizacindeenzimasesunprocesoenelqueseconfinaolocalizaunaenzimadeun
a regin definida (soporte slido), con la finalidad de poder reutilizarla en forma
repetida.
La tanasaliofilizada (100mg) fue disuelta en una solucin buffer (citrato100mM,
pH5, 5), hasta alcanzar una concentracin de 2mg/mL de tanasa la solucin de
enzimtica (45 mL) sobre el soporte activado, la mezcla se agit durante 24 horas
a temperatura ambiente y a una velocidadde100rpm. La mezcla se pas a travs
de una malla de 200 mesh. El catalizador se lav de manera sucesiva con una
solucin de cloruro de sodio 2M (50 mL), buffer acetato 0,015M pH6 (75mL) y
solucin de cloruro de sodio 2M (50mL). El volumen total de lavados se midi en
una probeta. El catalizador preparado se almacen en una solucin de cloruro de
sodio0.9%(30mL) a 4C. (Castillo, Acuache, Osorio, Fuertes. (2009)

APLICACIONES Y USOS POTENCIALES
Los usos de la tanasa se concentran en las industrias de la piel, farmacutica y de
alimentos. Hasta el momento, las principales aplicaciones de la tanasa estn en la
elaboracin de t instantneo y licor de bellota, as como en la produccin de
cido glico a partir de materiales vegetales con alto contenido de galotaninos. La
TAH tambin es utilizada como agente clarificante en jugos y bebidas refrescantes
con sabor a caf
El cido glico se utiliza en la industria farmacutica como un importante
compuesto intermediario en la sntesis del antibitico trimetoprima; en la industria
qumica se emplea como sustrato para la sntesis qumica o enzimtica de propil-
galato y otros compuestos antioxidantes utilizados en alimentos, cosmticos,
productos para el cabello, adhesivos y lubricantes. El cido glico es usado en la
elaboracin de semiconductores, tintas y en la revelacin fotogrfica. Diversos
estudios han encontrado que el cido glico y compuestos relacionados tienen
propiedades teraputicas importantes. (Rodrguez y col., 2010).
Los usos de la tanasa en bebidas y alimentos contribuyen a reducir los efectos
indeseables de los taninos. En la manufactura del t instantneo la TAH se utiliza
para eliminar precipitados insolubles que se forman cuando la bebida se enfra a
temperaturas por debajo de los 4 C. Estos precipitados se forman por la
polimerizacin de compuestos fenlicos y por su interaccin con la cafena.
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El tratamiento con TAH rompe los enlaces ster de los polifenoles, evitando su
polimerizacin y acomplejamiento con la cafena. Los procesos qumicos para
eliminar los precipitados del t pueden eliminar una gran cantidad de compuestos
aromticos, en cambio, mediante el tratamiento enzimtico se obtiene un t
soluble en agua fra con un alto contenido de compuestos aromticos y un color
apropiado (Rodrguez y col., 2010)
REFERENCIAS
1. Rodrguez L., Valdivia B., Contreras J., Rodrguez R. y Aguilar C. (2010).
Qumica y biotecnologa de la tanasa. Revista Cientfica de la Universidad
Autnoma de Coahuila. 2, (4).
2. Garca E.I (1996). Produccin, purificacin y caracterizacin de tanasa
producida por aspergillus niger, en fermentacin en medio slido. Tesis de
Maestro en Biotecnologa. Universidad Autnoma Metropolitana, D.F.,
Mxico.
3. Rodrguez L., Rodrguez N., Rodrguez N., Hernndez M., Aguilar C. (2007)
Estudio de la Inhibicin de la enzima Tanasa producida por Aspergillus
niger GH1 en Fermentacin en Estado Slido (FES). [En lnea]
TURevista Digi.U@T Agosto 2009. Vol. 4 Nm. 2 [20-11-13]
4. Gayen S. and Ghosh U. (2013), Purification and Characterization of Tannin
Acyl Hydrolase Produced by Mixed Solid State Fermentation of Wheat Bran
and Marigold Flower byPenicillium notatum NCIM 923. BioMed Research
International. 2013, (596380), 6.
5. Sabu A., Kiran S., and Pandey A. (2005) Purification and Characterization of
Tannin Acyl Hydrolase from Aspergillus niger ATCC 16620. Original
scientific paper. Biotechnology Division, Regional Research Laboratory. 43
(2) 133138.
6. Castillo A., Acuache K., Osorio A., Fuertes C.(2009). Obtencin de galato
de n-propilo mediante transesterificacin enzimtica con tanino, propanoly
tanasa inmovilizada en quitina.
7. BRENDA. The Comprehensive Enyme Information System. E.C. 3.1.1.20
Tannase.