INSTITUTO DE QUMICA

DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS BIOQUMICOS

BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL - BIOQUMICA
DOCENTES: GUSTAVO DE SOUZA E FABIO MERON

Prtica n
o
1: PODER REDUTOR DOS GLICDIOS


1 - Teoria:
Os glicdios que possuem em sua estrutura um grupamento hemiacetal, identificado pela
presena da hidroxila heterosdica ligada ao carbono anomrico, apresentam poder redutor.
Metais como Cu
2+
, Ag
+
, Bi
3+
e Hg
2+
e ainda substncias orgnicas como o cido dinitrossaliclico
(DNS) so reduzidos em meio alcalino por glicdios. O poder redutor uma propriedade muito
utilizada para determinao qualitativa e quantitativa de glicdios.

2 - Objetivo:
Avaliar o poder redutor dos seguintes glicdios: glicose, frutose, sacarose, maltose e
lactose.

3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagentes: Reativos de Benedict, de Fehling, de Tollens e soluo de DNS.
-Solues aquosas: 1% de glicose (G), 1% de frutose (F), 2% de sacarose (S), 2% de
maltose (M) e 2% de lactose (L).

4 - Procedimento:
- Para cada reagente separar seis tubos de ensaio. Marcar cada um dos tubos com a inicial
de um dos glicdios a ser testado e mais um que ser o branco (B). Cada conjunto de seis tubos de
reagente corresponde a uma srie.
- Adicionar aos tubos da 1 srie 1mL de reativo de Benedict, ao da 2 srie 1mL do
reativo de Fehling, aos da 3 srie 1mL de reativo de Tollens e aos da 4 srie 1mL de DNS.
- Adicionar cada tubo 1 mL da respectiva soluo de glicdio. Aos tubos marcados com
B adicionar 1mL de gua destilada.
- Aos tubos contendo o reagente de Tollens, deve ser acrescida uma gota de soluo de
hidrxido de amnio.
- Aquecer a mistura em banho-maria.
-Verificar a formao de precipitado, mudana de cor ou formao de espelho prata.

5 - Resultados:
Elaborar uma tabela indicando os glicdios que apresentam poder redutor frente aos
diferentes reagentes:
+ = reao positiva
- = reao negativa
Anotar todas as alteraes ocorridas.

6 - Relatrio:
-Apresentar as reaes de reduo dos reagentes estudados pelos glicdios.
-Explicar porque nem todos os glicdios avaliados apresentaram poder redutor.
2
INSTITUTO DE QUMICA
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS BIOQUMICOS
BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL - BIOQUMICA
DOCENTES: GUSTAVO DE SOUZA E FABIO MERON


Prtica n
o
2: DOSAGEM DE GLICDIOS REDUTORES (GR) MTODO DE NELSON


1 - Teoria:
O mtodo de Nelson um mtodo espectrofotomtrico que tem como base a reduo do
cobre em meio alcalino (reativo de Fehling), seguido da formao de um complexo azul de Cu
+

com molibdato de amnio (tcnica colorimtrica de Somogyi). um mtodo bastante sensvel,
sendo a intensidade da colorao azul diretamente proporcional quantidade de glicdio redutor.
2 - Objetivo:
- Elaborar uma curva padro para determinao da concentrao de glicdios redutores
presentes numa amostra.
3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagentes: Solues Nelson A, Nelson B e Nelson C.
-Soluo padro de glicose 18mg/100mL (18 mmol/L).
4 - Procedimento:
4.1- Preparo da curva padro
a-Adicionar a 6 tubos de Folin-Wu 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0 mL da soluo padro de
glicose e completar cada um deles para 1mL com gua destilada.
OBS: Iniciar o item 4.2.
b-Adicionar em cada tubo 1mL da mistura dos reagentes Nelson A e Nelson B (24 mL de
Nelson A + 1,0 mL de Nelson B).
c-Aquecer em banho-maria em ebulio por 20 minutos.
d-Resfriar os tubos em gua corrente.
e-Adicionar 1,0 mL do reagente Nelson C e agitar at parar de espumar.
f-Completar o volume para 25 mL com gua destilada (usar a marcao do tubo) e
homogeneizar.
g-Ler as absorvncias das solues em espectrofotmetro a 540nm, zerando o aparelho
com o branco (aquele que contm 0 mL da soluo padro de glicose).
4.2- Determinao da concentrao de glicose em amostra desconhecida
a-Adicionar a um tubo de Folin-Wu 1 mL de soluo da amostra desconhecida.
b-Repetir os procedimentos dos itens 4.1.b a 4.1.g.
5 - Resultados:
-Elaborar uma tabela com os dados de [glicose] e as respectivas absorvncias em 540nm.
-Construir a curva padro de absorvncia a 540nm versus concentrao de glicose (g/L),
incluir a equao da curva e o coeficiente de determinao (R
2
).
-Determinar a concentrao de glicose na amostra desconhecida.
-Apresentar a reao qumica que ocorreu, explicando a funo dos componentes dos
reagentes de Nelson.


3
INSTITUTO DE QUMICA
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS BIOQUMICOS
BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL - BIOQUMICA
DOCENTES: GUSTAVO DE SOUZA E FABIO MERON


Prtica n
o
3: DOSAGEM DE GLICDIOS REDUTORES (GR) E GLICDIOS
REDUTORES TOTAIS (GRT) EM AMOSTRA DE CALDO DE CANA-DE-ACAR


1 - Teoria:
O principal componente do caldo de cana-de-acar a sacarose, glicdio que no possui
redutor. Na determinao dos glicdios totais (GRT) presentes no caldo de cana, inicialmente a
sacarose presente deve ser hidrolisada, de acordo com a seguinte equao qumica:

sacarose + gua glicose + frutose

Como glicose e frutose so glicdios redutores, a partir de sua quantificao no caldo
hidrolisado possvel determinar a concentrao de sacarose no caldo de cana.

2 - Objetivo:
Determinar a concentrao de GR, GRT, sacarose presentes no caldo de cana-de-acar e
a eficincia da hidrlise.
3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagente: Soluo de DNS.
-Soluo padro de sacarose (20 % m/v) e caldo de cana de acar.
-Soluo padro de glicose 20mg/100mL (1 mmol/L).

4 - Procedimento:
4.1- Hidrlise cida da soluo padro de sacarose e do caldo de cana-de-acar para
anlise de GRT
a-Colocar em erlenmeyer de 250 mL, 20 mL de amostra de caldo de cana-de-acar e 30
mL de gua destilada.
b-Colocar em um segundo erlenmeyer de 250 mL, 20 mL da soluo padro de sacarose
20% e 30 mL de gua destilada.
As etapas a seguir sero realizadas para ambas as solues obtidas nos itens a e b.
c-Levar a banho-maria na temperatura de 65C.
c-Atingida a temperatura acima adicionar 10 mL de HCl 6,2 mol/L e homogeneizar.
d-Retirar o erlenmeyer do banho e aguardar 30 minutos.
e-Transferir o hidrolisado para um balo de 500 mL e completar o volume.
f-Pipetar 10 mL da soluo do hidrolisado e colocar em balo de 500 mL, neutralizar com
2,0 mL de NaOH 0,62 mol/L e completar o volume a 500 mL.
g-Transferir 1,0 mL da soluo obtida no item f para um tubo de Folin-Wu.
4.2- Diluio do caldo de cana-de-acar para anlise de GR
a-Diluir o caldo de cana na proporo 1:100.
b-Adicionar 1 mL do caldo diludo na proporo 1:100 a um tubo de Folin-Wu.
4
4.3- Preparo de curva padro
a-Adicionar a 6 tubos de Folin-Wu 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0 mL da soluo padro de
glicose e completar cada um deles para 1mL com gua destilada.

4.4- Determinao de GR nas amostras
Ser feita a anlise de GR pelo mtodo do DNS nos seguintes tubos de Folin-Wu: Os dois
tubos obtidos no item 4.1, o tubo obtido no item 4.2 e os seis tubos obtidos no item 4.3.
a-Adicione 1,0 mL do reagente do DNS a cada um dos tubos de Folin-Wu.
b- Aquecer em banho-maria em ebulio por 5 minutos.
c- Resfriar os tubos em gua corrente.
d- Completar o volume para 12,5 mL com gua destilada (usar a marcao do tubo) e
homogeneizar.
e- Ler as absorvncias das solues em espectrofotmetro a 540 nm, zerando o aparelho
com o branco (1,0 mL de gua destilada).

5 - Resultados:
- Construir a curva padro de absorvncia a 540nm versus concentrao de glicose
(mmol/L), incluir a equao da curva e o coeficiente de determinao (R
2
).
- Calcular a concentrao de glicdios redutores totais (GRT), em g/L, no hidrolisado da
soluo padro de sacarose. A partir deste dado, calcular a eficincia da hidrlise.
- Calcular a concentrao de glicdios redutores (GR), em g/L, na amostra de caldo de
cana-de-acar.
- Com base na eficincia da hidrlise e na concentrao de GR no caldo de cana, calcular
as concentraes de glicdios redutores totais (GRT) e sacarose, em g/L, no caldo de cana-
de-acar.
- Comparar as curvas padres obtidas pelos mtodos de Nelson (prtica 2) e do DNS
(prtica 3) no sentido de identificar a de maior sensibilidade na anlise de glicdios redutores na
faixa de concentraes em estudo.




















5
INSTITUTO DE QUMICA
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS BIOQUMICOS
BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL - BIOQUMICA
DOCENTES: GUSTAVO DE SOUZA E FABIO MERON


Prtica n
o
4: DETERMINAO DOS NDICES DE SAPONIFICAO E ACIDEZ


I-ndice de Saponificao (I.S.):

1 - Teoria:
Corresponde a massa, em miligramas, de hidrxido de potssio necessria para neutralizar
os cidos graxos resultantes da hidrlise de 1 grama de gordura ou leo. Desprezando-se a
matria insaponificvel, este ndice inversamente proporcional massa molar mdia dos
grupamentos acila (resduos de cidos graxos) presentes na molcula de triacilglicerol.

2 - Objetivo:
-Determinar o ndice de saponificao de amostras de leos ou gorduras comerciais.

3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagentes: Soluo alcolica de hidrxido de potssio a 4% m/v, soluo alcolica de
fenolftalena a 1% e cido clordrico 0,5 mol/L.

4 - Procedimento:
a-Pesar 2g de amostra em um frasco erlenmeyer de 250 mL.
b-Adicionar 20 mL de soluo alcolica de hidrxido de potssio a 4%.
c-Adaptar o erlenmeyer a um condensador de refluxo.
d-Aquecer at ebulio branda por 30 minutos.
e-Resfriar, adicionar 2 gotas de fenolftalena e titular com HCl 0,5 mol/L at que a
colorao rsea desaparea.
f-Realizar um ensaio em branco em outro frasco erlenmeyer sem amostra (item b ao e).

5 - Resultados:
Elaborar uma tabela com os resultados da titulao.
Calcular o ndice de saponificao para as amostras.
I.S. = (Vb - Va) MHCl x MMKOH
m
onde: Vb = volume da soluo de HCl gasto na titulao do branco (L)
Va = volume da soluo de HCl gasto na titulao da amostra (L)
M
HCl
= concentrao em quantidade de matria da soluo de do HCl (mol/L)
MM
KOH
= massa molar do KOH (56000 mg/mol)
m = massa da amostra (g)




6
II-ndice de Acidez (I.A.):

1 - Teoria:
Corresponde massa, em miligramas, de hidrxido de potssio necessria para neutralizar
os cidos graxos livres presentes em 1 grama de leo ou gordura.

2 - Objetivo:
-Determinar o ndice de acidez em amostras de leos comerciais.

3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagentes: Soluo de ter etlico-lcool etlico (2:1) neutra, soluo alcolica de
fenolftalena a 1% e hidrxido de sdio 0,05 mol/L.

4 - Procedimento:
a-Pesar 2g de amostra em um frasco erlenmeyer de 250 mL.
b-Adicionar 25 mL de soluo de ter etlico-lcool etlico neutra e homogeneizar.
c-Adicionar 2 gotas de fenolftalena e titular com NaOH 0,05 mol/L at colorao rsea.

5 - Resultados:
Elaborar uma tabela com os resultados da titulao.
Calcular o ndice de acidez para as amostras.
I.A. = Va x MNaOH x MMKOH
m
onde: Va = volume de soluo de NaOH gasto na titulao da amostra (L)
MNaOH = concentrao em quantidade de matria da soluo de NaOH (mol/L)
MMKOH = massa molar do KOH (56000 mg/mol)
m = massa da amostra (g)


6- Questes:
1) Comparar e interpretar os resultados obtidos para as amostras analisadas.
2) A partir da estequiometria da reao, deduzir as equaes para os clculos dos ndices.
3) Explique a viabilidade de se expressar um ndice em termos de KOH, quando se
empregou NaOH nos ensaios.














7
INSTITUTO DE QUMICA
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS BIOQUMICOS
BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL - BIOQUMICA
DOCENTES: GUSTAVO DE SOUZA E FABIO MERON


Prtica n
o
5: CURVA DE TITULAO DE AMINOCIDOS


1 - Teoria:
Os aminocidos apresentam-se na forma dipolar inica, com propriedades anfotricas em
funo dos seus grupamentos amino NH
2
(NH
3
+
) e carboxila COOH (COO
-
).
A adio de quantidade equivalente de um cido forte (HCl) ao aminocido far com que
ele se apresente na forma protonada. A titulao potenciomtrica utilizando uma base forte
(NaOH) permite determinar os pKs dos grupamentos COOH e NH
2
e o ponto isoeltrico (P.I.).

2 - Objetivo:
-Construir a curva de titulao do aminocido alanina.
-Determinar os pKs dos grupamentos COOH e NH
2
, e o ponto isoeltrico (P.I.) da
alanina.

3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagentes: Alanina, NaOH 0,1 mol/L e HCl 0,1 mol/L.

4 - Procedimento:
-Pesar 2 mmol de alanina em um becher de forma alta de 100 mL.
-Adicionar quantidade equivalente de HCl 0,1 mol/L.
-Proceder titulao potenciomtrica da alanina utilizando 40 mL NaOH 0,1 mol/L.
-Adicionar 1 mL de NaOH 0,1 mol/L de cada vez e anotar o pH aps estabilizar a leitura.

5 - Resultados:
Elaborar uma tabela com os resultados da titulao (volume de base adicionado, nmero
de mmoles equivalente e valor do pH).
Construir a curva de titulao da alanina (mmol de base x pH).
Determinar no grfico os pKs dos grupamentos COOH e NH
2
, e calcular o ponto
isoeltrico (P.I.) da alanina.
Comparar os valores de pKs e P.I. com os indicados na literatura.










8
INSTITUTO DE QUMICA
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS BIOQUMICOS
BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL - BIOQUMICA
DOCENTES: GUSTAVO DE SOUZA E FABIO MERON


Prtica n
o
6: CURVA DE SOLUBILIDADE DA CASENA EM FUNO DO pH


1 - Teoria:
As protenas tm sua solubilidade altamente influenciada pelo pH. Isto se deve ao carter
anfotrico desses compostos, apresentando em sua estrutura resduos de aminocidos com cargas
eltrica distintas. O pH de menor solubilidade de uma protena localiza-se no seu ponto
isoeltrico (P.I.), uma vez que a fora de repulso entre as molculas menor. A solubilidade
aumenta quando o pH desloca-se para valores inferiores ou superiores ao P.I. da protena.

2 - Objetivo:
-Verificar a influncia do pH na solubilidade de uma protena.

3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagentes: Soluo de casena 0,3g/100 mL em acetato de sdio 0,1 mol/L
cido actico 0,1 mol/L
cido actico mol/L

4 - Procedimento:
-Numerar 8 tubos de ensaio e proceder seu preenchimento de acordo com o quadro:

Tubo B 1 2 3 4 5 6 7
gua (mL) 5,0 4,4 4,3 4,0 3,5 2,5 0,5 3,9
Ac. Actico 0,1 mol/L (mL) - 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 4,0 -
Ac. Actico 1,0 mol/L (mL) - - - - - - - 0,6
pH (calcular)
Sol. Casena
Abs (ler em 570 nm)

-Adicionar 0,5 mL da soluo de casena em acetato de sdio nos tubos 1 at 7 e ler a
absorvncia em 570 nm.

5 - Resultados:
Calcular o pH terico de cada tubo usando a equao de Henderson-Hasselbach.
Construir um grfico do inverso da absorvncia (1/Abs) X pH.
Analisar o grfico obtido indicando a faixa onde se situa o P.I. da casena.

9
INSTITUTO DE QUMICA
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS BIOQUMICOS
BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL - BIOQUMICA
DOCENTES: GUSTAVO DE SOUZA E FABIO MERON


Prtica n
o
7: ANLISE DE PROTENAS PELO MTODO DO BIURETO


1 - Teoria:
O biureto o composto formado pelo aquecimento da uria 180C. Quando o biureto
colocado em presena de CuSO
4
, em meio alcalino, obtm-se um complexo de colorao azul.
Este mesmo tipo de reao colorida ocorre entre substncias com duas carbonilas ligadas
diretamente, atravs de um tomo de nitrognio ou carbono, peptdios (mnimo 2 ligaes
peptdicas) e protenas com o CuSO
4
, conservando o nome de reao do biureto. Esta reao
muito utilizada na dosagem de protenas em materiais biolgicos, uma vez que a intensidade da
cor depende exclusivamente da concentrao da protena, j que as ligaes peptdicas aparecem
com a mesma freqncia por grama do material a ser analisado.
2 - Objetivo:
- Determinar a concentrao de protena em amostra de produto comercial.
3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagentes/solues:
Reagente do biureto: CuSO
4
em soluo alcalina
Soluo padro de casena 10 mg/mL, em NaOH 0,1 mol/L.
Solues de produtos comerciais na concentrao de 10 mg/mL em NaOH 0,1
mol/L: extrato de leveduras, protena de soja e gelatina.
4 - Procedimento:
-Seguir o protocolo abaixo utilizando a soluo padro de casena:
Tubo Soluo de casena (mL) H
2
O (mL)
Reagente
biureto (mL)
Abs
(ler em 550 nm)
Br 0 1,0 5,0
1 0,2 0,8 5,0
2 0,4 0,6 5,0
3 0,6 0,4 5,0
4 0,8 0,2 5,0
5 1,0 0 5,0
A 1,0 mL da sol. ext. de leveduras 5,0
C 1,0 mL da sol. de protena de soja 5,0
-Aps a adio dos reagentes, agitar e aguardar 30 minutos temperatura ambiente em
ausncia de luz.
-Ler as absorvncias a 550 nm, usando o tubo Br como branco.
5 - Resultados:
Construir a curva padro de Absorvncia 550nm X Concentrao de protenas (mg/mL),
incluir a equao da curva e o coeficiente de determinao (R
2
).
Determinar a [protenas] nas solues de extrato de leveduras e de protena de soja.
Comentar os resultados obtidos.
10
INSTITUTO DE QUMICA
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS BIOQUMICOS
BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL - BIOQUMICA
DOCENTES: GUSTAVO DE SOUZA E FABIO MERON


Prtica n
o
8: ATIVIDADE ENZIMTICA


1 - Teoria:
A influncia do tempo sobre a velocidade de uma reao enzimtica ser verificada com a
utilizao da enzima invertase, que catalisa a converso (hidrlise) da sacarose (glicdio no
redutor) em quantidades idnticas de glicose e frutose (glicdios com poder redutor). Atravs do
emprego do mtodo de dosagem de glicdios redutores pelo DNS (cido 3,5 dinitro saliclico)
possvel quantificar os acares formados no hidrolisado.

2 - Objetivo:
-Determinar a velocidade de reao e calcular a atividade da preparao enzimtica.

3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagentes/solues:
Soluo de sacarose 0,5 mol/L em soluo tampo de acetato 0,05 mol/L, pH 4,7.
Soluo de enzima obtida por extrao com NaCl de fermento biolgico.
Reagente do DNS (cido 3,5 dinitro saliclico em meio alcalino).
Soluo padro de glicose 5,0 mol/mL em soluo tampo de acetato 0,05 mol/L.

4 - Procedimento:
4.1- Obteno da enzima invertase:
a- Pesar 15 g de fermento biolgico e 15 g de NaCl.
b- Misturar os dois slidos por 10 min.
c- Centrifugar a mistura por 20 min ( 2500 rpm).
d- Recolher o sobrenadante e diluir na proporo de 1:250 com gua destilada.

4.2- Curva padro de glicose
a- Adicionar aos tubos de Folin-Wu 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1,0 mL da soluo padro de
glicose 5,0 mol/mL e completar para 1,0 mL com gua destilada.
b- Adicionar em cada tubo 1,0 mL do reagente do DNS.
c- Aquecer em banho-maria por 5 min.
d- Resfriar os tubos em gua corrente.
e- Completar o volume para 12,5 mL com gua destilada (usar a marcao do tubo) e
homogeneizar.
f- Ler as absorvncias das solues em espectrofotmetro a 540 nm, zerando o aparelho
com o branco (0 mL da soluo padro de glicose 5,0 mol/mL).

4.3-Influncia do tempo de reao (T=ambiente).
a- Marcar 6 tubos de Folin-Wu com os tempos de reao a serem avaliados: 1, 2, 3, 5, 10
e 15 min.
b- Adicionar em cada tubo 0,5 mL da soluo de sacarose 0,5 mol/L.
11
c- Em seguida, adicionar 0,5 mL da soluo da enzima obtida no item 4.1 e
imediatamente disparar o cronmetro para cada tempo de reao a ser avaliado.
d- Imediatamente aps finalizado o tempo de reao, adicionar 1,0 mL do reagente do
DNS e levar a banho-maria em ebulio por 5 minutos.
e- Utilizar os procedimentos de d at f descritos no item 4.2.

5- Resultados:
- Construir a curva padro de Absorvncia 540nm X Concentrao de glicose (mol/mL),
incluir a equao da curva e o coeficiente de determinao (R
2
).
- Elaborar uma tabela com os dados de produto formado (mol/mL) e os respectivos
tempos de reao.
- Construir um grfico de produto formado (mol/mL) X tempo (min).
- Calcular a velocidade inicial da reao, isto quando P/t constante. Explicar a
importncia da determinao da velocidade inicial da reao.
- Calcular a atividade da preparao enzimtica, apresentando o resultado em unidade
padro (U)/mL. Unidade padro (U) de uma enzima a quantidade de enzima que catalisa a
formao de 1 mol de produto por minuto sob condio definida. Neste caso considerar
U=1mol de glicose/min a T=ambiente em pH= 4,7.

6- Questes:
- Explique os fatores que leva a interrupo da reao enzimtica.
- Justifique os pontos do grfico escolhidos para o clculo da velocidade inicial



























12
INSTITUTO DE QUMICA
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS BIOQUMICOS
BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL - BIOQUMICA
DOCENTES: GUSTAVO DE SOUZA E FABIO MERON


Prtica n
o
9: INFLUNCIA DA TEMPERATURA SOBRE A ATIVIDADE ENZIMTICA


1 - Teoria:
A temperatura altera a velocidade de uma reao enzimtica exercendo influncia na
constante de velocidade. Entretanto, como a enzima uma protena, a elevao da temperatura
tende a provocar a desnaturao da mesma, com perda de atividade.

2 - Objetivo:
-Verificar a influncia da temperatura sobre a atividade da enzima.

3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagentes/solues:
Soluo de sacarose 0,45M em tampo de acetato 0,05M, pH 4,7.
Soluo de enzima obtida por extrao com NaCl de fermento biolgico.
Reagente do DNS (cido 3,5 dinitro saliclico em meio alcalino).

4 - Procedimento:
a- Marcar 5 tubos de Folin-Wu com as temperaturas a serem avaliados (0
o
C, ambiente,
50
o
C e 100
o
C) e o branco (B).
b- Adicionar em cada tubo 0,5 mL da soluo de sacarose 0,5 mol/L e no branco 1,0 mL
de gua destilada.
c- Em seguida, adicionar 0,5 mL da soluo da enzima (exceto no branco) e,
imediatamente, colocar os tubos nos respectivos banhos: 0
o
C banho de gelo, temperatura
ambiente medir a temperatura, 50
o
C banho trmico a 50
o
C e 100
o
C gua fervente.
d- Aps exatamente 10 min retirar os tubos dos respectivos banhos e adicionar em cada
tubo 1,0 mL do reagente do DNS, inclusive no branco.
e- Aquecer em banho-maria em ebulio por 5 minutos.
f- Resfriar os tubos em gua corrente.
g- Completar o volume para 12,5 mL com gua destilada e homogeneizar.
h- Ler as absorvncias das solues em espectrofotmetro a 540 nm, zerando o aparelho
com o branco (1,0 mL de gua destilada).

5- Resultados:
- Elaborar uma tabela com os dados de temperatura (
o
C), absorvncia a 540 nm,
concentrao d eproduto formado (mol/mL) e velocidade da reao (mol/mL.min.).
- Construir um grfico de velocidade de reao (mol/mL.min) X temperatura (
o
C).
Obs.: O clculo do produto formado em mol/mL deve ser feito utilizando a curva padro
obtida na prtica n
o
8.
6- Questes:
- Determinar a temperatura na qual a enzima apresenta maior atividade. Justifique.
- Explicar como a temperatura afeta a velocidade de uma reao enzimtica.
13
INSTITUTO DE QUMICA
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS BIOQUMICOS
BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL - BIOQUMICA
DOCENTES: GUSTAVO DE SOUZA E FABIO MERON


Prtica n
o
10: MODELO CINTICO DE MICHAELIS-MENTEN

1 - Teoria:
Se aumentarmos a concentrao do substrato ([S]) tal que [S]>[S
n-1
]...>[S
3
]>[S
2
]>[S
1
],
verificamos que as velocidades iniciais aumentam. Quanto maior [S], mais lentamente este
aumento ocorre, at que mais nenhum aumento observado. Isto quer dizer que atingimos [ES]
mxima, e a enzima est totalmente saturada pelo seu substrato.
2 - Objetivo:
-Verificar a influncia do fator concentrao de substrato sobre a velocidade inicial de
uma reao enzimtica.
3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagentes/solues:
Soluo de sacarose 1,0 mol/L; 0,5 mol/L; 0,2 mol/L; 0,1 mol/L; 0,05 mol/L; 0,02 mol/L
e 0,01 mol/L em tampo de acetato 0,05M, pH 4,7.
Soluo de enzima obtida por extrao com NaCl de fermento biolgico.
Reagente do DNS (cido 3,5 dinitro saliclico em meio alcalino).
4 - Procedimento:
a- Marcar 8 tubos de Folin-Wu com as concentraes de sacarose a serem avaliadas (1,0
mol/L; 0,5 mol/L; 0,2 mol/L; 0,1 mol/L; 0,05 mol/L; 0,02 mol/L e 0,01 mol/L) e o branco (B).
b- Adicionar em cada tubo 0,5 mL das respectivas solues de sacarose e no branco 0,5
mL de gua destilada.
c- Em seguida, adicionar 0,5 mL da soluo da enzima e imediatamente disparar o
cronmetro.
d- Aps exatamente 10 minutos adicionar em cada tubo 1,0 mL do reagente do DNS,
inclusive no branco.
e- Aquecer em banho-maria em ebulio por 5 minutos.
f- Resfriar os tubos em gua corrente.
g- Completar o volume para 12,5 mL com gua destilada e homogeneizar.
h- Ler as absorvncias das solues em espectrofotmetro a 540 nm, zerando o aparelho
com o branco (0,5 mL de gua destilada).
5- Resultados:
- Elaborar uma tabela com os dados de concentrao de substrato - [S], absorvncia a 540
nm, produto formado (mol/mL), velocidade da reao -V (mol/mL.min.), 1/[S] e 1/V.
- Construir um grfico de velocidade de reao -V (mol/mL.min) X concentrao de
substrato - [S] e analisar o grfico.
- Construir um grfico de 1/V X 1/[S] e determinar os parmetros Km e Vmax.
Obs.: O clculo do produto formado em mol/mL deve ser feito utilizando a curva padro
obtida na prtica n
o
8.
- Explique como a concentrao de substrato afeta a velocidade de uma reao
enzimtica.