INTRODUCCIN

En su mayor parte los microorganismos son demasiado pequeos para observarse a simple
vista: protozoos, algas, hongos, bacterias y virus.
Estos microorganismos difieren en caractersticas tales como forma de nutricin, estructura,
tamao, composicin entre otros aspectos; es por ello que se emplea el estudio microscpico
el facilita notablemente la observacin; principalmente en las bacterias se facilita al tratarlas
con colorantes o tintes los cuales facilitan tambin la observacin de ciertas estructuras
celulares.
Una tincin o coloracin es una tcnica auxiliar utilizada en microscopa para mejorar el
contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que
usualmente se utilizan en biologa y medicina para resaltar estructuras en tejidos biolgicos
que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios. Los diferentes
colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definicin y examinar grandes cortes de
tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares
(por ejemplo clasificando diferentes clulas sanguneas) o incluso para resaltar organelas
dentro de clulas individuales.
Son compuestos, orgnicos que contienen radicales cromforos esto es que producen color y
grupo de anxocromos que forman sales los grupos nitrito (-NO2) y azo (-N = N) son
cromforos. Los radicales hidroxilo (-OH) y amino (-NH2) son grupos anxocromos. Los
cromforos imparten la propiedad cromgena al colorante y los anxocromos permiten que el
colorante se una con la fibra o tejido.




TINCIONES
1. Azul de metileno
El azul de metileno se utiliza para teir clulas animales, para hacer ms visibles sus ncleos. Es
tambin utilizado para teir los extendidos de sangre para ser utilizados en citologa y como
colorante vital en el recuento de reticulocitos.
PROCEDIMIENTO: Tincin Bacteriolgica Simple de Clulas Epiteliales Bucales y su Flora
Bacteriana
Obtener de la muestra
Depositar una gota de agua con el cuentagotas sobre un portaobjetos.
Raspar ligeramente la cara interna de la mejilla con un bastoncillo.
Extender la muestra frotando el bastoncillo sobre la gota de agua.
Fijar y tincin.
Pasar el portaobjetos sobre la llama del mechero con movimientos rpidos para secar
lentamente la muestra. El portaobjetos no debe calentarse en exceso, para ello debemos
mentenerlo alejado de la llama.
Agregar unas gotas de colorante sobre la muestra seca y djalo actuar durante 3 minutos.
Lavar la preparacin con agua para eliminar el colorante. No verter el agua directamente
sobre la muestra, podra arrastrar las clulas.
Colocar sobre la muestra un cubreobjetos, djalo caer sobre la muestra como si fuese la tapa
de un libro evitando que se formen burbujas de aire.
Observacin:
Utiliza el objetivo de menor aumento para buscar zonas donde las clulas se encuentren
aisladas y no estn excesivamente teidas.
Enfoca la zona con los objetivos de mayor aumento.
400X


2. Carmn de best
El carmn se utiliza para teir glucgeno (almidn animal), mucopolisacridos (cadenas de
azcares que se encuentran en el moco y en el lquido articular) y ncleos de las clulas. Tie
las muestras de color rojo y se hace a partir del insecto Coccus cacti. El insecto Coccus cacti es
ms comnmente conocido como una escala de cochinilla o insecto de tinte rojo. Estos
insectos son indgenas de Mxico y el suroeste de Estados Unidos y se alimentan de cactus. El
colorante se hace de los fluidos corporales del insecto.
PROCEDIMIENTO:
Los fijadores utilizados son; Bouin alcohlico, o normal, Carnoy, y alcohol al 80%
Hidratar los cortes
Teir con hematoxilina de Harris 2 minutos (Hematoxilina 1 gr. Alcohol absoluto 10 ml.,
alumbre potsico o ferrico 20 gr, agua destilada 200 ml -disolver en caliente-. Hervir, aadir
xido de mercurio 0,5 gr. y enfriar rpidamente.)
Lavar en agua, hasta eliminar exceso de colorante.
Hacer la solucin colorante a partir de:
2 partes de solucion de Carmin de Best,
2 partes de amoniaco y
3 partes de metanol
(Cubrir con esta solucin 5 - 10 min.)
Diferenciar con diferenciador de Best, (alcohol metilico absoluto 40 ml. alcohol etlico
absoluto 80 ml., agua destilada 100 ml.) hasta que quede limpio el corte.
Lavar directamente en alcohol absoluto, al menos dos veces, y dejar en l 2 min
Aclarar en xilol y montar.
Conclusin: El glucgeno aparece rojo y los ncleos azules.




3. Naranja de acridina
El naranja de acridina es un cido selectiva colorante fluorescente catinico nucleico til para
la determinacin del ciclo celular. Es permeable a las clulas, e interacta con el ADN y ARN
por intercalacin o atracciones electrostticas, respectivamente. Cuando se une a ADN, que es
muy similar espectralmente a la fluorescena. Naranja de acridina tambin entrar en
compartimentos cidos como lisosomas y ser protonado y secuestrado. En estas condiciones
de pH bajo, el colorante emite luz naranja cuando es excitado por la luz azul. Por lo tanto,
naranja de acridina se puede utilizar para identificar las clulas apoptticas envueltos, ya que
ser fluorescente en inmersin. El colorante se utiliza a menudo en la microscopa de
epifluorescencia.
Naranja de acridina se puede utilizar para diferenciar entre el cido desoxirribonucleico y cido
ribonucleico muy fcilmente. Cuando acridina lazos de color naranja con el ADN y forma un
complejo, la radiacin emitida es de color verde. Cuando se une con el ARN y forma un
complejo, la luz emitida es de color naranja.
PROCEDIMIENTOS:
Transferir una gota del cultivo a un portaobjetos limpio y desengrasado, dejar secar al aire.
Fijar con etanol al 100%, cubriendo el frotis durante 5 min.
Eliminar el etanol y colocar 100 de naranja de acridina durante 3 min. Eliminar el exceso
del colorante con etanol al 70%.
Observar en un microscopio de epifluorescencia con un filtro azul, emisin a 490 nm.

- ADN -ARN

4. Rojo Nilo
El Rojo Nilo (tambin conocido como oxazona del azul nilo) se produce hirviendo el Azul Nilo
con cido sulfrico. Este tratamiento produce una mezcla de Rojo y Azul Nilo. El Rojo Nilo es
una coloracin lipoflica, y se acumula en los glbulos lipdicos en el interior de las clulas, y los
colorea de rojo. Azul del Nilo es una tintura utilizados en la biologa y la histologa. Se puede
utilizar con clulas vivas o fijas, e imparte un color azul para ncleos de las clulas.
Tambin puede ser usado en conjuncin con microscopa de fluorescencia para teir la
presencia de grnulos de polihidroxibutirato en clulas procariotas o eucariotas.
Fluoresce fuertemente cuando se encuentra particionado en lpidos, pero prcticamente no
presenta fluorescencia en soluciones acuosas.
Reactivos:
Azul de nilo 1%
Agua acetificada 1%
PROCEDIMIENTO:
Teir en solucin acuosa de Sulfato azul de Nilo al 1%-
Lavar en agua destilada.
Lavar rpido en agua acetificada al 1%.
Lavar en agua destilada nuevamente
Montar en gelatina glicerina.
Resultados:
Lpidos cidos: azul
Elementos basofilos no lipidicos: azul
Lpidos neutros: rosados

5. Verde de metilo- pironina
Se trata de una solucin de Verde de Metilo asociada con Pironina G segn Tarf-Kurnick.
Colorante Histolgico. Empleado para la investigacin histolgica del cido nucleico contenido
en los tejidos, as como para demostrar la presencia de clulas de la serie linftica y clulas
plasmticas.Tambin es til en la identificacin de clulas plasmticas y RNA en secciones de
tejidos y preparaciones citolgicas.
Reactivos:
Verde metilo
Cloroformo
Pironina
PROCEDIMIENTO:
Purificacin Verde Metilo:
Preparar 4% de verde metilo
agregar cloroformo
Agitar
Separar la capa de cloroformo de color violeta (violeta de metilo), hasta que el cloroformo
tenga un color muy claro.
Nota: Purificar 20 ml de verde metilo, se utilizaran 300 a 350 ml de cloroformo, dejar evaporar
completamente el cloroformo antes de preparar la solucin colorante (18 hrs aprox.)
Solucin Verde Metilo-Pironina:
Pironina Y o G 2% 16ml
Verde Metilo 4% 10ml
Agua destilada 12.5ml

Desparafinar e hidratar hasta el agua destilada.
Poner en 2030 min en Verde metilo-pironina
Secar ligeramente con papel filtro.
Deshidratar en dos cambios de alcohol butlico.
Aclarar y montar.
Resultados:
ADN: verde-verde azulado
RNA: rojo brillante