INTRODUCCIN A LAS TCNICAS

DE DETECCIN DE CIDOS
NUCLICOS
(N.A.T.)
BIOQ. LILIANA DI TULLIO BUDASSI
FAC. CS .BIOQUMICAS Y FARMACUTICAS
UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO
lilianadt2003@yahoo.com.ar
INFECCIONES TRANSMISIBLES POR TRANSFUSIN
Patgenos transmisibles por transfusin
Virus Virus de la Hepatitis B (HBV)
Virus de la Hepatitis C (HCV)
Virus de la Inmunodeficiencia Humana 1 y 2 (HIV1/2)
Virus Linfotrpico Humano I/II (HTLV I/II)
otros: H1N1, virus del Dengue, West Nile Virus
Parsitos Trypanosoma cruzi (Enf. de Chagas-Mazza)
otros: Plasmodium malariae, Pl falciparum
Bacterias Treponema pallidum (Sfilis)
Brucella abortus (Brucelosis)
otros
Agentes no convencionales-Priones
2
TAMIZAJE DE INFECCIONES TRANSMISIBLES POR
TRANSFUSIN EN ARGENTINA
(LEY 22.990 - LEY NACIONAL DE SANGRE )
HVB: Enzimoinmunoensayos HBsAg y anti-HBc total
HCV :Enzimoinmunoensayo anti- HCV y Ag HCV
HIV1/2 : Enzimoinmunoensayo ag-p24 y anti-HIV1/2
HTLV I/II: Enzimoinmunoensayo anti-HTLV I/II
Chagas : Enzimoinmunoensayo y Hemaglutinacin indirecta, ambos anti-
Tripanosoma cruzi
Sfilis: Test de VDRL anti- Treponema pallidum
Brucelosis: Reaccin de Huddlesson, anti-Brucella abortus

3
TAMIZAJE DE INFECCIONES TRANSMISIBLES POR
TRANSFUSIN
Mtodos indirectos: deteccin en la sangre (suero o
plasma) del donante de la presencia de una respuesta
inmune contra un patgeno dado
Diagnstico serolgico mediante diferentes tcnicas de laboratorio
Ej: anlisis en bsqueda de anticuerpos especficos contra HIV en el suero del
donante (EIA anti-HIV 0/1/2)
Mtodos directos: deteccin directa de la presencia
del patgeno (genoma o antgenos) en la sangre del
donante
Ej: EIA para detectar p24 HIV, HBsAg o HCV ag
Tcnicas de biologa molecular: buscan el DNA o RNA viral
4
FACTORES DE RIESGO EN LA TRANSMISIN DE
INFECCIONES A TRAVS DE LAS TRANSFUSIN
Errores humanos o de laboratorio
Problemas en los sistemas de anlisis/equipos
Insuficiencias en la calidad de los anlisis
Entrenamiento deficitario
Seroconversiones atpicas
Variantes o genotipos del patgeno no detectadas
Cambios epidemiolgicos
Periodo de ventana serolgico
5
Tiempo
Infeccin
Reaccin inmune
Reactivo Serolgico
PERODO VENTANA
TIEMPO ENTRE EL MOMENTO DE LA INFECCIN Y EL
DESARROLLO DE MARCADORES SEROLGICOS
6
Perodo
Ventana: NAT
Eclipse
Bacterial Contamination of Blood Components: Risks, Strategies, and Regulation Hillyer et al.
Joint ASH and AABB Educational Session in Transfusion Medicine. Hematology 2003
Ao
1/1000
1/10,000
1/100,000
1/1000,000
R
i
e
s
g
o

d
e

i
n
f
e
c
c
i

n


p
o
r

u
n
i
d
a
d


t
r
a
n
s
f
u
n
d
i
d
a
1985 1990 1996 1999 2001
HCV
HBV
HIV
1/180,000
1/1.600,000
1/1.900,000
1/100
Ac Anti-HIV Ac Anti-HCV NAT p24
EVOLUCIN DEL RIESGO EN LA PROVISIN DE SANGRE
7
NUCLEIC ACID TESTING
Ventajas de NAT
Importante avance teconolgico en screening de sangre
Altamente sensible & especfico
dirigido especificamente a las secuencias nuclicas virales
Deteccin directa del RNA or DNA viral
Ayuda a la prevencin de enfermedades transmisibles por
transfusin
Provee una etapa adicional de seguridad a la provisin de sangre
segura
Reduce el Perodo Ventana desde la infeccin hasta la deteccin
8
Tiempo
Infeccin
Reactividad Serolgica
Virus
Deteccin ms temprana
NAT positivo
OBJETIVO DE NAT O DGV:
DISMINUCIN DEL PERODO DE VENTANA
Reaccin inmune
9
Eclipse
Perodo
Ventana
EJ: EVOLUCIN CLNICA DE HIV: DNDE ACTA NAT?
10
EVOLUCIN EN LA IMPLEMENTACIN DE LAS TCNICAS NAT
EN LOS BANCOS DE SANGRE
1993 se considera formalmente la utilizacin de NAT para el tamizaje en bancos de
sangre, luego que la Food and Drug Administration (FDA) reportara diversos casos
de infeccin por el VHC como consecuencia del uso de inmunoglubulina intravenosa
manufacturada.
1995 Comit Europeo para Productos Medicinales Manufacturados (CPMP) se
adhiri a este lineamiento, hacindolo extensivo a todos los productos medicinales
derivados del plasma.
1997 Organizacin Mundial de la Salud (OMS) se establecen estndares para el
ADN del VHB, el ARN del VHI-1, el ARN del VHC y el ADN del Parvovirus B19.
2000-2001 diferentes pases incorporan paulatinamente NAT para HCV y HIV en el
tamizaje de donaciones.
2009 OMS en su documento Recommendations: Screening Donated Blood for
Transfusion-Transmisibles Infection sugiere que junto a los ensayos de tamizaje
serolgicos para VHC, VIH y VHB, dirigidos a los marcadores serolgicos de
antgenos y/o anticuerpos, se realice la bsqueda de cidos nuclicos virales para
estos patgenos.
11
PERODO VENTANA
MODEL TESTING DATA
Fuente: Busch et al. Transfusion.2005;45(2):254-264.
Kleinman and Busch. Transfusion. 2006;36:S23-S29 .
12
VENTAJAS NAT
13
VIRUS Pruebas
serolgicas
NAT MP
(Minipool)
NAT ID
(Individual)
VIH
(incluye p24)
16 das 10 das 7 das
VHC 70 das 9 das 7 das
VHB 59 das 49 das 38 das
Acortamiento del perodo de ventana inmunolgico
Disminucin del riesgo residual
TCNICAS BASADAS EN BIOLOGA
MOLECULAR
Involucran tres etapas:
1. Extraccin o captura del genoma viral
2. Amplificacin
3. Deteccin
Ejemplos:
PCR(Polymerase Chain Reaction)
RT-PCR (Real Time PCR)
NASBA (Nucleic Acid Based on Amplification)
TMA (Transcriptional Mediated Amplification) 14
15
EasyQ Instrument &
Reagents
Desktop computer
Strip centrifuge
NucliSens
EasyQ
Incubator
NucliSens
EasyQ
Analyzer
Nuclisens Easy Q system
TMA: pasos principales del ensayo
Deteccin
Captura del blanco
o diana (target)
Amplificacin
PCR Real
Time
PCR
TMA
NASBA
MODELOS DE PROCESAMIENTO DE LAS
TCNICAS NAT
Tcnicas in house
Tcnicas comerciales
Tcnicas Cualitativas
Tcnicas Cuantitativas
Procesamiento de las muestras individuales (ID) o en mini-pools (MP)
16
POOL
48
POOL
24
UNIDADES
POOL
24
UNIDADES
POOL
8
POOL
8
POOL
8
POOL
8
POOL
8
POOL
8
NAT DETECTA INFECCIN HCV MS TEMPRANO QUE EL
TEST DE ANTICUERPOS
17
0
1,000
10,000
100,000
10,000,00
10,000,000
0
1
2
3
4
5
0 10 20 30 40 50
NAT pool
HCV Ac
HCV GEq/mL
S/CO
Das
28 das
7 das
Fuente: Susan Stramer, Ph.D., American Red Cross, 1999
NAT ID test
HCV GEq/mL
PUNTOS IMPORTANTES A CONSIDERAR EN
CUANTO AL ORIGEN DEL MTODO A ELEGIR:
Sensibilidad
Especificidad
Deteccin de variantes/subtipos
Reproducibilidad
Trazabilidad de reactivos y resultados
Software adecuado
Control Interno
Control de Contaminacin
Ensayos discriminatorios/confirmatorios
Identificacin de su uso: RUO o IVD
Marca CE, FDA, ANMAT
18
PARA ASEGURAR LA CALIDAD DEL RESULTADO, CADA
SISTEMA NAT DEBE POSEER CONTROLES ADECUADOS
EN SUS DIFERENTES ETAPAS:
Controles de Reactivos: para evaluar la presencia de
ADN/ARN forneo o productos de amplificaciones
precedentes.
Control Negativo: para evaluar los riesgos de
contaminacin (en la organizacin del espacio fsico, en
los mtodos de trabajo, posible aerozolizacin durante
el alicuotado de reactivos)
Control Positivo: para controlar la presencia de
inhibidores y el buen desarrollo de las diferentes etapas.
Control Interno: para verificar la idoneidad de la
amplificacin y/o la presencia de inhibidores de la
misma.
19
Marca (s) Formato Muestra Uso habilitado Fabricante Fecha de
Aprobacin
COBAS
Ampliscreen HIV-1
Test
PCR
Plasma
Donor Screen
Expanded Indications
For Use: Source
Plasma donors, other
living donors, and
organ donors
Roche Molecular
Systems, Inc
12/20/2002
Procleix HIV-1/HCV Nucleic
Acid Test (TMA)
Plasma
Donor Screen
Expanded Indications
For Use: Source
Plasma donors, living
organ donors and
cadaveric samples
Gen-Probe
San Diego, CA
92121
02/08/2002
UltraQual HIV-1
RT-PCR Assay PCR
Plasma
Donor Screen National Genetics
Institute
Los Angeles, CA 92121
09/18/2001
UltraQual HCV RT-
PCR Assay PCR
Plasma
Donor Screen National Genetics
Institute
Los Angeles, CA
92121
09/18/2001
COBAS
AmpliScreen HCV
Test
PCR
Plasma
Donor Screen
Expanded Indications
For Use: Source
Plasma donors, other
living donors, and
organ donors
Roche Molecular
Systems, Inc
12/3/2002
COBAS
AmpliScreen HBV
Test PCR
Plasma
Donor Screen
Indications For Use:
Source Plasma donors,
other living donors,
and organ donors
Roche Molecular
Systems, Inc
04/21/2005
Procleix WNV Assay
Nucleic Acid Test
(TMA)
ID
Plasma
Qualitative detection of
West Nile Virus
(WNV) RNA from
volunteer donors
Gen-Probe
San Diego, CA
92121
12/01/2005
20
COMPARACIN DE LA SENSIBILIDAD ANALTICA
DE LOS TEST NAT
95% Lmite de Deteccin (95% CI)
Ensayo HIV
(IU/ml)
HCV
(IU/ml)
HBV
(IU/ml)
WNV**
(Copies/ml)
Procleix TMA* 19.62
(17.15-23.16)
2.78
(2.44-3.37)
7.46
(6.43-8.97)
3.4
AmpliScreen*
Std
preparation
323.4
(284.9-387.3)
41.9
(28.0-111.8)
15.99
(13.78-20.06)
Taq
Screen
15
AmpliScreen*
Multiprep
78.4
(68.4-94.4)
28.8
(20.5-85.8)
4.41
(3.56-6.13)
* Roches COBAS AmpliScreen US Package Inserts or Procleix Ultrio CE Package Insert
** From Busch et al. 2000.Transfusion 45, 492-499
21
DISEO, ACONDICIONAMIENTO E INFRAESTRUCTURA
DEL LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR
Metas principales para la instalacin:
Proporcionar el espacio suficiente para el flujo
de trabajo y mantenimiento de equipos
Evitar la contaminacin
Mantener la correcta temperatura , humedad y
presin del ambiente
22
CONDICIONES GENERALES
Nivel de seguridad 2 : BSL2
Paredes con pintura resistente a la descontaminacin
(cidos o lcalis)
Pisos con bordes sanitarios, antideslizante o de vinilo.
Presin relativa ambiente: neutra o ligeramente negativa
en rea de post-amplificacin
Divisorios: gabinetes modulares a base de metal, con
bordes sanitarios y puertas corredizas
Mesadas: resistentes a agentes qumicos
Iluminacin: compartimiento estanco
Electricidad: UPS de soporte / grupo electrgeno
23
REAS DEL LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR
rea de preparacin de reactivos y muestras
rea de pre-amplificacin
rea de post-amplificacin y deteccin
Se definen las diversas reas mediante barreras fsicas o
protocolo de barreras entre un rea de trabajo y otra.
Objetivo: evitar la contaminacin entre reas de trabajo
diferentes
24
BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE
BIOLOGIA MOLECULAR
Principal objetivo: minimizar la contaminacin a travs de
Diseo del ensayo
Disposicin del laboratorio
Control del flujo de trabajo
25
REAS DEL LABORATORIO DE BIOLOGA
MOLECULAR
26
Pre-Amplificacin
Post-Amplificacin
GESTIN DE LA CALIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOLOGIA
MOLECULAR
Manuales de Gestin de la Calidad
Manuales de procedimientos
Manual de Bioseguridad
Estndares y normativas:
Norma ISO 9001:2000
Norma ISO /IEC17025 /1999
Estndar Paul Erlich Institute
Organismos internacionales: OMS Collaborative Study
Group (provee CCE y establece la unidad de medida:
UI/ml)
Acreditacin
27
CONCLUSIONES (1)
Disminucin del perodo ventana
Otras aplicaciones: tests que permiten una
deteccin directa de otros virus. Ej: WNV, otros
virus emergentes
Progresar desde analizar mini-pooles a analizar
muestras individuales.
Lograr la implementacin de automatizacin total
de las tcnicas de NAT:
-disminucin de los errores del operador.
-mejor estandarizacin operativa.
-optimizacin de los tiempos de reaccin.
-trazabilidad de los productos liberados. 28
CONCLUSIONES (2)
Necesidad de lograr un consenso nacional acerca de temas
puntuales referentes a la implementacin de NAT en
Argentina:

la obligatoriedad de las tcnicas NAT en Medicina Transfusional,

creacin de comits de expertos que evalen la necesidad de
legislar el tema

definicin de la logstica de centralizacin de muestras para lograr

un tamizaje de manera uniforme y a un costo razonable

evaluacin de resultados obtenidos hasta el momento mediante las

tcnicas in house y comerciales, en pool o ID, con el objeto de
definir si la sensibilidad de dichas tcnicas y su ejecucin son
tiles en nuestro sistema de salud

consolidacin en la formacin de los recursos humanos dedicados

a la aplicacin de NAT.
29