TRADUCCION N2

Vol Current Microbiology. 52 (2006), pp. 182-185

DOI: 10.1007 / s00284-005-0133-8
Actual Microbiology an International Journal Springer Science + Business Media, Inc.
2006

Verificacin de la Degradacin de n-alcanos de Diesel Oil por

Pseudomonas aeruginosa cepa WATG en microcosmos de suelo
Akio Ueno, 1 Mohammad Hasanuzzaman, 2 Isao Yumoto, 3 Hidetoshi Okuyama1
1Laboratory de Biologa Molecular Ambiental, Facultad de Ciencias de la Tierra del
Medio Ambiente, la Universidad de Hokkaido, Kita-ku, Sapporo, Hokkaido 0600810, Japn 2ROM Co. Ltd., Chuo-ku, Sapporo, Hokkaido 064-0804, Japn
3Genomic Recursos y del Medio Ambiente Adaptacin Grupo de Investigacin,
Instituto de Investigaciones de la Biofbrica a base de Genoma, del Instituto
Nacional de Ciencia Industrial Avanzada y Tecnologa (AIST), Toyohira-ku,
Sapporo, Hokkaido 062-8517, Japn
Recibido: 20 May 2005 / Aceptado: 24 de octubre 2005
Resumen.
La degradacin de los n-alcanos en aceite diesel por cepa Pseudomonas
aeruginosa WATG (WATG) fue verificado en microcosmos de suelo. El nivel total
de hidrocarburos de petrleo (TPH) la degradacin en dos bioaumentacin
muestras fue de 51% y 46% durante 1 semana en microcosmos de suelo sin
esterilizar y esterilizados, respectivamente. La degradacin TPH en la
bioestimulacin era de nivel de control (15%). La degradacin de TPH en
muestras de aireacin limitada se redujo claramente en comparacin con la de
desaireacin ilimitada las condiciones tanto esterilizados y no esterilizados. La
adicin de WATG en microcosmos de suelo fue acompaada por la produccin
dirhamnolipido slo en la presencia de aceite diesel. Estos hallazgos sugieren que
degradacin de los n-alcanos en aceite diesel en microcosmos de suelo se vera
facilitada por bioaumentacin de WATG, con produccin de dirhamnolipido, y
tambin por la participacin de tierra indgena bioestimulante para las bacterias.
A medida que se expandi la industrializacin, hidrocarburos de petrleo son una
potencialmente mayor fuente de contaminantes en ambientes de agua y suelo [8].
Una vez que el ambiente del suelo est contaminado con hidrocarburos de

petrleo, bacterias intrnsecas se cree que degradar y utilizarlos como fuentes de

carbono [7]. Sin embargo, si la contaminacin es tan pesada que las bacterias
intrnsecas ya no pueden eliminar que efectivamente, algunos procesos de
descontaminacin artificiales son obligatorios. Bioestimulacin es una tcnica en la
actividad de las bacterias intrnsecas es estimulada por la adicin nutrientes o por
aireacin, mientras que en la bioaumentacin, especies o cepas de
microorganismos que pueden degradar Xenobitios efectivamente se aaden
artificialmente al suelo contaminados con petrleo. Cepa Pseudomonas
aeruginosa WATG se considera para ser un buen candidato para la
bioaumentacin de petrolera-suelos contaminados, debido a que de manera muy
eficiente degrada productos derivados del petrleo, tales como aceite diesel,
pesado aceite y queroseno en un medio que contiene lquido mineral sales de [13].
En este artculo, la capacidad de una nica cepa de P. aeruginosa para degradar
el petrleo en el ambiente del suelo ha sido examinada, y se discute la prctica
utilidad de esta cepa en la bioaumentacin en el suelo medio ambiente.
Materiales y mtodos
Cepas bacterianas y medios de cultivo. Petrleo-degradantes
Cepa de P. aeruginosa WATG (WATG) y P. aeruginosa cepa de tipo JCM5962T
cepa de referencia como se describe anteriormente [13]. WATG se deposit al
Instituto Nacional de Tecnologa y Evaluacin (NITE) Microorganismos patentes
Depositario, Chiba, Japn (No. NITE AP-97). Las caractersticas del suelo fueron
descritas anteriormente [2].
Diseo y elaboracin de microcosmos del suelo.
Dos gramos de suelo seco se pusieron en 15 ml tubos de ensayo con tapn de
rosca o porosos de silicio de rosca. Cuando sea necesario, el suelo se trat en
autoclave dos veces en 121_C durante 30 min a esterilizar por completo. En este
estudio, Luria-Bertani (LB) medio fue utilizado como fertilizante para el suelo, ya
que los resultados preliminares mostraron que WATG exhibi una actividad de
degradacin muy bajo de aceite diesel en el suelo suplementado con sales
minerales medianas [13].
Para cambiar el tamao del inculo, 250 y 500 lL del pre-cultivo de WATG se
inocul a 2 g de los suelos. El primero y el ltimo fueron designados 12,5% -WatG
agregado y el 25% -WatG-ad- se aadi a cada microcosmos terreno est a una
concentracin final de 1,0% (w / w). Despus mezclar bien con esptulas
esterilizados, cada microcosmos del suelo se dej a 20_C durante 1 semana.

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La extraccin y el anlisis de hidrocarburos totales de petrleo desde el suelo
microcosmos. El procedimiento para la extraccin de petrleo total de
hidrocarburos (TPH) de microcosmos del suelo se bas en la Mtodo Agencia de
Proteccin Ambiental 3550B [12] con una ligera modificaciones. En pocas
palabras, un patrn interno, n-dodecano (NC12) (Kishida Chemical Co. Ltd.,
Osaka, Japn), se aadi a cada suelo microcosmos para dar una concentracin
final de 0,3% (v / w) antes extraccin. Un volumen igual de disolvente, que
consiste en diclorometano (DCM) y etanol (1: 1, v / v), se aadi a la tierra
muestras y bien mezclado con un mezclador de vrtice. Las muestras fueron luego
sonicado en 30_C durante 1,5 h en un bao ultrasnico, seguido de recproco
agitacin a 180 rpm a 20 _C durante 2 das. Todas las muestras se centrifugaron a
1000 g durante 10 min. La fase de DCM-etanol que contiene hidrocarburos se
retir cuidadosamente de la fase inferior del suelo y se analizaron por gas
cromatografa y cromatografa de gases-espectrometra de masas [13].
Para el clculo de la eficiencia de la extraccin de TPH, una solucin de DCM y
etanol (1: 1, v / v) que contena 1% (w / v) de aceite diesel era considerada como
la eficacia de la extraccin de la muestra 100%. la extraccin eficiencia de cada
muestra se calcul comparando la cantidad de TPH extrajo con la de la muestra
eficacia de extraccin del 100%. Extraccin y de capa fina anlisis de
cromatografa de biotensioactivos. Veinte gramos de suelo suplementado con
12,5% (v / w) Cultivo LB de WATG o control cepa de P. aeruginosa JCM5962T,
12,5% (v / w) de medio LB fresco, y 1% (w / w) de aceite diesel se pusieron en 100
ml de silicio-capsulado matraces y despus se incub a 20 _C durante 1 semana.
Biosurfactantes se extrajeron de la tierra de acuerdo con los mtodos de Hori et al.
[6] y Sim et al. [10] con algunas modificaciones. el disolvente sistema utilizado era
cloroformo, metanol y cido actico (65: 15: 2, v / v / v) [6]. Manchas de lpidos en
la placa fueron detectados bajo UV despus de rociar con purimuline, glicolpidos
y luego se visualizaron por la A-naftol mtodo [3].
Datos estadsticos analiza. La media del grupo de eficiencia de la extraccin de
TPH se analiz mediante la prueba de Kruskal-Wallis en el P <0,05 de importancia
[1] y, si es significativa, se utiliz la prueba t de dos muestras de analizar las
diferencias entre los grupos de control y de prueba en el P <0,05 nivel de
significacin.

Resultados
La degradacin de los n-alcanos de gasoil por suelo WatGin microcosmos. La
recuperacin de TPH a partir de 2 g de suelos no esterilizadas que contienen 1,0%
(w / w) de aceite diesel fue 97% (Tabla 1). Evaporacin espontnea del gasleo a
partir de la misma cantidad de suelos esterilizados en el tornillo de tope (no
celular) y porosa de silicio-capsulado (gaseosos) tubos fue de 7 1,4% y 5,0%
15, respectivamente (Tabla 1). La disminucin de TPH en el tornillo de tope para
tubos de ensayo se atribuira a la espontnea evaporacin del aceite diesel para
el espacio de cabeza de tubos de ensayo. La diferencia en aproximadamente un
4% entre el control y muestras de bioestimulacin de 25% -WatG-tornillo tope-la
muestra se atribuira a la participacin de bacterias que pueden crecer bajo micro
aerbica condicin. El nivel de degradacin de TPH del 12,5% -WatGsiliconbioestimulacin muestra capsulado era el mismo que la de la muestra de control
(Tabla 1). Cuando el TPH niveles de degradacin de dos cubiertas de -WatGsilicio 12.5%
Se examinaron muestras de bioaumentacin 51 16,9% y 46 3,5% para
aquellos que utilizan sin esterilizar y esterilizado microcosmos, respectivamente.
Estos resultados demuestran que la bioestimulacin no es eficaz en este sistema
al menos durante 1 semana y que la bioaumentacin utilizando suelo no
esterilizado es ms eficiente que el uso de suelo esterilizado.
El tamao del inculo es otro punto crucial para bioaumentacin en microcosmos
de suelo. Los resultados de Se compararon 12,5% de las muestras coronadas de WatG-silicio con los de 25% de las muestras coronadas de -WatG-silicio. El
Niveles de degradacin de TPH de la antigua fueron aproximadamente 20%
mayor que la de este ltimo bajo sin esterilizar condiciones. Condiciones Del
mismo modo, en virtud esterilizados el primero era un 30% mayor que el segundo
(Tabla 1).

Tabla degradacin 1. TPH en cada microcosmos del suelo Porcentaje de

degradacin de TPH (%) a, b Recuperacin condicin TPH Experimento del suelo
[%] un 12,5% WATG de silicio-capsulado 25% WATG de silicio-capsulado 25%
WATG con tapn de rosca Extraccin 100% 0 veces No esterilizado 100 6.4 97
4.0 Control C esterilizado 15 15 5.0d 7 1.4 La bioestimulacin sin
esterilizar 15 15 5.7e 11 2.5
Bioaumentacin sin esterilizar 51 16.9 2.9 41 24 11.2
Bioaumentacin esterilizado 46 3,5 32 5,1 20 16.5
Desviacin estndar valor a Mean (n = 3).
Definido como la degradacin total en la que se toma en cuenta la recuperacin de
TPH. c. Definido como la desaparicin de compuestos diesel en ausencia de
actividad biolgica (evaporacin espontnea). d.- El valor de los mismos
experimentos. e.- El valor a partir de los mismos experimentos.
Degradacin de n-alcanos de Diesel Oil por P. aeruginosa en microcosmos de
suelo 183 Estos valores fueron significativas al P <0,05 nivel de importancia
cuando se compara con el control y la bioestimulacin muestras (15 5,0% y
5,7% 15, respectivamente, Tabla 1). Para examinar los efectos de las
condiciones de aireacin en la degradacin del aceite diesel, WATG tambin se
inocul a tubos de ensayo con tapn de rosca para evitar la aireacin espontnea
as como la evaporacin de los componentes del petrleo diesel. Como se
muestra en la Tabla 1, la degradacin de TPH por bioestimulacin y dos muestras
bioaumentacin (no celular) en 25% tubos de ensayo tapados--WatG-tornillo se
redujo obviamente, cuando se compara con la de 25% -WatG porosa muestras de

silicio con tapa (gaseosos). En particular, TPH degradacin (24 11,2%) bajo
condiciones no aireados era slo el 40% de los que (41 2,9%) bajo aireado
condiciones en el suelo sin esterilizar. Produccin ramnolpido por el suelo WatGin
microcosmos. Como se muestra en la figura. 1, dos a-naphthol positivo lpidos con
valores de Rf de 0,26 y 0,20 fueron detectado slo en el microcosmos de suelo
agregado WATG contaminada con aceite diesel (carriles 5 y 6). El Rf valor (0.26)
de la antigua de lpidos fue el mismo que el de dirhamnolipido del medio lquido
adulto WATG
(Fig. 1, carril 1). Por lo tanto, el lpido se identific como dirhamnolipido. La
produccin de dirhamnolipido en el microcosmos del suelo que contiene WATG
slo en presencia de gasoil implica que WATG sera sintetizar dirhamnolipido
utilizando gasoil como inductor y secretar que en el suelo. Hasta donde sabemos,
no hay informes sobre ramnolpido produccin en microcosmos de suelo se han
presentado. No punto obvio que corresponde a monorhamnolipido era observado
en ninguna muestra. El lpido con el valor de Rf de 0,20 sera probablemente un
lpido celular comnmente derivados de dos cepas de P. aeruginosa (carriles 5 a
10) pero no de microcosmos del suelo (carriles 2 a 4), debido su ocurrencia nica
de todos los microcosmos clulas agregado muestras (carriles 5 a 10).

Discusin
WATG podra degradar el petrleo diesel hasta un 51% en 1 semana en
microcosmos del suelo a 20_C (Tabla 1). El hallazgo de que la diesel capacidad
de degradacin del aceite fue mucho mayor en 25% - Cultura WATG-silicio-un
tope que en el 25% -WatG-tornillo de tope sugiere que el aire (oxgeno) se
convertira en un factor limitante en el cultivo de WATG en con tapn de rosca
tubos de ensayo. Esta capacidad de WATG para degradar n-alcanos en aceite
diesel en microcosmos de suelo es comparable a la de un consorcio bacteriano
que consta de Nocardia nova y Rhodotorula glutinis [11] y para la de los lodos de
depuracin activa [5]. Por lo tanto, se considera que WATG se puede adoptar a un
degradador sola prctica de productos derivados del petrleo en condiciones
aerbicas en el ambiente del suelo.
Cabe destacar que el porcentaje de TPH la degradacin fue inesperadamente
superior en el 12,5% - Grupos WATG aadi-que en el 25% aadido--WatG
grupos (Tabla 1). La modificacin de un medio nuevo para microcosmos de suelo
estimulara el crecimiento de WATG y Higo. 1. El cromatograma en capa fina de
ramnolpidos crudo extrados de microcosmos del suelo aadido WATG. WATG
est en microcosmos de suelo y despus se incubaron durante 1 semana en las

condiciones mostradas en la figura. P. aeruginosa cepa JCM5962T se utiliz como

control negativo. Carril 1, ramnolpidos de WATG cultivadas en medio LB; carril 2,
Bioaumentacin con WATG en el tiempo 0; carril 3, Control; carril 4,
bioestimulacin; carriles 5 a 8, Bioaumentacin con WATG; carriles 9 y 10,
Bioaumentacin con P. aeruginosa JCM5962T. +: Presente; -: Ausente. 184 Vol
Current Microbiologa. 52 (2006) bacterias indgenas suelo, mediante el cual el
consumo de petrleo diesel se incrementara. Por lo tanto, intermitente provisin
de medio fresco para el microcosmos del suelo puede facilitar la eficiencia de la
degradacin del aceite diesel en el ambiente del suelo mucho ms que la provisin
de un mayor inculo en medio gastado.
El hallazgo de que la degradacin de TPH era claramente mayor en microcosmos
de suelo sin esterilizar que en esterilizada los (Tabla 1) es razonable, ya que los
suelos pueden inherentemente incluyen bacterias que degradan petrleo. Aunque
hay evidencia directa de que se ha proporcionado, es probable que bacterias del
suelo indgenas trabajen cooperativamente con WATG para degradar el petrleo
diesel en suelos. Esta cooperacin puede ser mediada por ramnolpidos
producidos por WATG, porque Se sabe que el fenantreno se degrada en los
suelos inoculadas con fenantreno-degradante y Biosurfactantes- bacterias
productoras [4] y que la modificacin de ramnolpidos a tierra no estril aumenta nalcano la degradacin de [9].
En conclusin, 1) WATG exhibi un aceite de alta diesel (principalmente nalcanos) capacidad de degradacin en el suelo siempre con nutrientes ricos; 2)
WATG produjo dirhamnolipido en del suelo; 3) dirhamnolipido produccin por
WATG en el suelo puede facilitar su capacidad bioaumentacin por bioestimulante
bacterias del suelo indgenas.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue apoyado en parte por el norte de Avance Centro de Ciencia y
Tecnologa y la Fundacin Sumitomo. Literatura Citada
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3. Christie WW (1982) analiza lpidos. 2 ed. Oxford, Reino Unido: Pergamon

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5. Gallego JLR, Loredo J, Llamas JF, Vzquez F, Snchez J (2001)
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TRADUCCION. N 3
Degradacin diferencial
Pseudomonas.

del

crudo

(Bonny Light)

por

cuatro

cepas de

Obayori OS, Adebusoye SA, Adewale AO, Oyetibo GO, Oluyemi OO, Amokun RA,
Ilori MO.
Fuente
Departamento de Microbiologa de la Universidad del Estado de Lagos, Ojo, Lagos
100001, Nigeria. femiobayori@yahoo.com
Resumen
Cuatro degradadores de hidrocarburos aislados de suelos de petrleo y asfalto
contaminado enriquecidos en Lagos, Nigeria, fueron probados por su potencial de
degradacin del petrleo. Todos los aislamientos fueron identificados como
especies de Pseudomonas. Pseudomonas putida P11 demostr una fuerte
capacidad de degradar el queroseno, gasolina, diesel, aceite del motor y el
petrleo crudo, mientras que P. aeruginosa BB3 exhibi capacidad degradativa
justo en el petrleo crudo, gasolina, aceite de motor, antraceno y pireno, pero dbil
sobre el queroseno, diesel y dibenzotiofen. Pseudomonas putida WL2 y P.
aeruginosa MVL1 crecieron en el petrleo crudo y todos sus cortes analizados con
las potencialidades que poseen estos ltimos similares policclicos aromticos
como P11. Todas las cepas crecieron de forma logartmica con 1-2 rdenes de
magnitud y con tiempo de generacin que van significativamente entre 3,07 y 8,55
das a 0,05 niveles de confianza. Las cepas WL2 y MVL1 utilizaron el sustrato de
aceite mejor con ms de 70% en 6 d perodo experimental, mientras que la misma
hazaa se logr mediante P11 en 12 periodo d. BB3 por otro lado degrada slo el
46% dentro de 6 d. Curiosamente, los datos obtenidos a partir de anlisis
cromatogrfico de gases del aceite recuperado de los fluidos de cultivo de MVL1
confirmaron casi desaparicin de los picos principales (incluyendo compuestos
alifticos y aromticos) en la mezcla de hidrocarburos.
PMID:
19402429