Soluciones

Objetivos
Que el alumno:
1. Identifique la existencia de soluciones en
los sistemas biolgicos.
2. Explique los clculos y procedimientos
para preparar soluciones porcentuales,
molares y normales, as como las diferentes
diluciones de stas.
3. Presente ejemplos de soluciones utilizadas
en medicina (solucin isotnica, Ringer,
Darrow y Hartman).
Responda a las siguientes preguntas:
1. Qu es una solucin?
2. Cuntas clases de soluciones existen?
3. Qu significan los siguientes trminos:
mol, solucin molar y solucin normal?
4. Qu significan: v/v, p/v, p/p y ppm?
5. Cul es la composicin de las siguientes
soluciones: solucin isotnica de cloruro de
sodio, suero glucosado a 5%, Ringer-lactato?
6. Cules son los tipos de soluciones que
existen in vivo? Mencionar ejemplos.
7. Qu es una solucin isotnica?
8. Qu es una solucin osmolar?
9. Cmo se calcula la osmolaridad de una
solucin?
10. Qu les pasa a los eritrocitos cuando se
ponen en contacto con soluciones salinas de
diferente osmolaridad?
11. Qu se entiende por dilucin y dilucin
seriada de las soluciones?
Material
Por equipo:
3 vasos de precipitado de 10 ml
3 pipetas de 1.0 ml
3 pipetas de 5.0 ml
3 pipetas de 10.0 ml

Gradilla con 6 tubos de ensayo

Eritrocitos humanos lavados en solucin.
Salina isotnica
Solucin de azul de metileno al 1.0%
Cloruro de sodio en cristales (NaCl)
Balanza granataria
Por grupo:
1 Microscopio marca Leica.
Procedimiento
1. Hacer los clculos para preparar una
solucin de KCl al 3%.
2. Hacer los clculos para prepara una
solucin de CaCl2 0.25 M se requieren 15 ml.
3. Calcular el volumen de H2SO4 se requiere
para preparar una solucin 3N 40 ml volumen
final.
4. Hacer los clculos correspondientes para
comprobar que la solucin a 0.9% de NaCl
es isotnica con respecto al plasma (ver pag.
92). Considerar que:
a) El cloruro de sodio se disocia en solucin
acuosa en los iones sodio y cloruro, por lo
que la concentracin inica se duplica (1
mmol/l = 2 mosm/l).
b) La presin osmtica normal del plasma es
de 290-310 mosm/l.
5. Preparar 20 ml de una solucin de NaCl a
4.5% (etiquetar como solucin 1).
6. A partir de la solucin anterior, preparar 25
ml a 0.9% (solucin 2) y 50 ml a 0.045%
(solucin 3).
7. Colocar en tres tubos de ensayo las
diferentes soluciones de cloruro de sodio
preparadas en los puntos 1 y 2. Con la ayuda
de un gotero (dejando caer lentamente por
las paredes del tubo) 2 gotas de eritrocitos
lavados.
Mezclar con cuidado y dejar
reposar a temperatura ambiente unos
minutos. Valorar el grado de hemlisis que
sufren los eritrocitos cuando se ponen en
contacto con las diferentes soluciones.
8. Hacer los clculos necesarios para
preparar otras soluciones, por ejemplo: 500
ml de etanol a 45 % (a partir de etanol a 96
%).Expresar en meq/l una concentracin de
calcio de 11 mg/dl. Una solucin contiene 14

g de glucosa en 25 ml. Cul es la

concentracin molar de la solucin?
A un enfermo hay que inyectarle 15 g de KCl
y 126 g de glucosa (C6O6H12).
Cunta agua habr que aadirles para que
resulte un suero 0.4 osmolar?
9. Calcular la osmolaridad a partir de la
composicin de algunas soluciones como
Dextrosa a 10 % en solucin salina a 0.45%.
Dextrosa a 5 % en solucin salina a 0.2 %.
Hartman, Ringer y Darrow.
10. Hacer la dilucin y redilucin (dilucin
seriada) de la solucin de azul de metileno
como se muestra en el siguiente cuadro:
DILUCIN SERIADA DE AZUL DE
METILENO
Tubo
H2O
Sol de azul
Volumen de
(ml)
de metileno
transferencia
1
2
0.5 ml*
2
2
0.5 ml
3
2
0.5 ml
4
2
0.5 ml
5
2
0.5 ml
6
2
0.5 ml
*Nota: para mezclar al hacer las diluciones se
debe succionar y soplar con cuidado la pipeta en
cada tubo varias veces antes de transferir la
dilucin al siguiente tubo.

Resultados

1. Expresar en forma ordenada los clculos

efectuados para cada uno de los ejercicios.
2. Deducir el movimiento o no del solvente
cuando se ponen en contacto eritrocitos con
soluciones hipo, hiper e isoosmticas.
3. Calcular la dilucin y la concentracin de
azul de metileno en cada uno de los seis
tubos de la dilucin seriada (ver pg. 93).
Asegrese que la coloracin obtenida
disminuya gradualmente conforme avanza la
dilucin.

REFERENCIAS
1. Villazn SA, Crdenas CO, Villazn DO,
Sierra UA. Fluidos y electrlitos. Mxico: JGH
Editores; 2000.
2. Pea-Daz A, Arroyo BA, Gmez PA,
Tapia IR, Gmez EC. Bioqumica. Undcima
reimpresin de la 2a. ed. Mxico: Editorial
Limusa; 2004.
3. Laguna J, Pia E. Bioqumica de Laguna.
5a.ed. Mxico: Editorial El Manual Moderno;
2002: p. 41-56.
4. Holum JR. Fundamentos de qumica
general, orgnica y bioqumica para ciencias
de la salud. Mxico: Editorial Limusa Wiley;
2001.
5. Farias GM. Qumica clnica. Dcima
edicin Mxico: Editorial El Manual Moderno;
1999.
6. Bloomfield MM.Qumica de los organismos
vivos. Mxico: Editorial Limusa; 1997.

INSTRUCCIONES PARA EL USO

DEL MICROSCOPIO MARCA LEICA

1. Nunca use un adaptador entre el cable y

la fuente de alimentacin.

muestra con precisin utilizando el mando de

enfoque micromtrico.
11. Ajuste los tubos oculares a la distancia de
los ojos.

2. Use siempre el microscopio sobre una

superficie dura y estable.
3. Conecte el cable de alimentacin del
microscopio a una toma de corriente con
conexin a tierra. Se suministra un cable de
tres terminales con toma a tierra.
4. Encienda el microscopio girando el
interruptor de control de la iluminacin
situado en la parte inferior izquierda del
instrumento.
5. Coloque el interruptor de control de la
iluminacin en el nivel ms bajo. El control
de iluminacin le permite ajustar la intensidad
de luz.
6. Abra completamente el diafragma de
apertura del condensador girando el anillo
hacia el extremo derecho.
7. Usando el botn
de enfoque del
condensador, suba el condensador hasta el
extremo superior de su desplazamiento.
Iluminacin critica
nicamente: si el
desplazamiento
del
condensador
es
excesivo, limtelo con el tornillo situado
debajo de la platina hasta que la lente
superior del condensador
se encuentre
debajo de la superficie de la platina.
8. Coloque la preparacin de la muestra con
la muestra en la platina.

12. Al trmino del uso del microscopio retirar

la muestra de la platina.
13. Bajar la platina hasta el tope y regresarla
a su posicin original si es necesario.
14. Colocar el revolver de los objetivos de
manera que el objetivo de 4X sea el que
quede en direccin de la lmpara.
15. Desconectar
cable.

el equipo y

enrollar el

16. Limpiar la platina y oculares con un pao

humedecido con metanol o con un limpia
cristal comercial.
17. Colocar al microscopio la funda contra el
polvo
para
mantenerlo
en
buenas
condiciones fsicas y mecnicas.
Partes del microscopio:
1) -Oculares.
2) -Revolver con 4 objetivos 4X, 10X, 40X y
100X.
3) -Platina.
4).-Diafragma.
5) -Lmpara.
6).-Tornillo de la platina para desplazar la
muestra.
7).-Interruptor de control de la iluminacin.
8).-Tornillo macromtrico.
9).-Tornillo micromtrico.

9. Gire el revlver hasta situar el objetivo 4X

en la posicin de trabajo. (pag X)

10. Suba la platina girando el mando de

enfoque macromtrico hasta que observe la
preparacin y, finalmente, enfoque la

2
6
9

Prctica 2

3
4

Prctica 2
5

Regulacin del equilibrio cido-base

despus del ejercicio muscular intenso y
de la ingestin de bicarbonato de sodio

Objetivos
1. Al finalizar la prctica, el alumno
constatar las actividades reguladoras del
pulmn y el rin para mantener el equilibrio
cido-base en condiciones que tienden a
romperlo.
2. Mediante la determinacin del pH
observar la variacin de la concentracin de
hidrogeniones en la orina de un individuo que
ha realizado ejercicio muscular intenso.
3. Relacionar los resultados obtenidos con
los cambios metablicos originados por el
ejercicio muscular intenso.
Conteste las siguientes preguntas:
1. Por qu es importante que se mantenga
constante, dentro de ciertos lmites, el pH en
el organismo?
2. Cules son las fuentes de iones H + en el
organismo?
3. Cules son los sistemas reguladores que
facilitan la eliminacin del H+ producido en el
organismo con el fin de mantener constante
el pH sanguneo?
4. Cules son las reacciones de formacin
del cido carbnico (H2CO3) a partir de CO2 y
H2O, y de su disociacin para formar el ion
bicarbonato? Escrbalas.
5. Qu sistemas amortiguadores participan
directamente en la regulacin del pH
sanguneo?
6. Cules son los sistemas extrasanguneos
que tienden a mantener el pH extracelular?
Escriba la ecuacin de Henderson
Hasselbalch aplicada al sistema

HCO3/H2CO3 y, con base en ella, conteste la

siguiente pregunta:
1. Cmo participan el aparato respiratorio y
el rin en el control del pH sanguneo?
Material
Diez probetas o vasos de precipitado.
Orina.
Potencimetro.
Piceta.
Mtodo
Un alumno por equipo desayunar o comer
normalmente (evitar ingestin de jugos
cidos); despus har lo que se indica a
continuacin:
1. Tomar 250 ml de agua una hora antes de
la clase prctica. Vaciar la vejiga y descartar
esa orina.
2. Tomar 250 ml de agua inmediatamente
antes de la clase prctica.
3. Orinar en un vaso de precipitado de 100
ml. Anotar el volumen de la muestra.
4. Ingerir 250 ml de agua.
5. Realizar ejercicio muscular intenso, como
subir y bajar varias veces las escaleras de
tres o cuatro pisos u otro ejercicio sugerido
por el profesor.
6. Obtener muestras de orina cada 15
minutos, como en el inciso 3, hasta completar
por lo menos cinco muestras.
7. A cada muestra se le determinar el pH
inmediatamente despus de haber sido
obtenida ya que con el tiempo el pH tiende a
aumentar debido a la prdida de dixido de
carbono y a que el crecimiento bacteriano
produce amoniaco a partir de la urea.
Anlisis de resultados

Una vez obtenido el valor del pH para cada

una de las 5 muestras de orina, trazar una
grfica de pH contra tiempo; interpretar los
resultados y discutirlos en grupo.
Segunda parte
Objetivos
1. El alumno constatar el papel del rin en
el mantenimiento del equilibrio cido-base en
una situacin de alcalosis metablica
provocada por la ingestin de bicarbonato de
sodio.
2. Mediante la medicin del pH, observar la
variacin
de
la
concentracin
de
hidrogeniones en la orina de un individuo que
ha ingerido una carga de bicarbonato de
sodio.
Hiptesis

1. Tomar 250 ml de agua una hora antes de

la clase prctica. Vaciar la vejiga y descartar
esa orina.
2. Tomar 250 ml de agua inmediatamente
antes de la clase prctica.
3. Orinar en una probeta de 100 ml. Anotar el
volumen de la muestra.
4. Ingerir 250 ml de agua con 7.5 g de
bicarbonato de sodio.
5. Obtener muestras de orina cada 15
minutos, hasta completar por lo menos 5
muestras.
6. A cada muestra se le determinar el pH
inmediatamente despus de haber sido
obtenida.
Anlisis de resultados
Una vez obtenido el valor del pH para cada
una de las cinco muestras de orina, trazar
una grfica de pH contra tiempo; interpretar
los resultados y discutirlos en grupo.

Elabore la hiptesis apropiada.

Material
Orina.
Solucin de bicarbonato de sodio a 3%.
Potencimetro.

REFERENCIAS
1. Devlin TM. Bioqumica. Libro de texto con
aplicaciones clnicas. 4a. ed. Barcelona:
Editorial Reverte; 2004.
2. Montgomery R. Bioqumica: casos y texto.
6a. ed. Editorial Harcourt-Brace; 1998: cap.4.
3. Villazn SA, Crdenas CO,Villazn

Mtodo

Prctica 3

Titulacin de un aminocido con una

base y la aplicacin de la ecuacin de
Henderson y Hasselbalch.
Determinacin del pK1 y del pK2

Objetivos
Que el alumno:
1. Experimente y entienda cmo se comporta
un sistema amortiguador de pH.
2. Aprenda el uso de la ecuacin de
Henderson-Hasselbalch.
3. Aprenda a calcular el pK de un par cidobase.
4. Mida el pH de diferentes sustancias y
calcule su concentracin de H+.
5. Aplique estos conocimientos al estudio de
las propiedades de los aminocidos.
Para lograr lo anterior conteste las
siguientes preguntas y planteamientos:
1. Qu es el pH de una solucin?
2. Qu es un sistema amortiguador cidobase y para qu sirve?
3. Cules son los sistemas amortiguadores
ms importantes en biologa?
4. Escribir la ecuacin de HendersonHasselbalch.
5. Qu es el pK de un par cido base?
6. Por qu es importante la concentracin
de H+ en los seres vivos?
7. Dibujar la frmula de la glicina, de la lisina,
de la histidina y del cido asprtico
e identificar a los grupos -amino y carboxilo de estos aminocidos, as como su
radical, e indicar la naturaleza del mismo.
8. Qu les pasa a estos grupos funcionales
cuando se someten a pH cido o bsico?
9. Se pueden usar los aminocidos como
amortiguadores de pH?
10.
Son
los
aminocidos
buenos
amortiguadores a pH de 7.0?

11. Cul es el punto isoelctrico de los

aminocidos que tienen un grupo amino y un
grupo carboxilo?
12. Cul es la carga elctrica de los
aminocidos que tienen dos grupos carboxilo
a pH de 7.0?
13. Cul es la carga elctrica de los
aminocidos que tienen dos grupos amino a
pH de 7.0?
Material
Cuatro vasos de precipitado de 100 ml.
Pipeta de 1 ml (para el NaOH).
Potencimetro.
Piceta para enjuagar el electrodo.
Glicina 0.025 mol/l pH 2.
Lisina 0.025 mol/l pH 2.
cido asprtico 0.025 mol/l pH 2.
Histidina 0.025 mol/l pH 2.
NaOH 1.0 mol/l.
Mtodo
1. Poner 20 ml de la solucin de glicina en un
vaso de precipitado de 100 ml.
2. Proceder a la medicin del pH.
3. Aadir 0.1 ml de NaOH 1.0 mol/l. Agitar el
vaso y volver a medir el pH; anotar los
resultados.
4. Repetir el paso 3 hasta llegar a un pH
aproximado de 12.
5. Hacer lo mismo (pasos 1 a 4) para los
otros tres aminocidos.

Anlisis de resultados
1. Hacer una grfica de pH vs volumen en
ml de NaOH gastados luego de tomar en
cuenta que cada 0.1 ml de NaOH diluido en
20 ml aumenta la concentracin de OH en 5
mM.
2. Localizar en la grfica el pI y los
diferentes pK de los aminocidos.
3. Mediante la ecuacin de HendersonHasselbalch cuantificar la relacin entre cada
par de especies ionizables de los
aminocidos a diferentes pH.
4. Identificar a qu pH tienen poder
amortiguador.

Medicin del pH y clculo de la concentracin

de H+ en diferentes lquidos
Mtodo
1. Pedir a los alumnos desde la clase
anterior que traigan diferentes muestras,
tales como leche, caf, refresco, orina, saliva,
jugo de frutas, etctera.
2. Colocar los lquidos en un vaso de
precipitado y medir el pH en el
potencimetro.
Anlisis de resultados
Calcular la concentracin molar de H + en
cada uno de las muestras estudiadas.
REFERENCIAS
1. Devlin TM. Bioqumica. Libro de texto con
aplicaciones clnicas. 4a. ed. Barcelona:
Editorial Reverte; 2004.
2. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de
bioqumica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones
Omega; 2005

Prctica 4

Estudio de las protenas corporales

Objetivos
1. Aplicar los conocimientos generales sobre
las protenas al estudio de las protenas
corporales.
2. Conocer las alteraciones ms frecuentes de
las
protenas
plasmticas
y
sus
consecuencias.
3. Conocer los mtodos generales para el
estudio de las protenas plasmticas.
4. Determinar la concentracin srica de
protena total y de albmina e interpretar los
resultados obtenidos.
INTRODUCCIN
Las protenas son polmeros lineales
constituidos por los aminocidos, que se unen
entre s por medio de enlaces tipo amida
denominados enlaces peptdicos.
Los
polmeros
compuestos
por
dos
aminocidos forman un dipptido, por tres, un
tripptido; cuando el nmero de aminocidos
es mayor, oligopptidos y polipptidos o
simplemente se denominan pptidos. Las
protenas son molculas constituidas por una o
ms cadenas polipptidicas.
Las protenas pueden ser clasificadas en
funcin de aspectos tan diversos como su
composicin, su disposicin espacial, su
funcin biolgica y su localizacin.
Atendiendo a su localizacin dentro del
organismo humano, las protenas pueden
clasificarse en:
Hsticas o tisulares, son las protenas de los
tejidos.

Plasmticas o hemticas, son las protenas

de la sangre.
Aunque las protenas tisulares son de gran
importancia en el organismo, las localizadas en
la sangre (la hemoglobina en los eritrocitos y
las protenas plasmticas), por su gran
accesibilidad, proporcionan con facilidad
informacin importante y, por lo tanto, son las
ms utilizadas en el laboratorio clnico.
Protenas plasmticas
La sangre est constituida por formas celulares
en suspensin (eritrocitos, leucocitos y
plaquetas) en un medio lquido llamado
plasma. El plasma se obtiene cuando,
inmediatamente despus de extraer la sangre,
se le agregan anticoagulantes como oxalato,
citrato, EDTA o heparina y se centrifuga. Si se
recoge sangre sin anticoagulante y se deja que
sta coagule, el lquido que se separa se llama
suero. El suero carece de clulas y de factores
de la coagulacin incluyendo la protena
fibringeno, pues sta ha sido transformada en
fibrina insoluble en el proceso de la
coagulacin. El fibringeno constituye slo de
3 a 6% del total de las protenas en plasma.
El agua constituye 92 a 93% del plasma o
suero y en ella encontramos electrolitos,
metabolitos, nutrientes, hormonas y protenas
en una proporcin de 7 a 8%; de estos solutos
presentes, las protenas son las que estn en
mxima proporcin, aproximadamente 6 a 8
g/dl de suero y este valor es 0.2 a 0.4 g/dl
mayor en plasma por la presencia de
fibringeno.

Las protenas plasmticas son un grupo de

ms de 100 molculas distintas con
caractersticas y funciones muy diversas,
aunque para fines prcticos el trmino
"protena plasmtica" se usa para todas
aquellas protenas cuya concentracin en el
plasma sea mayor a 10 mg/dl y que cumplan
con alguna funcin especfica dentro de l.
Aproximadamente son 20 las protenas que
cumplen con ambas definiciones. Todas estas
protenas, a excepcin del fibringeno, se
encuentran tanto en plasma como en suero.
La mayora de las protenas plasmticas son
sintetizadas por el hgado. Las protenas del
plasma, al igual que otras protenas del
organismo, son destrudas y reemplazadas
constantemente, con una vida media de
aproximadamente 10 das.
Las funciones de las protenas plasmticas
pueden agruparse en tres grandes grupos: de
transporte como la transferrina, lipoprotenas y
la albmina; de defensa del organismo en el
ataque a agentes extraos o para limitar la
respuesta
inflamatoria,
como
las
inmunoglobulinas,
la
a1-antitripsina,
la
haptoglobina y el complemento. Por ltimo,
para mantener la presin onctica de la
sangre, necesaria para prevenir prdidas de
lquido del espacio vascular al intersticial: la
albmina es el ejemplo ms importante de este
grupo.
Mtodos para el estudio de las protenas
plasmticas
El laboratorio clnico cuantifica en una muestra
de suero las concentraciones de protena total
y de albmina. A partir de estos datos, se
calcula la fraccin globulina como la diferencia
entre los dos resultados anteriores y la relacin
albmina/globulina se calcula a partir de
estos ltimos. La concentracin de otras
protenas se determina por grupos (por
ejemplo,
las
gamma-globulinas)
o
individualmente por mtodos inmunoqumicos
(por ejemplo algunas hormonas o marcadores
tumorales).

Las enzimas se estudian evaluando su

actividad cataltica o su concentracin de masa
mediante mtodos inmunoqumicos. Tambin
es posible el estudio fraccionado de las
protenas, para lo que se recurre a otros
procedimientos ms precisos de gran ayuda
clnica,
como
la
electroforesis,
la
inmunoelectroforesis y la inmunodifusin radial
de protenas plasmticas.
Protena total
La suma de las concentraciones de todas y
cada una de las protenas presentes en el
plasma se conoce como protenas totales y la
cifra normal, en promedio, es de 7.1 g/dl,
siendo las cifras lmite entre 6 y 8 g/dl.
Las protenas totales estn integradas por
albmina (ms de la mitad) y las globulinas;
estas ltimas agrupan a todas las protenas
que no son albmina.
La concentracin de las protenas plasmticas
en un momento determinado es el resultado de
tres procesos: la velocidad de sntesis, el
volumen del lquido en que se distribuyen y la
velocidad de degradacin. En diversos estados
patolgicos,
estos
procesos
pueden
superponerse. En la prctica, la determinacin
de la concentracin de la protena total es un
parmetro que slo refleja los cambios de las
protenas ms abundantes, como la albmina y
las inmunoglobulinas.
La determinacin de protena total es til en el
diagnstico de enfermedades del hgado, de
los riones y de la mdula sea.
En clnica se puede observar hiper o
hipoproteinemias, pero tanto en unas como en
otras, frecuentemente existe disminucin de la
generalmente aumento de globulinas, en
alguna de sus fracciones.
La determinacin de las protenas totales suele
realizarse en el suero que carece de
fibringeno y de cualquier anticoagulante que
pueda diluir levemente las protenas en el
plasma.

Albmina
La albmina es la principal protena plasmtica
y es sintetizada y secretada por el hgado a
razn de 12 g al da. Supone alrededor de 25%
de la produccin proteica heptica total y la
mitad de toda su protena secretada. La
albmina es una protena globular compuesta
por 585 aminocidos en una sola cadena
polipeptdica con 50% de -hlice y 15% de
estructura , posee 17 puentes disulfuro y
tiene una vida media entre 14 y 20 das.
En el adulto normal se degradan diariamente
12 g de albmina que pueden proveer de
aminocidos para la sntesis de otras
protenas. Adems de esta funcin nutritiva, la
albmina ayuda a conservar la distribucin
normal de agua ya que produce cerca de 80%
del efecto osmtico de las protenas
plasmticas totales, debido a su alta
concentracin y bajo peso molecular. La
albmina interviene en el equilibrio cidobsico y se encarga tambin del transporte de
varias sustancias como son los cidos grasos,
la bilirrubina, varias hormonas e incluso
algunos frmacos (sulfonamidas, penicilina G,
aspirina, entre otras).
Alteraciones en la concentracin de albmina.
La ms comn es la disminucin en su
concentracin o hipoalbuminemia. En general,
la disminucin de 1 g de albmina srica
equivale a una prdida de 30 g de protena
tisular.
Las
principales
causas
de
hipoalbuminemia son las enfermedades
renales, la desnutricin por baja ingestin de
protenas y la sntesis deficiente como
consecuencia de la insuficiencia heptica,
sobre todo en casos de cirrosis. La
manifestacin clnica ms llamativa de la
hipoalbuminemia es el edema.
Las cifras normales de albmina son de 4.5
g/dl y las cifras lmite entre 3.5 y 5 g/dl. La
relacin normal A/G es mayor de uno y es un
indicador importante en algunos estados
patolgicos. Una relacin A/G baja puede

obtenerse porque existe hiperglobulinemia,

hipoalbuminemia o ambas.
Separacin electrofortica de las protenas
del suero
Las tcnicas de electroforesis, enfoque
isoelctrico y cromatografa de intercambio
inico son algunas de las ms importantes
para el estudio de las protenas basadas en su
carga elctrica.
En la electroforesis, si se colocan las protenas
en un soporte (geles polimricos, almidn o
papel)
inmersas
en
una
solucin
amortiguadora a un pH determinado dentro de
un campo elctrico, las protenas se desplazan
hacia un polo cargado. En funcin de la
relacin entre el pH del amortiguador y el pI de
la molcula, sta se mover hacia el ctodo,
hacia el nodo, o permanecer estacionaria
(pH=pI), por influencia del campo elctrico
externo.
Cuando se realiza la electroforesis en papel o
acetato de celulosa a pH 8.6, que es un pH
significativamente superior al pI de las
principales protenas plasmticas cuyo peso
molecular oscila entre 66 000 y 700 000, las
protenas estn cargadas negativamente y se
mueven hacia el polo elctrico positivo. En
funcin de su velocidad de desplazamiento, las
protenas del suero se separan en cinco
fracciones principales: albmina, globulina -1,
globulina -2, globulina , fibringeno (para
plasma solamente) y globulina (Fig. 5.1). La
electroforesis no separa los componentes
proteicos en sustancias qumicamente puras:
algunas de estas fracciones representan
decenas a cientos de protenas individuales y
diferentes que slo tienen en comn la misma
velocidad de desplazamiento electrofortico.
Hay que tener en cuenta que la migracin a
distinta velocidad en el campo elctrico,
obedece a la forma y carga de la molcula y
menos a su tamao o peso molecular.
Las membranas de acetato de celulosa tienen
la ventaja de ser qumicamente homogneas y

poder transparentarse, con lo que las

sustancias
que
se
separan
pueden
cuantificarse por densitometra, una vez
teidas. Este aparato condujo histricamente a
la separacin y clasificacin operacional de las
protenas del plasma humano (Fig. 5.1). El
rea de cada pico determina la concentracin
de la protena que posee esa movilidad
particular.

La electroforesis separa las protenas del

suero en patrones que pueden ser altamente
especficos para ciertas enfermedades como
sucede en el mieloma, el sndrome nefrtico,
la cirrosis o las quemaduras corporales
extensas (Fig. 5.1).
Protenas especficas
Las protenas plasmticas de inters clnico
pueden determinarse por procedimientos
cuantitativos especficos que proporcionan una
informacin clinica ms precisa que los
mtodos anteriores. La cuantificacin se
realiza
mediante
mtodos
como
la
nefelometra,
la
turbidimetra
y
la
inmunodifusin
radial
y
mtodos
de
inmunoanlisis con reactivos marcados, como
el
radioinmunoanlisis,
el
enzimoinmunoanlisis, el fluoroinmunoanlisis
y el luminoinmunoanlisis.

Tabla
5.1
Algunas
protenas
cuya
concentracin se determina en el suero
NOMBRE DE LA
PROTENA

g/L

PROPIEDADES Y
FUNCIN

MOTIVO PARA LA
PRUEBA

Albmina

35-50

Transporte de
mltiples
sustancias

Desnutricin
Hepatopata
Neoplasias

Ig G

8-17

Inmunidad
humoral

Inmunodeficiencias
Mieloma

C3

0.50.9

Protena del
complemento

Obstruccin biliar
Lupus eritematoso

Protena C
reactiva

<0.005

Implicada en la
respuesta
inmune

Infecciones agudas

Protena fijadora
de vitamina D

0.20.55

Une y
transporta
vitamina D3

Dao heptico
grave

Haptoglobina

0.53.2

Fija la
hemoglobina

Hemlisis
Sndrome nefrtico

Fibronectina

0.250.4

Promueve la
adhesin
celular, une
fibrina

Sepsis
Leucemia
Pancreatitis aguda

Transferrina

2.34.3

Transporte de
hierro

Hemocromatosis
malnutricin

Ceruloplasmina

0.20.55

Transporte de
cobre

Dao heptico
grave
Sndrome nefrtico

La tabla 5.1 describe algunas de las protenas

cuya cuantificacin es de utilidad clnica.
Alteraciones de las protenas plasmticas
Dada la gran diversidad de funciones
desempeadas por las protenas plasmticas
en el organismo, son tambin muchas las
alteraciones o disfunciones que pueden
aparecer.
Las alteraciones pueden clasificarse en:
Alteraciones en la cantidad de protenas
totales.
Alteraciones en las fracciones obtenidas tras
una electroforesis, disproteinemias.
Presencia en el plasma de alguna Ig anormal
y/o
de
alguno
de
sus
fragmentos,
paraproteinemias.

 Circulacin en plasma de Ig que precipitan al

descender la temperatura. Crioglobulinemia.
Defectos aislados de alguna fraccin.
Material
Gradilla con 6 tubos de ensayo
2 Pipetas de 5 ml,
Pipetas automticas
Puntas para pipetas automticas
Reactivo de Biuret para determinacin de
protena: tartrato de K-Na 15 mmol/l, yoduro de
sodio 100 mmol/l, ioduro de potasio 15 mmol/l
y sulfato de cobre 5 mmol/l.
Espectrofotmetro a 540 nm.
Solucin reactiva para albmina: verde de
bromocresol a pH 4.2
Espectrofotmetro a 630 nm.
Suero problema.
Solucin estndar de protenas 7 g/dl.
Solucin estndar de albmina 5 g/dl.
Jeringa*, ligadura y torundas con alcohol.
Precauciones. Evtese la hemlisis. La
concentracin de las protenas del plasma se
modifica por la postura, de forma que existe un
incremento de entre un 10% y un 20% tras 30
minutos de pasar de la posicin acostada a la
ortosttica. Adems la aplicacin de la ligadura
para extraer la sangre puede producir un
aumento significativo al cabo de unos minutos.
En ambos casos, la modificacin se debe a un
aumento del paso de lquido desde el
compartimiento vascular hacia el intersticial.
Mtodo
Para la determinacin de protena total se
utiliza el mtodo de Biuret modificado, el cual
es de gran especificidad y precisin. Los
polipptidos que contengan, por lo menos, dos
enlaces peptdicos reaccionan con las sales de
cobre en medio alcalino para formar un quelato
2+
coloreado (violeta) entre el ion Cu y los
tomos de oxgeno del carbonilo y de
nitrgeno de la amida del enlace peptdico. La
concentracin
de
este
complejo
es
proporcional a la concentracin de protena

total en la muestra. La absorbencia se

determina a 540 nm con un blanco de
reactivos.
Preparar la siguiente serie de tubos:
No.
de
tubo
Estndar
Suero
problema
Reactivo
de Biuret

1. Blanco

2. Estndar

25 l
-

3. Suero
problema
25 l

1 ml

1 ml

1 ml

Mezclar e incubar 15 min a temperatura

ambiente.
Leer frente al blanco de reactivos a 540 nm.
El color es estable durante 30 min.
Clculo:
ASuero X [Estndar g/dl] = [Protena Total g/dl]
A Estndar
Donde A es la absorbencia.
El resultado se obtiene en g/dl.
El mtodo es lineal hasta valores de 15 g/dl
(150 g/l).
Valores esperados:
Recin nacidos
5.2 - 9.1 g/dl
Nios (hasta 3 aos) 5.4 - 8.7 g/dl
Adultos
6.0 - 8.0 g/dl
Para la determinacin de albmina se requiere
de la fijacin especfica del verde de
bromocresol a esta protena a determinado pH
producindose un cambio de coloracin, de
amarillo verdoso a verde azulado. El cambio
en la coloracin es directamente proporcional a
la concentracin de albmina en la muestra. La
absorbencia se determina a 630 nm con un
blanco de reactivos.

Preparar la siguiente serie de tubos:

No. de
tubo
Estndar
Suero
problema
Reactivo
de
albmina

1. Blanco

2. Estndar

10 l
-

3. Suero
problema
10 l

2 ml

2 ml

2 ml

Mezclar e incubar 10 min a temperatura

ambiente.
Leer frente al blanco de reactivos a 630 nm.
El color es estable durante 60 min.
Clculo:
ASuero X [Estndar g/dl] = [Albumina g/dl]
A Estndar
Donde A es la absorbencia.
El resultado se obtiene en g/dl.
El mtodo es lineal hasta valores de 6 g/dl (60
g/l).
Los valores mayores de 6 deben diluirse 1:2
con solucin salina.
Valores esperado de 3.5 a 5 g/dl (50 g/l).

REFERENCIAS
1. Peters TJ. Clin Chem. 1968; 14: 1147.
2. Murray KR, Granner DK, Mayes PA,
Rodwell VW. Bioqumica de Harper. 16a. ed.
Mxico: Editorial El Manual Moderno; 2004.
3. Gonzlez de Buitrago JM. Bioqumica
clnica. Madrid: McGraw-Hill Interamericana;
1999.
4. Laguna-Pia. Bioqumica. 4a. ed. Mxico:
Salvat; 1990. Cap. 4.
5. Pacheco Leal D. Bioqumica mdica.
Mxico: Editorial Limusa; 2004.

Prctica 5

Cintica enzimtica.
Efecto de la concentracin del sustrato
sobre la velocidad de reaccin enzimtica
Objetivos
El alumno:
1. Explicar el efecto de la concentracin de
sustrato sobre la velocidad de una reaccin
enzimtica.
2. Calcular por mtodos grficos la velocidad
mxima y la constante de Michaelis de una
reaccin enzimtica.
3. Conocer los diferentes tipos de inhibidores
que existen y estudiar su efecto sobre la Km y
V mx.
4. Conocer
aspectos
bsicos
de
fotocolorimetra (ver pg, 115).
Para lograr los objetivos de esta prctica
contestar las siguientes preguntas:
1. Qu es la velocidad de una reaccin
enzimtica?
2. Cmo se define la constante de Michaelis
(Km) de una reaccin enzimtica?
3. Cmo se define la velocidad mxima (V
mx) de una reaccin?
4. Para qu le sirve a un mdico la
determinacin de la actividad de algunas
enzimas?
5. Cules son las enzimas cuya determinacin
tiene valor diagnstico?
Hiptesis
Si la velocidad de una reaccin enzimtica es
proporcional a la concentracin del sustrato;
cuando la concentracin del sustrato es muy
alta, por lo tanto la enzima se satura y alcanza
su velocidad mxima.
La enzima que sirve de modelo en esta prctica
es la glucosa oxidasa acoplada a la peroxidasa.

Fundamento
El mtodo se basa en el hecho de que la
glucosa, en presencia del oxgeno del aire y con
la participacin de la glucosa oxidasa, se oxida
hasta cido glucnico. El perxido de hidrgeno
que se forma en el curso del proceso se
descompone mediante la peroxidasa. El oxgeno
atmico que se desprende en esta ltima
reaccin se combina con un cromgeno que se
colorea al oxidarse. La intensidad de la
coloracin
del
cromgeno
oxidado
es
proporcional a la concentracin de glucosa.
La glucosa oxidasa (-D-glucosa: oxgeno
xidorreductasa, EC1.1.2.4) tiene un peso
molecular de 160 000. Existe en forma dimrica
y contiene dos moles de FAD como grupo
prosttico por mol de enzima. La glucosa
oxidasa es altamente especfica, hecho que ha
permitido su empleo para el anlisis cuantitativo
de glucosa. La reaccin consiste de dos pasos:
1. Glucosa+glucosa oxidasa-FAD

gluconolactona + glucosa oxidasa-FADH2

2. Glucosa oxidasa-FADH2 + O2
glucosa oxidasa-FAD + H2O2
La
4-gluconolactona
se
hidrata
espontneamente dando cido glucnico. La
reaccin global se expresa:
Glucosa oxidasa

Glucosa + O2

Acido glucnico + H2O2

La peroxidasa cataliza la transferencia de

oxgeno del perxido a un aceptor que es
cromgeno
como
la
ortotoluidina,
la
ortodianisidina,
la
2,2-azino-bis
(3-

etilbencentiazolin-6-sulfnico) o la 4-aminoantipirina (y fenol) que se colorean al oxidarse.

La reaccin se expresa:
E+S

ES

1. Clculo de la concentracin inicial de

sustrato en cada tubo; tomar en cuenta que la
solucin de glucosa contiene 40 molas ml1.
2. La velocidad ser igual a las unidades Klett
por .5 min-1 de incubacin.
3. Con los datos obtenidos completar el cuadro
5.2 y hacer las dos grficas en papel milimtrico.
4. Hacer una segunda grfica con los valores
de 1/v vs 1/[S].
5. Calcular el valor de la velocidad mxima
(Vmx) y de la constante de Michaelis (Km) con
y sin inhibidor.
6. Determinar el tipo de inhibidor de acuerdo
con las grficas del punto anterior.
7. Analizar si los resultados obtenidos estn de
acuerdo con la hiptesis planteada.

E+P

Material y reactivos
2 Gradillas con 8 tubos de ensaye cada una.
1 Pipeta de 5 ml.
2 Pipetas de 5 ml.
1 Matraz Erlemeyer de 100 ml.
Fotocolormetro con filtro azul.
Solucin estndar de glucosa 40 mmol/l y una
dilucin 1:10 de sta para los tubos 2, 3 y 4.
2 frascos con solucin de enzimas: 41.6 Uml1
de glucosa oxidasa, 4.6 Uml1 de peroxidasa,
ortodianisidina 0.21 mmol/l.
Solucin de azida de sodio 400 mmol/l como
inhibidor.
Gotero con HCl.
Mtodo I (con azida de sodio)
1. En un matraz Erlenmeyer de 100 ml
preincubar 20 minutos la solucin de enzimas
con 0.3 ml del inhibidor.
2. Preparar la siguiente serie de tubos (tabla 1).
3.- Considerar un intervalo de 30 segundos para
cada tubo al agregar la enzima.
4.- Agitar cada tubo e incubar 5 minutos
temperatura ambiente y de inmediato detener la
reaccin agregando 3 gotas de HCl concentrado
Considerar un intervalo de 30 segundos para
cada tubo al agregar el HCl.

Mtodo II (sin inhibidor)

1.- Preparar nuevamente una serie de tubos
como lo indica la tabla 1.
2.- Repetir los paos 3 y 4 del Mtodo I
Leer ambas series de tubos en el
fotocolormetro; utilizar como blanco el tubo 1.
Resultados (cuadro 5.2)

REFERENCIAS
1. Devlin TM. Bioqumica. Libro de texto con
aplicaciones clnicas. 4a. ed. Barcelona: Editorial
Revert; 2004.
2. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de
bioqumica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones
Omega; 2005.
3. Mathews CK, van Holde KE. Bioqumica. 3a.
ed. Espaa: McGraw-Hill Interamericana; 2003.
Tubo
No.
1
2
3
4
5
6
7
8

Solucin
glucosa (ml)

de

H2O
(ml)

Soucin de
enzimas
(ml)
0.0
1.0
3
dil 1:10
0.1
0.9
3
dil 1:10
0.25
0.75
3
dil 1:10
0.5
0.5
3
0.1
0.9
3
0.25
0.75
3
05.
0.5
3
1.0
0.0
3
4. Voet D, Voet JG, Pratt C. Fundamentals of
biochemistry. USA: John Wiley and Sons; 1999.

Cuadro 5.2 Resultados

Tubo
No

Concentracin
de sustrato
molas de
glucosa inicial
-1
ml
ABCISAS (X)

Velocidad de
la reaccin
unidades Klett
5 min-1
ORDENADAS
(y)

Velocidad de
la
reaccin
con
INHIBIDOR
Unidades
-1
Klett 5 min

1
2
3
4
5
6
7
8

Cuadro 5.3 Resultados (inverso)

Tubo
No.

1
2
3
4
5
6
7
8

Concentracin
de sustrato
molas de
glucosa inicial
ml-1
ABCISAS (X)

Velocidad de la
reaccin
unidades Klett 5
min-1 1/V
ORDENADAS (Y)

Velocidad de
la reaccin
con
INHIBIDOR
1/V
Unidades
Klett 5 min1
(Y)