Lensemble form par un vecteur et un ou des fragments insrs est appel ADN recombinant. Le mlange dADN recombinant est ensuite utilis pour transformer des cellules bactriennes. En gnral, il pntre une seule molcule de vecteur recombinant par cellule bactrienne. Ces cellules sont tales et se multiplient en formant des colonies. Par consquent, une colonie contient une population trs importante dinserts identiques dADN, et on appelle cette population un clone dADN.
La construction de lADN recombinant
1- Les types dADN donneur: a) ADN gnomique b) ADN complmentaire (ADNc) c) ADN obtenu par synthse chimique 2- Couper lADN donneur et le vecteur laide denzymes de restrictions 3- Relier les molcules dADN (ADN donneur-vecteur) 4- Amplifier chaque ADN recombinant laide de la machinerie bactrienne Cest la dcouverte et la caractrisation des enzymes de restriction qui a permis le dveloppement de la technologie de lADN recombinant. Les enzymes de restriction sont produites par des bactries et agissent comme des ciseaux en coupant lADN au niveau de squences cibles spcifiques. Exemple de coupure laide dEcoRI:
Les enzymes de restriction
Enzymes qui clivent lADN
Reconnaissent des squences nuclotidiques spcifiques 1re enzyme dcouverte chez Haemophilus influenzae en 1970 Diffrentes enzymes sont disponibles commercialement Nomenclature: BamHI B premire lettre du genre bactrien (Bacillus) am lettres de lespce bactrienne (amyloliquefaciens) H reprsente la souche bactrienne (H) I premire enzyme dcouverte chez cette bactrie
Fabrication dun plasmide dADN chimrique
Afin que des extrmits collantes
sassocient pour former une population de molcules chimriques, les squelettes sucre-phosphate doivent tre souds ensemble par lutilisation de lADN ligase qui cre des liaisons phosphodiesters.
Amplifier lADN recombinant
LADN recombinant ligatur pntre dans une cellule bactrienne par transformation. Aprs son entre dans la cellule hte, le vecteur plasmidique est capable de se rpliquer car les plasmides possdent habituellement une origine de rplication. La colonie rsultante de bactries contiendra des milliards de copies de linsert dADN donneur de dpart. Cet ensemble de copies amplifies du fragment unique dADN donneur constitue un clone dADN.
Choisir un vecteur de clonage
1- Les plasmides: Petites molcules circulaires dADN capables de rpliquer leur ADN indpendamment du chromosome bactrien. Servent cloner des fragments dau plus 30 kb. 2- Les vecteurs viraux: Offrent de nombreux avantages pour le clonage et les applications des gnes clons qui en dcoulent. Comme lefficacit dinfection des virus est lev, le gne clon peut tre introduit dans une cellule une frquence leve. Servent cloner des fragments de tailles dfinies. 3- Les cosmides: Vecteurs hybrides de phages lambda et de plasmides. Leur ADN peut se rpliquer dans la cellule comme celui dun plasmide et tre empaquet comme celui dun phage. Servent cloner des fragments dau plus 45 kb. 4- Les vecteurs large capacit: Permettent le clonage de larges fragments (maximum de 300 kb pour les BAC et de 400 kb pour les YAC). BAC: Bacterial artificial chromosome ; et YAC: Yeast artificial chromosome. 5- Les vecteurs dexpression: Permettent le clonage mais aussi lexpression.
Choisir un vecteur de clonage -suite
Diffrents scnarios pour lentre des
molcules recombinantes dans la cellule bactrienne Un clonage dans le phage lambda
Fabrication dune banque dADN
Une banque dADN constitue lensemble des clones obtenu partir dun seul chantillon dADN. Il existe trois types de banques dADN: 1- Banque gnomique: Banque couvrant lensemble du gnome. 2- Banque dADN complmentaire ou ADNc: Banque constitue dADNc, qui ne reprsentent pas ncessairement la totalit des ARNm. Il sagit plutt dune banque fabrique partir uniquement des rgions transcrites du gnome. 3- Banque dexpression: Banque dans laquelle le vecteur porte des signaux transcriptionnels permettant nimporte quel insert clon de produire un ARNm et en dernier lieu, une protine.
Trouver des clones spcifiques laide de sondes
Le criblage dune banque dADN est ralis en utilisant une sonde spcifique qui trouvera et signalera le clone que lon cherche identifier. On peut soit utiliser une sonde dADN ou une sonde qui reconnat les protines si un vecteur dexpression est utilis et si le produit spcifique dun gne (protine) a au pralable t isol sous forme pure, permettant le dveloppement danticorps.
Criblage dune banque dADN phagique
Le criblage destin identifier des acides nucliques spcifiques
Les techniques de transferts de Southern et Northern peuvent galement tre utilise pour dterminer si 1) un individu est porteur du gne ou plus prcisment de lallle qui aura au pralable t clon ou 2) dterminer si le gne en question est exprim sous certaines conditions ltude.
La complmentation fonctionnelle On peut dtecter des clones spcifiques dans une banque bactrienne (plasmidique) ou phagique grce leur capacit restaurer la fonction limine par la mutation rcessive dans un organisme. Cette procdure sappelle la complmentation fonctionnelle ou le sauvetage de mutants.
Construire une banque bactrienne ou phagique contenant
des inserts dADN donneur recombinant de type sauvage a+ Transformer les cellules dune ligne cellulaire mutante a- en utilisant lADN de clones individuels de la banque Identifier les clones de la banque qui produisent des cellules transformes avec le phnotype dominant a+ Rcuprer le gne a+ partir du clone phagique ou bactrien positif
Amplification in vitro laide de la raction de polymrase en chane
Si on connat la squence de certaines parties
du gne ou dun fragment intressant, on peut lamplifier en conditions in vitro dans un tube, tout cela sans clonage. Cette procdure sappelle la raction de polymrase en chane (PCR ou polymerase chain reaction en anglais). tapes de la raction: 1) Dnaturation (95C) tape qui dnature les deux fragments dADN 2) Hybridation (temprature variable) tape o les amorces shybrident leurs squences complmentaires 3) longation (72C) Extension des amorces par lADN polymrase
Applications de la technologie de lADN recombinant
Le fait de disposer dun gne isol sous la forme dun clone (ou obtenu par PCR) ouvre diverses perspectives exprimentales: 1- On peut dterminer la squence dADN de ce gne en utilisant la technique de squenage. 2- On peut muter le gne clon et le rintroduire dans son hte dorigine afin dtudier les proprits fonctionnelles de ce gne. 3- On peut lutiliser comme sonde pour la cartographie ou le diagnostic gntique. 4- On peut introduire le gne clon dans un nouvel hte afin de crer un organisme transgnique (ou gntiquement modifi) que lon naurait pas pu obtenir facilement la suite de procdures standards de croisement.
Dterminer une squence dADN
La squence nuclotidique dun gne reprsente laboutissement de la
caractrisation de sa structure gntique. Pour squencer un ADN, il faut pouvoir en obtenir des fragments dfinis. Il y a donc une forte interdpendance entre la technologie du clonage et celle du squenage.
Le principe du squenage La technique de squenage la plus utilise actuellement a t dveloppe par Fred Sanger. Elle est base sur une synthse dADN en prsence de didsoxynuclotides, qui linverse de dsoxynuclotides normaux, sont dpourvus de groupement hydroxyle en 3.
Squenceurs automatiss Ces appareils ont permis dintensifier les squenages dADN et mme dobtenir la squence de gnomes complets en employant grande chelle des protocoles de squenages robustes haut dbit.
Ajout des 4 ddNTP marqus par un fluorophore diffrent
lectrophorgramme obtenu suite au
squenage automatis
Exprimer des gnes eucaryotes dans des bactries
Les bactries transgniques, contenant un transgne, peuvent tre utilises comme usine de synthse de protines eucaryotes utiles, qui autrement seraient difficiles obtenir. Il existe plusieurs systmes de ce type pour produire en masse des protines trangres. Lun de ces systmes utilise lARN polymrase du phage T7 dont laction sexerce sur un promoteur de T7. Vers la fin de linfection, le phage T7 synthtise de grandes quantits de produits de gne partir de plusieurs sites appels promoteurs tardifs. Les gnes des chromosomes de lhte ntant pas synthtiss ce moment-l, ces produits sont les seules protines synthtises. Pour tirer profit de ce systme, le gne de lARN polymrase de T7 est manipul de faon tre transcrit sous le contrle dun promoteur lac, partir duquel la transcription est normalement inhibe par le rpresseur lac, une protine exerant une rgulation ngative. Toutefois, si on ajoute de lIPTG, un analogue du lactose, le rpresseur est inactiv et de grandes quantits de lARN polymrase de T7 sont synthtises. Dans le second composant du systme, le gne choisi est insr ct du promoteur tardif de T7. LARN polymrase de T7 transcrit alors ce gne en quantit leve.
La technologie de lADN recombinant chez les eucaryotes
Les techniques de manipulation, clonage et expression des gnes ont dabord t dveloppes chez les bactries, mais elles sont dsormais utilises en routine chez de nombreux modles eucaryotes. Le baculovirus des insectes est un vecteur largement employ pour les protines eucaryotes. Des gnes sont insrs dans celui-ci et exprims des frquences levs dans des cellules dinsectes en culture.
Suivre lintroduction dun gne
Lorsque de lADN tranger (provenant de la mme espce ou non) est introduit dans une cellule eucaryote, il peut soit remplacer un gne rsidant, soit subir une insertion ectopique. Une fois introduit, il peut tre difficile de dtecter lactivit dun gne donn. Ce problme peut tre rsolu en mettant sous le contrle dun mme promoteur le gne en question et un autre gne, un gne rapporteur, dont le produit est facilement dcelable. Le gne rapporteur signalera les endroits et les moments auxquels le gne tudi est actif.
Le gnie gntique chez les vgtaux
Le plasmide Ti: Les principaux vecteurs utiliss de faon routinire pour produire des plantes transgniques sont drivs de la bactrie du sol Agrobacterium tumefaciens. Cette bactrie provoque une maladie appele galle du collet au cours de laquelle la plante infecte produit des excroissances incontrles, gnralement la base du collet de la plante. Le responsable de la formation de tumeurs est un grand ADN plasmidique circulaire de 200 kb, le plasmide Ti inducteur de tumeurs.
Le gnie gntique chez les vgtaux
Le gnie gntique chez les animaux
On peut maintenant cloner et manipuler des gnes de champignons, vgtaux et animaux dans des bactries, puis les rintroduire dans la cellule eucaryote, o ils sintgrent gnralement dans lADN chromosomique. Ces recherches ont ouverts la voie la thrapie gnique, soit une approche o un gne fonctionnel est introduit pour remplacer ce mme gne mais qui est dficient chez un receveur. On en distingue deux types, soient la thrapie gnique germinale et la thrapie gnique somatique.
Utilisation de la gntique molculaire pour dtecter
directement les allles responsables des maladies
Lorsque lon peut attribuer une maladie gntique
au changement dun nuclotide spcifique, des sondes oligonuclotidiques synthtiques permettent didentifier ces changement. Une sonde, qui contient la squence de type sauvage, peut tre utilise lors dune analyse par transfert de Southern, pour dterminer si lADN contient la squence de type sauvage ou mutante. La PCR constitue galement un autre outil qui permet de mener bien ce diagnostic grce lutilisation damorces spcifiques qui encadrent le site, puis isolation de cet ADN amplifi et squenage.
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