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Chapitre 10

Lisolement et la manipulation de gnes

Injection dADN tranger dans une


cellule animale

Comment amplifier un gne dintrt?

Amplification in vivo laide du clonage dADN


Lensemble form par un vecteur
et un ou des fragments insrs
est appel ADN recombinant. Le
mlange dADN recombinant est
ensuite utilis pour transformer
des cellules bactriennes. En
gnral, il pntre une seule
molcule de vecteur recombinant
par cellule bactrienne. Ces
cellules sont tales et se
multiplient en formant des
colonies. Par consquent, une
colonie contient une population
trs importante dinserts
identiques dADN, et on appelle
cette population un clone dADN.

La construction de lADN recombinant


1- Les types dADN donneur:
a) ADN gnomique
b) ADN complmentaire (ADNc)
c) ADN obtenu par synthse chimique
2- Couper lADN donneur et le vecteur laide denzymes de restrictions
3- Relier les molcules dADN (ADN donneur-vecteur)
4- Amplifier chaque ADN recombinant laide de la machinerie bactrienne
Cest la dcouverte et la caractrisation des enzymes de restriction qui a
permis le dveloppement de la technologie de lADN recombinant. Les
enzymes de restriction sont produites par des bactries et agissent
comme des ciseaux en coupant lADN au niveau de squences cibles
spcifiques.
Exemple de coupure laide dEcoRI:

Les enzymes de restriction

Enzymes qui clivent lADN


Reconnaissent des squences nuclotidiques spcifiques
1re enzyme dcouverte chez Haemophilus influenzae en 1970
Diffrentes enzymes sont disponibles commercialement
Nomenclature: BamHI
B premire lettre du genre bactrien (Bacillus)
am lettres de lespce bactrienne (amyloliquefaciens)
H reprsente la souche
bactrienne (H)
I premire enzyme
dcouverte chez cette
bactrie

Fabrication dun plasmide dADN chimrique

Afin que des extrmits collantes


sassocient pour former une
population de molcules chimriques,
les squelettes sucre-phosphate
doivent tre souds ensemble par
lutilisation de lADN ligase qui
cre des liaisons phosphodiesters.

Amplifier lADN recombinant


LADN recombinant ligatur pntre
dans une cellule bactrienne par
transformation. Aprs son entre
dans la cellule hte, le vecteur
plasmidique est capable de se
rpliquer car les plasmides
possdent habituellement une
origine de rplication. La colonie
rsultante de bactries contiendra
des milliards de copies de linsert
dADN donneur de dpart. Cet
ensemble de copies amplifies du
fragment unique dADN donneur
constitue un clone dADN.

Choisir un vecteur de clonage


1- Les plasmides: Petites molcules circulaires
dADN capables de rpliquer leur ADN
indpendamment du chromosome bactrien.
Servent cloner des fragments dau plus 30 kb.
2- Les vecteurs viraux: Offrent de nombreux
avantages pour le clonage et les applications
des gnes clons qui en dcoulent. Comme
lefficacit dinfection des virus est lev, le
gne clon peut tre introduit dans une cellule
une frquence leve. Servent cloner des
fragments de tailles dfinies.
3- Les cosmides: Vecteurs hybrides de phages
lambda et de plasmides. Leur ADN peut se
rpliquer dans la cellule comme celui dun
plasmide et tre empaquet comme celui dun
phage. Servent cloner des fragments dau
plus 45 kb.
4- Les vecteurs large capacit: Permettent le
clonage de larges fragments (maximum de 300 kb pour les BAC et de 400 kb pour les YAC).
BAC: Bacterial artificial chromosome ; et YAC: Yeast artificial chromosome.
5- Les vecteurs dexpression: Permettent le clonage mais aussi lexpression.

Choisir un vecteur de clonage -suite

Diffrents scnarios pour lentre des


molcules recombinantes dans la cellule
bactrienne
Un clonage dans le phage lambda

Fabrication dune banque dADN


Une banque dADN constitue lensemble des
clones obtenu partir dun seul chantillon
dADN. Il existe trois types de banques
dADN:
1- Banque gnomique: Banque couvrant
lensemble du gnome.
2- Banque dADN complmentaire ou ADNc:
Banque constitue dADNc, qui ne
reprsentent pas ncessairement la totalit
des ARNm. Il sagit plutt dune banque
fabrique partir uniquement des rgions
transcrites du gnome.
3- Banque dexpression: Banque dans
laquelle le vecteur porte des signaux
transcriptionnels permettant nimporte
quel insert clon de produire un ARNm et en
dernier lieu, une protine.

Trouver des clones spcifiques laide de sondes


Le criblage dune banque
dADN est ralis en utilisant
une sonde spcifique qui
trouvera et signalera le clone
que lon cherche identifier. On
peut soit utiliser une sonde
dADN ou une sonde qui
reconnat les protines si un
vecteur dexpression est utilis
et si le produit spcifique dun
gne (protine) a au pralable
t isol sous forme pure,
permettant le dveloppement
danticorps.

Criblage dune banque dADN phagique

Le criblage destin identifier des acides nucliques spcifiques


Les techniques de transferts de
Southern et Northern peuvent
galement tre utilise pour
dterminer si 1) un individu est
porteur du gne ou plus
prcisment de lallle qui aura
au pralable t clon ou 2)
dterminer si le gne en question
est exprim sous certaines
conditions ltude.

La complmentation fonctionnelle
On peut dtecter des clones spcifiques dans une banque bactrienne
(plasmidique) ou phagique grce leur capacit restaurer la fonction
limine par la mutation rcessive dans un organisme. Cette procdure
sappelle la complmentation fonctionnelle ou le sauvetage de mutants.

Construire une banque bactrienne ou phagique contenant


des inserts dADN donneur recombinant de type sauvage a+
Transformer les cellules dune ligne cellulaire
mutante a- en utilisant lADN de clones individuels de la banque
Identifier les clones de la banque qui produisent des cellules
transformes avec le phnotype dominant a+
Rcuprer le gne a+ partir du clone phagique ou bactrien positif

Amplification in vitro laide de la raction de polymrase en chane

Si on connat la squence de certaines parties


du gne ou dun fragment intressant, on
peut lamplifier en conditions in vitro dans un tube,
tout cela sans clonage. Cette procdure sappelle
la raction de polymrase en chane (PCR ou
polymerase chain reaction en anglais).
tapes de la raction:
1) Dnaturation (95C)
tape qui dnature les deux fragments dADN
2) Hybridation (temprature variable)
tape o les amorces shybrident leurs
squences complmentaires
3) longation (72C)
Extension des amorces par lADN polymrase

Applications de la technologie de lADN recombinant


Le fait de disposer dun gne isol sous la forme dun clone (ou obtenu par PCR)
ouvre diverses perspectives exprimentales:
1- On peut dterminer la squence dADN de ce gne en utilisant la technique
de squenage.
2- On peut muter le gne clon et le rintroduire dans son hte dorigine afin
dtudier les proprits fonctionnelles de ce gne.
3- On peut lutiliser comme sonde pour la cartographie ou le diagnostic gntique.
4- On peut introduire le gne clon dans un nouvel hte afin de crer un
organisme transgnique (ou gntiquement modifi) que lon naurait pas pu
obtenir facilement la suite de procdures standards de croisement.

Dterminer une squence dADN

La squence nuclotidique dun gne reprsente laboutissement de la


caractrisation de sa structure gntique. Pour squencer un ADN, il faut
pouvoir en obtenir des fragments dfinis. Il y a donc une forte interdpendance
entre la technologie du clonage et celle du squenage.

Le principe du squenage
La technique de squenage la
plus utilise actuellement a t
dveloppe par Fred Sanger.
Elle est base sur une synthse
dADN en prsence de
didsoxynuclotides, qui
linverse de dsoxynuclotides
normaux, sont dpourvus de
groupement hydroxyle en 3.

Squenceurs automatiss
Ces appareils ont permis dintensifier les squenages dADN et mme dobtenir
la squence de gnomes complets en employant grande chelle des protocoles
de squenages robustes haut dbit.

Ajout des 4 ddNTP marqus par un fluorophore diffrent

lectrophorgramme obtenu suite au


squenage automatis

Exprimer des gnes eucaryotes dans des bactries


Les bactries transgniques, contenant un transgne, peuvent tre utilises
comme usine de synthse de protines eucaryotes utiles, qui autrement
seraient difficiles obtenir. Il existe plusieurs systmes de ce type pour
produire en masse des protines trangres.
Lun de ces systmes utilise lARN polymrase
du phage T7 dont laction sexerce sur un
promoteur de T7. Vers la fin de linfection, le
phage T7 synthtise de grandes quantits de
produits de gne partir de plusieurs sites
appels promoteurs tardifs. Les gnes des
chromosomes de lhte ntant pas synthtiss
ce moment-l, ces produits sont les seules
protines synthtises. Pour tirer profit de ce
systme, le gne de lARN polymrase de T7
est manipul de faon tre transcrit sous le
contrle dun promoteur lac, partir duquel la transcription est normalement inhibe par le
rpresseur lac, une protine exerant une rgulation ngative. Toutefois, si on ajoute de
lIPTG, un analogue du lactose, le rpresseur est inactiv et de grandes quantits de lARN
polymrase de T7 sont synthtises. Dans le second composant du systme, le gne choisi
est insr ct du promoteur tardif de T7. LARN polymrase de T7 transcrit alors ce gne
en quantit leve.

La technologie de lADN recombinant chez les eucaryotes


Les techniques de manipulation,
clonage et expression des gnes
ont dabord t dveloppes chez
les bactries, mais elles sont
dsormais utilises en routine
chez de nombreux modles
eucaryotes. Le baculovirus des
insectes est un vecteur largement
employ pour les protines
eucaryotes. Des gnes sont
insrs dans celui-ci et exprims
des frquences levs dans
des cellules dinsectes en culture.

Suivre lintroduction dun gne


Lorsque de lADN tranger (provenant de la mme espce ou non) est introduit
dans une cellule eucaryote, il peut soit remplacer un gne rsidant, soit subir
une insertion ectopique. Une fois introduit, il peut tre difficile de dtecter lactivit
dun gne donn. Ce problme peut tre rsolu en mettant sous le contrle dun
mme promoteur le gne en question et un autre gne, un gne rapporteur, dont le
produit est facilement dcelable. Le gne rapporteur signalera les endroits et les
moments auxquels le gne tudi est actif.

Le gnie gntique chez les vgtaux


Le plasmide Ti: Les principaux vecteurs utiliss de faon routinire pour produire
des plantes transgniques sont drivs de la bactrie du sol Agrobacterium
tumefaciens. Cette bactrie provoque une maladie appele galle du collet au
cours de laquelle la plante infecte produit des excroissances incontrles,
gnralement la base du collet de la plante. Le responsable de la formation
de tumeurs est un grand ADN plasmidique circulaire de 200 kb, le plasmide
Ti inducteur de tumeurs.

Le gnie gntique chez les vgtaux

Le gnie gntique chez les animaux


On peut maintenant cloner et manipuler des gnes
de champignons, vgtaux et animaux dans des
bactries, puis les rintroduire dans la cellule
eucaryote, o ils sintgrent
gnralement dans lADN
chromosomique. Ces
recherches ont ouverts
la voie la thrapie
gnique, soit une approche
o un gne fonctionnel est
introduit pour remplacer ce
mme gne mais qui est
dficient chez un receveur.
On en distingue deux types,
soient la thrapie gnique
germinale et la thrapie
gnique somatique.

Utilisation de la gntique molculaire pour dtecter


directement les allles responsables des maladies

Lorsque lon peut attribuer une maladie gntique


au changement dun nuclotide spcifique, des
sondes oligonuclotidiques synthtiques
permettent didentifier ces changement. Une
sonde, qui contient la squence de type sauvage,
peut tre utilise lors dune analyse par transfert
de Southern, pour dterminer si lADN contient
la squence de type sauvage ou mutante. La PCR
constitue galement un autre outil qui permet de
mener bien ce diagnostic grce lutilisation
damorces spcifiques qui encadrent le site, puis
isolation de cet ADN amplifi et squenage.

Quelques maladies gntiques courantes