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Departamento de Bioqumica y Biologa

Molecular
Unidad de Bioqumica, Facultad de Medicina

Regulacin de la plasticidad
astrocitaria por ibuprofeno y
FGF2
Mathieu Lichtenstein

TESIS DOCTORAL

Belleterra Junio 2011

Departamento de Bioqumica y Biologa


Molecular
Unidad de Bioqumica, Facultad de Medicina

Memoria de tesis doctoral presentada por Mathieu Lichtenstein para


optar al ttulo de doctor por la Universidad Autnoma de Barcelona.

Trabajo realizado en la Unidad de Bioqumica de la Facultad de


Medicina, del Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular
bajo la direccin de la Dra Elena Galea Rodrguez de Velasco.

Proyecto subvencionado por la Fundaci Marat de TV3 y Ministerio


de Ciencia e Innovacin

Bellaterra, 9 de Mayo de 2011

Doctorando

Director de Tesis

Mathieu Lichtenstein

Elena Galea

A mi madre, mis hermanos,


a Paco,
mis abuelos Marie et Robert, Jacqueline et Paul
y a todo el resto de la famila.

NDICE

I.

ndice ...................................................................... 1

II.

Abreviaturas............................................................ 5

III.

Resumen.................................................................. 7

IV.

Introduccin .......................................................... 11

1. Los astrocitos son un tipo celular altamente plstico y


polivalente
1.1... Morfologa y tipos de astrocitos.........................................12
1.2

Fisiologa astrocitaria..........................................................13
Soporte neuronal
Gliotransmisin y participacin a
la sinapsis tripartita
Regulacin de los niveles sinpticos
de glutamato
Acoplamiento neurovascular

2. Participacin de los astrocitos en la neuroinflamacin


2.1 Conceptos generales sobre la
inflamacin cerebral .............................................................19

2.2 Privilegio inmune del SNC......................................................19


2.3

La clulas gliales participan en


la inmunidad innata del SNC ..............................................20

2.4 Los astrocitos en la inmunidad innata ..................................22


MCP1
ICAM1
COX2

2.5

Migracin astrocitaria.........................................................29

2.6... Rho-GTPasas .......................................................................31


1

NDICE

3. FGF2 en la plasticidad astrocitaria


3.1 Recpetores de FGF..................................................................34
3.2 Funciones generales de los FGF ...........................................36
3.3 FGF2 .........................................................................................38
Descubrimiento y primeros trabajos
Estructura del FGF2
Secrecin del FGF2

3.4 FGF2 en el SNC........................................................................41


Control de la expresin de FGF2
Funciones de FGF2 en el SNC

3.5 Papel del FGF2 en la inflamacin cerebral ...........................48


4. Efecto protector de los antiinflamatorios no esteroideos sobre la
aparicin de la enfermedad de Alzheimer.
4.1 Etiologia y patologa de la enfermedad
de Alzheimer ...........................................................................50

4.2 Fases de la enfermedad de Alzheimer ..................................54


4.3 Tratamientos ............................................................................54
4.4

V.

Efecto protector de los AINES sobre la AD

Objetivos ................................................................... 59

VI. Materiales y mtodos ............................................... 61


1. Material biolgico
1.1 Cultivos primarios de astrocitos

1.2

Tratamiento farmacolgico de las clulas en cultivo

1.3

Infecciones virales

2. Mtodos bioqumicos
2.1 PCR en tiempo real

2.2

Fraccionamiento subcelular
2

NDICE

2.3

Western Blot

2.4

EMSA

2.5

ELISA para la deteccin de ICAM

2.6

ELISA para la deteccin de MCP

2.7

G-LISA

3. Mtodos de biologa celular


3.1 Inmunofluorescencia

3.2
4.

Ensayos de migracin

Mtodos estadsticos

VII.

Resultados .............................................................. 71

1. Captulo 1: JNK/ERK/FAK mediate pro-migratory actions of


basic fibroblast growth factor in astrocytes via MCP1 and
COX2 ............................................................................ 72
2. Captulo 2: Secretase-independent and RhoGTPase/PAK/
ERK-dependent regulation of cytoskeleton dynamics in
astrocytes by NSAIDs and derivatives. ............................... 110

VIII. Discusin
1. Inflamacin cerebral como diana teraputica en enfermedades
neurodegenerativa........................................................ 141
2. Nuevo papel de las cascadas de quinasas en la sealizacin
inflamatoria ................................................................... 144
2.1 Sealizacin inflamtoria por FGF2
2.2

Regulacin de las kinasas PAK y ERK por los profenos

3. Nuevo papel de las RhoGTPasas en la sealizacin


inflamatoria ................................................................... 153
3.1 Dianas de los AINES en astrocitos
3.2

Nuevo papel de las RhoGTPasas en la sealizacin inflamatoria


3

NDICE

4. Nuevo papel de la migracin en la respuesta


Inflamatoria................................................................... 156
4.1 FGF2 promueve la migracin astrocitaria
4.2

Los profenos en la migracin astrocitaria

5. Conclusiones y valor teraputico ................................ 165


5.1 FGF2
5.2

AINES

IX. Conclusiones ............................................................. 168


X. Otras publicaciones................................................... 171
1. Staging anti-inflammatory therapy in Alzheimer's disease.

XI. Bibliografa .................................................................178

ABREVIATURAS

AD

Alzheimers disease

AINEs

Anti-inflamatorios no esteroideos

APP

Amyloid precursor protein

ATP

Adenosina trifosfato

Pptido -amiloide

BHE

Barrera hemato-enceflica

cAMP

AMP cclico

COX

Ciclooxigenasa

CREB

cAMP-response element binding

CSPG

Chondroitin-sulfate proteoglycan

EAATs

Excitatory aminoacid transporters

ELISA

Enzyme-linked inmunoassay

ERK

Extracelular response kinase

FAK

Focal adhesion kinase

FGF

Fibroblast growth factor

FGFR

Fibroblast growth factor receptor

FRS2

Fibroblast growth factor receptor substrate

GLAST

Glutamate/Aspartate transporter

GPCR

G-coupled protein receptor

GTP

Guanidina trifosfato

HSPG

Heparan-sulfate proteoglycan

ICAM

Intercelular adhesion molecule

IFN

Interfern

IL

Interleuquina

IP3

Inositol trifosfato

JNK

c-Jun N-terminal kinase

ABREVIATURAS

LPA

cido lipofosfatdico

LPS

Lipopolisacrido

MAPK

Mitogen-activated protein kinase

MCP

Monocyte chemoatractant protein

MS

Multiple sclerosis

NF-kB

Nuclear factor kB

PAK

p21-activated kinase

PCR

Polymerase chain reaction

PD

Parkinsons disease

ROCK

Rho kinase

SNC

Sistema nervioso central

TNF

Tumor necrosis factor

VCAM

Vascular adhesion molecule

WB

Western Blot

Resumem

RESUMEN

OBJETIVO GENERAL: Los astrocitos, el tipo celular ms abundante en el sistema


nervioso central (SNC) desempean un papel clave en la homeostasis, la
neurotransmisin y, como tema central en esta tesis, en la neuroinflamacin, es decir,
el conjunto de reacciones del cerebro al trauma, las infecciones virales o bacterianas,
o la neurodegeneracin. El astrocito es extremadamente plstico, respondiendo a un
amplio repertorio de estmulos fisiolgicos o insultos patolgicos con cambios
morfolgicos, migracin, o cambios funcionales por modificacin de su expresin
gnica. El objetivo de esta tesis ha sido estudiar la plasticidad astrocitaria en dos
paradigmas distintos relacionados con la neuroinflamacin. En el primer bloque hemos
estudiado el efecto de un factor trfico de especial importancia en el SNC, el Factor
Bsico de Fibroblastos, o FGF2, en la expresin de genes inflamatorios astrocitarios.
El FGF2 es un factor de crecimiento cuya expresin en el SNC adulto es muy alta,
localizada principalmente en astrocitos, y que se regula a la alza en condiciones
patolgicas como el Alzheimer- alrededor de la placas de amiloide- o el ictus. As
como las propiedades trficas del FGF2, y su papel en el desarrollo del cerebro, son
ampliamente conocidos, su papel en la respuesta inflamatoria est pobremente
caracterizado. En el segundo bloque hemos analizado la capacidad de frmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINES) como el ibuprofeno y derivados (R-flurbiprofeno y
CHF5074) los cuales, segn estudios epidemiolgicos, reducen la aparicin de la
enfermedad de Alzheimer, de modular la dinmica del citoesqueleto de actina
astrocitario.

METODOS/MODELOS: Modelo de inflamacin (LPS o scratch-wound en cultivos


primarios de astrocitos. Estudio expresion molculas: RTPCR, Western Blot,
inmunocitoqumica,

ELISAS,

GLISAS.

Manipulacin

mecanstica:

inhibidores

farmacolgicos, sobreexpresin de protenas mutantes dominantes negativos o


constitutivamente activos.

RESULTADOS: En los cultivos primarios mostramos que FGF2 modula de una


manera bifsica la respuesta inflamatoria inducida por LPS aumentando en estados
iniciales la expresin de genes inflamatorios como el de la quimocina MCP1, mientras
que potencia su regulacin a la baja e inhibe la expresin de ICAM1 en estados ms
avanzados. Esta regulacin es dependiente de las vas de sealizacin de ERK, JNK
y FAK a travs de la activacin del receptor FGFR2 pero independiente del factor de
trasncripcin NF-kB. Mostramos tambin que el tratamiento de astrocitos con
ibuprofeno y derivados produce un rpido cambio morfolgico caracterizado por una
retraccin del soma y emisin de procesos dependiente de la modulacin de las
8

RESUMEN

protenas Rho-GTPasas RhoA, Rac1 y cdc42 e independiente de las diana clsica de


los antiinflamatorios las ciclooxigenasas (COX2). Este fenotipo resulta en una
capacidad migratoria acelerada en el caso del ibuprofeno o inhibida en el caso del RFlurbiprofeno y CHF5074.

CONCLUSIONES: Los resultados expuestos en esta tesis demuestran el papel


inmunomodulador del FGF2 en la respuesta inflamatoria astrocitaria. Especulamos
que el carcter bifsico de la respuesta permite los efectos beneficiosos de la
inflamacin pero evitando su cronificacin. Adems mostramos que los profenos son
capaces de promover la aparicin de fenmenos plsticos en astrocitos a travs de la
modulacin de nuevas dianas como las Rho-GTPasas, abriendo nuevas perspectivas
en la terapia de enfermedades neurodegenerativas en las que los astrocitos estn
implicados.

RESUMEN

10

Introduccin

INTRODUCCIN

1. Los astrocitos son un tipo celular altamente plstico y


polivalente.
1.1 Morfologa y tipos de astrocitos
Los astrocitos, representan un 90% del total de clulas del SNC (Sistema Nervioso
Central) y son una poblacin diversa, siendo su presencia ms abundante en reas
cerebrales determinadas como el hipocampo o el cerebelo (Norenberg, 1979). In vivo,
presentan una morfologa estrellada, extendiendo desde el soma numerosos procesos
que rodean a las neuronas vecinas y contactan con los microvasos cerebrales
(Nedergaard et al., 2003). Estos procesos, altamente ramificados, se caracterizan por
la presencia de la protena glial acdica fibrilar (GFAP) que se utiliza muy a menudo
como marcador de astrocitos. Poseen una morfologa altamente compleja y
heterognea, y cada uno de ellos ocupa compartimentos o territorios bien definidos
que apenas solapan con el de los astrocitos vecinos (Bushong et al., 2002;Wang and
Bordey, 2008), con los que est conectado a travs de canales tipo gap junction
formando un sincitio funcional (Konietzko and Muller, 1994). Las gap junctions,
formadas por protenas de la familia de las conexinas, son permeables a molculas
cargadas y permiten el flujo de sustratos energticos desde los vasos hasta las
neuronas que se hallan en el territorio de un astrocito (Simard et al., 2003)
Histricamente se ha dividido a los astrocitos en dos grupos atendiendo a su
morfologa y ubicacin. As, los astrocitos protoplasmticos, localizados en la materia
gris cerebral, presentan muchos procesos ramificados que contactan sinapsis y vasos
cerebrales (Frederickson and Silver, 1991), mientras que los astrocitos fibrosos se
localizan en la materia blanca y poseen menos procesos, ms largos y sin ramificar,
que contactan con los ndulos de Ranvier (Wang and Bordey, 2008). Esta clasificacin
puede considerarse actualmente simplista ya que dos astrocitos adyacentes y de
morfologa comparable pueden tener perfiles de expresin muy diferentes. Estudios de
expresin por microarrays demuestran que en realidad hay pocos genes que se
expresen especficamente en todos los astrocitos, y que se producen patrones de
expresin dependientes de la localizacin celular (Bachoo et al., 2004).
A grandes rasgos, los astrocitos presentan un soma relativamente pequeo de 7-9 m
desde donde extienden entre cinco a ocho procesos principales que se ramifican
uniformemente en pequeos apndices distribuidos uniformemente que se infiltran en
la intrincada red neuronal incluyendo terminales sinpticos, dendritas y espinas
dendrticas en un volumen que puede llegar a ocupar 66000 m3. Esta morfologa les
12

INTRODUCCIN

permite interaccionar con la mayora de tipos celulares del SNC. En este sentido, se
considera que el 99% de la microvasculatura cerebral est cubierta por pies
astrocitarios (Kacem et al., 1998) y que en el dominio de un solo astrocito en corteza o
hipocampo de un roedor se pueden localizar hasta 105 sinapsis (Bushong et al., 2002),
Alaza et al 2007), un valor que en humanos resulta superior, hasta el punto que se ha
propuesto que una caracterstica del cerebro humanos en relacin al de otros
mamferos, es su complejidad astrocitaria (Oberheim et al., 2009).
Se puede considerar a los astrocitos como unidades de integracin local de la
informacin sinptica y no-sinptica de la microregin que cubre cada uno de ellos. La
membrana plasmtica de los astrocitos contiene microdominios especficos que origina
seales intracelulares que pueden propagarse en estos dominios sin afectar la
totalidad de la clula, permitiendo el control por fracciones de territorio dominados por
un astrocito de manera independiente (Wang and Bordey, 2008).
Es importante destacar que todas estas observaciones sobre la morfologa astrocitaria
realizadas in vivo, no se reproducen en cultivos puros de astrocitos in vitro. En efecto,
la mayora de protocolos para conseguir este tipo celular en cultivo da como resultado
monocapas confluentes de astrocitos de morfologa epitelioide (plana y poligonal) que
no reproducen su morfologa original in vivo (McCarthy and de, 1980;Won and Oh,
2000). sta se consigue al tratar las clulas con diferentes factores como el cAMP
(Won and Oh, 2000) algunos neurotransmisores como la noradrenalina (Shao et al.,
1994) o el ATP (Neary et al., 1994) y con factores de crecimiento como el EGF o el
FGF2 (Heffron and Mandell, 2005). Tambin la presencia de neuronas en co-cultivos
de neuronas-astrocitos, genera en estos ltimos una morfologa estrellada. Estas
observaciones denotan que probablemente la compleja morfologa estrellada de los
astrocitos in vivo, depende de numerosos factores, entre ellos el entorno en el que se
encuentren.

1.2 Fisiologa astrocitaria


1.2.1 Soporte neuronal
Se han descrito numerosas funciones esenciales para los astrocitos, especialmente
aquellas relacionadas con el correcto funcionamiento de las neuronas y de la
transmisin neuronal. Ambos tipos celulares comparten varias funciones sobre todo
en el terreno metablico, aunque los astrocitos estn a menudo mejor posicionados
que las neuronas, poseen mecanismos ms eficientes y disponen de reservas

13

INTRODUCCIN

energticas mayores para realizarlas (Fuller et al., 2009). Entre estas funciones de
soporte estructural y metablico las ms importantes son:
-

Soporte metablico a neuronas, captando glucosa desde los microvasos y


transformndola a lactato mediante la gliclisis, que al ser liberado al medio
extracelular constituye el principal sustrato energtico para las neuronas
(Tekkok et al., 2005;Pellerin, 2005). Adems los astrocitos son las nicas
clulas del SNC capaces de almacenar reservas de glucosa en forma de
glucgeno,

las

cuales

pueden

movilizarse

en

respuesta

algunos

neurotransmisores (Brunet et al., 2010;Gavillet et al., 2008)


-

Regulacin de la concentracin extracelular de iones. La actividad


neuronal, es decir, la generacin de impulsos nerviosos entre neuronas, genera
en el espacio extracelular un gran aumento en las concentraciones de K+ y de
protones (resultado del metabolismo del piruvato por parte de las neuronas). La
acumulacin de estos productos, en altas concentraciones, dificultan el
correcto funcionamiento de la actividad neuronal. Los astrocitos disponen de
canales que permiten recaptar especficamente estos iones, y trasladarlos a
zonas donde su concentracin es menor, o directamente al torrente sanguneo
(revisado en Simard and Nedergaard, 2004)

Sntesis y liberacin de glutatin. El glutatin es un tripptido que en el SNC


es principalmente sintetizado por los astrocitos, y tiene varias funciones
esenciales como antioxidante frente a las especies reactivas de oxgeno, pero
tambin como cofactor en procesos de sntesis de protenas y cidos
nucleicos. Los astrocitos liberan el dipptido CysGly, precursor del glutatin,
que puede ser recaptado por las neuronas (revisado en Dringen and Hirrlinger,
2003).

1.2.2 Gliotransmisin y participacin a la sinapsis tripartita


El hecho de que no sean clulas excitables elctricamente llev a la conclusin
incorrecta de que los astrocitos eran elementos pasivos en la neurotransmisin. Los
astrocitos expresan en sus membranas receptores acoplados a protena G, (GPCRs)
que les permiten responder a neurotransmisores. Este descubrimiento, all en los 70
(McCarthy and de, 1978;van et al., 1978) puso de manifiesto que poda responder a
estmulos extracelulares que se pensaba que eran dirigidos exclusivamente a las
14

INTRODUCCIN

neuronas. A travs de la estimulacin de estos receptores se desencadenan vas de


sealizacin, entre ellas la de calcio y el cAMP, que permiten a los astrocitos
comunicarse entre ellos y con otras clulas vecinas. Hasta entonces la visin
predominante era que los astrocitos eran clulas elctricamente silentes y por lo tanto
no participaban en la neurotransmisin. El descubrimiento de que los astrocitos
respondan a estmulos extracelulares mediante fluctuaciones de Ca2+ puso de
maifiesto que se trataba de clulas excitables, aunque esta excitabilidad no dependa
de potenciales de accin y que existe un sistema de comunicacin neurona-astocito
que permite ligar la actividad neuronal con las ondas de Ca2+ astrocitarias (Agulhon et
al., 2008). Actualmente se sabe que astrocitos expresan una batera de receptores
para

la

mayora

de

sustancia

neuroactivas

incluyendo

neurotransmisores,

neuropptidos, factores de crecimiento y citoquinas, que les permiten responder a


estmulos a los que tambin responden las neuronas.
La va molecular ms estudiada en la elevacin del calcio citoslocio es la de la
PLC/IP3. Tras la activacin de los GPCRs, la formacin del segundo mensajero IP3, y
su subsiguiente unin a receptores IP3R, permite la liberacin de Ca2+ del retculo
endoplasmtico (aunque existen otros almacenes de calcio intracelular). Las
oscilaciones de calcio pueden ser muy variables, segn su amplitud, duracin y
frecuencia. Segn estos parmetros afectarn nicamente un microdominio del
astrocito, o se propagarn por toda la clula afectando incluso las clulas vecinas. As,
los astrocitos son clulas capaces de discriminar estmulos de diversos orgenes e
integrar seales concomitantes (Fiacco et al., 2009;Petravicz et al., 2008). Se han
descrito tambin oscilaciones de Ca2+ espontneas, es decir independientes de
seales neuronales. Estas oscilaciones se observan in vivo y podran depender de
canales de calcio dependientes de voltaje (Parri and Crunelli, 2003).
Diversos estudios han puesto de manifiesto que las seales de Ca2+ pueden
propagarse de un astrocito a otro recorriendo distancias relativamente largas. Esto
descubrimientos in vitro, por estimulacin elctrica, mecnica o qumica, han dado a
pensar que puede existir una red de comunicacin entre astrocitos (Sul et al., 2004).
No obstante no queda claro si este fenmeno se reproduce en condiciones
fisiolgicas. Estudios in vivo muestran que en respuesta a estmulos fisiolgicos no se
generan ondas de Ca2+ que viajen de una zona a otra. Ms bien se observa que cada
uno de los astrocitos estimulados responde de manera ms bien independiente
(Schummers et al., 2008). Existen dos modelos que podran explicar cmo las seales
de calcio se propagan de una clula a otra. Intracelularmente el IP3 generado en
15

INTRODUCCIN

respuesta a una seal extracelular puede difundir a travs de las gap-junctions que
unen a los astrocitos entre ellos (Newman, 2001) Extracelularmente, la elevacin del
calcio intracelular puede promover la liberacin de factores como el ATP, que a su vez
podran excitar a las clulas vecinas (Innocenti et al., 2000).
La sealizacin por Ca2+ en algunos casos promueve la rpida liberacin de los
denominados gliotransmisores, molculas provenientes del astrocito que son activas in
situ sobre neuronas pre- y post-sinpticas modulando su actividad, como el glutamato,
la D-Serina, el ATP, algunas prostaglandinas y el TNF-, revisado en (Halassa et al.,
2007). Todos estos descubrimientos han colocado a los astrocitos en un puesto muy
activo en la neurotransmisin, aadiendo un nuevo elemento, la glia perisinptica, en
el tradicional modelo de la sinapsis formada por las neuronas pre- y postsinpticas.
Este nuevo modelo recibe el nombre de sinapsis tripartita y es sujeto de un activo
debate en la actualidad (Perea et al., 2009).
1.2.3 Regulacin de los niveles sinpticos de glutamato.
El glutamato es considerado como el principal neurotransmisor excitador en el SNC y
est involucrado en la mayora de procesos que conforman el funcionamiento normal
del SNC como la cognicin, la memoria y el aprendizaje. Aproximadamente el 90% de
las neuronas liberan glutamato al ser excitadas. ste es liberado al espacio sinptico
por exocitosis de las vesculas que lo contienen, donde difunde hasta unirse a sus
receptores en la membrana post-sinptica. Para permitir una sealizacin sinptica
fina, el glutamato sobrante debe ser retirado rpidamente del espacio sinptico
(Danbolt, 2001).
Adems, el glutamato es una potente neurotoxina, y la excitoxicidad producida por
glutamato participa en numerosas patologas del SNC. Altas concentraciones
extracelulares de este neurotransmisor producen una sobrestimulacin de las
neuronas, que provoca daos en stas y que pueden llevar a su muerte, bien por una
va rpida dependiente de Ca2+, bien por apoptosis como ocurre en enfermedades
neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (AD).
El glutamato liberado al espacio intersinptico es rpidamente recaptado por los
astrocitos circundantes, terminando as su funcin neurotransmisora y evitando la
sobrestimulacin neuronal. La recaptacin se lleva a trmino mediante transportadores
especficos para glutamato presentes en la membrana de los astrocitos, siendo los
principales EAAT1 (GLT1) y EAAT2 (GLAST1). El glutamato recaptado es
16

INTRODUCCIN

transformado a glutamina, a travs de la glutamina sintasa, enzima de expresin


localizada principalmente en astrocitos, y se libera al medio donde es recaptada de
nuevo por las neuronas. El glutamato es recaptado por los EAATs astrocitarios juntos
con tres iones Na+, produciendo una aumento intracelular en la concentracin de este
in. Para reducirla, los astrocitos utilizan la ATPasa Na+/K+, provocando una demanda
energtica en estas clulas que como consecuencia activan las vas de la gliclisis.
Este aumento intracelular de los niveles de Na+ a causa de la recaptacin de
glutamato sirve como un sistema integrador entre la actividad neuronal con la
utilizacin de glucosa y confiere a los astrocitos un nivel adicional de control sobre la
actividad sinptica (Magistretti et al., 1999;Azarias et al., 2011;Danbolt, 2001).

Figura1.Metabolismodelarecaptacindelglutamatoenlasinapsisglutamatrgica.De

Magistrettietal,1999
En esta lnea, la recaptacin de glutamato es un proceso dinmico y se incrementa
durante la actividad neuronal, incluyendo la potenciacin a largo trmino (LTP).
Descubrimientos recientes han demostrado que la expresin de los EAATs son
regulados a nivel de la sinapsis por la interaccin neurona-astrocito mediante el
sistema de sealizacin de las efrinas. En el rea CA1 del hipocampo la presencia del
receptor de efrina A4 en la neurona post-sinptica, a travs de su interaccin con su
ligando, la efrina A3, que se encuentra expresada en los procesos astrocitarios peri17

INTRODUCCIN

sinppticos, disminuye la expresin de los EAATs gliales (Carmona et al., 2009) y es


capaz de modular la LTP (Filosa et al., 2009). La sealizacin ephrin-A3/EphA4
modula tambin la longitud y morfologa de las espinas dendrticas (Murai et al., 2003).
En resumen, esta va de sealizacin controla bidireccionalmente la funcin sinptica y
el transporte de glutamato, incidiendo directamente en la funcin hipocampal, una
evidencia adicional sobre la participacin de los astrocitos en la transmisin sinptica.
Se ha mostrado que la regulacin dinmica de los EAATs participa en procesos de
aprendizaje. En ratas sometidas al test del laberinto acutico de Morris, se ha
observado una disminucin en los niveles de expresin en hipocampo de GLAST y
EAAC1 (transportador de glutamato neuronal). Los autores proponen que esta
disminucin en las primeras fases del aprendizaje espacial podra permitir una
transmisin sinptica glutamatrgica de mayor intensidad durante las fases crticas del
aprendizaje (Fraticelli-Torres et al., 2010).
1.2.4 Acoplamiento neurovascular
A travs de la interaccin con las clulas endoteliales los astrocitos controlan tambin
la formacin de la barrera hematoenceflica (Abbott et al., 2006), y son capaces de
regular el flujo sanguneo cerebral. El control del flujo sanguneo cerebral (CBF) es
vital para mantener el aporte energtico necesario para el funcionamiento neuronal
correcto.

Descubrimientos

recientes

muestran

que

los

astrocitos

participan

directamente en el control del CBF, permitiendo acoplar las demandas energticas de


las neuronas de un rea con alta actividad neuronal con un incremento en el flujo
sanguneo. Este nivel de control parece depender de la gliotransmisin dependiente
de Ca2+ que conlleva variaciones en el tono arteriolar en una zona determinada. As, la
elevacin de la concetracin de Ca2+

intracelular conlleva a la formacin de la

prostaglandina PGE2 capaz de producir vasodilatacin en los capilares cerebrales


(Mulligan and MacVicar, 2004).

18

INTRODUCCIN

2. Participacin de los astrocitos a la neuroinflamacin


2.1 Conceptos generales sobre la inflamacin cerebral
La inflamacin es una reaccin de defensa de los tejidos destinada a neutralizar
estmulos

perjudiciales

restaurar

la

integridad

tisular.

En

enfermedades

neurodegenerativas la inflamacin tiene lugar como una respuesta local conducida por
las clulas gliales y el endotelio cerebral.
De una manera simplista, segn su duracin en el tiempo la neuroinflamacin puede
clasificarse en aguda o crnica. La inflamacin aguda consta de las reacciones
inmediatas de las clulas gliales a un dao, y es bsicamente un proceso defensivo
que prepara el terreno para la reparacin del rea lesionada. La inflamacin crnica es
caracterstica de las enfermedades neurodegenerativas en las que existe un estmulo
que persiste en el tiempo y se caracteriza por una activacin glial sostenida (Streit et
al., 2004) y en algunos casos, como en la esclerosis mltiple, por la acumulacin de
leucocitos en el parnquima cerebral. Bioqumicamente, el grado de activacin viene
determinado por el espectro de mediadores inflamatorios generados por las clulas
gliales. Este espectro incluye prostaglandinas, protenas del complemento, citoquinas,
quimiocinas, proteasas, molculas de adhesin y radicales libres (McGeer and
McGeer, 2004).
2.2. Privilegio inmune del SNC
El sistema nervioso central (SNC) presenta particularidades en cuanto a la respuesta
inflamatoria respecto a la inflamacin sistmica. La magnitud de las respuestas
inflamatorias en el parnquima cerebral es menor comparada con la de otros tejidos,
fenmeno conocido como privilegio inmune del cerebro (Matyszak, 1998). Esta menor
reactividad inflamatoria est basada en la existencia de la barrera hematoenceflica
(Pachter et al., 2003) y en la presencia de molculas endgenas con propiedades antiinflamatorias como la noradrenalina (Frohman et al., 1988;Feinstein et al., 2002;Galea
et al., 2003a).
1. La barrera hematoenceflica (BHE) representa una especializacin del endotelio
cerebral que se caracteriza por una densa red de uniones estrechas entre clulas
endoteliales y la presencia de numerosos procesos astrocitarios que se encuentran
rodeando los vasos cerebrales. Estas caractersticas confieren a la BHE la capacidad

19

INTRODUCCIN

de restringir el acceso de clulas inmunes y sustancias potencialmente nocivas de la


circulacin sistmica al SNC (Wolburg and Lippoldt, 2002).
2. Existen en el SNC sistemas neuronales con capacidad inmunomoduladora: Este
sera el caso de locus coeruleus que manda proyecciones a todo el cerebro y a la
espina dorsal y que en primates produce el 70% de la noradrenalina cerebral (Galea et
al., 2003b). La noradrenalina ejerce un papel inmunomodulador sobre la produccin de
molculas proinflamatorias en clulas gliales (astrocitos y microgla) (Galea and
Feinstein, 1999a) y el endotelio cerebral (Balyasnikova et al., 2000). Estos tres tipos
celulares son los principales responsables del desarrollo de la respuesta inflamatoria
en el cerebro.
3. El SNC es un tejido extremadamente rico en todo tipo de factores de crecimiento y
neurotrofinas. La expresin de algunos de estos factores est regulada por la
activacin de receptores beta-adrenrgicos (que son reconocidos por la noradrenalina)
(Riva et al., 1998a) y podran estar mediando los efectos de los sistemas
neuromoduladores. La hiptesis de la primera parte de este trabajo es que los
factores de crecimiento pueden regular las respuestas inflamatorias en el SNC.

2.3 La clulas gliales participan en la inmunidad innata del SNC


El sistema inmunitario posee dos grandes rutas de defensa: la inmunidad innata y la
adquirida. La inmunidad innata representa la capacidad inmediata del organismo de
responder a patgenos y otros tipos de trauma, y se caracteriza por la produccin de
novo de mediadores para eliminar los microorganismos y reparar el dao, bien
directamente o a travs de la activacin de clulas fagocticas. Estos mediadores son
las citoquinas, quimiocinas y protenas del complemento. En el SNC los genes que
codifican protenas que participan en la inmunidad innata pueden ser inducidos no slo
por microorganismos sino que tambin por clulas daadas en lesiones y patologas
neurodegenerativas (Rivest, 2003;Becher et al., 2000)

La inmunidad adquirida se

desarrolla frente a un antgeno especfico y es mediada por clulas del sistema


inmunitario: limfocitos B y T, requiriendo complejas reorganizaciones gnicas para la
produccin de anticuerpos.
Las clulas gliales participan activamente en la respuesta inmune innata del cerebro,
respondiendo ante la presencia de microorganismos patgenos. Los sistemas de
reconocimiento enfocados a patrones moleculares presentes sobre los patgenos
(PAMP) son la base de la inmunidad innata, la cual inicia y dirige la respuesta inmune
20

INTRODUCCIN

adaptativa. Entre estos sistema de reconocimiento de patrones moleculares destacan


la familia de los toll-like-receptors (TLRs). Existen hasta once miembros de esta familia
de receptores transmembrana, cada uno de los cuales presenta especificidad por
ligandos presentes en patgenos y son expresados de manera tejido-especfica
(Iwasaki and Medzhitov, 2004). As algunos TLRs reconocen molculas que se
encuentran en la superficie de patgeno, el TLR2 (como heterodmero con TLR1 o
TLR6) se activa tras la unin a lipoprotenas de origen bacteriano, TLR4 se une al
lipopolisacrido de la pared de bacterias gram negativas y a protenas de origen vrico,
mientras que el TLR5 reconoce una protena presente en los flagelos de algunas
bacterias denominada flagelina. Algunos TLRs son capaces de detectar la presencia
intracelular de cidos nuclecos de origen bacteriano o vrico; TLR3 reconoce ARN de
doble cadena, los TLR7/8 reconoce RNA de cadena sencilla y el TLR9 ADN
hipometilado rico en CpG. (Liew et al., 2005). La capacidad de los TLRs de reconocer
cidos nucleicos debe de tenerse en cuenta a la hora de realizar experimentos en los
que se pretende introducir construcciones de ARN mediante transfecciones utilizando
reactivos lpidicos (la mayora de kits comerciales de transfeccin utilizan molculas de
origen lipdico), para silenciar genes mediante siRNA, ya que algunas clulas, entre
ellas los astrocitos, desencadena una respuesta inmune a cadenas cortas de ARN en
conjuncin con lpidos a travs de la activacin de los TLR3 y 7 (Gorina et al., 2009).
Tras la unin de los TLRs a sus ligandos, protenas adaptadoras como MyD88, MAL,
TRIF y TRAM, son reclutadas al dominio intracelular de los receptores y se unen a l a
travs de dominios TIR. Este reclutamiento permite la activacin de kinasas de la
familia IRAK (IL-1 receptor-asociated kinases) 1,2 y 4. IRAK4 es la primera en ser
reclutada, y tas su activacin fosforila a IRAK1, que es capaz de activar a otros
efectores de esta va de sealizacin como son las kinasas del inhibidor de NF-B
(IB) que reciben el acrnimo IKK. La fosforilacin del IB por parte de las IKKs,
resulta en su degradacin va el proteasoma y en la traslocacin nuclear del factor de
transcripcin NF-B que media la transcripcin de genes inflamatorios generando una
respuesta pro-inflamatoria (Flannery and Bowie, 2010;Flannery et al., 2011).
Adicionalmente a la capacidad de los TLRs de reconocer PAMPs (Patogen-associated
molecular patterns) presentes en patgenos, recientemente se ha descubierto que
stos pueden ser activados por ligandos endgenos, a los que se conoce como
DAMPs (Danger-associated molecular patterns). Los TLRs extracelulares 2 y 4
reconocen molculas liberadas al medio extracelular por clulas muertes o daadas
que han perdido la integridad de la membrana plasmtica. Entre los putativos DAMPs
21

INTRODUCCIN

que activan a TLR2 y 4 se encuentran algunas protenas de choque trmico (HSPs),


protenas del gurpo HMGB1, el cido hialurnico, la fibronectina o el heparan sulfato
(Sirisinha, 2011). El amplio perfil de expresin de los TLRs y su capacidad de de
reconocer a muchos ligandos que se encuentran presentes a consecuencia de
situaciones de infecciones, heridas o estrs, hacen que la sealizacin por TLR
constituya un mecanismo de respuesta rpida frente al dao tisular. Debido a esto,
empiezan a ser considerados como dianas teraputicas, tanto para prevenir el shock
sptico que puede aparecer como consecuencia a algunas infecciones (Kuno et al.,
2009), o en enfermedades autoinmunes en las que los TLR parecen jugar un papel
como es el caso del lupus eritromatoso, la artritis reumatoide, la esclerosis mltiple u
otras patologas como la enfermedad de Alzheimer (Midwood et al., 2009;Marta et al.,
2009).
Los astrocitos expresan el TLR4 (Qin et al., 2005;Bowman et al., 2003a) que reconoce
el LPS (lipopolisacrido). Esta molcula ha sido ampliamente utilizada como estmulo
inflamatorio en todo tipo de modelos celulares y animales por su capacidad de inducir
una respuesta inmune/inflamatoria de tipo innata. La induccin de la respuesta
inflamatoria por LPS se produce por la accin coordinada de 4 protenas que
reconocen a esta endotoxina. Inicialmente LBP (LPS-binding protein) interacciona con
las membranas bacterianas ricas en LPS, o agregados de LPS, catalizando la
extraccin y transfiriendo los monmeros de endotoxina a CD14, que a su vez los
transfiere a la protena MD2. La heterodimerizacin de esta ltima protena con los
receptores TLR4 desencadenan las vas de sealizacin de las que se ha hablado
anteriormente. Es importante destacar que tanto LBP como CD14 son capaces de
detectar a LPS, incluso a muy bajas concentraciones (Jerala, 2007;Teghanemt et al.,
2007). El modelo inflamatorio inducido por LPS es relativamente fcil y econmico de
establecer y presenta la ventaja de que activa vas de transduccin de seales
comunes a las citoquinas inflamatorias IL-1

y TNF- (Palsson-McDermott and O'Neill,

2004), conocidas por ser las iniciadoras de diversas patologas con componente
inflamatorio.

2.4 Los astrocitos en la inmunidad innata


La respuesta de los astrocitos a condiciones patolgicas como la inflamacin o lesin,
recibe el nombre de astrogliosis y se caracteriza por hipertrofia, proliferacin,

migracin a las zona daadas acompaado de un aumento de la expresin de


protenas como GFAP (Hozumi et al., 1990;Pekny and Pekna, 2004), vimentina
(Ekmark-Lewen et al., 2010), S100 (Willoughby et al., 2004) y el receptor B de
22

INTRODUCCIN

endotelinas (ETbR) (Peters et al., 2003). Estos marcadores han sido los ms utilizados
para detectar astrocitos reactivos en el SNC en todo tipo de trastornos neurolgicos.
Adems, en el proceso de astrogliosis se sobreexpresan un buen nmero de
molculas de diversos tipos como citoquinas, quimiocinas (Meeuwsen et al., 2003),
molculas de adhesin (Lee and Benveniste, 1999), enzimas del sistema xidoreduccin, enzimas sintetizadoras de mediadores de inflamacin como NOS2 o COX2
(Galea et al., 1994), componentes de la matriz extracelular, entre ellos los
proteoglicanos (McKeon et al., 1999) y factores de crecimiento (Miklic et al.,
2004;Suzuki et al., 2006).
La astrogliosis puede variar cualitativa y cuantitativamente segn la naturaleza de la
lesin y el microentorno de la zona lesionada, poniendo de manifiesto la plasticidad de
los astrocitos reactivos. En general, la activacin de los astrocitos se considera un
mecanismo beneficioso a travs del cual el SNC normal responde a un dao y
reestablece la homeostasis (Faulkner et al., 2004a). Sin embargo la activacin glial
crnica, caracterstica de las enfermedades neurodegenerativas y de lesiones como la
seccin medular, se considera patolgica en parte por la sobreexpresin de citoquinas
pro-inflamatorias y por la formacin de la cicatriz glial que impide la regeneracin
axonal (Ridet et al., 1997;Wilhelmsson et al., 2004). La naturaleza dual de la reaccin
astrocitaria fue puesta de manifiesto en un estudio donde se muestra que la ablacin
qumica de los astrocitos, en el SNC lesionado. La ausencia de astrocitos reactivos
resulta en una mayor prdida de neuronas adyacentes a la lesin, as como en un fallo
en el restablecimiento de la integridad de la BHE y una mayor infiltracin de leucocitos.
Estos datos ilustran el papel reparador de los astrocitos reactivos en respuesta a
lesiones. Por otra parte la prdida de astrocitos est asociada a un dramtico
incremento en el crecimiento local de neuritas indicando que la formacin de la cicatriz
glial constituye un impedimento para regeneracin axonal (Bush et al., 1999;Faulkner
et al., 2004b).
La cicatriz glial representa un intento por parte de los astrocitos de aislar la zona
lesionada para evitar daos secundarios a las regiones adyacentes al foco. Est
constituida por astrocitos hipertrofiados que presentan alta expresin de GFAP,
rodeados de una densa matriz extracelular formada por una red molecular muy rica en
condroitn-sulfato proteoglicanos (CSPG). Los CSPG, entre ellos el neurocn y
fosfacn (Morgenstern et al., 2002), son glicoprotenas de muy alto molecular, cuya
parte glucdica, entre otros factores, es la que convierte la cicatriz glial en restrictiva
para el crecimiento axonal y por la tanto a la completa regeneracin funcional de los
23

INTRODUCCIN

tejidos afectados. Sin embargo, estudios recientes muestran que la formacin y


composicin de la cicatriz glial pueden modularse, resultando en una resolucin de la
lesin acompaada de una mejora en la recuperacin funcional, poniendo en duda la
idea preestablecida de que la presencia de esta cicatriz es siempre perjudicial. As, un
estudio (Renault-Mihara et al., 2011) muestra, que el tratamiento de ratas a las que se
efecta una lesin de espina dorsal con un inhibidor de la GSK3, resulta un aumento
en la migracin astrocitaria, asociada a una mayor compactacin, entendida como
aislamiento, del infiltrado celular inflamatorio, a una reduccin de la desmielinizacin y
a un incremento en el crecimiento axonal. En la misma lnea el tratamiento con FGF2
en un modelo similar de seccin de espina dorsal, da lugar a una mejora en la
recuperacin funcional debido a modificaciones en la composicin de la cicatriz glial
que permiten el crecimiento axonal (Kasai et al., 2010). Estos estudios ponen de
manifiesto que la modulacin de la migracin astrocitaria representa una diana
teraputica en procesos de regeneracin.
El carcter difuso de la reactividad astrocitaria en el SNC sugiere un papel de
mediadores solubles como las citoquinas, y/o a la presencia de un sincitio integrado
entre astrocitos que permite la transferencia de informacin a largas distancias.
Existen evidencias que muestran tanto in vivo como in vitro que ambos sistemas,
mediadores solubles y conexin por sincitio, son operativos en el SNC lesionado. En
este sentido la funcin de las citoquinas en el establecimiento, mantenimiento y, en
algunos casos, resolucin de la reactividad astrocitaria han sido ampliamente
caracterizadas y sigue siendo un tema activamente estudiado. Las citoquinas son
glicopptidos solubles de bajo peso molecular que actan de manera autocrina o
paracrina mediante la interaccin con receptores de membrana. La mayora de
citoquinas pueden actuar como ligando para ms de un receptor. Aqullas con un
claro papel en iniciar las astrogliosis son la IL-1 (Giulian et al., 1988;Herx and Yong,
2001) y el TNF- (Rostworowski et al., 1997), mientras que el IFN- (Yong et al.,
1991;Balasingam et al., 1994) jugara un papel potenciador, mientras que existen
citoquinas con un claro papel antiinflamatorio como el TGF- (Shrikant et al., 1996a) o
neuroprotector como la IL-6 (Quintana et al., 2008).
Hay que tener en cuenta que el trmino neuroinflamacin engloba fenmenos tan
diversos como la respuesta de las clulas gliales a infecciones, a mecanismos
reparadores como los que ocurren durante la isquemia o las lesiones de espina dorsal,
o a las reacciones a las que estn sometidas los astrocitos en la fases iniciales
asintomticas que, en la mayor parte de los casos, preceden la manifestacin de
24

INTRODUCCIN

muchas enfermedades neurodegenerativas. Todos estos procesos inflamatorios, que


pueden considerarse relacionados de alguna manera, no tendran por qu estar
incluidos en un mismo grupo. En efecto, el patrn de expresin gnico de un astrocito
reactivo puede variar segn cul sea la naturaleza del estmulo inflamatorio. Adems
existe una heterogeneidad astrocitaria durante la reactividad glial, que hasta el
momento ha sido pobremente caracterizada. Por eso, hemos credo conveniente
escoger genes candidatos, que cubren diferentes aspectos de la reactividad
astrocitaria, para el estudio de la modulacin de la plasticidad astrocitaria. Estos genes
son la MCP1, ICAM1 y COX2.

2.4.1 MCP1
MCP1 (Monocyte chemoatractant molecule), otramente denominada CCL2, es una
quimiocina de 20kDA que es secretada al medio extracelular donde ejerce sus
funciones. Pertenece al grupo de las quimiocinas tipo CC, que comparten la
caracterstica de presentar en su secuencia aminoacdica dos residuos de cistena
adyacentes (Laing and Secombes, 2004). Las quimiocinas son un amplio grupo de
protenas funcionalmente relacionadas, que, al generar gradientes de concentracin,
guan y atraen al tejido lesionado, a un extenso espectro de clulas inmunes, entre
ellas monocitos, leucocitos, clulas NK y clulas T, y que adems son capaces de
sealizar de manera parecida a las citoquinas (Ubogu et al., 2006). Adicionalmente al
bien establecido papel que ejercen en el sistema inmune, las quimiocinas ejercen
funciones en el SNC tanto en condiciones fisiolgicas como patolgicas. Por ejemplo,
CXCL1, CXCL8, y CXCL12 regulan la liberacin de neurotransmisores y la actividad
de canales inicos en las pre- y post-sinapsis. (Bertollini et al., 2006). La expresin de
la

MCP1

se

localiza

en

poblaciones

concretas

de

neuronas

colinrgicas,

dopaminrgicas y de Purkinje en el SNC normal, colocalizando con neurotransmisores


y neuropptidos, sugiriendo un papel como modulador de la actividad neuronal
(Banisadr et al., 2005). En la patologa, las quimiocinas y sus receptores participan en
la patognesis y desarrollo de enfermedades neurodegenerativas, como la
enfermedad de Alzheimer (Kiyota et al., 2009;Xia and Hyman, 1999) y la esclerosis
mltiple y en trastornos neurolgicos como la isquemia y la demencia asociada al
SIDA (Eugenin et al., 2006;Dhillon et al., 2008).
En particular, la MCP1 ha sido implicado en el dao neuronal que ocurre en la
isquemia y en la esclerosis mltiple ya que los animales KO (knock out) para esta
quimiocina o para su principal receptor, el CCR2, son resistentes a la EAE

25

INTRODUCCIN

(experimental autoinmune encephalomyelitis, modelo in vivo de la esclerosis mltiple)


(Fife et al., 2000) o presentan un menor dao cerebral en respuesta a modelos de
isquemia (Hughes et al., 2002). Adems de su papel quimiotctico sobre los monocitos
y la microgla (Tanuma et al., 2006;El-Hage et al., 2006), recientemente se han
descrito nuevas funciones neuroprotectoras para la MCP1. As, reduce la muerte
neuronal en cultivo inducida por excitotoxicidad, por exposicin a protenas del virus
del VIH (Eugenin et al., 2003) o durante la deprivacin de oxgeno y glucosa (Madrigal
et al., 2009a). Adicionalmente participa en el reclutamiento de precursores neuronales
tras un episodio isqumico (Yan et al., 2007;Xu et al., 2007). Recientemente, se ha
publicado un trabajo que muestra que la MCP1 podra tener per se, un papel
neuromodulador en los astrocitos, disminuyendo la expresin de citoquinas, como la
IL-6, tras un estmulo pro-inflamatorio (Semple et al., 2010b) Todos estos resultados
hacen pensar que la MCP1 desempea un papel importante en procesos de
regeneracin en el SNC.
A pesar de que varios tipos celulares, incluyendo neuronas, endotelio y gla, pueden
expresar la MCP1, (Thibeault et al., 2001;Flugel et al., 2001), los astrocitos parecen
ser su principal fuente en respuesta a lesiones (Khorooshi et al., 2008;Glabinski et al.,
1996). El gen de la MCP1, es del tipo early-response, y se transcribe de manera
rpida en respuesta a estmulos especficos por la accin de factores de trancripcin
como NF-B (Giraud et al., 2010), HIF1 (Mojsilovic-Petrovic et al., 2007) y CEBPs
(Abraham et al., 2005). Su expresin aumenta dramticamente en respuesta a
estmulos proinflamatorios como el TNF (Gao et al., 2010;Giraud et al., 2010), LPS
(Thompson and Van Eldik, 2009), o por A (Smits et al., 2002;Prat et al., 2000) pero es
tambin regulable por gliotransmisores como la noradrenalina (Madrigal et al., 2010) y
ATP (Panenka et al., 2001). La presencia del principal receptor para la MCP1, el
CCR2, de tipo 7 dominios transmembrana asociado a protenas G, se expresa en
astrocitos, sugiriendo que puede tener funciones autocrinas (Andjelkovic et al., 2002)
aunque poco se conoce sobre el papel de esta quimiocina sobre los astrocitos. Un
nico estudio muestra que, durante la formacin de las placas de amiloide en estados
iniciales de la enfermedad de Alzheimer, los astrocitos migran hacia las placas
siguiendo un gradiente de MCP1 hasta que contactan fsicamente con el A de stas,
momento en el cual se detienen. Los autores (Wyss-Coray et al., 2003a) sugieren que
los astrocitos atrados de esta manera a las placas son capaces de degradar el A. La
recopilacin de estos datos pone de manifiesto que es importante estudiar el posible
efecto autocrino de la MCP1, en fenmenos en que la migracin astrocitaria est
implicada.
26

INTRODUCCIN

2.4.2 ICAM1
La molcula de adhesin intracelular (ICAM1) juega un papel importante en las
reacciones inflamatorias en el SNC. ICAM1 es una glicoprotena transmembrana
integral que contiene 5 dominios Ig-like extracelulares. Acta como ligando de las
integrinas del tipo 2 LFA-1 (CD11a/CD18) y Mac-1 (CD11b/CD18) expresadas tanto
por leucocitos y macrfagos como por la microglia. En el cerebro adulto normal se
expresa en bajos niveles y de manera constitutiva en las clulas endoteliales de los
microvasos y en los astrocitos perivasculares , siendo su expresin regulable durante
condiciones inflamatorias (Dietrich, 2002). In vitro su expresin se regula a la alza en
respuesta a citoquinas como TNF-, Il-1.(Fabry et al., 1992)
Su papel en la extravasacin de leucocitos a travs de las paredes vasculares ha sido
extensamente estudiado. Este proceso consta de diversas fases. Inicialmente los
leucocitos deben interaccionan con componentes de la matriz extracelular de los vasos
como las selectinas. A continuacin se produce la adhesin firme a las membranas
luminales de las clulas endoteliales, proceso en el que participan diversas protenas
de membrana como selectinas, VCAM e ICAM. La interaccin de la ICAM con sus
receptores presentes en los leucocitos genera cascadas de sealizacin que conllevan
la activacin del leucocito, permitiendo la diapedesis de estos, entre las culas
endoteliales que forman el vaso para llegar al parnquima del tejido. Hasta hace poco
el papel de la ICAM se limitaba a ser de ancla para los leucocitos, pero nuevos
descubrimientos demuestran su dominio intracelular es tambin capaz de sealizar
tras la interaccin con Mac-1 y LFA-1, dando lugar a cambios en la dinmica del
citoesqueleto y de la expresin gnica en el endotelio (Greenwood et al.,
2002;Dietrich, 2002).
El significado funcional de la expresin de ICAM en astrocitos ha sido poco estudiado,
y su estudio se ha limitado a la interaccin intercelular entre astrocitos y leucocitos. Su
expresin se ve aumentada en algunas de las enfermedades neurodegenerativas
como AD, PD y MS. En la AD, los astrocitos que rodean las placas de amiloide son
positivos para ICAM. En el interior de las placas se encuentran tambin clulas
microgliales que expresan los co-receptores para la ICAM, sugiriendo un papel para la
interaccin entre astrocitos y microglia mediada por la interaccin LFA/ICAM en la AD.
(Akiyama et al., 1993) Se ha descrito tambin la sobre-expresin de ICAM en
esclerosis mltiple y la enfermedad de Parkinson. Estudios in vitro demuestran que la
mutacin de la -sinuclena causante de las formas autosmicas dominantes de la PD
es capaz de incrementar la ICAM (Klegeris et al., 2006) y que la expresin de sta se
27

INTRODUCCIN

ve aumentada en la substantia nigra de pacientes con dicha enfermedad (Miklossy et


al., 2006).
La activacin de la ICAM puede mimetizarse en astrocitos en cultivo mediante el uso
de anticuerpos anti-ICAM, que generan cross-linking de esta protena (Etienne et al.,
1998). As, el uso de anticuerpos anti-ICAM desencadena la expresin de TNF-

y IL-

6 a travs de las vas de las MAPK y AMPc.(Etienne-Manneville et al., 1999;Lee et al.,


2000) Las consequencias de la activacin de ICAM sobre la morfologa y migracin
astrocitarias no han sido estudiadas.

2.4.3 COX2
Las ciclo-oxigenasas (COX) son enzimas claves en la sntesis de prostaglandinas que
regulan el paso limitante de la produccin de stas utilizando como sustrato el cido
araquidnico. Se conocen dos principales isoformas, siendo la COX1 de expresin
ubicua y constitutiva y la COX2 de carcter inducible en numerosos tipos celulares en
respuesta a estmulos inflamatorios. Las prostaglandinas regulan mltiples funciones
fisiolgicas, como el acoplamiento neurovascular, y desempean un papel importante
en el control de la respuesta inmune innata, actuando bien como segundos
mensajeros pro-inflamatorios (Verma et al., 2011) de manera paracrina mediante de la
activacin de receptores de prostaglandinas, protenas de membrana asociadas a
protenas G, o anti-inflamatoria por activacin de los receptores nucleares PPAR
(Martinez-Gras et al., 2011), segn el tipo de prostaglandina y el contexto celular.
La COX2 se expresa en clulas gliales y endoteliales en condiciones de inflamacin
pero existen algunas situaciones en las que su loclizacin es principalmente
astrocitaria. Por ejemplo, se expresa principalmente en astrocitos en respuesta a
isquemia, mientras la COX1 se observan en neuronas y microgla tanto en basal como
en isquemia (Wu et al., 2011). Se induce tambin por inyeccin de cido kanico intrahipocampal especficamente en astrocitos de CA1 y CA3 (Serrano-Perez et al., 2011).
Su expresin es dependiente de factores de transcripcin como NF-kB (Serrano-Perez
et al., 2011) y NFAT (Blanco et al., 2010), AP1 y PPAR (Aleshin et al., 2009). El A la
induce de manera dependiente de NF-B, asociado a un aumento en la liberacin de
PGE2 (Blanco et al., 2010). Las prostaglandinas son molculas vasoactivas. En este
sentido, los astrocitos actan como puentes en el acoplamiento neurovascular, el ATP
liberado por los propios astrocitos en respuesta a la actividad neuronal, induce la
expresin de COX2 que sintetiza prostaglandinas que al actuar sobre las clulas
28

INTRODUCCIN

endoteliales regulan el flujo cerebral y participan en la proteccin ofrecida por el


precondicionamento isqumico (Birnbaum et al., 2005). Las prostaglandinas pueden
participar en la neurotransmisin ya que aumentan excitabilidad neuronal asociado a
un incremento en las sinapsis excitadoras (Koch et al., 2010). A pesar de que los
mecanismos de expresin de la COX2 han sido ampliamente estudiados, y su
presencia se interpreta muy a menudo como un marcador de inflamacin, poco se
conoce sobre el papel de la COX2 y las prostaglandinas sobre los astrocitos.
En otro contexto, es bien conocida la participacin de la COX2 en el desarrollo de
tumores y el establecimiento de metstasis, revisado en (Harris, 2007). En esta lnea,
se ha detectado la sobre-expresin de COX2 en diferentes tipos de tumores y se
conoce que las prostaglandinas son capaces de estimular la migracin de clulas
cancerosas, y que este efecto se revierte en presencia de inhibidores especficos del
enzima como son el NS398 y el celecoxib (Rodriguez et al., 2008), y ocurre a travs de
la activacin de receptores de prostaglandinas. Teniendo en cuenta estos resultados,
resulta interesante preguntarse si la COX2 puede intervenir en fenmenos de
plasticidad astrocitaria como es la migracin.

2.5 Migracin astrocitaria


La migracin celular es esencial para la organizacin y mantenimiento de la integridad
tisular y participa en el desarrollo embrionario, regeneracin, inflamacin e invasin a
travs de la matriz extracelular (Lauffenburger, 1996). La migracin celular es un
proceso vital en todos los organismos multicelulares y es importante no solamente
durante el desarrollo sino que tambin durante toda la vida en fenmenos como la
regeneracin y la inmunidad. La migracin celular es dirigida por seales
extracelulares que actan como atrayentes o repelentes. Estas seales desencadenan
respuestas intracelulares que incluyen cambios en el citoesqueleto (tanto microtbulos
de tubulina como microfilamentos de actina), en el transporte vesicular y en la
expresin gnica.
Cuando el SNC atraviesa una situacin traumtica, los astrocitos reactivos migran a
los bordes de la zona lesionada y/o inflamada donde forman la cicatriz glial, separando
el tejido sano de la zona daada. (Ellison et al. 1998; Saadoun et al. 2005).
Numerosas evidencia tanto in vivo como in vitro sealan a los mediadores
inflamatorios, incluyendo citoquinas, factores de crecimiento y ligandos de los
receptores Toll-like (TLRs), como directores de la astrogliosis (Ghirnikar et al.1998;
29

INTRODUCCIN

Caso et al. 2007), aunque el efecto beneficioso o deletreo de los procesos


inflamatorios sigue siendo tema de debate (Kriz, 2006).

Un papel importante de los mediadores inflamatorios podra ser el de regular la


capacidad migratoria de los astrocitos a las zonas daadas (Norton et al. 1992;
Ghirnikar et al. 1998). En numerosos estudios se muestras que citoquinas y LPS son
capaces de estimular la migracin de diferentes tipos celulares. Por ejemplo la IL-1
promueve la migracin de clulas de msculo liso vasculares (Delbosc et al. 2008) y
en clulas tubulares de rin humano (Zhang et al. 2005), TNF- en clulas
epidermales de Langherhans (Griffiths et al. 2005, TNF- e IFN- en precursores
multipotentes neurales (Ben-Hur et al. 2003). Aunque la IL-1 es capaz de dar lugar a
astrogliosis in vivo (Giulian et al. 1988), esta misma citoquina inhibe la migracin de
astrocitos fetales humanos in vitro (John et al. 2004), a diferencia de otros trabajos
(Sato et al., 2011). El papel de los mediadores inflamatorios en la migracin
astrocitaria no queda claro, por ejemplo el LPS, no es capaz de estimular migracin en
astrocitos (Sato et al., 2011), aunque en presencia de otros mediadores de la
inflamacin, como molculas lipdicas como el LPA, s es capaz de acelerar este
proceso. Por lo tanto, parece claro que existe cierta especificidad en las molculas
capaces de regular los fenmenos de migracin astrocitaria.
Es importante destacar tambin que en los ltimos aos est cobrando importancia la
hiptesis de que enzimas que participan en la respuesta inflamatoria pueden participar
tambin en un incremento de la capacidad migratoria de los astrocitos reactivos. De
esta manera MMP-9, una metaloproteinasa capaz de degradar componentes de la
matriz extracelular y ya implicada en otros fenmenos migratorios como en el
establecimiento de metstasis (van Kempen and Coussens, 2002), parece ser promigratoria, ya que al inhibir su actividad, astrocitos tratados con TGF- disminuyen la
velocidad de migracin (Hsieh et al., 2010). Asimismo, la sintasa de xido ntrico
inducible (iNOS) es capaz de estimular la migracin astrocitaria a travs de su
producto, el xido ntrico y las especies reactivas de oxgeno que de l se derivan
(Wang et al., 2010). Queda por ver si otras molculas que participan en la reaccin
inflamatoria como las quimiocinas, por su conocido papel de establecer gradientes
quimiotcticos que son reconocidos por las clulas inmunes para localizar zonas de
lesin, y la ciclooxigneasa-2 (COX2), que juega un papel claro en la formacin de
metstasis, o molculas de adhesin como ICAM y VCAM promueven la migracin
astrocitaria.

30

INTRODUCCIN

2.6. Participacin de las Rho GTPasas en la reactividad glial


A modo de resumen, el primer paso en la migracin celular es la emisin de un
proyeccin o proceso gua (leading edge), formado por un lamelipodio, que al crecer
establece nuevos puntos de adhesin al frente del sentido migratorio, seguido de una
contraccin del soma celular y la prdida de los puntos de anclaje de la clula en su
parte trasera lo que permite el avance de la clula. Todos estos pasos son posibles
por la reorganizacin del citoesqueleto de actina, el ensamblaje y desensamblaje de
las adhesiones focales y el establecimiento de la polaridad celular que determina el
sentido de la migracin. Estos procesos deben estar coordinados localmente de una
manera muy fina, tanto en el espacio como en el tiempo, para generar un movimiento
productivo. Se han descrito mltiples vas de sealizacin involucradas en el control de
la migracin celular como las MAPKs y las fosfolipasas, pero una familia de protenas,
las Rho GTPasas, destaca sobre las dems por desarrollar un papel esencial en la
regulacin de las vas bioqumicas relevantes en la migracin.
Las Rho-GTPasas son una familia de protenas G pequeas que, fluctuando entre
estados activos (cuando se encuentran unidas a GTP) e inactivos (al transformar el
GTP a GDP) coordinan cambios en la organizacin del citoesqueleto de actina y en la
transcripcin de genes, regulando as procesos biolgicos como la morfognesis, la
quimiotaxis, el crecimiento de los axones y la progresin del ciclo celular. La actividad
de las Rho-GTPasas est regulada por las GEFs (guanine-nucleotide-exchange
factors) que facilitan el intercambio de GDP por GTP y por las GAPs (GTPase
activating proteins), que tienen el efecto contrario al aumentar la velocidad de
hidrlisis del GTP. En su forma inactiva las Rho-GTPasas se encuentran formando un
complejo con GDIs (GDP-dissociation inhibitors) en el citoplasma mientras que su
activacin implica translocacin a la membrana con la que interaccionan mediante una
isoprenilacin. Las Rho-GTPasas incluyen a las Rho (A, B y C), las Rac, y las Cdc42,
que regulan diferentes aspectos de la dinmica del citoesqueleto. Generalizando, las
Rho activan la formacin de complejos actina-miosina que forman las fibras de estrs
en cuyo extremo se forman focos de adhesin a la matriz extracelular. Las Rac
inducen la formacin de una red de filamentos de actina en la periferia celular que da
lugar a la formacin de lamelipodios, mientras que las Cdc42 inducen extensiones
ricas en actina en la membrana llamadas filopodios (revisin en Bishop and Hall,
2000)). En su conformacin activada las Rho-GTPasas son capaces de interaccionar
de manera especfica con sus protenas efectoras que median sus efectos. La
serina/treonina kinasa ROCK es activada por la unin a Rho-GTP (Kubo and
Yamashita, 2007), as como mDia (Narumiya et al., 2009); por otro lado Rac1 y cdc4231

INTRODUCCIN

GTP promueven la actividad de la kinasa PAK (Szczepanowska, 2009;rias-Romero et


al., 2010), entre otras (Bishop and Hall, 2000).
Existe un cierto consenso en atribuir la formacin de las protrusiones que establecen
el sentido migratorio y el establecimiento de la polaridad celular a la cdc42 (Yokota et
al., 2010) y a la Rac1, mientras que la RhoA regula adhesin/deadhesin de la parte
trasera mediante el control de la contractibilidad de las fibras de actina-miosina, y la
formacin de adhesiones focales. Las adhesiones focales son microrregiones
especializadas de la membrana plasmtica, que constituyen puntos de unin con el
sustrato. Estas uniones se establecen a travs de protenas como las integrinas que
reconocen componentes de la matriz extracelular a los que se unen, y actan como
anclas que ligan en el citoesqueleto de actina con la matriz a travs de toda una serie
de protenas adaptadoras. Entre ellas se encuentran la paxilina (Yu et al., 2010) o la
kinasa

de

adhesiones

focales

(FAK).

La

FAK

regula

el

reciclaje

(formacin/desensamblaje) de las adhesiones focales a travs de la fosforilacin de


varias protenas efectoras, y su actividad est directamente relacionada con la
adhesin y migracin celular (Chalkiadaki et al., 2011).
Se han desarrollado distinto modelos experimentales in vitro para poner de manifiesto
la capacidad migratoria de las clulas y as estudiar las vas de sealizacin
implicadas en este fenmeno. Uno de los ms utilizados, el ensayo de scratch wound
assay, consiste en realizar una herida en una monocapa de clulas confluentes,
eliminando los contactos inhibidores clula-clula, estimulando as la migracin celular
para regenerar la herida. En el caso de los astrocitos, stos se polarizan en direccin
perpendicular a la herida, emitiendo largos procesos y cerrando totalmente zona libre
de clulas 48h despus de su generacin (Etienne-Manneville, 2006). Este ensayo
reproduce varios de los fenmenos que ocurren durante la migracin in vivo, y permite
ensayar cmo modulan la capacidad migratoria frmacos y molculas sobre la
polaridad, morfologa y velocidad migratoria.

32

INTRODUCCIN

3. FGF2 en la plasticidad astrocitaria


Los factores de crecimiento fibroblstico (FGF) y sus receptores (FGFR) constituyen
un elaborado sistema de sealizacin que participa en numerosos procesos durante el
desarrollo embionario y la edad adulta en virtualmente todos los tejidos en mamferos.
Fue una de las primeras familias de factores de crecimiento en ser descritas. El primer
miembro de esta familia fue identificado por su capacidad de estimular la proliferacin
de fibroblastos, de all su nombre. Hasta la fecha se conocen veintitrs miembros de
esta familia que sealizan a travs de cuatro receptores distintos. No todos los FGFs
pueden ser detectados en todas las especies incluyendo la humana. As, en humanos
el FGF15 no se detecta en el genoma resultando en un total de veintids miembros de
esta familia (Itoh and Ornitz, 2008). Por anlisis filogentico la familia de los genes
FGF humanos pueden dividirse en siete subfamilias compartiendo algunos de los
miembros de cada subfamilia funciones y patrones de expresin parecidos.
La mayora de FGFs se expresan durante el desarrollo con patrones de expresin
diferenciales y muy dinmicos. En el adulto la expresin de algunos de estos factores
se mantiene y en algunos casos de manera muy restringida a ciertos rganos. A
menudo varios FGFs se co-expresan en el mismo tejido, lo que resulta en cierta
redundancia funcional que se refleja en la generacin de KOs para FGFs especficos.
Este es el caso del ratn KO para FGF2, que es viable y no presenta un fenotipo
dramtico a pesar de que este factor est implicado en procesos tan importantes como
la induccin del mesodermo, angiognesis y formacin de extremidades (Ortega et al.,
1998). Es posible que la redundancia funcional haya sido un mecanismo seleccionado
evolutivamente para conferir robustez a un sistema de sealizacin
Los genes de todos los FGFs conocidos se estructuran en tres exones codificantes
siendo el exn 1 el que contiene el codn de inicio (Arnaud et al., 1999;Prats et al.,
1989). An as numerosos FGFs

presentan secuencias codificantes en 5 cuya

transcripcin se inicia a travs de codones CUG alternativos. Respecto a su


localizacin cromosmica los genes de los FGF no se localizan en un cluster
delimitado si no que muestran una localizacin altamente dispersa en el genoma (Itoh
and Ornitz, 2008).
Los FGFs son molculas evolutivamente antiguas. Han sido identificados tanto en
invertebrados como en vertebrados, pero no se encuentran en el genoma de
33

INTRODUCCIN

organismos unicelulares como E. coli o S. cerevisae. En Drosophila se conoce un solo


gen de FGF, branchless, y en C. Elegans dos (egl-17 and let-756), contrastando con el
alto nmero de FGFs identificados en vertebrados. La mayora de protenas FGF
ortlogas se encuentran altamente conservadas entre especies mostrando un 90% de
identidad en la secuencia aminoacdica. El tamao de estos factores oscila entre 17 y
34 kD y la mayora contienen un secuencia interna altamente conservada de 28
aminocidos (core domain) que determinan la interaccin con heparina y con los
FGFRs (Beenken and Mohammadi, 2009).

3.1 Los FGF sealizan a travs de los FGFR


Los FGFs ejercen sus funciones extracelulares a travs de la unin y activacin de
receptores de alta afinidad presente en la membrana extracelular, los FGFR. Los
FGFR son una subfamilia de receptores tirosina-quinasa de membrana, que en
vertebrados consta de cuatro miembros FGFR1-4. Son protenas con un solo dominio
transmembrana con un motivo de unin a ligando extracelular y dominios tirosinakinasa intracelulares. La regin extracelular est compuesta de tres dominios Ig (IgI,
IgII, IgIII) que son los responsables de la unin a FGF, determinando las especificidad
y afinidad por el ligando. Localizado entre los dominios IgI y II, se halla un motivo de
aa cidos (acdic box domain) seguido de un motivo de unin a heparina y un dominio
de homologa a molculas de adhesin (CHD). Estos dominios permiten la interaccin
de los FGFRs con molculas de la matriz extracelular, principalmente la heparina de
los heparan-sulfato-proteoglicanos (HSPGs) y molculas de adhesin como N-CAM.
Contigua a la parte extracelular se encuentra el domino transmembrana seguido de la
parte intracelular. Esta ltima consta de una regin yuxtamembrana, un dominio
tirosina-quinasa partido por un dominio interquinasa no cataltico y una cola C-terminal
corta. Adems del dominio cataltico, la regin intercelular contiene varios motivos de
fosforilacin as como de unin a protenas adaptadoras como FRS2 (Mohammadi et
al., 2005a;McKeehan et al., 1999;Gotoh, 2008).
La mayora de FGFs pueden unirse a ms de un FGFR. La diversidad de funciones
que presentan los distintos FGFs se consigue, a parte de la existencia de cuatro
receptores diferentes, gracias a la generacin de isoformas por splicing alternativo en
los ARN mensajeros de los receptores. La regin con un mayor impacto sobre la
afinidad del ligando por el receptor es la IgIII, para la cual existen tres variantes de
splicing denominadas IgIIIa, IgIIIb, IgIIIc (Mohammadi et al., 2005b).

34

INTRODUCCIN

El mecanismo de activacin de los FGFR no est del todo dilucidado. Se piensa que el
mecanismo comn a todos los receptores es la formacin de dos complejos FGFFGFR independientes que son de baja afinidad. Estos complejos pueden dimerizar y
subsecuentemente ser conectados por una molcula de heparina o HSPGs
estabilizando y activando el complejo, formado finalmente por dos molculas de FGF,
dos de FGFR y una de heparina (McKeehan et al., 1999).
La activacin del complejo conlleva un aumento en la actividad tirosina quinasa del
dominio intracelular resultando en la autofosforilacin de varios residuos tirosina del
propio receptor. Estas fosforilaciones sirven como puntos de amarre (docking sites)
para el reclutamiento y unin de varias protenas de docking como FRS2, GAB1,
protenas adaptadoras como GRB2 y protenas sealizadoras como la fosfatasa Shp2.
Las interacciones entre estas protenas se llevan a cabo a travs de dominio SH2 (srchomology2) y PTB (phosphotyrosine binding). Estos componentes se ensamblan en
complejos sealizadores que inician distintas vas de sealizacin que modifican la
expresin gnica y el comportamiento celular

Figura2.PrincipalesvasdetrasduccindesealesactivadasporlaactivacindelFGFR1. La
unin del FGFR con su ligando, provoca la dimerizacin del receptor y la activacin de diversas
vas de trasduccin de seales. La activacin de la fosfolipasa C (PLC) y la movilizacin de calcio
intracelular producen cambios morfolgicos en la clula, mientras que la accin de la fosfatidilinositol kinasa (PI3K) media la activacin de la proten quinasa B que regula la supervivencia
celular. La estimulacin de la va de las MAP quinasas transduce las seales iniciadas por el
receptor al ncleo modificando la expresin de genes. (Mohammandi et al, 2005)

35

INTRODUCCIN

Un fenmeno intrigante en la sealizacin por receptores FGFR es que, segn el


contexto y el tipo celular, tras la unin del ligando al receptor, el complejo es
internalizado y transportado al ncleo (Clarke et al., 2001). Esto sugiere que el
complejo ligando-receptor puede tener acciones nucleares facilitando la expresin de
genes (Peng et al., 2002;Stachowiak et al., 2003). Este proceso de internalizacin y
sealizacin intracrina representa una peculiaridad del sistema FGF-FGFR sobre otros
sistemas de sealizacin por factores trficos a los que se atribuye un mecanismo de
accin paracrino.

3.2 Funciones de los FGFs


Un nmero relativamente bajo de factores de crecimiento orquestan el desarrollo,
sealizando sobre clulas indiferenciadas proliferacin, diferenciacin y organizacin
en patrones especficos. Entre ellos se encuentran los FGFs y su receptores
involucrados en la mayora de procesos embrionarios tempranos como: el
establecimiento de los ejes corporales, formacin del mesodermo y el endodermo,
induccin neural y regionalizacin de la placa neural y somitognesis (Bottcher and
Niehrs, 2005;Mason et al., 2004).
Los FGFs a menudo sealizan de manera direccional y recproca en fronteras epiteliomesenquimales. Por ejemplo en vertebrados, en el desarrollo de las extremidades, el
FGF10 expresado por el mesodermo de placa lateral induce la formacin de la cresta
apical ectodrmica. La cresta expresa entonces FGF8 con el que sealiza sobre el
mesodermo. Esta sealizacin direccional inicia feedback loops, que junto con otros
factores solubles, promueven el crecimiento y la correcta organizacin de la
extremidad (Grieshammer et al., 1996). La expresin diferencial de las distintas
variantes de splicing de los receptores FGFR (que determinan la especificidad por el
ligando) permite esta sealizacin direccional evitando la sealizacin autocrina sobre
el mismo compartimiento.
Los FGFs juegan un papel importante en el desarrollo del SNC. El FGF3 y FGF8 han
sido implicados en el establecimiento de la regionalizacin del la estructuras
embrionarias que darn lugar al SNC maduro (Raible and Brand, 2004). Adems
participan en el desarrollo de los rganos sensoriales, en la condrognesis y en la
formacin del sistema esqueltico, de las extremidades, as como del corazn y
sistema digestivo

36

INTRODUCCIN

Para estudiar las funciones de los FGF, el abordaje utilizando en la mayora de los
casos ha sido la generacin de knock-outs mediante recombinacin homloga. Los
fenotipos varan de una letalidad severa embrionaria por fallos importantes en la
organognesis a cambios sutiles en el adulto. Es difcil atribuir funciones especficas a
cada uno de los FGFs por la redundancia funcional que presentan. An as, algunas
de las subfamilias de los FGFs presentan funciones bien delimitadas.

Figura3.AgrupacinfilogenticadelosFGFsdemamferoporsubfamilias. Anlisis
filogenticos sugieren que los FGFs pueden dividirse en siete subfamilias que
contienen entre dos y cuatro miembros. La longitud de las ramificaciones es
proporcional a la distancia evolutiva de cada uno de los genes. (Ithoh N., 2008).

La familia de hFGF (formado por los FGF19, FGF21, FGF23) presenta un claro papel
en la regulacin metablica, funcionando como hormonas endocrinas. FGF19 podra
ser un regulador energtico por su control sobre el metabolismo de lpidos y formacin
de bilis, FGF21 regula tambin el metabolismo de la glucosa y lpidos, mientras que
FGF23 controla el metabolismo de la vitamina D e iones fosfato. Otra peculiaridad de
esta subfamilia es que sus miembros muestran poca afinidad por los FGFRs,
requiriendo la presencia de co-receptores como Klotho y -Klotho para activar los
FGFR de manera eficiente (Itoh, 2010).
La familia del FGF11 (FGF11-14) se expresan tanto en el SNC en desarrollo como en
el adulto lo que hace pensar que estos factores desarrollan un papel importante en el
desarrollo y mantenimiento de este sistema, Como peculiaridad los miembros de esta
37

INTRODUCCIN

subfamilia no se secretan y su localizacin subcelular es principalmente nuclear


(Smallwood et al., 1996). La familia del FGF7 (FGF7, FGF10 y FGF22) presenta
funciones en la formacin de sinapsis como organizadores presinpticos. (Umemori et
al., 2004).
Las dems subfamilias de FGFs no presentan funciones ms definidas. En
organismos adultos los FGFs estn implicados en la regeneracin de tejidos,
angiognesis y homeostasis tisular (Lee and Kay, 2006a;Chang et al., 2006). Tiene
adems una importancia capital en cncer. Los FGF3-6 fueron inicialmente
identificados como proto-oncogenes. Adems junto con los FGFRs, los FGFs tiene un
importante papel en la proliferacin celular. Numerosas evidencias muestran que estn
involucrados en la carcinognesis y formacin de tumores de origen mamario, de piel,
de prstata, del tracto urinario, as como de patologas de tipo hematolgico (Lin and
Wang, 2010;Knights and Cook, 2010).
Adems por la importancia de la sealizacin de FGFs en el desarrollo del sistema
esqueltico, mutaciones en los FGFR generan displasias esquelticas que se pueden
agrupar en dos grupos: acondroplasias (Aviezer et al., 2003), la forma ms comn de
enanismo de origen gentico en humanos o craneosinostosis (cierre prematuro de las
suturas craneales, (Hatch, 2010).

3.3. FGF2
3.3.1 Descubrimiento y primeros trabajos
El FGF2 fue uno de los primeros factores de crecimiento en ser descubierto, hace ms
de 30 aos. Se identific en extractos de la glndula pituitaria bovina un factor capaz
de estimular la proliferacin de fibroblastos murinos (Armelin, 1973). Posteriormente
Gospodarowich et al lo purificaron de la pituitaria y lo nombraron factor de crecimiento
de fibroblastos (FGF). El FGF2 se expresa en grandes cantidades en esta glndula,
as como en el resto del cerebro, representando 5 mg de factor por kg de tejido. El
FGF2 se purifica con un punto isoelctrico de pH 9.6 por lo que fue llamado bFGF (b
de bsico) para diferenciarlo del aFGF (acdico o FGF1), que fue caracterizado en la
misma poca. Se demostr tambin que el FGF2 actuaba a travs de receptores de
membrana (Neufeld and Gospodarowicz, 1985).
La sospecha de que se tratara de un factor neurotrfico vena dada por haber sido
purificado en la pituitaria y en el cerebro. En 1986 se demostr que el FGF2 mejoraba
la supervivencia de neuronas corticales en cultivo (Morrison et al., 1986). Ms tarde el
38

INTRODUCCIN

FGF2 humano fue clonado de fibroblastos de piel y se determin que estimulaba la


proliferacin celular al ser transfectado su cDNA y que se secretaba al medio
extracelular (Kurokawa et al., 1987). Desde entonces las funciones que se atribuyen al
FGF2 no han parado de aumentar.

3.3.2 Estructura del FGF2


El FGF2 es un polipptido de cadena sencilla compuesto por 146 aminocidos que
carece de la secuencia seal de secrecin pero ha adquirido una secuencia de
localizacin nuclear NLS (Florkiewicz et al., 1991). Se originan mltiples isoformas del
FGF2, todas provenientes del mismo ARNm, por el uso alternativo de distintos inicios
de la traduccin en el extremo 3 del mensajero. La isoforma de 18kDa se sintetiza a
partir del codn AUG, a diferencia de las isoformas de mayor peso molecular (HMW:
21, 21.5 y 22kDa en rata) que se sintetizan a partir de los codones CUG upstream.
Todas las isoformas de alto peso molecular contienen la NLS en su extremo Nterminal, lo que causa su acumulacin nuclear. Esta localizacin nuclear es ms
prominente en el nucleolo a pesar de que distribuye por todo el ncleo. Por el
contrario, el FGF2 18kDa, que no posee la NLS, presenta una localizacin
predominantemente citoplasmtica y es secretado al medio extracelular por
mecanismos independientes del aparato de Golgi, donde puede ejercer sus funciones
extracelulares a travs de los FGFR1-4 (Mohammadi et al., 2005c)

B
GFAP

FGF2

CIT

NUC

22KD

22 kD
21 kD

21KD
18KD

18 kD

Esquema 4. Isoformas del bFGF y localizacin subcelular en astrocitos. A, Diagrama mostrando la


estructura polipeptdica con los sitios de inicio de transcripcin de las distintas isoformas del FGF2
(Adaptado de Ornitz et al.); B, Inmunocitoqumica para la GFAP (verde) y FGF2 (rojo) mostrando la
localizacin predominantemente nuclear de FGF2 en astrocitos primatios en cultivo, identificados por
39
la deteccin de GFAP. C, Western Blot de fracciones
nucleares y citoslicas de astrocitos. El FGF2
de 18kD es exclusivamente citoslico y el ncleo est enriquecido en isoformas de alto peso
molecular.

INTRODUCCIN

Las isoformas de alto peso molecular se expresan de manera especfica de tejido

detectndose in vivo en el cerebro y corazn entre otros tejidos y ejercen funciones


intracrinas en las clulas que los expresan. Su funcin es poco conocida pero parece
tener un papel en la regeneracin y la supervivencia de los tejidos en los que se
expresa, a travs de la interaccin con otras protenas como el factor antiapopttico
Api65 o factores de splicing como SMN (survival of motoneurons) (Claus et al.,
2003;Gringel et al., 2004), lo que hace pensar que algunas de las funciones intracrinas
del FGF2 de alto peso molecular podran acontecer a travs de la regulacin del
splicing de diversos trnscritos.

3.3.3 Secrecin del FGF2


La mayora de factores solubles de origen peptdico, entre ellos los FGFs, son
secretados al medio extracelular por mecanismos convencionales que dependen de su
paso por el retculo endoplasmtico (ER) y el aparato de Golgi, siendo empaquetados
en vesculas que al fusionarse con la membrana plasmtica por mecanismos
dependiente de Ca2+, liberan su contenido fuera de la clula. Este mecanismo depende
de la presencia en las protenas que van a ser secretadas de un secuencia o pptido
seal presente en la cadena aminoacdica. Por razones todava desconocidas, un
grupo de factores extracelulares son secretados por mecanismos que no dependen del
pptido seal y de su paso por el ER/Golgi. Entre ellos se encuentran factores de
relevancia clnica como el FGF1 y FGF2, as como el mediador inflamatorio IL-1.
Inicialmente se pens que el FGF2 poda liberarse de clulas daadas o muertas en la
que la integridad de la membrana plasmtica estaba comprometida. Estudios recientes
muestran que el FGF2 puede ser liberado al medio mediante un mecanismo
dependiente de su transporte directo a travs de la membrana. La identidad de este
transporte no es todava conocida, pero se sabe que el transporte en s depende del
correcto plegamiento y adquisicin de un estructura terciaria del FGF2 (Nickel, 2005).
Asimismo la introduccin en el FGF2 del pptido seal del FGF4 que s se secreta a
travs de la va ER/Golgi, redirige el FGF2 al mecanismo convencional de secrecin
hacindole perder la capacidad de interaccionar con los HSPG (Wegehingel et al.,
2008). Estos resultados hacen pensar que para su funcin normal el FGF2 debe ser
secretado al medio extracelular por mecanismos todava poco conocidos directamente
a travs de la membrana plasmtica. Otros mecanismos de transporte propuestos son
la ATPasa dependiente de Na+/K+ (Florkiewicz et al., 1998) o la multidrug resistanceassociated protein (Aggarwal and Gupta, 1998).

40

INTRODUCCIN

3.3.4 FGF2 en el SNC


En el SNC en condiciones fisiolgicas el FGF2 se localiza principalmente en astrocitos
y en algunas poblaciones de neuronas (Gonzalez et al., 1995). Las neuronas
diferenciadas pierden la habilidad de proliferar y su supervivencia requiere el sostn de
factores de crecimiento y neurotrofinas. Numerosos estudios sostienen un papel
neurotrfico para el FGF2 en condiciones normales. En (Forget et al., 2006a) se
demuestra que la presencia de FGF2 en el ncleo (endgeno) de astrocitos
mesenceflicos es necesaria para el correcto funcionamiento de neuronas
dopaminrgicas. Estos datos concuerdan con la menor immunoreactividad para FGF2
que se observa en la sustancia negra de pacientes con la enfermedad de Parkinson
(Tooyama et al., 1994). Paralelamente el FGF2 exgeno es capaz de inhibir la
apoptosis inducida por rotenona o MPTP en un modelo de neuronas dopaminrgicas
(Hsuan et al., 2006), o por dao excitotxico (Lenhard et al., 2002). El FGF2 parece
estar implicado tambin en el crecimiento axonal y en la neuritognesis (Aoyagi et al.,
1994), en la modulacin de la transmisin sinptica (Boxer et al., 1999) y en la
neurognesis en adultos (Nelson and Svendsen, 2006). Otra funcin que se atribuye al
FGF2 en el cerebro normal es el mantenimiento de la barrera hematoenceflica
(Reuss et al., 2003), promoviendo la expresin de protenas de las uniones estrechas
en clulas endoteliales de los microvasos cerebrales. Todos estos datos sugieren que
el papel trfico de los astrocitos sobre las neuronas podra estar mediado en parte por
el FGF2, pero poco se conoce sobre el posible papel autocrino que podra ejercer
sobre los propios astrocitos, lo que convierte en relevante el estudio de los
efectos de FGF2 sobre este tipo celular.
En el SNC se expresan altos niveles de FGF2. Estudios inmunohistoqumicos
muestran que la localizacin de FGF2 en el cerebro es principalmente astrocitaria por
todo el SNC, aunque es expresado tambin en algunas poblaciones de neuronas,
incluyendo las neuronas piramidales del rea CA2 del hipocampo (Gomez-Pinilla et al.,
1992;Woodward et al., 1992;Chadashvili and Peterson, 2006). El FGF2 in vivo se
encuentra tambin distribuido en el citoplasma y ncleo de los astrocitos, siendo ms
intensa la inmunoreactividad nuclear. La presencia de FGF2 en el ncleo ha sido
confirmada por microscopa electrnica y se mantiene en astrocitos en cultivo. En
respuesta a distinto modelos de lesiones traumticas o a la presencia de placas de
amiloide, la expresin del factor aumenta en astrocitos y en el neuropilo (Stopa et al.,
1990a). Estos hechos demuestran que el FGF2 presenta funciones tanto en el cerebro
normal como en respuesta a lesiones.

41

INTRODUCCIN

Control de la expresin de FGF2 en astrocitos


Los niveles de FGF2 en astrocitos son altamente regulables y son modificados por
numerosos estmulos de caracteres muy diversos, hecho que correlaciona con la
especulacin que el FGF2 est altamente implicado en los fenmenos de plasticidad
astrocitaria.
En astrocitos en cultivo ha sido demostrado que la estimulacin con la citoquina proinflamatoria Il-1, factores de crecimiento como PDGF, EGF o el propio FGF2, los
glucocorticoides, neurotransmisiores como el glutamato, la noradrenalina y la
dopamina y activadores de las vas del cAMP (tras activacin de receptores

adrenrgicos), o las PKC son capaces de aumentar la expresin del factor (Pechan et
al., 1993;Li et al., 2006;Riva et al., 1998b;Braun et al., 2009).
In vivo la expresin del FGF es regulada tanta en condiciones patolgicas como
fisiolgicas. Ha sido demostrado que los niveles de FGF2 aumentan especficamente
en el cerebelo y el hipocampo (Gomez-Pinilla et al., 1997;Gomez-Pinilla et al., 1998)
durante el aprendizaje espacial y la actividad fsica, dando lugar a la especulacin que
la actividad neuronal puede regular los niveles de factores trficos y que estos pueden
participar en procesos de memoria y aprendizaje.

Desarrollo
La mayora de funciones que se atribuyen al FGF2 durante el desarrollo del SNC se
conocen a travs del estudio del ratn FGF2 -/-. El KO para el factor es viable y no
presenta grandes alteraciones fenotpicas, a pesar del gran nmero de funciones que
se le atribuyen en el desarrollo, salvo una reduccin en el tamao del cortex y retrasos
en la regeneracin de la epidermis e hipotensin (Dono et al., 1998;Ortega et al.,
1998). La reduccin en el tamao cortical es debida a una disminucin en el nmero
de neuronas de la corteza principalmente de reas motoras, debido a defectos en la
capacidad proliferativa de los precursores neurales. Adems algunas neuronas
postmitticas no consiguen llegar a su destino quedando acumuladas en el habeas
callosum (Dono et al., 1998). Paralelamente, la inyeccin intraventricular de FGF2 en
ratones embrionarios promueve un aumento en el tamao de la corteza debido a un
aumento de neuronas y astrocitos (Vaccarino et al., 1999). Todo esto hacer pensar
que el FGF2 regula durante el desarrollo la capacidad proliferativa de los precursores
neurales.

42

INTRODUCCIN

Neurognesis y gliognesis
Durante muchos aos, el cerebro adulto ha sido errneamente considerado como una
estructura totalmente postmittica. En los ltimos aos se ha demostrado que existen
en el cerebro adulto clulas madre en zonas cerebrales determinadas capaces de
diferenciarse en neuronas y/o astrocitos sustituyendo clulas daadas. (Robel et al.,
2011). Las clulas madre adultas se caracterizan por ser capaces de auto-renovarse y
de dar lugar a diferentes tipos de clulas tras su diferenciacin. Estas caractersticas
dependen del entorno o nicho en el que se encuentran y depende en gran partida de
seales solubles de clulas diferenciadas adyacentes y de componentes de la matriz
extracelular.
En el cerebro adulto de los mamferos existen bsicamente dos regiones donde se
produce neurognesis: la zona subventricular (SVZ) en las paredes de los ventrculos
laterales y la zona subgranular (SGZ) del giro dentado del hipocampo. Numerosos
factores de crecimiento y hormonas tienen la capacidad de promover la proliferacin
y/o diferenciacin de los precursores neurales localizados en estas zonas, entre ellos
el FGF2.
Aunque varios estudios han demostrado el potencial neurognico del FGF2 in vitro en
precursores de ambas zonas, este factor parece promover neurognesis en la SVZ,
mientras que los progenitores de la SGZ aparentemente responden en menor medida
a FGF2 en el adulto. En la SVZ el FGF2 se expresa en clulas GFAP+, pero est
ausente en clulas precursoras que por el contrario s expresan FGFRs. El FGF2
parece regular la capacidad neurognica de la SVZ manteniendo un pool de clulas
indiferenciadas que proliferan a una velocidad muy lenta, bien alargando la duracin
del ciclo celular bien alterando la diferenciacin.
El tratamiento con FGF2 tras diversos tipos de lesiones como trauma (Tripathi and
McTigue, 2008) o isquemia (Fagel et al., 2009) parece promover la recuperacin
funcional a travs de un aumento en la neurognesis. Este hecho es de vital
importancia para la clnica ya que el FGF2 puede ser administrado por va intranasal
por ser capaz de atravesar la BHE, evitando as todos los efectos secundarios
negativos que el factor puede desencadenar tras una administracin sistmica (Wang
et al., 2008).
Adems de regular la adquisicin de un fenotipo neuronal, el FGF2 regula tambin
diversos pasos de la gliognesis. Durante la formacin del neocorteza el balance entre
43

INTRODUCCIN

la glia radial, cuya poblacin es capaz de autoregenerarse, y la produccin de clulas


precursoras a las que da lugar es esencial en la generacin del tamao y composicin
correcta de la corteza. Se ha demostrado que el FGF2 promueve el mantenimiento del
fenotipo de glia radial reprimiendo la transicin de glia radial a progenitores (Kang and
Song, 2010). Adems la sealizacin por los FGFRs participa de manera muy
importante en el correcto posicionamiento de la glia en el cortex durante el desarrollo,
siendo el FGFR2 el receptor que permite a la glia radial translocar a travs de la
corteza, y adquirir el fenotipo de astrocito maduro (Smith et al., 2006).
El FGF2 regula tambin el nmero de oligodendrocitos en el SNC, siendo su efecto
principalmente inhibidor ya que disminuye la diferenciacin de los precursores de
oligodendrocitos a oligodendrocitos maduros, tanto in vitro (Zhou et al., 2006), como in
vivo evidenciado por un menor nmero de oligodendrocitos maduros en los mutantes
FGF2 -/- (Murtie et al., 2005)

Crecimiento y ramificacin axonal


Adems de participar en la prolifercin y maduracin de precursores neuronales, el
FGF2 es un potente estimulador de la morfognesis de las neuronas. Un paso
importante en la adquisicin de la morfologa madura de las neuronas es el
crecimiento y ramificacin axonal (Kalil et al., 2000). En comparacin con otros
factores de crecimiento como BDNF y NT-4 que tambin influencian estos procesos, el
FGF2 es un potente estimulador del crecimiento y ramificacin axonal.
En neuronas corticales en cultivo, el FGF2 produce un aumento en el tamao del cono
de crecimiento, disminuyendo su avance y promoviendo un aumento dramtico en la
ramificacin del axn (Szebenyi et al., 2001). Este efecto es tambin visible en
neuronas hipocampales en cultivo, y se observa de manera ms pronunciada con
FGF2 que con otras neurotrofinas. Cabe destacar que el aumento en la ramificacin se
observa en el axn pero no sobre las dendritas (Patel and McNamara, 1995). Todas
estas observaciones hacen pensar que el FGF2 puede participar en la remodelacin
axonal en el desarrollo o tras una lesin que comprometa la integridad de los axones.
Uno de los componentes crticos en el establecimiento de una correcta conectividad en
el SNC es el direccionamiento de los axones a sus dianas especficas, que se
consigue a travs de la interaccin del cono de crecimiento axonal con seales
moleculares en el entorno. El FGF2 modula tambin este paso de la gua de los
axones a su destino correcto. Se ha demostrado que este factor regula la expresin de
44

INTRODUCCIN

seales moleculares como la semaforina3A o slit1 durante el desarrollo del tracto


ptico en Xenopus que va desde las clulares ganglionares de la retina hasta el
tectum ptico en el cerebro (Pollock et al., 2005).

Maduracin de sinapsis y transmisin sinptica


Para el establecimiento de las sinapsis maduras, se requiere un proceso de
maduracin en el que el cono de crecimiento axonal de la neurona pre-sinptica sufre
cambios hasta convertirse en un botn axonal correctamente ensamblado con el
terminal post-sinptico. Para ello molculas de origen post-sinptico sealizan sobre al
axn para cesar el crecimiento y formar sinapsis. La formacin de sinapsis comporta el
correcto posicionamiento de las membranas pre y post-sinpticas a una distancia
constante formando la hendidura sinptica en la que sern liberados los
neurotransmisores; este proceso depende mayoritariamente de la formacin de
uniones entre cadherinas. A continuacin es necesario la formacin coordinada, en un
proceso dependiente del citoesqueleto, de las denominadas zonas activas,
especializadas en la liberacin y reciclaje de vesculas de neurotransmisores en la
membrana pre-sinptica, y de la zona de densidad post-sinptica compuesta por una
gran cantidad de receptores, canales inicos, protenas de ensamblaje y maquinaria
de transduccin de seales. Algunos factores trficos entre ellos el FGFs, WNTs i
TGF ha sido relacionado con algunos pasos de la maduracin axonal (Terauchi et al.,
2010).
El FGF2 juega un papel importante en el ensamblaje del terminal pre-sinptico, ya que
es capaz de promover el clustering de protenas pre-sinpticas como la
sinaptotagmina dando lugar a zonas activas de docking y liberacin de vesculas (Dai
and Peng, 1995) y de reciclaje de estas (Li et al., 2002). Estos efectos van
acompaados de un incremento en puncta de PSD95 y GluR1 en la membrana postsinptica (Li et al., 2002), demostrando que el FGF2 es capaz de regular la formacin
de sinapsis en cultivo. Paralelamente, otra protena de la familia FGF, el FGF22
producido por neuronas granulares cerebelares ha sido implicada en la formacin de
sinapsis con las fibras musgosas in vivo (Umemori et al., 2004). Este fenmeno se
produce a travs de la activacin del FGFR2 que puede ser tambin activado por
FGF2. En otro estudio se demuestra que el FGF2 interviene en la remodelacin
sinptica despus de una lesin participando en el mantenimiento y/o mejorando la
recuperacin despus de una sobre-estimulacin sonora de los terminales del ncleo
coclear (D'Sa et al., 2007).

45

INTRODUCCIN

Transmisin Sinptica
El FGF2 es un neuromodulador de la transmisin sinptica y dada su expresin
principalmente astrocitaria podra considerarse como un gliotransmisor. Disminuye la
amplitud de las oscilaciones en la concentracin de Ca2+ intracelular en neuronas
corticales in vitro (Tanaka et al., 1996). Participa en el procesos de memoria,
facilitando la generacin de LTP disminuyendo el umbral a partir del cual se puede
producir este fenmeno (Ishiyama et al., 1991), o mejorando el dficit en el aprendizaje
inducido por lesin (Ishihara et al., 1992). Estos efectos parecen ser mediados a travs
del FGFR1 ya que el mutante KO para este receptor muestra dficit para LTP y
consolidacin de la memoria (Zhao et al., 2007). Tambin se ha descrito que los FGFR
pueden unirse a los receptores de adenosina A2a modulando la plasticidad sinptica
(Flajolet et al., 2008). El FGF2 modula tambin la liberacin de neurotransmisores
como la dopamina (Forget et al., 2006b) o el glutamato (Numakawa et al., 2002) y
regula la expresin de algunas subunidades de receptores NMDA (de vital importancia
en la LTP) modificando la composicin de este receptor y reduciendo as la entrada de
Ca2+ provocada por la activacin de este receptor (Brandoli et al., 1998).

Depresin-Ansiedad
Como se ha discutido, el FGF2 ejerce funciones neurotrficas sobre poblaciones
especficas de neuronas y previene la muerte neuronal en diferentes tipos de lesiones
mecnicas y qumicas. Se puede especular que la reduccin de la expresin de FGF2
en astrocitos ligada a la edad, podra aumentar la vulnerabilidad de las poblaciones
neuronales sobre las que ejerce su funcin trfica. Es bien conocido el papel del BDNF
(Hashimoto, 2010) en la depresin y estudios recientes parecen indicar que FGF2
puede tambin ser relevante en la etiologa y tratamiento de ciertas alteraciones
psiquitricas. Un estudio en muestras post-mortem de pacientes con depresin severa
y trastorno bipolar muestra una reduccin en la expresin del FGF2 especficamente
en los cerebros de pacientes con depresin respecto a los controles y los enfermos
bipolares (Evans et al., 2004).
El estrs es uno de los mayores factores de riesgo en la aparicin de trastornos
psiquitricos. Un estrs agudo como la inmovilizacin, puede inducir en ratas la
expresin de FGF2 en diversas zonas cerebrales incluyendo la corteza prefrontal y el
hipocampo. Este efecto parece depender del la activacin del eje hipotalmicopituitario-adrenal ya que puede ser mimetizado por el tratamiento con agonistas del
receptor de glucocorticoides. Esta regulacin aguda de la expresin del FGF2 puede
representar un intento de impedir los daos producidos por la exposicin crnica al
46

INTRODUCCIN

estrs y evitar as los efectos deletreos sobre las neuronas observados en la


depresin mayor (Molteni et al., 2001).
El mecanismo de accin de los antidepresivos no es bien conocido. La mayora de
ellos son inhibidores de la recaptacin de serotonina y noradrenalina, pero este
mecanismo no explica la eficacia de estos frmacos que requieren un tratamiento
crnico. Algunos estudios muestran que los antidepresivos como la desipramina y la
fluoxetina son capaces de inducir la expresin del FGF2 en el cortex y el hipocampo
de ratas (Mallei et al., 2002) y tambin de otros factores trficos como BDNF y NGF.
Este efecto no est restringido a los antidepresivos sino que los ansiolticos, como el
diacepam, son tambin capaces de aumentar la expresin de este factor (GomezPinilla et al., 2000). Dado que los efectos sobre el comportamiento de los
antidepresivos pueden ser mediados por la estimulacin de la neurognesis en el
hipocampo (Santarelli et al., 2003), y como ya ha sido discutido, el FGF2 juega un
papel importante en la neurognesis, la modulacin de la expresin o sealizacin de
este factor puede que est contribuyendo en estos efectos plsticos.
Estudios recientes ponen de relevancia el papel de FGF2 en el control de la ansiedad.
Perez et al demuestran que ratas con un fenotipo ansioso muestran un reduccin en la
expresin de FGF2 hipocampal respecto a las ratas control, y que este efecto puede
ser rescatado por el enriquecimiento del ambiente en el que viven las ratas.
Paralelamente el tratamiento crnico con FGF exgeno reduce la ansiedad a travs de
un aumento en la supervivencia de nuevas clulas generadas en el hipocampo,
particularmente de astrocitos. Los autores proponen al FGF2 como un inhibidor
endgeno de la ansiedad

que mediara sus efectos sobre el comportamiento

modificando los circuitos hipocampales (Perez et al., 2009). En otro estudio se pone de
manifiesto el posible papel de FGF2 en la extincin del miedo aprendido posttraumtico y en su reaparicin (Graham and Richardson, 2011).

Adiccin-Dopamina
EL FGF2 parece tener una importante funcin en el establecimiento y mantenimiento
del sistema de transmisin dopaminrgico (Grothe and Timmer, 2007). Durante el
desarrollo los niveles de FGF2 en reas cerebrales donde se encuentran las neuronas
dopaminrgicas, como el mesencfalo y el estriado, son altos. Adems promueve la
supervivencia de neuronas dopaminrgicas tanto in vivo como in vitro (Jensen et al.,
2011). En pacientes con enfermedad de Parkinson la inmureactividad para FGF2 en la
sustancia nigra disminuye (Tooyama et al., 1993), revelando un posible ciclo de
47

INTRODUCCIN

feedback entre los niveles de dopamina y la expresin del factor. Recientemente ha


sido demostrado que en respuesta a dopamina la expresin de FGF2 aumenta en
astrocitos estriatales por mecanismos dependientes de oscilaciones de Ca2+ y este
efecto promueve la supervivencia de neuronas dopaminrgicas (Zhang et al.,
2009;Reuss and Unsicker, 2000). Paralelamente, el FGF2 controla tambin la
susceptibilidad a dopamina de los astrocitos regulando la expresin de los receptores
astrogliales de dopamina en coteza y en estriado (Reuss et al., 2000). Todos estos
datos revelan que el control de los niveles de FGF2 puede ser una interesante diana
teraputica para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
La exposicin repetida a drogas estimulantes como la cocana o las anfetaminas, que
actan como agonistas dopaminrgicos indirectos a travs de la elevacin de los
niveles de dopamina sinpticos, resulta en una sensibilizacin a sus efectos en el
comportamiento y en el sistema dopaminrgico. Esta sensibilizacin, que produce un
aumento de los efectos de las drogas, se produce por cambios plsticos en el rea
tegmental ventral (VTA), un ncleo neuronal dopaminrgico que depende de
inervacin glutamatrgica. En los ltimos aos se ha demostrado que el fenmeno de
la sensibilizacin es dependiente de la transmisin glutamatrgica y recientemente se
ha demostrado que el FGF2 est tambin implicado. Durante la sensibilizacin a
anfetaminas la expresin del FGF2 aumenta en astrocitos del VTA de manera
dependiente de glutamato, y la interferencia en la sealizacin de este factor mediante
anticuerpos bloqueantes previene el establecimiento de la sensibilizacin (Flores and
Stewart, 2000). El aumento del FGF2 en los astrocitos del VTA es duradero en el
tiempo, observndose hasta meses despus de la ltima administracin de
anfetamina, y correlaciona con la permanencia de la sensibilizacin (Flores et al.,
1998).

3.5. Papel del FGF2 en la inflamacin cerebral


En condiciones patolgicas como el infarto cerebral se ha descrito un aumento
generalizado de la expresin del FGF2 en astrocitos y neuronas pero tambin en
microgla y clulas endoteliales (Issa et al., 2005). En esta misma patologa el
tratamiento con FGF2 resulta en una reduccin de la prdida de neuronas y en una
mejora en la recuperacin funcional (Baldauf and Reymann, 2005). En cerebros con la
enfermedad de Alzheimer existe un aumento de la expresin de FGF2 alrededor de las
placas de amiloide, particularmente en zonas de gliosis (Stopa et al., 1990b). En un
modelo animal de esclerosis mltiple la expresin de FGF2 aumenta en astrocitos y
microgla en zonas de desmielinizacin (Messersmith et al., 2000).
48

INTRODUCCIN

Es bien sabido que enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de


Alzheimer, la esclerosis mltiple o la enfermedad de Parkinson cursan con un
importante componente inflamatorio. Durante el desarrollo de estas patologas se ha
descrito la liberacin de neurotrofinas y factores de crecimiento (como acabamos de
ver para el FGF2 en el apartado anterior), citoquinas y quimiocinas por parte de las
clulas gliales. As como el papel de las citoquinas y quimiocinas en regular
aspectos generales de la reaccin inflamatoria y en mediar quimiotaxis son bien
conocidos, la funcin de los factores de crecimiento en la inflamacin ha sido
poco estudiada.
Existen precedentes que atribuyen al FGF2 un papel anti-inflamatorio. En clulas
microgliales el tratamiento con el factor disminuye la liberacin de especies reactivas
de oxgeno inducidas por TNF- (Colasanti et al., 1995). Adems, el FGF2 disminuye,
en clulas endoteliales, la expresin de molculas de adhesin como ICAM o VCAM y
de quimiocinas como MCP1 y IL-8 reduciendo lo capacidad de monocitos de migrar a
travs del endotelio (Zhang and Issekutz, 2002). Se ha descrito tambin la facultad del
FGF2 en inducir la activacin del factor de transcripcin CREB, que en el contexto de
la inflamacin puede inhibir la expresin de genes inflamatorios como la NOS2
(Gavrilyuk et al., 2001).
Algunos estudios han mostrado el potencial de otros factores de crecimiento en regular
la inflamacin cerebral. El TGF- parece tener un papel claramente antiinflamatorio ya
que reduce la sobreexpresin de quimiocinas(Guo et al., 1998), la produccin de TNF (Benveniste et al., 1995) y de ICAM1 (Shrikant et al., 1996b) en astrocitos. La
vasopresina es capaz de reducir la expresin de IL-1 y TNF-

a travs de la

activacin de CREB (Zhao and Brinton, 2004). Por otra parte el factor neurotrfico
PEDF induce per se la expresin de citoquinas y quimiocinas mediante la activacin
del factor de transcripcin NF-kB en astrocitos y microgla (Takanohashi et al.,
2005;Yabe et al., 2005).

Dado que el papel de las neurotrofinas en la inflamacin cerebral es poco


conocido y considerando numerosas evidencias que muestran que, en concreto,
FGF2 se sobre-expresa en astrocitos en diversas patologas que cursan con un
componente inflamatorio, hemos examinado en este trabajo el posible papel
autocrino de este factor sobre los astrocitos, en un modelo in vitro analizando
dos aspectos relevantes en la reactividad glial como son la expresin de genes
49

INTRODUCCIN

inflamatorios y la capacidad migratoria, as como la vas de sealizacin


implicadas en estos efectos.

4. Efecto protector de los antiinflamatorios no esteroideos


sobre la aparicin de la enfermedad de Alzheimer.
Como dijimos anteriormente, el cerebro muestra reacciones inflamatorias tambin
durante enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson o el Alzheimer, por lo
que tambin es importante entender el papel de la reactividad astrocitaria y su
componente migratorio, y su potencial teraputico en estas enfermedades.
El aumento de la esperanza de vida en nuestra sociedad ha supuesto tambin un
incremento en la prevalencia de la enfermedad de Parkinson o la enfermedad de
Alzheimer. Dado que este alargamiento de la duracin de la vida no se correlaciona en
todos los casos con una preservacin de la calidad de sta, actualmente se invierten
grandes recursos en la investigacin de estas enfermedades, tanto en aspectos de
prevencin y/o curacin, as como de identificacin de los factores que las provocan y
los mecanismos que actan en su desarrollo.

4.1 Etiologia y patologa de la enfermedad de Alzheimer


La enfermedad de Alzheimer (o AD) es la forma ms comn de demencia siendo
responsable del 50-60% de los casos. Es una de las patologas con mayor prevalencia
en nuestra sociedad, siendo de un 1,5% a los 65 aos de edad y aumentando hasta
un 30% a los 85 aos (Barranco-Quintana et al., 2005;Ferri et al., 2005). Las
consecuencias de esta enfermedad son la prdida progresiva de las principales
cualidades humanas: memoria, entendimiento, juicio, abstraccin y lenguaje. Fue
descrita por Alois Alzheimer en 1906, al presentar a la comunidad cientfica los
resultados de la neuropatologa de una de sus pacientes, August D, que presentaba a
los 56 aos una demencia progresiva acompaada de delirios y alucinaciones
(Bertram and Tanzi, 2005). Para el correcto diagnstico de la enfermedad de
Alzheimer es necesario un estudio neuropatolgico para excluir otras posibles
demencias. El cerebro de un paciente afectado por esta enfermedad presenta una
atrofia hipocampal y cortical, paralelamente a un incremento en el volumen de los
ventrculos cerebrales. En el plano microscpico se observa una prdida de neuronas
en el sistema lmbico y la corteza asociativa y en algunos ncleos subcorticales que
proyectan a estas zonas. Las alteraciones ms caractersticas que se hallan en los
50

INTRODUCCIN

cerebros de los pacientes de AD son la presencia de ovillos neurofibrilares


(neurofibrillary tangles, NFT), formados principalmente por acumulaciones de la
protena tau hiperfosforilada, y el incremento en el nmero y tamao de las placas
seniles, formadas mayoritariamente por el pptido A. Estos dos tipos de lesiones se
hallan de manera abundante en la corteza, hipocampo, amgdala y algunos otros
ncleos subcorticales (O'Brien, 1996). Los NFT estn formados de filamentos
helicoidales aparejados o PHF. Los PHF estn constituidos en gran parte por la
protena asociada a microtbulos tau, anormalmente hiperfosforilada por diferentes
kinasas. La fosforilacin de tau es un evento que provoca la disociacin de esta
protena de los microtbulos, a los que se encuentra unida en condiciones normales,
perdiendo su solubilidad, dando lugar a los PHF que al agregarse entre s originan los
NFT. stos se acumulan principalmente en cuerpos neuronales y dendritas,
provocando daos sinpticos y muerte neuronal (Friedhoff et al., 2000). Las placas de
amiloide estn formadas de un ncleo central de A, normalmente de 40 y 42
aminocidos, y estn rodeadas de axones y dendritas degenerados y clulas gliales
activadas (tanto astrocitos como microglia). Los pptidos A de 40 y 42 aminocidos
son generados constitutivamente por el corte secuencial de la protena precursora de
amiloide (APP), por parte de las beta y gamma secretasas. La forma A42 del amiloide
presenta una mayor tendencia a la agregacin, siendo la especie de A ms txica. A
menudo, adems de la afectaciones neuronales descritas, aparecen tambin lesiones
vasculares caractersticas, como la Angiopata Cerebral Amiloide (CAA), la
degeneracin microvascular o lesiones periventriculares en la sustancia blanca (de la
Torre, 1997;Kalaria, 1999).
El pptido A se deriva del procesamiento de la protena precursora del amiloide
(APP). APP es una glicoprotena transmembrana expresada ubicuamente y de forma
constitutiva, cuyas funciones fisilogicas son: regulacin del crecimiento de la
dendritas (Sabo et al., 2003), migracin de los precursores neurales durante el
desarrollo (Young-Pearse et al., 2007), interacciones clula-matriz extracelular
(Mattson, 1997), regulacin de la sealizacin por Ca2+ en respuesta a ApoE o del
mismo A (Leissring et al., 2002;Reinhard et al., 2005). El APP puede ser procesado
por dos vas distintas:
-

La va no amiloidognica: que es la predominante en condiciones normales. Al


inicio de esta va el APP es proteolizado por la actividad -secretasa,
constituda

por

proteasas

de

la

familia

ADAM

(a

desintegrin

and

metalloproteinase) como las ADAM9, ADAM10 y ADAM17. El corte del APP se


produce por el dominio A impidiendo as la formacin de este pptido txico.
51

INTRODUCCIN
La porcin C-terminal restante es cortada por la actividad enzimtica secretasa, formada por un complejo multiproteico que contiene como unidad
cataltica a la presenilina-1 (PS-1) o la presenilina-2 (PS-2), y a PEN-2
(presenilin enhancer-2), nicastrina (NCT) como protenas adaptadoras.
(Edbauer et al., 2003).
-

La va amiloidognica: en la que durante el procesamiento del APP se genera


el pptido A. El primer corte es realizado por el enzima BACE (-site APP
cleaving enzyme) de la actividad -secretasa (Sastre et al., 2006), seguido de
un segundo corte por parte de la -secretasa. El A as generado presenta
distinto nmero de aminocidos, siendo las formas mayoritarias las de 40 y 42
aminocidos, de las que, como ya se ha comentado, el A42 es el que
presenta mayor tendencia a agregarse (Munoz and Inestrosa, 1999)

La enfermedad de Alzheimer es una patologa heterognea que se presenta con una


etiologa de origen familiar o espordico. El Alzheimer familiar (FAD) es una
enfermedad autosmica dominante que aparece en edades tempranas (antes de los
65 aos) y representa menos del 5% del total. La mayora de pacientes de FAD
presenta mutaciones en los genes del APP o de la presenilinas. El gen APP fue
clonado a partir del anlisis del amiloide cerebrovascular de pacientes de AD en el
cromosoma 21. Al cabo de poco tiempo un estudio estableci un relacin entre una
mutacin en el cromosoma 21 con la aparicin de la patologa en cuatro familias que
presentaban FAD y la descripcin de la primera mutacin en el gen del APP, revisado
en (Bertram and Tanzi, 2005). An as, la mutaciones en el gen del APP explican slo
un pequeo porcentaje de la FAD, entre un 5-7 % (Small, 1998).
Posteriormente se clon el gen de la PS-1 en el cromosoma 14, que representa el
locus mayoritario que origina el Alzheimer de tipo familiar (Sherrington et al., 1995).
Actualmente hay descritas ms de 160 mutaciones en el gen de la PS-1, y bastantes
menos en su homlogo la PS-2, que causan FAD. Las mutaciones en los genes de las
presenilinas se localizan en las regiones transmembrana que son las ms
conservadas y conllevan un aumento en la relacin A42/ A40, bien por un aumento
en la produccin del A42, bien por una disminucin en la generacin de A40 o una
combinacin de ambos (De, 2007).

52

INTRODUCCIN

En el caso de la AD no familiar se han identificado numerosos factores de riesgo


asociados a un mayor riesgo de sufrir esta patologa. Entre ellos se pueden citar la
edad, la arterioesclerosis, la hipertensin, la diabetes, lesiones cerebrales, la
hiperhomocisteonemia, la hipercolesterolemia, factores trombognicos, y la dosis
gnica del alelo 4 del gen de la apolipoproteina E (ApoE), (Corder et al.,
1993;Gorelick, 2004;Saunders et al., 1993). Este gen codifica para una lipoprotena
plasmtica que participa en la recaptacin de varios lpidos, entre ellos el colesterol, y
que podra participar tambin en el metabolismo del A. El alelo 4 de ApoE presenta
una alta asociacin con la aparicin del AD espordico pero tambin del FAD,
mientras el alelo 2 parece ser protector frente a la patologa (Corder et al.,
1994;Bertram and Tanzi, 2005).
A pesar de la asociacin de estos factores de riesgo, la etiologa de la AD espordica
no es bien conocida desde el punto de vista bioqumico. Se piensa que la prdida de
control sobre los niveles de formacin y degradacin del A podra ser una de las
primeras alteraciones, pero evidencias recientes muestran que terapias enfocadas a
reducir la formacin de A mediante semagacestat, un inhibidor selectivo de la
presenilinas, no son efectivas en reducir el avance de la enfermedad (Cummings,
2010;Imbimbo and Giardina, 2011), poniendo en duda la teora segn la cual el A
sera el principal causante de la AD.
Existen evidencias experimentales que muestran que el estrs oxidativo juega un
papel importante en el desarrollo y la evolucin de la AD. En estados leves de AD, o
en pacientes de AD ya se observan marcadores oxidativos en protenas, lpidos y
cidos nucleicos y una disminucin en los sistemas antioxidantes (Pratico et al.,
2002;Behl, 2005). Hay que tener en cuenta que el cerebro es un rgano especialmente
sensible al estrs oxidativo por su naturaleza rica en cidos grasos peroxidables, una
alta tasa metablica y por lo tanto un consumo de oxgeno muy alto, y una menor
disponibilidad de antioxidantes que en tejidos perifricos. Existe tambin una estrecha
relacin entre el estrs oxidativo, la deposicin de A y la inflamacin subyacente a la
patologa (Tamagno et al., 2002;Lustbader et al., 2004). Un estudio muestra que el
tratamiento con citoquinas pro-inflamatorias causa un aumento de la liberacin de A
en neuronas que sobre-expresan la protena APP (Sastre et al., 2003). El mecanismo
parece ser un aumento de la expresin y de la actividad de la (BACE1). Es decir, se
crea un crculo vicioso en el que la A desencadena una respuesta inflamatoria que a
su vez favorece su produccin y depsito.

53

INTRODUCCIN

4.2 Fases de la enfermedad Alzheimer


La AD es una patologa de lenta evolucin que se puede definir en fases. La primera
es una fase pre sintomtica en la que la mayora de individuos no presentan sntomas
congintivos y en la que empiezan a acumularse el pptido A y la protena tau
hiperfosforilada. Esta primera fase tiene una larga duracin, pudiendo durar dos
dcadas antes de la manifestacin de los primeros sntomas de demencia. A
continuacin, las lesiones acumuladas progresivamente durante aos por el depsito
anormal de protenas se manifiestan en alteraciones sinpticas y metablicas que dan
lugar a los primeros sntomas cognitivos. En esta fase los pacientes muestran
alteraciones en la memoria, principalmente prdidas en la memoria episdica, a los
que se refiere genricamente, como mild cognitive impairment (MCI). La ltima fase en
la evolucin de la AD es la demencia, definida como una disfuncin en varios dominios
que son suficientemente severos para producir prdida de funcin, y cursa con atrofia
cerebral (Jack, Jr. et al., 2010).

4.3 Tratamientos
Actualmente no existe cura para la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, existen
frmacos que pueden ayudar a controlar sus sntomas. Adems, los tratamientos
tambin estn disponibles para ayudar a manejar la agitacin, depresin o los
sntomas sicticos (alucinaciones o delirios), que suelen ocurrir a medida que la
enfermedad progresa.
Tratamiento sintomtico: Existen cinco frmacos aprobadas por la Food and Drug
Administration (FDA) que pueden controlar los sntomas y retrasar la progresin de la
AD. Cuatro de ellas, son inhibidores de la colinesterasa: Cognex (tacrine), Aricept
(donepezil), Exelon (rivastigmine), y Razadyne (galantamine), bloquean la
degradacin metablica de la acetilcolina, manteniendo concentraciones ms elevadas
de este neurotransmisor (Larner, 2010). Esto retarda la progresin del deterioro
cognitivo y puede ser eficaz para algunos pacientes con AD. El quinto frmaco,
Namenda (memantine), antagonista de los receptores NMDA, est aprobado para el
tratamiento de la AD, de tipo moderada hasta la grave (Cranwell-Bruce, 2010).
Namenda protege las neuronas frente a la excitotoxicdad inducida por glutamato que
se libera en grandes cantidades por las clulas daadas del cerebro de la AD
(Volbracht et al., 2006).

54

INTRODUCCIN

Paralelamente en etapas intermedias de la enfermedad, cuando empiezan a aparecer


los primeros sntomas cognitivos tambin existen medicamentos para controlar la
depresin, ansiedad y comportamiento psictico, incluidos los pensamientos
paranoicos, delirios y alucinaciones. Estas personas tambin pueden mostrar
agresividad

hiperactividad.

Los

medicamentos

para

estos

sntomas

son

considerados cuando las alternativas no medicinales han fracasado y/o estos sntomas
ponen en peligro al paciente de AD o a su entorno.
Puesto que los tratamientos actuales son solo paliativos para los sntomas de la AD, el
desarrollo de un tratamiento para curar esta enfermedad es uno de los retos de la
neurociencia actual. Numerosos ensayos clnicos son lanzados cada ao. De la
diversas estrategias que se han ensayado a continuacin se destacan las siguiente:
Tratamientos anti-oxidantes: Hemos comentado anteriormente que el estrs
oxidativo constituye uno de los causantes del dao celular que se produce durante el
desarrollo de la AD. La vitamina E puede ofrecer cierta proteccin contra el dao
celular causado por los radicales libres (Ayasolla et al., 2004). Sin embargo, las
investigaciones han producido resultados conflictivos y un estudio cientfico riguroso
ser necesario para aclarar el papel de este antioxidante en la evolucin de esta
patologa (Devore et al., 2010;Lee et al., 2010). Otros compuestos que han sido
testados con el fin de prevenir la AD o el deterioro cognitivo son: el extracto de ginkgo
biloba (Janssen et al., 2010), la curcumina (Zhang et al., 2010a), los cidos grasos
omega-3 (Huang, 2010) o el selenio (van et al., 2010).
Inmunoterapia: En 1999 algunos estudios revelaron que la inyeccin del pptido A
por s mismo, llamada inmunizacin activa, era capaz de inducir en ratones la
produccin de anticuerpos contra el pptido reduciendo as su acumulacin y la
formacin de placas (Schenk et al., 1999). Alentados por el potencial de la
inmunoterapia, algunas compaas farmacuticas comenzaron los ensayos clnicos
humanos en 2001. No obstante, en 2002, los ensayos se interrumpieron cuando
alrededor del seis por ciento de los participantes desarroll un efecto secundario
potencialmente grave, encefalitis aguda (Munch and Robinson, 2002;Pfeifer et al.,
2002). Las autopsias de varios participantes que murieron de otras causas revelaron
una gran reduccin en nmero y superficie de placas de amiloide, y una disminucin
en la cantidad de NFT y en la reactividad para tau-hiperfosforilada. En el caso de los
participantes del ensayo que desarrollaron anticuerpos, stos evidenciaron una
mejora en funciones como memoria, atencin y concentracin. Ms recientemente,
55

INTRODUCCIN

algunas empresas farmacuticas han comenzado mas ensayos clnicos humanos


utilizando inmunoterapia pasiva, en la que anticuerpos en lugar de protena en s, son
administrados a los pacientes.
Tratamiento con antiinflamatorios no esteroideos: A principios de los aos noventa
fue cobrando fuerza la idea de que la inflamacin es un factor patognico en la
enfermedad de Alzheimer. En esta lnea fue en esa poca cuando se asoci el uso
crnico de anti-inflamatorios no esteroides (AINES) a una proteccin contra la
aparicin de la AD. Se publicaron numerosos estudios epidemiolgicos que mostraban
que pacientes tratados para la artritis con AINES tales como el ibuprofeno tenan un
riesgo menor de padecer la enfermedad de Alzheimer. En Szekely et al., 2004 se ha
realizado una revisin sistemtica de varios estudios epidemiolgicos y se concluye
que los AINES reducen la incidencia de la enfermad de Alzheimer entre un 20 y un
80%, segn el estudio, con un promedio del 50% y que el efecto protector se
manifiesta con ms claridad en pacientes que empezaron el tratamiento antes de tener
sntomas acusados de la enfermedad, es decir, es un efecto ms bien preventivo. Los
estudios epidemiolgicos se han visto confirmados en animales que sobre-expresan
APP, donde el tratamiento prolongado con AINES reduce la activacin glial, la
formacin de placas y mejora el dficit cognitivo (Lim et al., 2000;Lim et al., 2001).

4.4 Efecto protector de los AINES sobre la AD


A pesar de las expectativas generadas por los datos epidemiolgicos, los resultados
del efecto protector de los AINES frente a la AD son paradjicos. La mayora de
ensayos clnicos utilizando diferentes AINES, realizados de manera prospectiva en
pacientes con MCI o estados ya avanzados de la patologa, no han mostrado efectos
beneficiosos o incluso empeoran el estado de los pacientes. Esta falta de efecto se ha
atribuido a la eleccin de los AINES sujetos al estudio, a las dosis empleadas o a que
el efecto protector se manifiesta nicamente en las fases iniciales de la enfermedad.
(Imbimbo et al., 2010). Con la intencin de verificar esta ltima hiptesis, se inici en el
ao 2000 un ensayo preventivo (el ADAPT trial) con personas no afectadas de una
media de edad de 70 aos, utilizando el naproxeno (un AINE con capacidad de inhibir
tanto la COX1 como la COX2) y el celecoxib (inhibidor especfico de la COX2). Este
estudio se detuvo dos aos despus de su inicio porque los participantes parecan
mostrar una mayor incidencia a desarrollar patologas cardiovasculares, adems de no
mostrar efectos protectores frente a la AD (Lyketsos et al., 2007);ADAPT(ADAPT Trial
group, 2006)). An as los participantes del estudio siguieron siendo monitorizados y
se observ que con el paso de los aos, aquellos a los que se haba administrado
56

INTRODUCCIN

naproxeno tenan una reduccin del 70% en el desarrollo de la patologa (Hayden et


al., 2007). Estas evidencias ponen de manifiesto que los AINES muestran efectos
protectores cuando son tomados antes de la aparicin de los sntomas clnicos de la
AD, validando as los estudios epidemiolgicos.
La diana tradicional a travs de la cual los AINES ejercen su efecto anti-inflamatorio
siempre ha sido la COX2, de hecho la inhibicin de esta enzima en astrocitos es capaz
de reducir la gliosis (Heneka et al., 2005). Un giro inesperado en la interpretacin del
efecto preventivo de los AINES en la enfermedad de Alzheimer provino de varias
evidencias. La primera, que el efecto protector de los AINES en la enfermedad de
Alzheimer es independiente de la COX-2, porque inhibidores especficos de esta
enzima como el rofecoxib no tienen un efecto preventivo (Reines et al., 2004). El
segundo, es la demonstracin de que algunos AINES regulan in vitro la actividad de la
gamma secretasa y que dicho efecto es independiente de la COX-2 (Weggen et al.,
2001). Surgi as la idea de que los AINES eran capaces de prevenir la enfermedad de
Alzheimer ms por sus propiedades anti-amiloidognicas que por las antiinflamatorias. En esta lnea se generaron nuevos AINES, mejorados para inhibir la
actividad gamma secretasa y con poco o ningn efecto sobre las COX con la intencin
de reducir los problemas gstricos asociados a la toma crnica de estos frmacos.
Surgieron as frmacos como el R-flurbiprofeno (Kukar et al., 2007) o el CHF5074
(Imbimbo et al., 2007), que a pesar de dar excitantes resultados tanto en modelos in
vitro como in vivo, no han sido efectivos, en el caso del R-flurbiprofeno, en ensayos
clnicos con pacientes (Green et al., 2009). El CHF5074 de la compaa italiana Chiesi
Farmaceutici sigue todava en ensayo clnico. La hiptesis anti-amiloidognica, aunque
todava vigente y objeto de intensa investigacin, tiene algunos puntos dbiles: el
efecto se ha observado slo in vitro y a dosis muy altas, que quiz no se alcancen in
vivo dentro del cerebro, y existen AINES como el naproxeno que tienen un claro efecto
preventivo en estudios epidemiolgicos, pero ningn efecto sobre la gamma secretasa
in vitro discutido por Gasparini et al., 2004.
Por otra parte, la hiptesis anti-inflamatoria no se puede desdear porque existen al
menos dos vas anti-inflamatorias alternativas a la COX-2 que pueden ser moduladas
por los AINES: la va de los PPAR (peroxisome-proliferator activated receptors)
(Landreth and Heneka, 2001), y la va de las Rho-GTPasas, que proponemos
nosotros.

57

INTRODUCCIN

La activacin inflamatoria de los astrocitos implica una profunda reorganizacin del


citoesqueleto de actina que incluye la aparicin y desaparicin coordinada de fibras de
estrs, focos de adhesin, lamelipodios y filopodios. Es decir, existen fenmenos de
plasticidad asociados a la respuesta inflamatoria. Se ha mostrado la mediacin de las
Rho-GTPasas en los cambios morfolgicos (Abe and Misawa, 2003;Avalos et al.,
2004;John et al., 2004), la migracin (Holtje et al., 2005) y en la expresin de genes
inflamatorios en la gla reactiva (Cordle and Landreth, 2005).
As mismo, se ha establecido una relacin entre la actividad de la Rho y el
procesamiento de la protena APP. Un estudio muestra que la estimulacin de Rho en
lneas neuronales transfectadas con una forma mutada de la APP induce la liberacin
de beta amiloide, y revierte el efecto anti-amiloidognico de los AINES (Zhou et al.,
2003). Este estudio es importante porque demuestra, por un lado, que la Rho es una
diana de los AINES y, por otro, porque permite un nexo de unin entre las hiptesis
anti-amiloidognica y anti-inflamatoria. Por lo tanto, se puede deducir que, regulando
las Rho-GTPasas, los AINS tendran varios efectos beneficiosos en la enfermedad de
Alzheimer: i) la reduccin de la liberacin de A, y ii) reduccin de los efectos nocivos
derivados de la inflamacin por vas alternativas a la COX.
En los ltimos aos un nmero creciente de trabajos han puesto de manifiesto que los
AINEs pueden modular a la Rho incidiendo sobre diferentes aspectos de la fisiologa
neuronal y promoviendo la regeneracin de axones en modelos de lesin de espina
dorsal (Dill et al., 2010;Fu et al., 2007a;Wang et al., 2009b). La hiptesis de la
segunda parte de este trabajo es que los AINEs pueden modular la Rho tambin
en los astrocitos y que este efecto podra explicar los efectos preventivos de
estos frmacos sobre la aparicin de la AD. Para validarla hemos examinado la
actividad de distintas Rho-GTPasa en astrocitos en cultivo tras el tratamiento
con AINES y cmo afectan estos cambios de actividad sobre la dinmica del
citoesqueleto y la capacidad migratoria as como las vas de sealizacin
implicadas.

58

Objetivos

OBJETIVOS

Los objetivos de este trabajo han sido:

Trabajo 1:
Objetivo general: Estudiar el papel inmunomodulador del FGF2 en astrocitos.
1.1. Anlisis de la expresin de genes inflamatorios MCP1, COX2, ICAM1
1.2. Anlisis de las vas de sealizacin
1.3. Anlisis de la migracin.

Trabajo 2:
Objectivo general: Estudiar el efecto de los AINES sobre la dinmica del citoesqueleto
de actina en astrocitos
2.1. Anlisis de cambios morfolgicos.
2.2. Anlisis de la migracin.
2.3. Anlisis del papel de las Rho-GTPasas.

60

Materiales y mtodos

MATERIALES Y METODOS

1.Material biolgico
1.1 Cultivos primarios de astrocitos
Los cultivos primarios de astrocitos se obtuvieron a partir de cerebelos de ratas de la
cepa Sprague-Dawley de 7-8 das de edad y, en algunos casos, de corteza de
animales de 0-3 das suministrados por el Servicio de Estabulario de la propia
Universidad Autnoma de Barcelona. El procedimiento experimental fue aprobado por
el Comit tico de la Universidad Autnoma de Barcelona en conformidad con las
lneas directrices de las instituciones nacionales (Generalitat de Catalunya)
Para la realizacin del cultivo hemos utilizado un mtodo de disgregacin enzimticomecnico del tejido, para el que son necesarias las siguientes soluciones que se
preparan frescas justo antes de empezar el procedimiento:
Solucin 1: 50ml de tampn Krebs-Ringer (NaCl 120 mM, KCl 4.8 mM, KH2PO4 1.2
mM, NaHCO3 25 mM, Glucosa 14.3 mM), 0.15 g de albmina de suero bovino (BSA) y
0.4 ml de una solucin 3,8% de MgSO4
Solucin 2: 10ml de solucin 1 conteniendo 2.5mg de tripsina (Sigma)
Solucin 3: 10ml de solucin 1 conteniendo 5.2mg de inhibidor de tripsina (CASA),
0.8mg de DNAsa (Sigma) y 0,1ml de solucin 3,8% de MgSO4
Solucin 4: 8,4ml de solucin 1, 1,6ml de solucin 3
Solucin 5: 5ml de solucin 1 conteniendo 40ul de solucin 3,8% de MgSO4 y 6ul de
una solucin 1.2% de CaCl2.
Los animales fueron sacrificados por decapitacin y la diseccin de los cerebelos o
las cortezas se realiz bajo lupa en campana de flujo laminar en PBS (138 mM NaCl,
2,70 mM KCl, 1 mM Na2HPO4, 1,76 mM KH2PO4, pH 7,4). Los cerebelos fueron
disgregados por trituracin con un bistur. El tejido disgregado se sumergi en la
solucin 1 y se centrifug un pulso a 1500rpm. Seguidamente se aadi al precipitado
la solucin 2, que contiene tripsina, para disgregar enzimticamente el tejido durante
10 minutos a 37C. Trascurrido este tiempo se aadi la solucin 4 para parar la
reaccin enzimtica. Se volvi a centrifugar la suspensin celular con un pulso a
1500rpm, se elimina el sobrenadante y se aade la solucin 3. A continuacin la
suspensin celular se pas 10 veces con una pipeta Pasteur de vidrio a travs de una
malla de nylon de 0.2um, y fue transferida a la solucin 5 para restablecer la
homeostasis celular. Finalmente se centrifug a 1000rpm durante 5 minutos y las

62

MATERIALES Y METODOS
clulas se resuspendieron en medio de cultivo (90 % DMEM (Sigma-Aldrich), 10 %
FBS (Chambrex) suplementado con 2 mM glutamina, 20 unidades de penicilina y 20
g/ml de estreptomicina (Gibco). De esta suspensin se realiz un recuento de clulas
con una cmara de Neubauer utilizando Tripan Blue para descartar las clulas
muertas. Las clulas fueron sembradas a una densidad de 6x105 clulas/ml (astrocitos
cerebelares) o 3x105 (astrocitos corticales) y mantenidas en un incubador a 37C con
una atmsfera de 10% CO2 y 95% de humedad. Las clulas se sembraron en
diferentes tipos de placas de cultivo segn el tipo de ensayo. Para extracciones de
protenas las clulas se sembraron en placas de 100mm (Nunc), para extracciones de
RNA e inmunofluorescencia en placas de 35mm (Corning) y para ELISA en placas de
96 pocillos (Falcon). El medio de cultivo fue cambiado cada 7 das y los cultivos
confluentes se utilizaron entre los das 10 y 12 en caso de los astrocitos cerebelares o
7-9 en el caso de astrocitos corticales que es cuando los astrocitos llegan a
confluencia, evitando la proliferacin masiva de la contaminacin microglial. En el
momento de utilizacin de los cultivos el porcentaje de clulas era de un 90% de
astrocitos y un 10% de microgla

1.2 Tratamiento farmacolgico de clulas en cultivo


Una vez alcanzada la confluencia, las monocapas de astrocitos fueron deprivadas de
suero durante 18 horas antes del procedimiento experimental mediante la incubacin
en DMEM 0% de suero para G-LISA o 1% FBS para los restantes experimentos. En el
caso de utilizar inhibidores farmacogicos, estos fueron aadidos al medio 1h antes
del experiemto. En todos los casos, los tratamientos fueron detenidos colocando las
placas rpidamente en hielo y lavandolas con PBS frio.

1.3 Infecciones virales


Dado que los astrocitos primarios son relativamente resistentes a los mtodos de
trasnfeccin convencionales y ms ampliamente utilizados como son la tcnica del
calcio o los basados en detergentes, hemos optado por la utilizacin de vectores
virales para la introduccin de plsmidos en las clulas.
Adenovirus. Las monocapas confluentes de astrocitos fueron incubadas durante 3
horas en DMEM conteniendo 1% de FBS con adenovirus que codificaban para
mutantes constitutivamente activos (CA) o dominantes negativo (DN) de protenas
Rho-GTPasas: V17-RhoA (CA-RhoA), N17cdc42 (DN-cdc42), V17-Rac1 (CA-Rac1) o
N17Rac1 (DN-Rac1),cedidos por la Dra Beata Wojhack-Stothar y amplificados en el

63

MATERIALES Y METODOS
servicio de produccin de virus del CBATEG. La infeccin se realiz utilizando una
MOI (multiplicity of infection) de 50 en el caso del CA-RhoA, y de 100 para los dems
adenovirus. Alcanzadas las 3 horas, el medio fue sustituido por medio completo al
10% de FBS hasta el da siguiente (18horas) para conseguir una expresin completa
de los mutantes de Rho-GTPasas antes del procedimiento experimental. La expresin
de todos los mutantes fue confirmado mediante Westen Blot.
Retrovirus: Las partculas retrovirales, obtenidas de Sigma, fueron incubadas con las
clulas pre-confluentes (das 7-8 in vitro), en un relacin de 15 l del concentrado
vrico por ml de medio al 10% de FBS durante 24h. Transcurrido este tiempo, el medio
fue cambiado y los experimentos se realizaron 6-7 das despus para permitir la
intergracin de los constructos en el genoma de las clulas infectadas y la reduccin
en la expresin del FGFR2 por accin de los shRNA.

2. Mtodos bioqumicos
2.1 PCR en tiempo real
Se siguieron los siguientes pasos:
Aislamiento del ARN: Tras los tratamientos, el ARN total se extrajo mediante el
reactivo Trizol (Invitrogen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Durante la
fase de precipitacin del ARN en isopropanol se aadi 0.3M de acetato de sodio
(Sigma-Aldrich) para mejorar la eficiencia de esta reaccin. La concentracin del RNA
total se estim por mtodos fluoromtricos mediante el kit comercial Qubit de
Invitrogen.
Retrotranscripcin del ARN: Un total de 1g de ARN se incub con 900ng de
random primers (Invitrogen) 2 minutos a 65C para permitir la linearizacin de los ARN
mensajeros e interaccin con los primers. A continuacin se aadi a las muestras el
siguiente mix de reaccin: 10U de Superscript II en presencia de 0.5mM de dNTPs y
10mM DTT en el tampn adecuado para el enzima en un volumen final de 20ul
(Reactivos de Invitrogen). La reaccin se incub 1h a 42C en un termociclador
seguido de 5 minutos a 95C para desnaturalizar el enzima. Finalmente el cDNA se
diluy en 80ul de tampn Tris-EDTA y las muestras se guardan a -20C
PCR en tiempo real o cuantitativa: 2l de cDNA fueron amplificados en una mezcla

64

MATERIALES Y METODOS
de reaccin que contena 25U de Taq polymerase, 1.5mM MgCl2, 200mM dNTPs
(reactivos de Invitrogen), 0.5M de primers especficos para cada gen de inters (TIB
Molbiol) y SYGB Green (Molecular Probes, 1:100.000), en capilares de vidrio (Roche)
de un volumen final de 20l. Los primers utilizados fueron los siguientes:
MCP1 forward 5-CTTCTGGGCCTGTTGTTCAC-3,
MCP1 reverse 5GGGACGCCTGCTGCTGGTGATTC-3;
ICAM1forward 5- GGGCCCCCTACCTTAGGAA-3,
ICAM1 reverse 5- GGGACAGTGTCCCAGCTTTC-3;
18S forward

5-GGGAGGTAGTGACGAAAAATAACAAT-3,

18S reverse

5-TTGCCCTCCAATGGATCCT-3

El programa de PCR utilizado fue: 30 segundos a 93C (desnaturalizacin), 30


segundos a 58C (annealing) seguidos de 30 segundos a 72C (elongacin) durante
35 ciclos y un ciclo final de 10 minutos a 72C La reaccin se realiz en un
termociclador LightCycler

(Roche) que es capaz de detectar el incremento en la

fluorescencia respecto al ciclo de PCR. Para una cuantificacin precisa de la muestra


se asign un valor umbral por encima del ruido, y se determin en qu punto cada
muesrtra sobrepasaba el valor umbral. Este punto recibe el nombre de ciclo umbral o
Cp (crossing point). Las diferencias en los Cp de la muestras fueron utilizadas para
cuantificar las concentraciones relativas contenidas en cada tubo. La expresin relativa
de los mRNAs se calcul utilizando el mtodo comparativo Cp. Para ello el Cp de las
muestras tratadas se rest del Cp de las muestras controles y el valor obtenido se
utiliz para calcular el ndice de acumulacin de trnscrito (TAI).
TAI=2^(Cp controles-Cp tratadas)
Este clculo asume que todas las reacciones de PCR funcionan con una eficiencia del
100%. La eficiencia de los primers utilizados para estos ensayos de PCR resultaron
ser de entre el 85 y el 110% por lo que esta asuncin introduce errores mnimos en
estos clculos.

2.2 Fraccionamiento subcelular


Para conseguir muestras enriquecidas en fraciones citoslicas o nucleares hemos
utilizado el siguiente protocolo de fraccionamiento subcelular. Despus de los
tratamientos correspondientes, las clulas fueron despegadas de la placa con un
scraper en PBS a 4c, centrifugadas 5 minutos a 1000g

y resuspendidas en un

tampn hipotnico (10mM HEPES pH 7.9, 1.5mM MgCL2, 10mM KCl, 1mM DTT) con

65

MATERIALES Y METODOS
inhibidores de proteasas (Roche) y fosfatasas (Sigma-Aldrich). Tras 5 minutos en hielo,
se aadi detergente NP-40 (Sigma-Aldrich) a una concentracin final de 0.6 %, los
lisados se agitaron 10 segundos con un vortex a la mxima velocidad y se
centrifugaron a 1000g durante 30 segundos. En este punto el sobrenadante contiene
el extracto citoslico, y el pellet est constituido de ncleos. Se recogi el extracto
citoslico y los ncleos se lavaron en el mismo tampn por resuspensin y
centrifugacin. Los extractos nucleares se obtuvieron incubando los ncleos en el
tampn siguiente: 10mM HEPES pH 7.9, 25% glicerol, 400mM NaCl, 1mM EDTA,
1mM DTT con inhibidores de proteasas y fosfatasas durante 30 minutos en agitacin
suave a 4C. A continuacin los extractos se centifugaron a 13000rpm durante 15
minutos se recogi el sobrenadante en el que estn disueltas las protenas nucleares.
La concentracin de protena en la muestra se midi utilizando el mtodo Bradford.
Las muestras se almacenaron a -80C

2.3 Western Blot


Las muestras de protena obtenidas siguiendo el protocolo detallado en el apartado
anterior se diluyeron en tampn de carga (62.5 mM Tris HCl pH 6.8, 10 % Glicerol, 2%
SDS, 5% beta-ME, 0,01% Azul de Bromofenol), fueron hervidas 5 minutos a 95C y
fueron separardas por electroforesis en geles de un porcentaje variable de acrilamida
segn el experimento. Para cada muestra se cargaron cantidades iguales de protenas
entre 5-20g segn la protena a detectar. La electroforesis se realizn en tampn
Tris-glicina pH8.5.
Acabada la electroforesis las protenas fueron transferidas a membranas de PVDF
(Roche) previamente activadas con metanol y equilibradas en tampn de transferencia
( Tris-CAPS: 60mM Tris base, 40mM CAPS, pH 9.6) durante al menos 30 minutos. La
transferencia se realiz por el mtodo semi-seco a voltaje constante a 15V durante 3060 minutos segn el peso molecular de la protena de inters.
Las membranas con las protenas transferidas se bloquearon durante 1 hora en
tampn de bloqueo TBS-T+leche (20mM Tris, 137mM NaCl, pH 7.6 + 0,1 % Tween- +
5% de leche desnatada) para evitar uniones inespecficas. A continuacin las
membranas se incubaron durante toda la noche con el anticuerpo primario pertinente
en tampn de bloqueo a 4C. Tras 4 lavados de 15 minutos con TBS-T la membrana
se incub durante una hora con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa
diluido en tampn de bloqueo (1:5000), a temperatura ambiente. Las protenas se
detectaron mediante un kit de quimioluminiscencia (Santa Cruz) en un film (Kodak).
En algunos casos fue necesario visualizar bandas que migran al mismo peso

66

MATERIALES Y METODOS
molecular; para ello se incubaron las membranas en tampn de stripping (2% SDS,
100mM -mercaptoetanol, 50mM Tris ph 6.8) a 50C al bao mara durante 20
minutos con agitacin. A continuacin se lavaron las membranas con abundante TBST, se bloquearon de nuevo y se incubaron con el nuevo anticuerpo primario.

2.4 Ensayos de retraso de mobilidad electrofortica (EMSA)


Para monitorizar el estado de activacin del factor de transcripcin NF-B, hemos
analizado su capacidad de unirse a ADN que contiene secuencias de unin para este
factor.
Para obtener sonda de doble cadena se incubaron cantidades iguales (1 pmol) de
ambas cadenas sencillas en un termociclador mediante el siguiente programa: 5min a
95C, 10 min 70C, 10min 50C, 10 min 37C y 10 min a 4C. La sonda hibridada se
guard a -20C.
Para marcar radioactivamente la sonda, se incubaron 5l de la solucin que contena
la sonda de doble cadena con 10 unidades de T4 polinucletido quinasa (Fermentas)
en presencia de [32P]ATP (Perkin) en un volumen final de 10l a 37C durante 30
minutos. Para parar la reaccin se aadieron 90l de tampn Tris-EDTA. La
separacin de la sonda marcada del exceso de [32P]ATP se consigue mediante
columnas de Sephadex G-25 (Sigma-Aldrich).
Para permitir la interacciones sonda-protena los extractos nucleares se incubaron 20
minutos a temperatura ambiente en 20l de mix compuesto por 1g poly dI:dC (SigmaAldrich), 50mM Hepes pH 7.5, 1mM EDTA, 5% glicerol y aproximadamente 20000dpm
de sonda de doble cadena marcada con [32P]ATP. Los complejos sonda-protena se
separaron por electroforesis durante 2.5h a 100V a travs de geles de 6 % de
archilamida (BioRad). Los geles contenan tampn Tris-Borato-EDTA 0.5x y fueron
pre-corridos 30 minutos antes de ser utilizados. Una vez acabada la electroforesis los
geles se deshidrataron sobre papel Watman 30 minutos a 80C, y se expusieron en
films (Kodak) durante 12-72h, segn la intensidad de la sonda, a -80C.

2.5 ELISA para la deteccin de ICAM


Una vez realizados los tratamientos, se aspir el medio de la placa de 48 pocillos y las
clulas se lavaron con 200ul de PBS. A continuacin, se fijaron con 200ul de
paraformaldehdo 4% p/v durante 15 minutos a temperatura ambiente y se lavaron 3
veces con PBS durante 5 minutos. Tras bloquear con BSA 5% en PBS durante 30
minutos a temperatura ambiente para eliminar uniones inespecficas, las clulas se
incubaron durante toda la noche con el anticuerpo primario (anti-ICAM-CD54 3ug/mL,

67

MATERIALES Y METODOS
Pharmingen 1A29) a 4C disuelto 1:200 en PBS-BSA 1%. Como control se utiliza
tambin un anticuerpo primario del mismo isotipo (IgG de sueron murino, Sigma) a la
misma concentracin. A continuacin se realizaron 3 lavados y se aadi el anticuerpo
secundario conjugado a la fosfatasa alcalina (Sigma) disuelto 1:1000 en PBS-BSA 1%
durante 1 hora a temperatura ambiente.
Tras 5 lavados con PBS, se incubaron las clulas en 150 ul de tampn de revelado
(400ml H2O, 48.5ml Dietanolamina, 50mg MgCl2, pH8.9) que contiene el sustrato de
la fosfatasa alcalina (Sigma) durante aproximadamente 30 minutos hasta que la
reaccin se revel. La cuantificacin se lleva a cabo por espectofotometra a 450nm en
un lector de placas Bio-TeK Power-Wave XS.

2.6 ELISA MCP


Tras los tratamientos se recogi una alcuota de 100 l de sobrenadante celular, que
fue clarificada por centrifugacin a 2000g , diluda 1/200 y almacenada a

-80C. La

presencia de MCP1 en el medio se llev a cabo mediante un kit comercial de R&D


Systems siguiendo las instrucciones del productor. El rango de especificidad del
ensayo fue de 30-2000 pg/mL.

2.7 Ensayos para determinar la actividad de las Rho-GTPasas (G-LISAS)


Para medir la activacin de las Rho-GTPasas, cdc42, Rac1 y RhoA se estim su unin
al nucletido GTP mediante un kit comercial (G-LISA Activation Assay, Cytoskeleton,
Denver, CO) siguiendo los pasos sugeridos por el fabricante. Se usaron astrocitos
primarios confluentes sembrados en placas de 60mm, que fueron incubados en medio
sin suero 24h antes del experimento. Las clulas fueron tratadas con los frmacos
indicados o con reconocidos activadores de Rac1 y cdc42 como el factor de
crecimiento epitelial - EGF (100ng/ml) durante 2min

o de RhoA como el cido

lipofosfatdico - LPA (10uM) 5min. Alternativamente, las clulas fueron infectadas con
adenovirus que inducan la sobrexpresin de mutantes CA o DN o adenovirus control
(GFP) durante 24h, seguidas de 24h adicionales de deprivacin de suero. Tras los
tratamientos, las clulas se lavaron con PBS enfriado en hielo y se lisaron con un
scrapper en 80-100ul de tampn de lisado (suministrado por el fabricante). Los lisados
se recogieron en tubos eppendorf y fueron rpidamente clarificados por centrifugacin
a 14.000rpm a 4C. Los lisados clarificados fueron inmediatamente congelados a 60
en isopropanol enfriado en nieve carbnica, conservndose una alcuota del clarificado
hielo para la posterior determincin de la concentracin de protena. Despus de
ajustar la concentracin de protena, los lisados se descongelaron en un bao a

68

MATERIALES Y METODOS
temperatura ambiente y se cargaron 50ul en una placa de unin a Rho-GTP. Estas
placas permiten la determinacin del grado de activacin de las diferentes RhoGTPasas ya que sus pocillos estn recubiertos de dominios de unin a estas protenas
(ROCK para RhoA, y PAK para Rac1 y cdc42). Pocillos adicionales se cargaron con
tampn de lisado o con protena Rho-GTP constitutivamente activa, como controles
negativo y positivo respectivamente. La placa se coloc inmediatamente en un
agitador orbital a 400rpm a 4C. Tras 30min de agitacin la placa fue lavada 2 veces
con 200ul de tampn de lavado e incubada durante 2 min en tampn de exposicin
antignica. A continuacin se lav tres veces y se incub durante 45min a temperatura
ambiente con 50ul de anticuerpo primario. Despus de 3 lavados adicionales se
incub en 50ul de anticuerpo secundario ligado a peroxidasa HRP, que permite la
deteccin colorimtrica de los complejos unidos a la placa. Discurridos 45min de
incubacin los pocillos fueron lavados 3 veces y se cargaron con 50ul de una solucin
que contena el sustrato de la peroxidasa a 37C durante 5-10min. La reaccin
colorimtrica

fue detenida con la solucin de Stop 50ul y la seal medida

inmediatamente a 490nm en un lector de placas Bio-TeK Power-Wave XS-

3. Mtodos de biologa celular


3.1 Inmunofluorescencia
Para la deteccin de protenas por inmunofluorescencia de clulas en cultivo se
siguieron los siguientes pasos:
1) Fijacin: Despus de aspirar el medio a las placas de 35mm, las clulas se lavaron
con tampn PBS, y se fijaron con paraformaldehdo durante 30 minutos a 4C.
2) Permeabilizacin y bloqueo de uniones inespecficas: Las clulas se lavaron dos
veces con PBS a temperatura ambiente, se incubaron 15 minutos con PBS
conteniendo el detergente tritn X-100 (Fluka) al 0,1 % v/v, luego se lavaron
nuevamente con PBS para incubarlas con BSA 1 % en PBS durante 30 minutos.
3) Incubacin con el anticuerpo primario: Las clulas se incubaron 18 horas a 4C
con anticuerpo/s especficos para la/s protena/s que se desee detectar en PBS-BSA
0.01 % p/v. Los anticuerpos utilizados fueron los siguientes: GFAP (Sigma; 1:500),
MCP1 (Serotech; 1:3000), ICAM (Pharmingen 1:200), iNOS (Santa Cruz

FGF2

(1:1000 Transduction Labs).


4) Incubacin con el anticuerpo secundario: Tras lavados (3 x 15 minutos) en PBS, las
clulas se incubaron 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios

69

MATERIALES Y METODOS
conjugados con Alexa 488 y 555 (Molecular Probes; 1:1000 en PBS-BSA 0.1% p/v)
Este paso y los sucesivos se realizaron en la oscuridad. Luego se efectuaron lavados
(3 x 15 minutos) con PBS. En algunos casos se marcaron los ncleos de las clulas
con DAPI (Molecular Probes). Para ello tras los 3 lavados con PBS, se realiz una
incubacin de 5 minutos a temperatura ambiente con DAPI 1g/ml disuelto en PBS.
Finalmente las clulas se lavaron con agua destilada para eliminar la presencia de
sales. Las clulas se observaron y fotografiaron en un microscopio de fluorescencia
Nikon Eclipse.

3.2 Ensayos de migracin


La capacidad migratoria de los astrocitos fue analizada mediante el ensayo del scratch
wound assay, que consite en generar una zona libre de clulas de aproximadamente
500m de ancho en monocapa confluentes, generando un herida rascandolas con el
extremo ms fino de una punta amarilla estril. Inmediatamente despus el medio fue
retirado para eliminar la presencia de clulas levantadas y las clulas se incubaron en
medio con un 1% de suero conteniendo el tratamiento durante 0, 12, 24 o 48h, tiempos
a los que fueron fijadas con paraformaldehido 4% y procesadas para la
inmunocitoqumica para GFAP/DAPI y otros. Para el anlisis cuantitativo, fueron
tomadas 4-5 imgenes por condicin a magnificacin 2X y el rea libre de clulas fue
medida utilizando el progama ImageJ.
Para descartar fenmenos de proliferacin en el cierre de las heridas generadas, se
analiz la incorporacin de BrdU en el ADN de las clulas. Para ello se aadi BrdU
(1ug/mL) al medio durante el ensayo en presencia o ausencia de los diferentes
tratamientos. Al finalizar los tratamientos las clulas fueron fijadas, tratadas con HCl
0.1M durante 30min y neutralizadas con un tampn borato 0.1M, pH 8.0 y la BrdU
incorporada se visualoz por inmunofluorescencia, con un anti-BrdU (1:100 Abcam).

4. Mtodos estadsticos
Los experimentos han sido repetidos como mnimo en tres ocasiones. Los
resultados de las grficas muestran la media de los diferentes experimentos
la desviacin estndar. Los grupos experimentales fueron comparados
mediante el anlisis de la variancia con el test ANOVA seguido del test
Neuwman-Kuels post hoc. Los resultados se consideraron estadsticamente
siganificativos si p0,05

70

Resultados

71

RESULTADOS

Captulo 1: JNK/ERK/FAK mediate promigratory actions of basic fibroblast growth


factor in astrocytes via MCP1 and COX2

72

RESULTADOS
Running title: Regulation of astrocyte migration by FGF2
JNK/ERK/FAK mediate pro-migratory actions of
basic fibroblast growth factor in astrocytes via CCL2 and COX2

Mathieu P. Lichtenstein1,2, Jos M. Madrigal3,4, Aurora Pujol5,6,7


and Elena Galea1,2,5

1. Institute de Neurocincies, Universitat Autnoma de Barcelona, Spain


2. Departament de Bioqumica, Universitat Autnoma de Barcelona, Spain
3. Departamento de Farmacologa, Facultad de Medicina, Universidad
Complutense de Madrid, Spain
4. Centro de Investigacin Biomdica en Red de Salud Mental (CIBERSAM),
Spain
5. Catalonian Institute for Advanced Studies (ICREA), Spain
6. Centre de Gentica Mdica i Molecular, Institut d'Investigaci Biomdica de
Bellvitge (IDIBELL), Hospitalet de Llobregat, Barcelona, Spain.
7. Centro de Investigacin Biomdica en Red de Enfermedades Raras
(CIBERER), Spain

Corresponding autor:
Mathieu P. Lichtenstein
Institut de Neurocincies

Key words: Astrocyte, basic fibroblast growth factor (FGF2), c-jun N-terminal kinase
(JNK), cytoskeleton, extracellular-signal regulated kinase (ERK), focal adhesion kinase
(FAK), intercellular adhesion molecule (ICAM) migration, monocyte chemo attractant
protein (CCL2), cyclo-oxygenase 2 (COX2) .

73

RESULTADOS

ABSTRACT

While the role of cytokines in causing pro- and anti-inflammatory cascades in the brain
and that of chemokines in promoting chemotaxis is well recognized, the
immunomodulatory actions of neurotrophins released during brain injury remains
largely undetermined. This knowledge gap affects basic fibroblast growth factor, or
FGF2, which in the brain is mainly produced by astrocytes and characteristically
upregulated in reactive astrocytes. The goal of this study was to characterize the
inflammatory actions of FGF2 in astrocytes using primary cultures. We report that
FGF2 induced the upregulation of monocyte chemoatractant protein (CCL2) and
cycloxygenase type 2 (COX2), and the inhibition of lipopolysaccharide-elicited ICAM1
upregulation. The effects of FGF2 were: i) dependent on gene transcription as revealed
by the concomitant regulation of CCL2 or ICAM1 mRNAs, ii) mediated by the FGF2
receptor type 2 (gene silencing approach), iii) dependent on ERK, JNK and FAK
(pharmacological modulations), and iv) NFkappaB-independent (electrophoresis
mobility shift assays). FGF2 also caused accelerated wound closure dependent on
CCL2, COX2, ERK, JNK and FAK in a scratch assay. We conclude that the signaling
network triggered by FGF2 in astrocytes converged into accelerating directed motion. It
follows that astrocyte migration to injury sites may be a key factor in the repair
mechanisms orchestrated by FGF2.

74

RESULTADOS

INTRODUCTION

Basic fibroblast growth factor, or FGF2, is a ubiquitous and versatile peptide that
regulates cell proliferation, migration, cell survival and differentiation during
development, tissue repair or tumor growth. FGF2 is produced in several isoforms
ranging between 18-34KD that are produced by alternative use of two initiation codons
at translation [1]. The low molecular weight (LMW) isoform (18KD) is secreted [2,3] by
a mechanism implicating multidrug resistance-associated proteins [4] and Na+/K+ATPase [4,5], and accounts for most of the biological functions attributed to FGF2 by
acting through membrane-spanning tyrosine kinase receptors in conjunction with low
affinity binding to heparin sulfate proteoglycans [6]. In addition, LMW-FGF2 can exert
nuclear actions upon internalization - alone or in complex with its receptors - and
subsequent import to the nucleus [7-10]. Specific proteins like translokin [11], or
importin [12] mediate the intracellular trafficking of FGF2 and FGFR1, respectively. By
contrast, high molecular weight (HMW) FGF2 isoforms (21-25KD) are localized in the
nucleus and cytoplasm and their function remains largely unknown, although some
reports point to an implication in cell growth control [13,14].
In the brain, FGF2 is a regulator of processes leading to tissue repair and
regeneration after injury including scar formation [15], angiogenesis [16], neuronal
survival [17], and recruitment of neuronal progenitors [18]. An often underappreciated
fact in FGF2-dependent repair is that astrocytes are the primary source of the factor
and, indeed, overexpression of FGF2 in reactive astrocytes is a hallmark of brain injury
[18-21]. The terms reactive astrocytes or gliosis define the cellular hypertrophy that
astrocytes undergo as part of the inflammatory reactions that follow brain injury,
infection or degeneration. While the post-injury increase of FGF2 expression in
astrocytes suggests a role of the factor in driving astrogliosis, it has never been
examined whether FGF2 controls astrocyte inflammatory responses and, if so, what
precise molecules and pathways are involved. A hint is provided by a preliminary study
wherein the effect of axonal injury-associated factors in astrocyte migratory response
was tested in a model of scratch injury in cultured astrocytes. LMW-FGF2 strongly
stimulated astrocyte migration and this response was the greatest among all factors
tested, which included transforming growth factor (TGF-), epidermal growth factor
(EGF) and insulin-like growth factor (IGF) [22]. Here we sought to further characterize
the FGF2-elicited immunomodulation of astrocytes by focusing on the expression of
molecules with documented ability to regulate migration. These were monocyte
75

RESULTADOS

chemoattractant protein (CCL2, formerly called MCP1), cyclooxygenase 2 (COX2), and


intercellular adhesion molecule 1 (ICAM1). CCL2 is a potent chemoattractant and
activator for monocytes, and is primarily expressed in astrocytes in ischemia and after
peripheral administration of bacterial lipopolysaccharide (LPS) [23]. CCL2 plays a
critical role in the migration of newly formed neuroblasts from neurogenic niches to
damaged regions of the brain after focal ischemia [24]. ICAM1, in addition to its well
established control of leukocyte adhesion and migration across the blood-brain barrier
[25,26], is expressed in astrocytes in Alzheimers disease and other neurodegenerative
diseases [27], where it is believed to contribute to microglia recruitment [28]. COX2, in
turn, is expressed in reactive astrocytes in neuropathological conditions [29,30], and a
wealth of evidence documents the capacity of COX2-released prostaglandins to
increase cancer-cell motility [31,32]. The role of COX2 in astrocytes is, however,
largely unknown. Lipopolysaccharide (LPS) was used as a positive control of
inflammatory activation in astrocytes. We report that LMW-FGF2 stimulated the
expression of CCL2 and COX2, whereas it decreased the LPS-induced ICAM1
expression, in astrocytes cultured from rat cerebella. FGF2 accelerated astrocyte
migration in a scratch model in vitro, the effect being mediated by CCL2 and COX2 but
not ICAM1. The actions of FGF2 were mediated by the FGF2 receptor type 2 (FGFR2)
and JNK/FAK/ERK-dependent signaling. Cell proliferation did not contribute to this
phenomenon because inhibitors of cell growth had no effect. We conclude that FGF2
induces a pro-migratory phenotype in astrocytes, which may be a key factor in the
repair mechanisms orchestrated by FGF2 during brain injury.

76

RESULTADOS

MATERIAL AND METHODS

Materials
Recombinant human FGF2 was purchased from R&D Systems. Dulbeccos modified
Eagles medium (DMEM), penicillin, streptomycin, paraformaldehyde, Triton X-100,
bovine serum albumin (BSA), cytosine-arabinoside, LPS, 4',6-diamidino-2-phenylindole
(DAPI), phosphatase inhibitors, mouse anti-actin (1/10000) antibody, rabbit anti-FGFR1
and anti-FGFR2 (1/500), mouse anti-GFAP antibodies were obtained from Sigma.
Protease inhibitors, PVDF membranes and Light Cycler capillaries were from Roche.
Reverse transcriptase and Taq Polymerase were purchased from Invitrogen. Foetalbovine serum (FBS) was from Cambrex. Anti-COX2 (1/1000) rabbit polyclonal antibody
was from Cayman. Anti-CCL2 (1/500) rabbit polyclonal antibody was from Abcam. AntiICAM1 (CD54, clone 1A29) mouse monoclonal antibody and isotype matched IgG1
were purchased at BD Pharmingen. Primers and NFkappaB oligonucleotides were
synthesized by Roche. Rabbit monoclonal antibodies against ERK1/2 and phosphoERK (pERK), JNK1/2 and phospho-JNK (pJNK), FAK and phospho-FAK (Tyr 397)
were from Cell Signaling (all used a 1/1000 dilution). Viral particles encoding shRNA for
FGFR2, and GFP, and rabbit anti-FGFR3 antibody were from Santa Cruz
Biotechnology. ERK (PD98059), JNK (SP600125) and FAK (PF573228) inhibitors were
from Tocris.

Astrocyte cultures
Astrocyte cultures were prepared from cerebellum from 7-8 day-old Sprague-Dawley
rats as described [33]. In brief, rats were decapitated and brains immediately dissected
out. After meninges and blood vessels were removed, the tissue was minced and
incubated for 10 min at 37 C in Ca2+-free Krebs-Ringer buffer containing 0.025 %
trypsin. Cells were then mechanically triturated through a glass pipette and filtered
through a 40 m nylon mesh in the presence of 0.52 mg/ml soybean trypsin inhibitor
and 170 IU/ml DNase. After centrifugation (500 x g), cells were stained by Trypan Blue
exclusion and counted in a Neubauer chamber and then resuspended in 90% DMEM,
10% FBS, 20 U/ml penicillin and 20 g/ml streptomycin at 6x105 cells/ml. The dishes
used for each experiment were: 35-mm dishes for immunofluorescence and migration
experiments, 48-well plates for ELISAS, 100-mm plates for Western Blot 60mm and
EMSA. The cells were maintained in a humidified atmosphere of 90 % air-10 % CO2.
77

RESULTADOS

The medium was changed at day 7, and the cells were immediately used when
cultures reached confluency (around 12 DIV). This minimizes contamination by
microglia, which rapidly proliferate when the astrocyte monolayer reaches confluency
[33]. To quantify microglia, cultures were incubated with DiL-Ac-LDL (Molecular
Probes) 10g/ml for 2h, which is readily taken up by microglia ((Hao and Fedoroff
1991)), and counterstained with DAPI to label nuclei thereby obtaining the total number
of cells. The percentage of DiL-Ac-LDL-positive cells/total number of cells was 10.74%
4.09 (n=4).
The medium was changed to 1 % FBS-DMEM overnight before treating cultures with
different compounds for the indicated times and concentrations to minimize cell
proliferation. Cerebellar granule cells were obtained by the same protocol as astrocytes
but were seeded at 1.3x106 cells/ml in the same culture media as astrocytes. At day 1
in vitro, cytosine arabinoside (10 M) was added to prevent glia proliferation. Cell lines
3T3s, HeLa and SH-SY5Y were passaged every 3-4 days and cultured in 90 % DMEM,
10 % FBS, 20 U/ml penicillin and 20 g/ml streptomycin, except for SH neuroblastoma
that were cultured in 20 % FBS.

Immunocytochemistry
Cultures were fixed for 30 min with 4 % paraformaldehyde in phosphate buffered saline
(PBS) at room temperature. After several washes, the monolayers were incubated with
PBS-0.1% Triton X-100 for 15 min to permeabilize cells. This permeabilization step
was omitted in the case of ICAM as this protein is extracellular. Blockade of nonspecific binding was performed with 1 % BSA in PBS, and afterwards cells were
incubated overnight at 4 C with mouse monoclonal anti-GFAP (1/1000), rabbit antiCCL2 (1/3000), anti-COX2 (1/500) or anti-ICAM1 (1/200) antibodies in 0.1 % BSAPBS). After washing, cells were incubated for 1 h with Alexa labeled secondary IgGs
diluted 1/1000 in 0.1 % BSA-PBS. The primary antibody was omitted in controls. In the
last wash, cells were incubated with DAPI to perform nuclear staining.

CCL2 ELISA
After indicated treatment, CCL2 levels in the culture medium were assessed using an
ELISA specific for rat CCL2 according to manufacturer s instructions (R&D systems).
The assay detection limits were 30-2000 pg/mL
78

RESULTADOS

Whole-cell ELISA
ELISAs were performed as thoroughly described elsewhere [34]. In brief, the cells were
fixed with 4 % paraformaldehyde in PBS, and incubated overnight with a monoclonal
antibody against rat ICAM1 (clone 1A29, Pharmingen, concentration: 3 g/mL).
Isotype-matched IgG1 (Pharmingen) was used at the same concentration as the
negative control. The cells were finally incubated with a goat anti-mouse antibody
conjugated to alkaline phosphatase (1:1000, Sigma). The alkaline phosphatase
substrate was added, and the cells incubated at room temperature until the reaction
developed. The OD405 was measured in a Bio-TeK Power-Wave XS microplate
spectrophotometer.

Real Time PCR


Total RNA was prepared from cells using the trizol reagent (GIBCO); aliquots (0.5 to
1.0 g) were converted to cDNA (SuperScript II, Invitrogen) using random hexamer
primers, and mRNA levels estimated by real time, quantitative RT-PCR (Q-PCR). The
primers used were: CCL2 fwd: 5- CTTCTGGGCCTGTTGTTCAC-3, CCL2 rvs: 5GGGACGCCTGCTGCTGGTGATTC-3; ICAM1 fwd 5- GGGCCCCCTACCTTAGGAA3,

ICAM1

rvs

5-

GGGACAGTGTCCCAGCTTTC-3;

18S

fwd

5-

GGGAGGTAGTGACGAAAAATAACAAT-3, 18S rvs 5-TTGCCCTCCAATGGATCCT3 Q-PCR cycling conditions were: 35 cycles of denaturation at 94 C for 30 s,
annealing at 58 C for 30 s, and extension at 72 C for 30s, followed by 2 min at 72 C,
in the presence of SYBR Green (1:10,000 dilution of stock solution from Molecular
Probes, Eugene, OR). Reactions were carried out in a 20 L reaction volume in a Lifecycler (Roche). Relative mRNA concentrations were calculated from the take-off point
(Ct) of the PCR reactions, and normalized for the levels of 18S ribosomal RNA using
the software provided by the manufacturer. Correct product amplification was
confirmed by the existence of a single melting point in melting curve analysis, and by
size determination using 2 % agarose gel electrophoresis.

Preparation of cytosolic and nuclear extracts


After treatment, the cells were scraped out of the plates in ice-cold PBS, collected by
brief centrifugation, resuspended in buffer A containing 10 nM HEPES pH 7.9; 1.5 mM
MgCl2, 10 mM KCl, 0.5 mM dithiothreitol and a cocktail of protease (Roche) and
phosphatase (Sigma) inhibitors. Nonidet P-40 was added (final concentration 0.6 %)
79

RESULTADOS

and the cells vortexed for 10 seconds. The nuclei were collected by brief centrifugation
in a microcentrifuge, and the supernatants kept at 80 oC as cytosolic extracts. The
nuclei were washed once with buffer A and collected again by centrifugation. Nuclear
extracts were obtained by incubating nuclei in buffer B (20 mM HEPES buffer pH 7.6,
25 % glycerol, 420 mM NaCl, 0.2 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), 0.5 mM
dithiothreitol, and protease and phosphatase inhibitors) at 4 oC for 30 min with gentle
rocking. The suspensions were centrifuged at 15000 xg for 15 min at 4 oC, and the
supernatants stored at 80 oC. Protein concentrations were measured by the Bradford
method.

Western blot
Samples containing equal amounts of protein (15-30 g) were subjected to sodium
dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) on 8-15 %
gradient gels. The proteins were then transferred to polyvinyl difluoride membranes,
which were blocked with 5% milk in Tris-buffered saline (TBS) containing 0.1% Tween20 for 1 h,

and incubated overnight at 4 C with primary antibodies (indicated in

Materials). This was followed by incubation with anti-IgG-horseradish peroxidaselabelled secondary antibodies (Pierce, 1/10000) for 1 h at room temperature and
subsequent detection with an enhanced chemiluminescence detection kit (ECL,
Amersham Life Science). Proteins were visualized by autoradiography on X-ray film
(AGFA). Relative band intensity was quantified with Image J (National Institutes of
Health).

Electrophoretic mobility shift assays


Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) were performed as thoroughly described
previously [34]. In brief, the NFkappaB oligonucleotides corresponding to the
palindromic consensus sequences were end-labeled with 10 Ci [32P ATP
(Amersham*) with 10U T4 polynucleotide kinase (Fermentas) and purified in G-25
sephadex columns (Sigma). Nuclear extracts (5-10 g protein) were incubated with
radiolabeled oligonucleotides in a final volume of 20 l in the presence of 1 g poly
dIdC, 20 mM HEPES buffer pH 7.9, 1 mM EDTA, 5% glycerol, 100 mM NaCl and 0.5
mM dithiothreitol. DNA-protein complexes were resolved by electrophoresis in 4 % non
80

RESULTADOS

denaturing polyacrylamide gels using 0.5 x Tris-Borate-EDTA as the running buffer.


Autoradiographs were obtained by placing dried gels in close contact with films
(AGFA).

Retroviral infection
Viral particles encoding for rat shRNA FGFR2 were purchased from Santa Cruz
Biotechnology. Pre-confluent cultures (DIV 6-7) were infected with 2x104 retroviral
particles per ml overnight in 10% FBS containing DMEM, and were grown for 7 days to
confluency to permit integration and expression of shRNAs. The efficiency of FGFR2
silencing was confirmed by Western Blotting. GFP-expressing (Santa Cruz) viruses
were used as a control for efficient infection.

Scratch wound assay


The capacity of astrocytes to migrate was tested by scratching confluent astrocyte
monolayers to induce natural cell migration to close the scratch, as previously reported
[35]. The scratch was 500 m in width and 35 mm in length, and was done with a
sterile yellow pipette tip. The cells were treated immediately after scratching, and
pharmalogical inhibitors, when indicated, were present the entire time. In some cases
blocking/activating antibodies were used as follows: anti-CCL2 4g/ml, anti-ICAM1
10g/ml, and unspecific isotype-matched IgG1 antibody (as control) 10g/ml, which
were also present during the entire length of migration experiments. The cells were
fixed at 0-24 h thereafter, and immunostained for GFAP/DAPI, and/or COX2, CCL2 or
ICAM. Individual images (6 per scratch-wound) were taken with the 2 x magnification
lens, and the cell-free area was measured using ImageJ Software.

Statistical analysis
Experiments were always reproduced a minimum of 3 times. Quantifiable
determinations were expressed as means SEM of the indicated number of
experiments performed in independent cultures. Significance of differences was
evaluated by one-way ANOVA followed by the Newman-Keuls posthoc test when more
than 2 conditions were evaluated.

81

RESULTADOS

RESULTS

FGF2 modulated the expression of CCL2, ICAM1 and COX2 in astrocytes


The joint evaluation of CCL2 by ELISAs of culture media (Fig. 1A, B, C),
immunocytochemistry (Fig.1D), western blots of whole cells (Fig. 1E), and RT-PCR
(Fig. 1F) indicated that FGF2 caused expression of the CCL2 gene and protein, and
the release of the latter to the extracellular media. CCL2 was barely detectable in
control cells by any approach. The increased CCL2 expression appeared to derive
from de novo synthesis as judged by the robust perinuclear immunolabeling in the
Golgi apparatus (Fig. 1D). The effect of FGF2 was time- and dose-dependent (Fig. 1A,
B). CCL2 was thus detected in the extracellular media as early as 6 h after the
administration of FGF2, and the chemokine contents increased progressively up to 48
h, the last time analyzed. When assessed at 24 h the extracellular CCL2 increased
linearly upon exposure to 5-100 ng/mL FGF2. The factor was hence used in the
ensuing experiments at the submaximal dose of 25 ng/mL. Overall, the ELISAs
appeared more sensitive than western blots to quantify CCL2 production. Plausibly, the
secretion of newly synthesized CCL2 diminishes the intracellular pool detected by
western blot. Considering that FGF2 is produced in the brain during the inflammatory
reactions that follow injury, we also examined whether the increased production of
CCL2 was enhanced when provoking a standard inflammatory condition by LPS. As
previously reported [36] LPS caused expression of CCL2 gene and protein in
astrocytes (Fig. 1C, E, F). LPS moderately increased the FGF2-elicited expression of
CCL2, indicating additive rather than synergistic actions of both factors. The combined
effect was evident at early (i.e. 5-12 h) but not late (i.e. 48 h) treatment times (Fig. 1C,
E, F) suggesting a detrimental effect of excess co-stimulation.

FGF2 also caused the transient expression of COX2 in astrocyte cultures (Fig.
2) with a peak at 8 h, as revealed by western blot (Fig. 2A). The immunocytochemical
analyses confirmed that the increased expression originated in astrocytes and
revealed, surprisingly, that part of COX2 was localized to the nucleus (Fig. 2C),
suggesting heretofore undescribed nuclear actions of the enzyme. Of note, FGF2
caused a morphological change in astrocytes consisting in soma retraction followed by
process emission. The change, which has been previously reported and characterized
[37], was clearly established 8 h after the addition of the factor. As compared with

82

RESULTADOS

FGF2, LPS caused a more sustained increase of COX2 expression, and potentiated
the effect of FGF2 (Fig. 2B).

Cells displayed a slight basal expression of ICAM1, detected by both ELISA


(Fig. 3A) and immunocytochemistry, which revealed that ICAM was localized to cell-tocell contacts following a pattern reminiscent of a beehive (Fig. 3C). FGF2 had no effect
per se on ICAM1 expression, although it completely inhibited the increase of ICAM1
mRNA and protein caused by LPS (Fig. 3B, C). So far, the data indicated that FGF2
can exert both pro- or anti-inflammatory actions in astrocytes, and that the antiinflammatory effects (i.e. ICAM1 down-regulation) were only manifest when additional
inflammatory stimulation was performed as with LPS.

ERK, JNK and FAK but not NFkappaB mediated the immunomodulatory actions
of FGF2
FGF2 has been reported to activate numerous signal transduction pathways including
MAPK (ERK, JNK, p38), PKC, PI3K-Akt, PKA, PKG, and calcium-calmodulin kinase IV
[38]. We sought proof of the participation of these kinases by determining: i) whether
specific inhibitors reversed the immunomodulatory actions of FGF2, using CCL2 as the
endpoint in preliminary screens, and ii) if FGF2 stimulated the pathways, which was
assessed by western blot analyses. Both requirements were only met by ERK and
JNK, as documented below, while pharmacological inhibitors of p38, PKC, Akt, PKA or
PKG had no effect (data not shown). Inhibitors of ERK (PD98059), and JNK
(SP600125) completely inhibited the increase in CCL2 release (Fig. 4A), and reversed
the inhibition of ICAM1 caused by FGF2 back to LPS-plus-inhibitors controls (Fig.
4B). Of note, these values were slightly reduced as compared with the ICAM1
expression attained with LPS alone (Fig. 4B). FGF2 caused the phosphorylation of
both ERK and JNK, which was detected as early as 1 h after the administration of the
factor and persisted over the next 5 h (Fig. 4C). Interestingly, LPS caused a small,
barely detectable increase of pERK and pJNK, and did not alter significantly the
increases elicited by FGF2 (Fig. 4C). This is in accordance with the small inhibitory
effect of ERK and JNK inhibitors detected in the LPS-elicited ICAM up-regulation. By
contrast, EMSA analysis showed a strong and long-lasting activation of NFkappaB
upon LPS administration (Fig. 4D). NFkappaB was thus present in the nucleus of LPStreated astrocytes as soon as 30 min after treatment (data not shown), and remained
activated for at least 48 h. FGF2 neither activated NFkappaB per se nor it interfered
83

RESULTADOS

with the LPS-mediated activation of the transcription factor. The immunomodulatory


effects of FGF2 were hence NFkappaB independent. Overall, the data support the
notion that immunomodulatory regulation by LPS and FGF2 encompasses different
signaling pathways. Finally, the JNK inhibitor SP600125, but not the ERK inhibitor
PD98059, completely abrogated COX2 expression, indicating a role of JNK but not
ERK in the upregulation of COX2 by FGF2 (Fig. 5A).

Because studies exist documenting a strong interplay between ERK and FAK in
directed cell movement [39], we also examined the role of FAK in the
immunomodulatory effects of FGF2. The FAK inhibitor PF573238 completely inhibited
COX2 (Fig. 5A) and CCL2 (Fig. 5B) up-regulation, and reversed the inhibition of ICAM1
up to the LPS-plus-PF573238 control (Fig. 5C). Accordingly, FGF2 caused activation
of FAK, as judged by the increased pFAK, which was clearly detected 4 h after the
addition of the factor and lasted for the ensuing 48 h (Fig. 5D). We next examined the
possible interplay between ERK, JNK and FAK by testing the effect of pharmacological
inhibitors on kinase phosphorylations at 4 h after the administration of FGF2.
PF573238 completely inhibited ERK and JNK stimulation, whereas SP600125
completely inhibited FAK and ERK (Fig. 5E). By contrast, PD98059 inhibited JNK but
not FAK (Fig. 5E), indicating that ERK is downstream of the other two kinases. A model
reconciling these findings is depicted in Fig. 8.

FGFR2 mediated the immunomodulatory actions of FGF2


We next sought to identify the FGF2 receptor involved. We first determined whether
astrocytes expressed FGFR1, FGFR2 or FGFR3 by western blot analysis. Cerebellar
granule cells (CGCs), C6 glioma, SHSY-5Y neuroblastoma, Hela and NIH3T3 cell lines
were used as positive controls. FGFR3 was highly expressed in C6, SHSY-5Y, Hela
and NIH3T3 while FGFR1 was detected in C6 glioma and NIH3T3, and FGFR2 only in
NIH3T3 (Fig. 6A). Of the three receptors, only FGFR2 was detected in astrocytes (Fig.
6A), where it appeared, in blots, as two differently-migrating bands that apparently
arise from receptor glycosylation [40, 41]. Interestingly, exposure to FGF2 caused
FGF2R to transiently disappear within 6-12 h after the addition of the factor (Fig. 6B).
Analysis of FGFR2 expression in cytosolic and nuclear fractions indicated that the
receptor did not migrate to the nucleus (Fig. 6C). The finding supports instead that the
receptor was degraded after the exposure of astrocytes to FGF2.

84

RESULTADOS

Overall, the results pointed to FGFR2 as the receptor mediating the


immunomodulatory effects of FGF2 in astrocytes. To establish this further, we tested
whether astrocytes became unresponsive to FGF2 when obliterating FGFR2
expression by RNA interference. Activation of ERK and JNK pathways - assessed by
the phosphorylation of the kinases - was used as the endpoint. Lentivirally-induced
expression of FGFR2 shRNA in astrocytes reduced the expression of FGFR2, hence
validating the gene silencing approach (Fig. 6D). FGFR2 shRNA inhibited the activation
of ERK and JNK by FGF2 (Fig. 6E).

FGF2-mediated migration
FGF2 has been shown to promote migration of astrocytes in a scratch-wound injury
[22]. Here, we sought to establish whether the signaling pathways described above
play a role in this phenomenon. First, we confirmed that FGF2 accelerated scratch
closure (Fig. 7A). The effect was not due to cell proliferation because the proliferation
inhibitor cytosine arabinoside had no effect (Fig. 7A). Rather, increased astrocyte
polarity appeared to account for the acceleration, as revealed by the long protruding
edges assembled in parallel in FGF2-treated astrocytes (Fig. 7B). We next tested the
implication of the pathways regulated by FGF2 by interfering with their actions. We thus
inhibited ERK, FAK, JNK and COX2 with the pharmacological inhibitors PD98059,
PF573238, SP600125, or NS398, respectively. Specific antibodies were used to block
the released CCL2 [42] or to stimulate ICAM1 [26], thereby reversing the dual, opposite
actions of FGF2 on chemokine and adhesion molecule expression. The increased
migration was completely abrogated by ERK, FAK and JNK inhibitors (Fig. 7C).
Likewise, blockade of CCL2 or COX2 reversed the increased migration with no effects
on controls (Fig. 7D). By contrast, the antibody against ICAM1 had no effect (Fig. 7D).
In accordance with the effects of pharmacological inhibitors or modulatory antibodies,
robust CCL2 and COX2 upregulation was detected in FGF2-treated astrocytes all over
the cultures, not just near the migration fronts (Fig. 7E), whereas no change was
observed for ICAM1 expression (data not shown). Note that the picture in 7E was taken
at 6 h after the administration of FGF2 to facilitate detection of intracellular CCL2, at
which time the morphological changes produced by the factor or the injury are not very
pronounced yet. Incidentally, LPS had no effect on astrocyte migration (data not
shown).

85

RESULTADOS

DISCUSSION

We have shown here that LMW-FGF2 induced the upregulation of CCL2 and COX2 in
astrocytes, while it completely antagonized the upregulation of ICAM1 caused by LPS.
The data thus support an immunomodulatory rather than a pro-inflammatory or antiinflammatory role of FGF2 in astrocytes.
To date, four similar, high affinity fibroblast growth factor receptor (FGFR)
genes have been identified from several species [43]. FGFR1-3 are widely expressed
in the adult brain and show different cellular locations depending on the region [44].
FGFR1 is abundant in cortex, hippocampus and cerebellum, while FGFR2 is amply
expressed in olfactory bulb, hippocampus, and cerebellum [45]. Cell-wise, FGFR1 is
predominantly expressed in neurons, while FGFR2 and FGFR3 are mainly present in
astrocytes [46,47]. FGFR4, by contrast, is only expressed in early stages of
development and, with the exception of the lateral habenular nucleus, is not detectable
in the adult brain [48]. In the cerebellar astrocytes used for the present study we
detected FGFR2, but not FGFR1 or 3, indicating that FGFR expression in astrocyte
cultures is region specific, that it closely mirrors the distribution described in vivo, and
that FGFR2 is therefore the receptor type candidate accounting for the observed
actions of FGF2. Accordingly, silencing FGFR2 expression by RNA interference led to
blockade of ERK and JNK, the uppermost mediators of FGF2 signaling.
The FGFR1-4 genes encode for structurally similar peptides containing an
extracellular domain of three immunoglobulin-like domains, a transmembrane domain,
and an intracellular tyrosine kinase domain. Cells also exhibit low-affinity FGF-binding
sites composed of heparin sulphate proteoglycans [6], which enhance the stability of
FGF2-FGFR complexes. Binding of FGF2 to FGFR results in receptor dimerization and
autophosphorylation at tyrosine residues. It has been reported that, after binding of
FGF2 to FGFR1, the FGF2-FGR1 complex translocates to the nucleus [49,50], where it
initiates several signalling pathways leading to differentiation and proliferation [8,51].
Nuclear trafficking of FGF2 and FGFR1 in neurons and astrocytes is indeed a hallmark
of injury in the adult brain cortex [19,20]. However, we found no evidence in the present
study that the effect of LMW-FGF2 via FGFR2 involved nuclear actions of the receptor.
Western blot analyses showed no signs of nuclear translocation of FGFR2. Rather, a
most striking phenomenon was the transient disappearance of FGFR2 in FGF2stimulated cells, unveiling an inhibitory feedback controlling FGF2-dependent signaling
in astrocytes. A comparable phenomenon has been reported in NIH 3T3 cell lines [52],
86

RESULTADOS

wherein

FGFR

internalization

followed

by

degradation

leads

to

receptor

desensitization. It appears overall that a cell membrane rather than a nuclear FGFR2
accounts for the immunomodulatory actions of LMW-FGF2 in cerebellar astrocytes.
In contrast to FGFR1, the best characterized FGFR, little is known about the
intracellular signaling of FGFR2. For FGFR1, a wealth of evidence documents the
activation of three major pathways: phospholipase C/PKC, Ras/MAPK (including ERK,
JNK and p38), and PI3K/AKt (for review [53,54]). While these intracellular signaling
cascades have not been confirmed for FGFR2, it is believed that, owing to the strong
structural resemblance, the signaling pathways driven by different FGFRs are very
similar. Studies with chimeric receptors composed of cytoplasmic domains of FGFR1-4
indeed suggest that the main difference among FGFRs is the strength of tyrosine
kinase activity and not the target proteins [55]. No report exists about FGF2 regulating
FAK. Since FAK is a key molecule in cell migration (see below), this knowledge gap is
consistent with the lack of attention that FGF2 has received as a migration modulator
thus far.
We have shown that FAK, JNK and ERK mediate the regulation of CCL2 and
ICAM1 by FGF2, while FAK/JNK mediate that of COX2. Downstream effectors remain
to be identified, although our data rules out the participation of NFkappaB. While a
precedent exists of activation of ERK-dependent pathways by FGFR2 [56], the
inhibition and not the activation of JNK is involved in the FGF2-mediated protection of
myocardial cells from ischemia [57]. This suggests that cells, and not receptors, instruct
the particulars of FGF2-elicited signaling. All in all, the data reveal that the various
kinases regulating FGF2-mediated immunomodulation interact in a rather complex
manner. First, there is gene specificity since ERK regulated CCL2 and ICAM1 but not
COX2. Second, depending on the target gene, kinases can play both stimulatory (e.g.
CCL2 and COX2) and inhibitory (e.g. ICAM1) roles. Third, examination of hierarchic
arrangements with pharmacological kinase inhibitors suggest the existence of intricate
feedback loops whereby there is reciprocal regulation of ERK-JNK, and FAK-JNK,
while FAK stimulates ERK but not the opposite. A schematic consistent with these
observations is provided in Fig. 8. In brief, FGF2 would regulate two intertwined kinase
loops in astrocytes. One would encompass JNK and ERK and lead to the stimulation of
CCL2 synthesis and release, and to the inhibition of the LPS-dependent ICAM1
regulation. A second loop would implicate FAK and contribute to: i) CCL2 and ICAM1
modulation via ERK/JNK, and ii) ERK-independent COX2 up-regulation. The delayed
and more long-lasting FAK activation with respect to ERK and JNK - as assessed by

87

RESULTADOS

kinase phosphorylation - suggest a maintenance function of FAK in FGF2


immunomodulatory signaling.
The adaptor protein FAK recruits proteins that regulate the turnover of focal
adhesion assemblies during cell migration [58, 59]. The higher the turnover of focal
adhesion assemblies the faster the cell moves. FGF2 has been reported to induce
focal adhesion disassembly in brain capillary endothelial cells thus leading to FGF2directed chemotaxis [60]. The central role of FAK in the FGF2-mediated
immunomodulation described in the present study suggests that, like in endothelial
cells, the factor may coordinate directed motility in astrocytes through promoting focal
adhesion disassembly. Indeed, focal adhesions may contain FGFR [61].
Within focal adhesions, FAK is activated upon ligation of integrins to the
extracellular matrix. Integrins, in turn, have been reported to down-regulate ICAM1
expression via FAK [62], suggesting that migration requires the down-regulation of this
adhesion molecule. It was therefore not surprising at first that FGF2 decreased ICAM1
expression while increasing migration via CCL2, all phenomena depending on FAK.
We even reasoned that stimulating ICAM1 activity with an anti-ICAM1 antibody would
reverse the pro-migratory actions of FGF2 but, unexpectedly, the antibody had no
effect, indicating that the decrease in ICAM1 expression did not contribute to the
observed accelerated movement. We speculate that CCL2 and ICAM1 may embody
distinct functions of cell adhesion during astrocyte migration upon injury. One is the cell
movement along chemotactic gradients, which involves highly controlled cycles of
adhesion/de-adhesion to the extracellular matrix. Another is the recognition of and the
cross-talk with locally activated immune cells, namely microglia. The scratch injury
model used in the present study may hence simulate chemotaxis, but not the full range
of post-injury immune reactions.
The notion that migration is an integral part of the post-injury inflammatory
response in astrocytes has not been recognized, nor the molecular mechanisms
dissected out until recently. Thus, it has been reported that TGF, tissue plasminogen
activator (tPA), and endothelin stimulate astrocyte migration through metalloprotease 9
(MMP9) [63,64,65]. The pro-migratory actions of tPA requires COX2, too [64], where
those of endothelin involve the nitric-oxide mediated tyrosine nitration of MMP9 [65].
Our study implicates CCL2 and COX2 in the autocrine regulation of astrocyte
migration. While CCL2 is a paradigmatic chemotactic agent acting via its receptor
CCR2, the mechanisms underlying the pro-migratory actions of COX2 remain

88

RESULTADOS

undetermined, although they may involve the interaction of the prostaglandin E2 with
receptor EP1 [66].
Future research will further clarify the molecular signaling guiding astrocyte
migration, but for the time being it is worth stressing two ideas. One, that the signaling
and the derived effects will strictly depend on the stimulating agents. Our data show,
for example, that the robust CCL2 expression caused by LPS in astrocytes is not
associated with accelerated motion as with FGF2, or that NFkappaB does not mediate
the effects of FGF2, which is at variance with the reported implication of the
transcription factor in the pro-migratory actions of TGF [63]. Two, that Rho-GTPases,
which play a key role in directed movement in astrocytes by guiding cytoskeleton
remodeling [67,68], are plausible downstream targets of CCL2 and COX2-produced
prostaglandins.
It is widely believed that FGF2 is a key regulator of the wounding response in
the adult brain. Protective and regenerative effects of FGF2 have been described in
brain ischemia [69-71], and spinal cord injury [72, 73]. Plausibly, multiple functions
relating to neurons, microvasculature and glia are involved in the beneficial actions of
FGF2, but the exact mechanisms of protection are yet unclear. Likewise, while reactive
astrocytes over-expressing FGF2 and FGFRs are an indisputable hallmark of brain
injury [18, 20], the role and consequences of astrocyte reactivity are ill-defined. In fact,
a widespread misconception in the neuroinflammation field is to ascribe roles, generally
deleterious, to astrocytes or microglia based exclusively on morphological changes.
The existence of a complex, temporally evolving, disease-specific functional
heterogeneity in glia after brain injury remains to be fully recognized and characterized.
This knowledge void also affects the astrocytes rendered reactive by the in vivo
injection of FGF2 to the site of a brain injury [74, 75]. Here we posit that migration of
reactive astrocytes to injury sites and eventual formation of a glia limitans lead to repair
and tissue regeneration. Recent evidence indeed challenges the prevailing view that
astrocyte scars impair tissue repair by hindering axon growth. First, scars are dynamic,
highly regulatable proteoglycan networks whose composition can, by controlling the
activity of signaling molecules like FGF2, render the microenvironment conducive for
axon regeneration [76]. Second, astrocyte scars lead to the compaction of microglia
and macrophages within necrotic areas thereby preventing inflammation-derived
secondary damage [77].

In this study, we have unveiled molecules and signaling

pathways contributing to astrocyte migration. Additional molecular profiling of the


astrocyte phenotype induced by FGF2 will aid progress towards the understanding,

89

RESULTADOS

and ultimately the therapeutical utilization, of the repair capability of FGF2 through
increasing migratory ability of astrocytes in the injured brain.

90

RESULTADOS

FIGURE LEGENDS

Figure 1. FGF2 induced CCL2 expression in astrocytes. A-C) ELISA measurements


of CCL2 in extracellular media: (A) dose response; (B) time course; (C) effect of LPS;
D) Immunocytochemistry, images are representative of at least 3 independent
experiments and show perinuclear localization of CCL2, presumably in the Golgi
apparatus; E) Western blot analysis of whole cell extracts showing a representative gel
and densitometries; and F) RT-PCR analysis at 5 h (top) and 48 h (bottom) after the
addition of FGF2 and/or LPS. The astrocytes were incubated with FGF2 (5-100 ng/mL
in A and 25 ng/ml in the rest of panels) or LPS (10 ng/mL) for 3-48 h. Values are the
means SEM, of n=3-5 independent experiments. (*) p<0.05, (**) p<0.01 and (***)
p<0.001, against control condition (no FGF2 no LPS), and (##) p< 0.01, (###) p<0.001
against LPS-treated cultures at the same time of analysis. ANOVA analysis, NewmanKeuls post-hoc. FGF2 caused the de novo synthesis of CCL2 mRNA and protein,
which was released. FGF2 moderately potentiated the LPS-elicited increase of CCL2
expression at early (i.e. 12 h) but not late times (i.e. 48 h). Scale bar 50m.

Figure 2. FGF2 increased the expression of COX2. A) Western blot analysis


showing a representative gel and densitometry; B) Effect of co-stimulation with LPS
assessed by western blot; and C) Immunocytochemistry representative of at least 3
independent determinations. The astrocytes were incubated with FGF2 (25 ng/mL)
and/or LPS (10 ng/mL) for 0.5-48 h as indicated. Values are the means SEM, of n=4
independent experiments. (**) p<0.01, (***) p<0.001, with respect to controls, and (##)
p< 0.01, (###) p<0,001, with respect to LPS-treated cultures at the same time of
analysis. ANOVA analysis, Neumann-Keuls post-hoc. Scale bar 50m. FGF2 caused a
transient expression of COX2 protein (maximal effect detected at 8 h), and LPS
potentiated this increase.

Figure 3. FGF2 inhibited LPS-elicited increase in ICAM1 protein and mRNA


expression. A) ELISA; B) RT-PCR; and C) Immunocytochemistry showing results
representative of 3 independent experiments. The astrocytes were incubated with
FGF2 (25 ng/mL) and/or LPS (10 ng/mL) for 12-48 h as indicated. Values are the
means SEM, of n=4 independent experiments. (*) p<0.05, (***) p<0.001, with respect
91

RESULTADOS

to controls, and (##) p< 0.01, (###) p<0,001, with respect to LPS-treated cultures at the
same time of analysis. ANOVA analysis, Neumann-Keuls post-hoc. Scale bar 50m.

Figure 4. FGF2 immunomodulatory actions were mediated by ERK and JNK but
not NFkappaB. A) Effect of PD98059 (ERK inhibitor) and SP600125 (JNK inhibitor) on
the expression of CCL2 measured by ELISA; B) Effect of PD98059 and SP600125 on
ICAM1 expression measured by ELISA; C) Western blot analysis of ERK and JNK
phosphorylations showing a representative blot; and D) EMSA analysis of NFkappaB
nuclear translocation. Arrows point to NFkappaB complexes of different electrophoretic
mobility. Astrocytes were incubated with 25 ng/mL FGF2 (and 10 ng/mL LPS in the
case of ICAM1 and NFkappaB). Cells had been pre-incubated for one hour with
PD98059 (50 M) or SP600125 (10 M) before the addition of factors. FGF2 activated
ERK and JNK-dependent pathways to a much greater extent than LPS, and ERK and
JNK pharmacological inhibitors reversed the actions of FGF2. LPS caused a long
lasting activation of NFkappaB that was not mimicked nor modified by FGF2. Values
are means SEM of n=3-5 independent experiments. (***) p<0.001, with respect to
controls, and (#) p<0.05, (##) p< 0.01, and (###) p<0,001, with respect to FGF2- or
LPS-treated cultures; (ns), not significant. ANOVA analysis followed by NeumannKeuls. ERK/JNK and NFkappaB blots are representative of at least 3 independent
determinations.

Figure 5. FGF2 immunomodulatory actions were mediated by FAK. A) Western


blot analysis of the effect of PD98059 (ERK inhibitor), SP600125 (JNK inhibitor) and
PF573238 (FAK inhibitor) on the expression of COX2, showing a representative blot
and a densitometry; B) Effect of PF573238 on the secretion of CCL2 measured by
ELISA; C) Effect of PF573238 on ICAM1 expression measured by ELISA; D) Western
blot analysis of FAK phosphorylation showing a representative blot and densitometry,
and E) Western blot analysis of the interplay between ERK, FAK and JNK showing a
representative blot. Astrocytes were incubated with 25 ng/mL FGF2 (and 10 ng/mL
LPS in the case of ICAM1). Cells had been pre-incubated for one hour with PD98059
(50 M), SP600125 (10M) or PF573238 (2.5 M) before the addition of factors.
Values are means SEM of 3 independent experiments, except for E that shows
results representative of at least 3 independent determinations.(*) p<0.05, (**) p<0.01,
(***) p<0.001 against control conditions; (#) p< 0.05, (###) p<0.001 against FGF2 or
LPS alone. ANOVA analysis followed by Neumann-Keuls.
92

RESULTADOS

Figure 6. FGFR2 mediated the immunomodulatory actions of FGF2. A) Western


blot analysis of FGFR1-3 in astrocytes, cerebellar granule cells (CGCs), glioma (C6),
SH neuroblastoma, HeLa and NIH3T3. Astrocytes only expressed FGFR2, which
appeared in two bands; B) Western blot analysis of FGFR2 expression in astrocytes
upon incubation with FGF2 showing representative blot and densitometry. FGF2
induced the transient disappearance of FGFR2; C) FGFR2 did not migrate to the
nucleus upon FGF2 treatment, as shown in western blot analysis of cytosolic and
nuclear fractions. Protein loading of nuclear fractions was controlled for with CREB
expression. Gels show analysis in subcellular fractions obtained from the same wholecell extract; D) Western blot analysis of FGFR2 after over-expressing FGFR2 shRNA,
which reduced the expression of the receptor; E) FGHFR2 shRNA completely
obliterated pERK and pJNK expression, as shown by western blot analysis. Data are
the means SEM of n=3 independent experiments, except for C where a result
representative of 2 experiments is shown. (*) p<0.05, (**) p<0.01, (***) p<0.001 with
respect to control, and (###) p<0.01 with respect to Retro-GFP as indicated; ANOVA
analysis, Neumann-Keuls post-hoc.

Figure 7. FGF2 accelerated astrocyte migration in a scratch-injury assay. A)


Effect of FGF2 on the scratch width in the presence or absence of cytosine arabinoside
(20 M) to prevent proliferation; B) Migration fronts of control and FGF2-treated cells
(24 h) stained for GFAP; C) Effect of PD98059 (50 M), SP600125 (10 M) or
PF573238 (2.5 M) on FGF2-induced acceleration; D) Effect of antibodies blocking
CCL2 (MCP, 4 g/ml), stimulating ICAM1 (ICAM1, 10 g/ml), or control unspecific
isotype-matched IgG (10 g/ml), as well as the COX2 inhibitor NS398 (25 M); and E)
Control and FGF2-treated (6 h) astrocytes stained for GFAP, CCL2 or COX2. FGF2treated astrocytes adopted overtime a polarized morphology bearing long processes
arranged perpendicularly to the scratch. In all experiments, cells were incubated with
25 ng/mL FGF2, and/or the pharmacological inhibitors or MCP/ICAM1 the entire
time. Migration was measured as the percentage of free area 24 h after the scratch
was made. Values are means SEM of n=3-4 independent experiments. (*) p<0.05,
(**) p<0.01, (***) p<0.001 against control condition unless otherwise noted, ANOVA
analysis followed by Neumann-Keuls. Images are representative of 3 independent
experiments. Scale bar 50 m. FGF2 increased astrocyte acceleration and the
phenomenon was dependent on ERK, FAK, JNK, COX2, and CCL2 but not ICAM1.
93

RESULTADOS

Figure 8. Schematic representation of FGF2-elicited pro-migratory signaling


pathways in astrocytes. FGF2, acting through FGFR2 receptor, may regulate two
kinase loops in astrocytes. One would encompass JNK and ERK and lead to CCL2
synthesis and release, and to the inhibition of LPS-dependent ICAM1 regulation. A
second loop would implicate FAK and contribute to: i) CCL2 and ICAM1 modulation via
ERK/JNK and ii) ERK-independent COX2 upregulation. The delayed and more long
lasting

FAK

activation

suggest

maintenance

function

of

FAK

in

FGF2

immunomodulatory signaling.

Acknowledgements
The authors want to thank Cristina Gutirrez and Mar Castillo for expert assistance
with astrocyte cultures and immunocytochemical analyses, respectively. The study was
supported by BFU2004-00729/BFI and BFU2007-63031/BFI to EG, and FPI to ML.

94

RESULTADOS

REFERENCES

Prats H, Kaghad M, Prats AC, Klagsbrun M, Lelias JM, Liauzun P, Chalon P,

Tauber JP, Amalric F, Smith JA, et al.: High molecular mass forms of basic fibroblast
growth factor are initiated by alternative cug codons. Proc Natl Acad Sci U S A
1989;86:1836-1840.
2

Hardikar AA, Marcus-Samuels B, Geras-Raaka E, Raaka BM, Gershengorn

MC: Human pancreatic precursor cells secrete fgf2 to stimulate clustering into
hormone-expressing islet-like cell aggregates. Proc Natl Acad Sci U S A
2003;100:7117-7122.
3

Dahl JP, Binda A, Canfield VA, Levenson R: Participation of na,k-atpase in fgf-2

secretion: Rescue of ouabain-inhibitable fgf-2 secretion by ouabain-resistant na,katpase alpha subunits. Biochemistry 2000;39:14877-14883.
4

Aggarwal S, Gupta S: A possible role for multidrug resistance-associated

protein in the secretion of basic fibroblast growth factor by osteogenic sarcoma cell line
(mg-63). Int J Oncol 1998;13:1331-1334.
5

Florkiewicz RZ, Anchin J, Baird A: The inhibition of fibroblast growth factor-2

export by cardenolides implies a novel function for the catalytic subunit of na+,k+atpase. J Biol Chem 1998;273:544-551.
6

Ibrahimi OA, Zhang F, Hrstka SC, Mohammadi M, Linhardt RJ: Kinetic model

for fgf, fgfr, and proteoglycan signal transduction complex assembly. Biochemistry
2004;43:4724-4730.
7

Baldin V, Roman AM, Bosc-Bierne I, Amalric F, Bouche G: Translocation of bfgf

to the nucleus is g1 phase cell cycle specific in bovine aortic endothelial cells. EMBO J
1990;9:1511-1517.
8

Bouche G, Gas N, Prats H, Baldin V, Tauber JP, Teissie J, Amalric F: Basic

fibroblast growth factor enters the nucleolus and stimulates the transcription of
ribosomal genes in abae cells undergoing g0----g1 transition. Proc Natl Acad Sci U S A
1987;84:6770-6774.
9

Stachowiak EK, Maher PA, Tucholski J, Mordechai E, Joy A, Moffett J, Coons

S, Stachowiak MK: Nuclear accumulation of fibroblast growth factor receptors in human


glial cells--association with cell proliferation. Oncogene 1997;14:2201-2211.
95

10

RESULTADOS

Joy A, Moffett J, Neary K, Mordechai E, Stachowiak EK, Coons S, Rankin-

Shapiro J, Florkiewicz RZ, Stachowiak MK: Nuclear accumulation of fgf-2 is associated


with proliferation of human astrocytes and glioma cells. Oncogene 1997;14:171-183.
11

Bossard C, Laurell H, Van den Berghe L, Meunier S, Zanibellato C, Prats H:

Translokin is an intracellular mediator of fgf-2 trafficking. Nat Cell Biol 2003;5:433-439.


12

Reilly JF, Maher PA: Importin beta-mediated nuclear import of fibroblast growth

factor receptor: Role in cell proliferation. J Cell Biol 2001;152:1307-1312.


13

Arese M, Chen Y, Florkiewicz RZ, Gualandris A, Shen B, Rifkin DB: Nuclear

activities of basic fibroblast growth factor: Potentiation of low-serum growth mediated


by natural or chimeric nuclear localization signals. Mol Biol Cell 1999;10:1429-1444.
14

Quarto N, Fong KD, Longaker MT: Gene profiling of cells expressing different

fgf-2 forms. Gene 2005;356:49-68.


15

Smith C, Berry M, Clarke WE, Logan A: Differential expression of fibroblast

growth factor-2 and fibroblast growth factor receptor 1 in a scarring and nonscarring
model of cns injury in the rat. Eur J Neurosci 2001;13:443-456.
16

Cuevas P, Gimenez-Gallego G, Carceller F, Cuevas B, Crespo A: Single topical

application of human recombinant basic fibroblast growth factor (rbfgf) promotes


neovascularization in rat cerebral cortex. Surg Neurol 1993;39:380-384.
17

Reuss B, Leung DS, Ohlemeyer C, Kettenmann H, Unsicker K: Regionally

distinct regulation of astroglial neurotransmitter receptors by fibroblast growth factor-2.


Mol Cell Neurosci 2000;16:42-58.
18

do Carmo Cunha J, de Freitas Azevedo Levy B, de Luca BA, de Andrade MS,

Gomide VC, Chadi G: Responses of reactive astrocytes containing s100beta protein


and fibroblast growth factor-2 in the border and in the adjacent preserved tissue after a
contusion injury of the spinal cord in rats: Implications for wound repair and
neuroregeneration. Wound Repair Regen 2007;15:134-146.
19

Clarke WE, Berry M, Smith C, Kent A, Logan A: Coordination of fibroblast

growth factor receptor 1 (fgfr1) and fibroblast growth factor-2 (fgf-2) trafficking to nuclei
of reactive astrocytes around cerebral lesions in adult rats. Mol Cell Neurosci
2001;17:17-30.

96

20

RESULTADOS

Leadbeater WE, Gonzalez AM, Logaras N, Berry M, Turnbull JE, Logan A:

Intracellular trafficking in neurones and glia of fibroblast growth factor-2, fibroblast


growth factor receptor 1 and heparan sulphate proteoglycans in the injured adult rat
cerebral cortex. J Neurochem 2006;96:1189-1200.
21

Fahmy GH, Moftah MZ: Fgf-2 in astroglial cells during vertebrate spinal cord

recovery. Front Cell Neurosci;4:129.


22

Faber-Elman A, Solomon A, Abraham JA, Marikovsky M, Schwartz M:

Involvement of wound-associated factors in rat brain astrocyte migratory response to


axonal injury: In vitro simulation. J Clin Invest 1996;97:162-171.
23

Gourmala NG, Buttini M, Limonta S, Sauter A, Boddeke HW: Differential and

time-dependent expression of monocyte chemoattractant protein-1 mrna by astrocytes


and macrophages in rat brain: Effects of ischemia and peripheral lipopolysaccharide
administration. J Neuroimmunol 1997;74:35-44.
24

Yan YP, Sailor KA, Lang BT, Park SW, Vemuganti R, Dempsey RJ: Monocyte

chemoattractant protein-1 plays a critical role in neuroblast migration after focal


cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab 2007;27:1213-1224.
25

Dietrich JB: The adhesion molecule icam-1 and its regulation in relation with the

blood-brain barrier. J Neuroimmunol 2002;128:58-68.


26

Etienne-Manneville S, Manneville JB, Adamson P, Wilbourn B, Greenwood J,

Couraud PO: Icam-1-coupled cytoskeletal rearrangements and transendothelial


lymphocyte migration involve intracellular calcium signaling in brain endothelial cell
lines. J Immunol 2000;165:3375-3383.
27

Akiyama H, Kawamata T, Yamada T, Tooyama I, Ishii T, McGeer PL:

Expression of intercellular adhesion molecule (icam)-1 by a subset of astrocytes in


alzheimer disease and some other degenerative neurological disorders. Acta
Neuropathol 1993;85:628-634.
28

Dalmau I, Vela JM, Gonzalez B, Castellano B: Expression of lfa-1alpha and

icam-1 in the developing rat brain: A potential mechanism for the recruitment of
microglial cell precursors. Brain Res Dev Brain Res 1997;103:163-170.
29

Salvador-Silva M, Aoi S, Parker A, Yang P, Pecen P, Hernandez MR:

Responses and signaling pathways in human optic nerve head astrocytes exposed to
hydrostatic pressure in vitro. Glia 2004;45:364-377.
97

30

RESULTADOS

Luo J, Lindstrom CL, Donahue A, Miller MW: Differential effects of ethanol on

the expression of cyclo-oxygenase in cultured cortical astrocytes and neurons. J


Neurochem 2001;76:1354-1363.
31

Rodriguez C, Lopez P, Pozo M, Duce AM, Lopez-Pelaez M, Fernandez M,

Alemany S: Cox2 expression and erk1/erk2 activity mediate cot-induced cell migration.
Cell Signal 2008;20:1625-1631.
32

Singh B, Berry JA, Shoher A, Ramakrishnan V, Lucci A: Cox-2 overexpression

increases motility and invasion of breast cancer cells. Int J Oncol 2005;26:1393-1399.
33

Agullo L, Baltrons MA, Garcia A: Calcium-dependent nitric oxide formation in

glial cells. Brain Res 1995;686:160-168.


34

Balyasnikova IV, Pelligrino DA, Greenwood J, Adamson P, Dragon S, Raza H,

Galea E: Cyclic adenosine monophosphate regulates the expression of the intercellular


adhesion molecule and the inducible nitric oxide synthase in brain endothelial cells. J
Cereb Blood Flow Metab 2000;20:688-699.
35

Etienne-Manneville S: In vitro assay of primary astrocyte migration as a tool to

study rho gtpase function in cell polarization. Methods Enzymol 2006;406:565-578.


36

Thompson WL, Van Eldik LJ: Inflammatory cytokine stimulate the chemokine

CCL2/MCP-1 and CCL7/MCP-3 through NFkB and MAPK depnendent pathways in rat
astrocytes. Brain Res 2009;27;1295:230.
37

Heffron Ds, Mandell JW: Opposing role of ERK and p38 MAP kinases in FGF2-

induced astroglial process extension. Mol Cell Neurosci 2005;28(4):779-90.


38

Nugent MA, Iozzo RV: Fibroblast growth factor-2. Int J Biochem Cell Biol

2000;32(2):115-120.
39

Flinder LI, Timofeeva OA, Rosseland CM, Wierod L, Huifeldt HS, Skarpen E:

EGF-induced ERK-activation downstream FAK requires Rac1-NADPH oxidase. J Cell


Physiol 2010 [Epub ahead of print]
40

Hatch NE, Hudson M, Seto ML, Cunningham ML, Bothwell M: Intracellular

retention,

degradation,

and

signaling

of

glycosylation-deficient

fgfr2

and

craniosynostosis syndrome-associated fgfr2c278f. J Biol Chem 2006;281:2729227305.

98

41

RESULTADOS

Mangasarian K, Li Y, Mansukhani A, Basilico C: Mutation associated with

crouzon syndrome causes ligand-independent dimerization and activation of fgf


receptor-2. J Cell Physiol 1997;172:117-125.
42

Madrigal JL, Leza JC, Polak P, Kalinin S, Feinstein DL: Astrocyte-derived mcp-

1 mediates neuroprotective effects of noradrenaline. J Neurosci 2009;29:263-267.


43

Johnson DE, Williams LT: Structural and functional diversity in the fgf receptor

multigene family. Adv Cancer Res 1993;60:1-41.


44

Belluardo N, Wu G, Mudo G, Hansson AC, Pettersson R, Fuxe K: Comparative

localization of fibroblast growth factor receptor-1, -2, and -3 mrnas in the rat brain: In
situ hybridization analysis. J Comp Neurol 1997;379:226-246.
45

Asai T, Wanaka A, Kato H, Masana Y, Seo M, Tohyama M: Differential

expression of two members of fgf receptor gene family, fgfr-1 and fgfr-2 mrna, in the
adult rat central nervous system. Brain Res Mol Brain Res 1993;17:174-178.
46

Miyake A, Hattori Y, Ohta M, Itoh N: Rat oligodendrocytes and astrocytes

preferentially express fibroblast growth factor receptor-2 and -3 mrnas. J Neurosci Res
1996;45:534-541.
47

Chadashvili T, Peterson DA: Cytoarchitecture of fibroblast growth factor

receptor 2 (fgfr-2) immunoreactivity in astrocytes of neurogenic and non-neurogenic


regions of the young adult and aged rat brain. J Comp Neurol 2006;498:1-15.
48

Fuhrmann V, Kinkl N, Leveillard T, Sahel J, Hicks D: Fibroblast growth factor

receptor 4 (fgfr4) is expressed in adult rat and human retinal photoreceptors and
neurons. J Mol Neurosci 1999;13:187-197.
49

Kilkenny DM, Hill DJ: Perinuclear localization of an intracellular binding protein

related to the fibroblast growth factor (fgf) receptor 1 is temporally associated with the
nuclear trafficking of fgf-2 in proliferating epiphyseal growth plate chondrocytes.
Endocrinology 1996;137:5078-5089.
50

Maher PA: Nuclear translocation of fibroblast growth factor (fgf) receptors in

response to fgf-2. J Cell Biol 1996;134:529-536.


51

Stachowiak MK, Fang X, Myers JM, Dunham SM, Berezney R, Maher PA,

Stachowiak EK: Integrative nuclear fgfr1 signaling (infs) as a part of a universal "Feed-

99

RESULTADOS

forward-and-gate" Signaling module that controls cell growth and differentiation. J Cell
Biochem 2003;90:662-691.
52

Moscatelli D, Devesly P: Turnover of functional basic fibroblast growth factor

receptors on the surface of bhk and nih 3t3 cells. Growth Factors 1990;3:25-33.
53

Wiedlocha A, Sorensen V: Signaling, internalization, and intracellular activity of

fibroblast growth factor. Curr Top Microbiol Immunol 2004;286:45-79.


54

Beenken A, Mohammadi M: The fgf family: Biology, pathophysiology and

therapy. Nat Rev Drug Discov 2009;8:235-253.


55

Raffioni S, Thomas D, Foehr ED, Thompson LM, Bradshaw RA: Comparison of

the intracellular signaling responses by three chimeric fibroblast growth factor receptors
in pc12 cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:7178-7183.
56

Miraoui H, Oudina K, Petite H, Tanimoto Y, Moriyama K, Marie PJ: Fibroblast

growth factor receptor 2 promotes osteogenic differentiation in mesenchymal cells via


erk1/2 and protein kinase c signaling. J Biol Chem 2009;284:4897-4904.
57

Liao S, Porter D, Scott A, Newman G, Doetschman T, Schultz Jel J: The

cardioprotective effect of the low molecular weight isoform of fibroblast growth factor-2:
The role of jnk signaling. J Mol Cell Cardiol 2007;42:106-120.
58

Tomar A, Schlaepfer DD: Focal adhesion kinase: Switching between gaps and

gefs in the regulation of cell motility. Curr Opin Cell Biol 2009;21:676-683.
59

Laczko R, Szauter KM, Jansen MK, Hollosi P, Muranyi M, Molnar J, Fong KS,

Hinek A, Csiszar K: Active lysyl oxidase (lox) correlates with focal adhesion kinase
(fak)/paxillin activation and migration in invasive astrocytes. Neuropathol Appl
Neurobiol 2007;33:631-643.
60

Kanda S, Miyata Y, Kanetake H, Smithgall TE: Fibroblast growth factor-2

induces the activation of src through fes, which regulates focal adhesion disassembly.
Exp Cell Res 2006;312:3015-3022.
61

Lehembre F, Yilmaz M, Wicki A, Schomber T, Strittmatter K, Ziegler D, Kren A,

Went P, Derksen PW, Berns A, Jonkers J, Christofori G: Ncam-induced focal adhesion


assembly: A functional switch upon loss of e-cadherin. EMBO J 2008;27:2603-2615.
62

Yasuda M, Tanaka Y, Tamura M, Fujii K, Sugaya M, So T, Takenoyama M,

Yasumoto K: Stimulation of beta1 integrin down-regulates icam-1 expression and icam100

RESULTADOS

1-dependent adhesion of lung cancer cells through focal adhesion kinase. Cancer Res
2001;61:2022-2030.
63

Hsieh HL, Wang HH, Wu WB, Chu PJ, Yang CM: Transforming growth factor-

beta1 induces matrix metalloproteinase-9 and cell migration in astrocytes: Roles of rosdependent erk- and jnk-nf-kappab pathways. J Neuroinflammation;7:88.
64

Chiu WT, Shen SC, Chow JM, Lin CW, Shia LT, Chen YC: Contribution of

reactive oxygen species to migration/invasion of human glioblastoma cells u87 via erkdependent cox-2/pge(2) activation. Neurobiol Dis;37:118-129.
65

Wang HH, Hsieh HL, Yang CM: Nitric oxide production by endothelin-1

enhances astrocytic migration via the tyrosine nitration of matrix metalloproteinase-9. J


Cell Physiol
66

Yang SF, Chen MK, Hsieh YS, Chung TT, Hsieh YH, Lin CW, Su JL, Tsai MH,

Tang CH: Prostaglandin e2/ep1 signaling pathway enhances intercellular adhesion


molecule 1 (icam-1) expression and cell motility in oral cancer cells. J Biol
Chem;285:29808-29816.
67

Etienne-Manneville S: Polarity proteins in glial cell functions. Curr Opin

Neurobiol 2008;18:488-494.
68

Lichtenstein MP, Carriba P, Baltrons MA, Wojciak-Stothard B, Peterson JR,

Garcia

A,

Galea

E:

Secretase-independent

and

rhogtpase/pak/erk-dependent

regulation of cytoskeleton dynamics in astrocytes by nsaids and derivatives. J


Alzheimers Dis;22:1135-1155.
69

Bethel A, Kirsch JR, Koehler RC, Finklestein SP, Traystman RJ: Intravenous

basic fibroblast growth factor decreases brain injury resulting from focal ischemia in
cats. Stroke 1997;28:609-615; discussion 615-606.
70

Martinez G, Di Giacomo C, Sorrenti V, Carnazza ML, Ragusa N, Barcellona ML,

Vanella

A:

Fibroblast

growth

factor-2

and

transforming

growth

factor-beta1

immunostaining in rat brain after cerebral postischemic reperfusion. J Neurosci Res


2001;63:136-142.
71

Kiprianova I, Schindowski K, von Bohlen und Halbach O, Krause S, Dono R,

Schwaninger M, Unsicker K: Enlarged infarct volume and loss of bdnf mrna induction
following brain ischemia in mice lacking fgf-2. Exp Neurol 2004;189:252-260.

101

72

RESULTADOS

Furukawa S, Furukawa Y: [fgf-2-treatment improves locomotor function via

axonal regeneration in the transected rat spinal cord]. Brain Nerve 2007;59:1333-1339.
73

Tripathi RB, McTigue DM: Chronically increased ciliary neurotrophic factor and

fibroblast growth factor-2 expression after spinal contusion in rats. J Comp Neurol
2008;510:129-144.
74

Barotte C, Eclancher F, Ebel A, Labourdette G, Sensenbrenner M, Will B:

Effects of basic fibroblast growth factor (bfgf) on choline acetyltransferase activity and
astroglial reaction in adult rats after partial fimbria transection. Neurosci Lett
1989;101:197-202.
75

Eclancher F, Kehrli P, Labourdette G, Sensenbrenner M: Basic fibroblast

growth factor (bfgf) injection activates the glial reaction in the injured adult rat brain.
Brain Res 1996;737:201-214.
76

Kasai M, Jikoh T, Fukumitsu H, Furukawa S: Fgf-2-responsive and spinal cord-

resident cells improve locomotor function after spinal cord injury. J Neurotrauma
77

Renault-Mihara F, Okada S, Shibata S, Nakamura M, Toyama Y, Okano H:

Spinal cord injury: Emerging beneficial role of reactive astrocytes' migration. Int J
Biochem Cell Biol 2008;40:1649-1653.

102

RESULTADOS

Captulo 2: Secretase independent and


RhoGTPase-PAK/ERK dependent
regulation of cytoskeleton dynamics in
astrocytes by NSAIDs and derivatives

110

1135

Journal of Alzheimers Disease 22 (2010) 11351155


DOI 10.3233/JAD-2010-101332
IOS Press

Secretase-Independent and
RhoGTPase/PAK/ERK-Dependent
Regulation of Cytoskeleton Dynamics in
Astrocytes by NSAIDs and Derivatives
Mathieu P. Lichtensteina,b,1, Paulina Carribaa,b,1 , Mara Antonia Baltronsb,c , Beata Wojciak-Stothardd ,
Jeffrey R. Petersone, Agustina Garcab,c,1 and Elena Galeaa,b,f,1,
a

Institut de Neuroci`ences, Universitat Aut`onoma de Barcelona, Spain


Departament de Bioqumica i Biologia Molecular, Universitat Aut`onoma de Barcelona, Spain
c
Institut de Biotecnologia i de Biomedicina, Universitat Aut`onoma de Barcelona, Spain
d
Department of Experimental Medicine and Toxicology, Hammersmith Campus, Imperial College London, UK
e
Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA, USA
f
Institut Catal`a dEstudis Avancats (ICREA), Spain

Accepted 13 August 2010

Abstract. Profens like ibuprofen, R-flurbiprofen, or CHF5074 are being considered for the treatment of Alzheimers disease
because epidemiological data indicates that non-steroidal anti-inflammatory drugs are protective against neurodegeneration.
Rho-GTPases are small G proteins, including RhoA, Cdc42, and Rac1, which control cytoskeleton dynamics. Because ibuprofen
promotes axon growth via RhoA in neurons, we examined whether profens modulate astrocyte plasticity via Rho-GTPases. We
report that ibuprofen (100500 M), R-flurbiprofen (100500 M), and CHF5074 (1030 M) caused a concentration-dependent
stellation of astrocytes in primary cultures, associated with the reorganization of GFAP and actin filaments. The stellation was
independent of COX2, -, - or -secretase as judged by the lack of effect of inhibitors of these enzymes. RhoA, PAK, and
Cdc42, but not Rac1, accounted for the profen-mediated stellation, as concluded from the joint analyses of activities and reversal
experiments with adenoviral or pharmacological manipulations. Ibuprofen accelerated migration in a scratch-wound assay, while
R-flurbiprofen had no effect and CHF5074 caused deceleration. Cell polarity regulation by Cdc42 and ERK1/2 may underlie
the paradoxical effects of profens on migration. We conclude that profens regulate cytoskeleton dynamics in astrocytes via
Rho-GTPases, PAK, and ERK1/2. Since migration is a hallmark of astrocyte response during inflammation we propose that, in
addition to (or instead of) lowering amyloid-42 via secretases, ibuprofen and its derivatives may prevent Alzheimers disease by
modulating astrocyte reactivity through Rho-GTPase/PAK/ERK-dependent signaling.
Keywords: Actin, Alzheimers disease, astrocytes, Cdc42, CHF5074, ibuprofen, IPA3, NSAIDs, Rac1, RhoA, R-Flurbiprofen
Supplementary data available online: http://www.j-alz.com/issues/22/vol22-4.html#supplementarydata02

1 Equal

author contribution.
to: Elena Galea, PhD, Institut of Neuroci`encies,
Edifici M Universitat Aut`onoma de Barcelona, Bellaterra, 08193
Correspondence

Barcelona, Spain. Tel.: +34 93 586 8143; Fax: +34 93 581 1575;
E-mail: galea.inc@gmail.com.

ISSN 1387-2877/10/$27.50 2010 IOS Press and the authors. All rights reserved

1136

M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes

INTRODUCTION
Numerous epidemiological studies have shown
that long-term use of certain non-steroidal antiinflammatory drugs (NSAIDs) like ibuprofen correlates with reduced incidence of Alzheimers disease
(AD) [1]. This correlation was initially taken as a proof
of the pathogenic role of the inflammation that, in addition to plaques, is a prominent feature in AD [2].
However, the mechanism of action of NSAIDs is under
debate because clinical trials using specific inhibitors
against cyclooxygenases (COX) 1 and 2, the canonical targets of NSAIDs, have failed to show clear benefits [1]. A common belief in AD is that NSAIDs
target -secretase and not COXs, based upon numerous studies showing that some NSAIDs modulate secretase thereby lowering the production of the more
pathogenic form of amyloid-, A42 [3,4]. This evidence has prompted the development of several COX
inactive, secretase-active, ibuprofen derivatives such as
R-flurbiprofen [5] and CHF5074 [6,7] to treat AD while
avoiding the gastric problems associated with chronic
COX inhibition. Despite promising results in transgenic animal models [5,8] and in a Phase II clinical
trial [9] R-flurbiprofen has failed to show in Phase III
any improvement in primary endpoints such as cognition and activities of daily living. It has therefore been
discontinued [10]. Explanations for the negative results are that brain levels of R-flurbiprofen were insufficient to achieve a meaningful reduction in A generation, that the disease was too advanced to be reversed,
that the amyloid cascade hypothesis is wrong, or that a
residual COX inhibitory activity worsens the pathology in already settled AD [11]. Further insight into the
correct answer will be obtained with CHF5074, which
has a greatly improved pharmacological and pharmacokinetic profile over R-flurbiprofen [6,7], decreases
A pathology and cognitive deficits in two transgenic
models of AD [12,13] and is now in Phase 2 clinical
trial.
A very recent development in the issue of NSAIDs
and AD comes from the last report of the only primary
prevention trial in AD (ADAPT) which, although incomplete, points to almost 70% protection in naproxenbut not celecoxib-treated individuals [14]. Naproxen
is a non-selective COX2 inhibitor with no effect on secretase [15], challenging the prevailing view that secretases account for the protection afforded by NSAIDs.
RhoA, a small G protein member of the Rho-GTPase
family, emerges as an alternative target. RhoA regulates the actin cytoskeleton and gene transcription, thus

coordinating cellular events that require both morphological and functional changes such as morphogenesis, axon growth, migration or progression of cell cycle [16]. Ibuprofen promotes the regeneration of severed axons via inhibition of RhoA [17,18]. This is at
present the only valid evidence linking ibuprofen to
RhoA because a report claiming that RhoA accounts
for the ibuprofen-mediated reduction of A production
in neurons [19] has not been validated thereafter [20].
Numerous reports indicate that RhoA, and other
Rho-GTPases including Cdc42 and Rac1,regulate plasticity and motility in astrocytes [2126]. Here we
sought to analyze: i) if ibuprofen modulates RhoA
in astrocytes as it does in neurons; ii) the implications in plasticity, that is, effects on morphology and
motility; iii) whether the effects on RhoA extend to
Cdc42, Rac1 and downstream kinases; iv) whether
the ibuprofen derivatives R-flurbiprofen and CHF5074
still target Rho-GTPases despite the chemical transformation towards improved secretase inhibition, and
v) the effects of -secretase-modulating NSAIDs (indomethacin, sulindac sulfide, diclofenac) versus non
modulators (naproxen).
We report that ibuprofen, R-flurbiprofen, and
CHF5047 induced stellation but differentially affected
migration of astrocytes in primary cultures. The stellation appeared dependent on RhoA inhibition and PAK
activation, whereas ERK1/2 and Cdc42 might mediate differences in migration patterns, and Rac1 did not
seem to be involved. The other NSAIDs tested mimicked the effect of ibuprofen in stellation and migration.
These findings are relevant to AD because astrocyte reactivity, manifested as hypertrophy, and migration towards A plaques, is a hallmark of the disease [2,13]. It
follows that profens may influence the AD progression
by modulating astrocyte plasticity and motility through
some Rho-GTPases, PAK and ERK1/2. Our data thus
support that astrocyte Rho-GTPases, PAK and ERK1/2
be brought to the spotlight as additional targets to neuronal secretases in the protective effects of profens in
AD.

MATERIALS AND METHODS


Materials
Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM),
penicillin, streptomycin, paraformaldehyde, Triton X100, bovine serum albumin (BSA), 4,6-diamidino-

M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes

1137

2-phenylindole (DAPI), bromodeoxyuridine (BrdU),


ibuprofen, naproxen, diclofenac, indomethacin, sulindac sulfide, GW9662, lipophosphatidic acid (LPA),
phosphatase inhibitors, mouse anti-actin antibody were
obtained from Sigma. R-Flurbiprofen, pioglitazone
and rabbit polyclonal anti-COX2 antibody was from
Cayman. CH5074 was from Chiesi Farmaceutici (Parma, Italy). Foetal-calf serum (FCS) was from Cambrex. ROCK (RhoA GTPase kinase) and Rac1 inhibitors, Y27632 and NSC23766 respectively, BACE
inhibitor (-secretase inhibitor IV), TAPI1 and Nterminal PS1 rabbit polyclonal antibody (1/3000) were
from Calbiochem. The PAK1/2/3 inhibitor IPA3
was from Jeffrey Peterson (Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, USA). The protease inhibitor cocktail was from Roche. Rabbit monoclonal antibodies
against ERK1/2 and phospho-ERK (pERK) were from
Cell Signaling (1/1000). Rabbit monoclonal to PAK1
was from Abcam or Invitrogen (1/3,000). Rabbit polyclonal against phospho-PAK1/2/3 serines 144/141/139
(1/3,000) was from Abcam or Invitrogen. Rabbit monoclonal against phosho-PAK1/2 threonines 423/402
was from Cell Signaling. Rabbit anti-GFAP (1/1,000)
and mouse anti-BrdU (1/100) antibodies were from
DAKO. Mouse anti-myc antibodies (1/300) were from
Santa Cruz Biotechnology. Horseradish peroxidaseconjugated anti-rabbit or mouse IgG from Amersham
Life Science. RhoA and Cdc42 monoclonal antibodies and Rhodamine Phalloidin were from Cytoskeleton.
Rabbit polyclonal anti-GLAST antibody was from Abcam, and anti-BACE1 and anti-ADAM10 from Millipore. Epidermal Growth Factor (EGF) from R&D was
used as a positive control in GLISAs.

dishes at 1.25 105 cells/cm2 . For immunofluorescence experiments, a 24 24 mm glass cover slip
was inserted into each dish before seeding. Cells were
maintained in a humidified atmosphere of 90% air-10%
CO2 . The medium was changed at day 7, and the cells
were immediately used when cultures reached confluency (around 10 DIV). This minimizes contamination
by microglia that rapidly proliferate when the astrocyte
monolayer reaches confluency [27]. The medium was
changed to 1%FCS-DMEM for 3 h before treating cultures with different compounds for the indicated times
and concentrations.

Cultures

We used adenoviruses containing constitutively active (CA) or dominant negative (DN) forms of RhoGTPases: V17-RhoA (CA-RhoA), N17Cdc42 (DNCdc42), V17-Rac1 (CA-Rac1), N17Rac1 (DN-Rac1).
Virus generation was described in [28]. In brief, cDNAs encoding aminoterminal GFP-tagged V17-RhoA,
N17Rac1 and V17Rac1, or myc-tagged N17Cdc42,
were subcloned into the admid transfer vectors pCR259
and pCR244. The admid transfer vectors were then
transformed into an E. coli strain containing a vector
encoding a transposase and an Ad5-based adenovirus
vector deleted in the E1 and E3 genes (Ad5 DE1DE3).
Transposition of the Rho cDNAs from the admid transfer vectors into Ad5 DE1DE3 created the adenoviral
vectors where the Rho transgenes are under the control
of a IRES-CMV promoter. Recombinant adenoviral
DNA was purified from E. coli and transfected into

Astrocyte cultures were prepared from cerebellum


from 7-day-old or cortex from 1-day-old SpragueDawley rats [27]. In brief, rats were decapitated and
brain immediately dissected out. After meninges and
blood vessels were removed, the tissue was minced
and incubated for 10 min at 37 C in Ca2+ -free KrebsRinger buffer containing 0.025% trypsin. Cells were
then mechanically triturated through a glass pipette
and filtered through a 40 m nylon mesh in the presence of 0.52 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 170
IU/ml DNase. After centrifugation (500 x g), cells
were stained by Trypan Blue exclusion and counted
in a Neubauer chamber and then resuspended in 90%
DMEM, 10% FCS, 20 U/ml penicillin and 20 g/ml
streptomycin in a volume to be seeded on plastic Petri

Immunocytochemistry
Astrocytes were labeled by fluorescence immunostaining for GFAP. Cultures were fixed for 40 min with
4% paraformaldehyde in phosphate buffered saline
(PBS) at room temperature. After several washes,
monolayers were incubated with PBS-0.1% Triton X100 for 15 min. Then, blockade of non-specific binding was performed with 1% BSA in PBS, and afterwards cells were incubated overnight at 4 C with a rabbit polyclonal anti-GFAP antibody (1/1,000) in 0.1%
BSA-PBS). After washing, cells were incubated for 1 h
with Alexa 488 anti-rabbit IgG diluted 1:1000 in 0.1%
BSA-PBS. The primary antibody was omitted in controls. F-actin was stained with rhodamine-phalloidin
(1/200, 1 h) from Cytoskelton Inc, added together with
the secondary antibody in double-labeling procedures.
Adenoviral infections

1138

M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes

Fig. 1. Profens induced astrocyte stellation in a time- and concentration-dependent manner. Cerebellar (A, B) or cortical (C) astrocytes were
incubated with ibuprofen (100500 M), R-flurbirprofen (100500 M), or CHF5074 (1030 M) for 0.524 h as indicated in the figure, and
stained for GFAP (red) or F-actin (green). A) Concentration dependency for ibuprofen, R-flurbiprofen and CHF5074. B) Time course for
ibuprofen. C) Effect of profens in cortical astrocytes. Profens caused a time-dependent retraction of the soma and process elongation that was
detected at 30 min for the higher concentrations. (See Supplementary Figs 14). The stellation was fully developed by 3 h, and partially reversed
by 24 h. Scale bar, 25 or 50 m.

293 human embryonic kidney cells, which express E1


genes, to allow purification of adenoviral particles.
To establish appropriate MOIs, astrocytes were infected with MOIs ranging 1100. Cells were infected for 2 h 1% serum-containing DMEM. The medium was then replaced by complete medium, and the
cells left overnight to allow full expression of mutated
Rho-GTPases. Infection was verified by visualization
of tags (GFP or myc, the latter after performing immunocytochemistry). The MOI chosen for the experiments was the one that produced infection in 100%
of the cells. Expression of transgenes was confirmed
by western blots (Fig. 5), where mutated RhoA and
Cdc42 appeared as bands with reduced electrophoretic
mobility due to the tags.

Scratch-wound assay
The capacity of astrocytes to migrate was put to the
test by scratching confluent astrocyte monolayers to induce natural cell migration to close the scratch, as previously reported [24]. Immediately after profens were
added to the cultures, a scratch of 500 m in width was
done with a sterile yellow pipette tip. The cells were
fixed at 0, 12, 24, or 48 h thereafter and immunostained
for GFAP/DAPI. Individual images (45 per scratchwound) were taken with the 20 x magnification lens,
and the cell-free area (given in mm2 ) was measured
using ANALYSIS software (version 3.2, Soft Image
Analysis System, Munster, Germany).

M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes

1139

Fig. 2. Profens modulated migration following a scratch-injury. Cultures were scratched and immunostained for GFAP at the times indicated.
A) Migration profiles showing that ibuprofen but not the other profens accelerated the scratch closure; B) Migration fronts. Ibuprofen and
R-flurbiprofen enhanced the length of the leading edges, whereas CHF5074 caused a remarkable loss of cell polarity; C) Quantification of
migration rates as percentage of cell free area. Data are the means SEM of 58 independent determinations. Statistical differences respect to 0
h p < 0.001 or respect to untreated cultures at the same migration time #p < 0.05, ##p < 0.01 were obtained by ANOVA analysis followed
by Newman-Keuls post-hoc test.

1140

M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes

Fig. 3. Effect of profens is secretase independent. A) Western blots were performed on astrocyte membrane fractions and secretases detected by
incubation with antibodies against -secretase, BACE, PS1. N-ter is N-terminal, the active form of PS1. Anti-glutamate transporter GLAST was
used as a membrane marker; B) Effect of NSAIDs on stellation. Cells were treated with ibuprofen (ibu), naproxen (nap) indomethacin (indo)
and diclofenac (diclo) at 125 and 250M, and sulindac sulphate (SS) at 30 and 60 M. All profens caused stellation, sulindac sulphate being the
most potent and naproxen the least. C) Naproxen and indomethacin (250 M) accelerated migration in a scratch-wound injury when tested at 18
h. Fronts showed enhanced protrusions. Data are means SEM of 3 independent experiments. p < 0.05, Student T-test.

M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes

1141

Fig. 4. Antagonistic effects of profens and LPA on stellation and RhoA-GTP loading. A) Cells were treated with 10 M LPA, 250 M ibuprofen,
250 M R-flurbiprofen or 30 M CHF5074 in the combinations indicated for 3 h, and then stained for F-actin (green) or GFAP (red). Images
are representative of 3 independent determinations. B) RhoA-GTP contents. Cells were incubated with profens with/without LPA for 45 min
and processed for GLISAs. The data are expressed as the means SEM of n = 35 experiments. p < 0.05, p < 0.01 respect to basal
contents; #p < 0.05, ##p < 0.01 respect to LPA alone. ANOVA analysis, followed by the Newman-Keul test. The three profens inhibited the
increase in RhoA-GTP contents caused by LPA. Only CHF5074 exerted an inhibitory effect on basal contents.

1142

M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes

Fig. 5. CA-RhoA and DN-Cdc42 overexpression prevented stellation. A) Astrocytes were infected with adenoviruses containing only GFP,
CA-RhoA/GFP or DN-Cdc42/c-myc, and exposed to ibuprofen, R-flurbiprofen or CHF5074. All cells were processed for fluorescent detection of
F-actin (red). Infection efficiency was controlled for by counterstaining with c-myc (green) or GFP flurorescence (green). Images are representative
of 3 independent determinations. Bar is 50 m. CA-RhoA and Cdc42 prevented stress-fiber disassembly upon profen administration. B) Western
blot analyses confirmed expression of CA-RhoA and DN-Cdc42, detected as forms with reduced electrophoretic mobility due to the tags; GLISA
measurements confirmed that CA-RhoA and DN-CDc42 respectively increased and decreased RhoA and Cdc42 activities. C) Measurements of
Cdc42-GTP amounts by GLISA revealed differing effects of profens. Epidermal Growth Factor (EGF, 100 ng/mL) was used as a positive control.
The data are expressed as the means SEM of n = 3 experiments. p < 0.05, p < 0.01, Student T test.

Bromodeoxyuridine (BrdU) staining


This was performed to examine the contribution of
new cell generation, as opposed to migration to the
closure of scratches. BrdU (1 g/mL) was added in
DMEM-1% FCS with or without different compounds
and the monolayer scratched as described above. After
24 h cells were fixed and incubated with 1N HCl during
30 min, followed by several washes with 0.1 M borate
buffer pH 8.5, to denaturate the DNA to allow for the
antibody to bind. Cells were then permeabilized with
PBS-0.1% Triton X-100 and double-immunostained
for BrdU, GFAP and DAPI. Mouse anti-BrdU (1/100)

was incubated with a rabbit anti-GFAP antibody for


3 h followed by secondary antibodies together with
DAPI (0.25 g/ml). BrdU- and DAPI-positive astrocytes were counted in photomicrographs whose right
margin coincided with the midline of the wound to
assure that the analyses were performed in equivalent
areas.
Western blots
Cultures were scraped out of the plates with PBS,
collected by brief centrifugation (5 min, 1,000 x g), and
then homogenized in ice-cold 10 mM HEPES pH 7.9,

M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes

1.5 mM MgCl2 , 10 mM KCl, 1 mM DTT containing


antiprotease and antiphosphatase cocktails, and placed
in ice 5 min. NP-40 was added to 0.6%, and the homogenates were vortexed and centrifuged 30 s at high
speed (20,000 x g). The supernatants were then centrifuged at 100,000 x g for 2 h. The resulting pellets and
supernatants were respectively considered membrane
and cytosolic fractions. Samples containing equal
amounts of protein (1530 g) were subjected to sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) (SDS-PAGE). After running the
samples, proteins were transferred to polyvinyl difluoride membranes, and incubated with primary antibodies (indicated in Materials). This was followed by incubation with anti-IgG-horseradish peroxidase-labeled
secondary antibodies (1:10,000) and subsequent detection with an enhanced chemiluminescence detection kit
(Millipore). Protein concentration was determined by
the method of Bradford [29] with BSA as standard.
GLISAs
GLISA Activation Assay Biochem kits (Cytoskeleton, Denver, CO) were used to measure RhoA, Cdc42
and Rac1 activation according to the manufacturers
recommendations. Astrocyte cultures were grown in
60-mm dishes and incubated in serum-free medium
24 h prior to experimental procedures. Cells were
then incubated in the presence or absence of profens (250 M ibuprofen or R-flurbiprofen or 30 M
CHF5074 for 45 min), or known activators of Rac1
and Cdc42 such as EGF (100 ng/ml) or LPA (15 M) for
RhoA. Afterwards, monolayers were washed with icecold PBS to remove serum proteins. Ice-cold cell lysis
buffer (80100 l) was added, dishes were scrapped,
and cell lysates were harvested by centrifugation at
20,000 x g at 4 C for 1 min. An aliquot was kept on
ice for protein concentration measurement, and samples were snap frozen at 70 C. After adjustment of
protein concentrations, cell lysates were thawed in a
room temperature bath and 50 l of lysates were added
to the wells of the GTPase binding plate. Wells were
sequentially incubated with antigen-presenting buffer,
primary antibodies, a secondary anti-horseradish peroxidase (HRP)-labeled antibody, and horseradish peroxidase. Signals were measured at 490 nm using a BioTeK Power-Wave XS microplate spectrophotometer.
Statistical analysis
Experiments were always reproduced a minimum of
three times. Quantifiable determinations are expressed

1143

as means SEM of the indicated number of experiments performed in independent cultures. Significance
of differences was evaluated by one-way ANOVA followed by the Newman-Keuls post-hoc test when more
than two conditions were evaluated, or the Students T
test when only two conditions were compared.

RESULTS
Profens caused astrocyte stellation and altered
migration
The used concentrations of profens were based on
pilot dose-response analyses where we tested ranges
of ibuprofen (10 M-1 mM) R-flurbiprofen (10 M1 mM), and CHF5074 (560 M) at concentrations
based upon the IC50 values or concentration ranges
of action on possible targets namely COX, PPAR and
-secretase (Table 1). Of note, 500 M ibuprofen
has been the concentration used to induce RhoA inhibition in vitro [1719]. Cerebellar astrocytes treated
with profens went from a flat fibroblast-like morphology to a highly ramified stellate shape caused by soma retraction and process elongation. Stellation was
evident with GFAP immunostaining (Fig. 1A) and under phase contrast (Supplementary Figs 14; available online: http://www.j-alz.com/issues/22/vol224.html#supplementarydata02). The effect was time and
concentration-dependent for the three profens. The
stellation was incipient, but detectable, as early as
30 min after administration of the profens at the lowest concentrations, and it was clearly in progress at
the highest ones. By 3 h the stellation was fully settled. The order of potencies was CHF5074 > Rflurbiprofen > ibuprofen. By 24 h the stelllation was
reversed (Fig. 1B). The staining of polymerized actin
(F-actin) revealed actin organization on parallel stress
fibers and adhesion rings in control cells as previously described [25]. Profens caused the disorganization
of stress-fibers (Fig. 1A). Profens also caused stellation in cortical astrocytes (Fig. 1C), suggesting that the
phenomenon was not region-specific. The ensuing experiments were performed in cerebellar astrocytes at
concentrations that produced maximal effects, which
were 250 M for ibuprofen and R-flurbiprofen (note
that 250 and 500 M had similar effects), and 30 M
for CHF5074.
To examine the effect of profens in migration we
used the scratch-wound in vitro assay wherein the loss
of cell contacts induces local chemokine release that

1144

M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes


Table 1
Potential targets of profens and NSAIDS (M)
Ibuprofen R-flurbiprofen CHF5074

-secretase (decrease in A42 )


COX1
COX2
PPAR

300(3)
5(30)
72(30)
300(44)

268(7)
100*(7)
300*(7)
75#

40(7)
300*(7)
None*(7)
30#

Indomethacin

Sulindac Sulfide

Naproxen

Diclofenac

100(3)
0.27(30)
1.7(30)
5 fold activation
at 10 M (34)

100(3,15)
nd
nd
100(63)

none(3,15)
9.5(30)
5.6(30)
5 fold activation
at 10 M (34)

nd
1.69(30)
1.18(30)
25(64)

For -secretase and COXs all values were obtained from assays involving living cells except
purified enzymes
Concentrations associated with a 2-fold increase in PPAR- activity (EC200 )
Imbimbo BP. personal communication.

drives the cells to close the scratch. Ibuprofen accelerated the scratch closure, as judged by the smaller cellfree areas observed 1224 h after the scratch was performed (Fig. 2A, C). The accelerated migration was not
due to increased cell proliferation because the analysis
of proliferating cells with BrdU revealed no change in
the presence of ibuprofen (data not shown). The scratch
fronts in cells treated with ibuprofen showed longer
leading edges than control cells, arranged in parallel
and perpendicular to the wound (Fig. 2B), suggesting
increased polarity. R-flurbiprofen, by contrast, showed
no significant effect on migration (Fig. 2A, C). However, fronts showed no obvious difference with cultures
treated with ibuprofen, for cells also displayed long
and orderly protrusions (Fig. 2B). This suggests that,
in astrocytes, migration, motion and polarity are independently regulated and that ibuprofen increases both,
while R-flurbiprofen only the latter. CHF5074, by contrast, inhibited migration at all times tested (Fig. 2A,
C). The moving front looked highly disorganized indicating a dramatic loss of polarity in the presence of this
new profen derivative (Fig. 2B).
Role of COX2, secretases, or RhoA
In order to gain insight into the mechanism underlying the structural and dynamic changes we considered five possible targets of profens: i) COX2, ii)
-secretase, iii) -secretase, iv) PPAR, and v) secretase (BACE). Ibuprofen inhibits COX2 [30], and
modulates -secretase by binding to the amyloid- protein precursor (APP) [31] thereby shifting its cleavage to produce A40 instead of A42 [3]. Ibuprofen also inhibits -secretase according to one study [32] but
not to another [33], and is a ligand of PPARs [34,35].
R-flurbiprofen has residual COX [7], and PPAR activities (BP Imbimbo, personal communication), while
it modulates -secretase like ibuprofen [5]. CHF5074
inhibits -secretase thereby lowering both A40 and

and represent the IC50 . Values obtained from

A42 [7], while it does not inhibit COX [7], but can
stimulate PPAR activity (BP Imbimbo, personal communication). We also considered BACE, which can be
inhibited by ibuprofen via PPAR upon inflammatory
stimulation [36].
It is worth stressing that the inhibitory versus modulatory actions of profens on secretase have been
defined based on APP metabolism and A42 /A40 ratios, which have no place in this study because expression of APP is not detected (data not shown). However, molecules cleaved by secretases other than APP
may be relevant in regulating astrocyte dynamics.
The expression of -secretase, BACE, PS1, COX2
and PPAR was examined in cytosolic and membrane
fractions by Western blot analysis. While -secretase,
BACE, and PS1 were detected in membranes (Fig. 3A),
COX2 and PPAR were not detected in either fraction
(data not shown). The most abundantly expressed secretase was PS1 in its cleaved, active N-terminal form.
The inhibition of -secretase (25 M TAPI), COX2
(10 M NS398), or BACE (1 M BACE Inhibitor IV)
had no effect on stellation or migration, that is, the inhibitors did not mimic the effect of profens thus precluding that these acted inhibiting -secretase, COX2,
or BACE (n = 2, Supplementary Fig. 5). Likewise,
inhibition of PPAR with 20 M GW9662 did not reverse the actions of ibuprofen (n = 2, Supplementary
Fig. 6), nor the PPAR agonist pioglitazone (1030 M)
had any effect. Finally, inhibition of PS1 with 2 M
DAPT had no effect on stellation ormigration, nor it
interfered with the stellation and accelerated migration
caused by ibuprofen (n = 2, Supplementary Fig. 5).
This indicates that PS1 is not involved in the profen
effects, whether these are modulators or inhibitors of
the enzyme.
NSAIDs other than ibuprofen have shown to be
preventive in epidemiological studies and, interestingly, the effect appears independent on their capacity to decrease A42 /A40 ratios by modulating secretase [37]. Here we tested indomethacin, sulin-

M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes

dac sulfide, and diclofenac, all -secretase modulators,


and naproxen, which have no effect on -secretase.
NSAIDs were tested within the range of purported secretase inhibitory concentrations (25250 M (Table 1).
All of them produced stellation and, with the exception
of naproxen, they appeared more potent than ibuprofen.
Figure 3B shows the minimum and maximal effects observed. Both a -secretase modulator (indomethacin)
and naproxen accelerated migration in a scratch-wound
assay (Fig. 3C). Cells in moving fronts displayed elongated fronts suggesting increased polarity (Fig. 3C).
Overall, the data indicate that the regulation of cytoskeleton dynamics by profens or NSAIDs was mediated by a target other that COX2 or secretases.
RhoA was a likely candidate to mediate stellation
since extensive evidence shows that the formation and
maintenance of stress fibers in cells in culture is mediated by the activation of myosin light chain kinase (MLCK) by RhoA via ROCK [38]. Lysophosphatidic acid
(LPA), a well characterized RhoA activator widely used
to facilitate the appraisal of putative RhoA inhibitory
molecules [39,40], prevented the profen-elicited disorganization of the actin cytoskeleton and the ensuing stellation (Fig. 4A). This suggests that profens and
LPA play antagonistic roles on the RhoA-dependent
signaling leading to stress fiber organization. To further localize the site of action of profens along the pathway, we measured the contents of GTP-bound RhoA
by GLISA. LPA increased RhoA-GTP loading as expected [40], and the three profens counteracted the increase (Fig. 4B). This result implies that profens regulate RhoA-dependent signaling acting directly on, or
upstream to, RhoA-GTP formation.
To further implicate RhoA inhibition in the effect
of profens on astrocyte morphology we tested the effect of CA-RhoA by introducing the encoding construct in the cells with an adenovirus. The viral infection per se (Ad-GFP) caused a moderate disorganization of stress fibers (Fig. 5). Overexpression of CARhoA enhanced stress-fiber formation in control cells,
which adopted a more polygonal shape, and prevented
completely the stellation caused by all profens (Fig. 5).
These findings provide additional proof that inhibition
of RhoA-dependent pathways was necessary for the
profen-mediated stellation to occur. Reports indicate
that RhoA inhibition hastens migration [24], as confirmed here with the ROCK inhibitor Y27632 (Fig. 8A,
B). RhoA inhibition, however, cannot account for the
effect of profens on migration because this would only explain the acceleration caused by ibuprofen, but
not the deceleration caused by CHF5074, or the mixed
effects of R-flurbiprofen.

1145

Role of Cdc42/Rac1/PAK
Cdc42 and Rac1 can antagonize RhoA by inhibiting MLCK via PAK [41]. In addition Cdc42 and Rac
activation are involved in directed cell migration [26].
We thus sought to determine whether profens activated
Cdc42, Rac1 and the effector PAK, as well as the reversal actions on stellation and migration of the overexpression of DN or CA forms, as appropriate, or the
effect of pharmacological inhibitors.
Overexpression of DN-Cdc42 completed abrogated
the profen-mediated stellation (Fig. 5A), suggesting
that Cdc42 activation was involved in this effect. Interestingly, stress-fiber disorganization appeared to proceed in the presence of DN-Cdc42 indicating that, unlike RhoA, Cdc42 regulates yet uncharacterized mechanisms of process extension during stellation. Paradoxically, Cdc42-GTP contents were increased by ibuprofen and R-flurbiprofen but decreased by CHF5074
(Fig. 5C), despite the comparable effects of the three on
stellation. This suggests that, in the case of CHF5074,
actions on PAK or RhoA along with remaining levels
of active Cdc42 permitted stellation.
Rac1 was modulated by profens like Cdc42, as
judged by changes in Rac1-GTP loading. Ibuprofen and
R-flurbiprofen increased the activity whereas CHF5074
was inhibitory (Fig. 6B). Infection of astrocytes with
adenoviruses containing DN-Rac1 (N17Rac) or CARac1 (V17Rac1) caused extreme disarray in the
cells that precluded further experimentation (data not
shown). The only tool left was the pharmacological
inhibitor NSC23766 [42], which had no effect on the
profen-mediated stellation (Fig. 6A), nor it reversed
significantly the ibuprofen-elicited acceleration in migration (Fig. 6C).
The novel PAK1/2/3 inhibitor IPA3 [43] largely prevented the disorganization of the actin cytoskeleton
caused by profens (Fig. 7A), and blocked migration
completely (Fig. 8B). Cells at the migrating front presented blunted shapes, indicating that PAK inhibition
had completely prevented the formation of protruding
edges (Fig. 8A). Altogether, these findings reveal a
key role of PAK in process formation in astrocytes,
and prompted us to examine the level of phosphorylated and presumably active forms of the enzyme
within 15 min24 h. No increase of PAK phosphorylated in threonine 423/402 was detected (data not
shown). A robust phosphorylation of PAK in serine
S139/141/144 (pPAKSer141 ) was present in controls.
All profens tended to increase pPAKSer141 although
only R-flurbiprofen caused a statistically significant in-

1146

M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes

Fig. 6. Role of Rac1 on stellation and migration. A) The Rac1 inhibitor NSC23766 did not reverse stellation. Cells were incubated with 100 M
NSC23766 prior to administering profens, which were left for 3 h. The cells were processed for detection of GFAP (red) and F-actin (green).
NSC23766 appeared to cause F-actin accumulation in clumps despite the overall unchanged stellation. B) Ibuprofen and R-flurbiprofen at
250 M increased Rac1-GTP contents whereas CHF5074 (30 M) caused a decrease. Data are expressed as the means SEM of 3 independent
determinations. C) NSC23766 did not reverse the acceleration elicited by ibuprofen (250 M). Data are the means SEM of 3 independent
determinations. Statistical differences versus controls p < 0.05, p < 0.01, ANOVA, Newman-Keuls post-hoc.

M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes

1147

Fig. 7. PAK inhibition prevented the profen-induced stellation. A) Effect of the PAK inhibitor IPA3. Astrocytes were incubated for 3 h
with 250 M ibuprofen or R-flurbiprofen or 30 M CHF5074 in the presence or absence of 25 M IPA3, and stained for GFAP or F-actin.
IPA3 enhanced stress-fiber formation in control cells and prevented the stellation caused by profens. Representative of at least 3 independent
determinations. B) pPAK and total PAK expression. Cells were incubated with profens for 1560 min or 324 h and processed for western
blot analysis of pPAK 1/2/3 (S139/141/144) and total PAK. A robust constitutive expression of pPAK was detected, and there was no significant
increase by profens within 15-60 min, whereas at later times only R-flurbiprofen caused a statistically significant increase at 6 h. Total PAK did
not change. The values are the means SEM of 5 determinations; p < 0.05, ANOVA analysis, Newman-Keuls post-hoc; C: 25 M IPA3
inhited flurbiprofen-elicited increase in pPAK, as revealed by western blot. Representative of n = 2.

1148

M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes

Fig. 8. Regulation of migration by PAK, ERK1/2, and ROCK. A) Migration fronts in cells treated with inhibitors of PAK (25 M IPA3), ERK1/2
(50 M PD98059), and ROCK (10 M Y27632). IPA3 and PD98059 prevented the formation of leading edges, while Y276132 caused a striking
network of very long protrusions. The experiments with IPA3 were performed at 12 h due to the short-lived nature of the inhibitor [43]. B)
Quantification of migration rates in the presence of inhibitors and 250 M ibuprofen (IBU). IPA3 completely abolished migration, PD98059
retarded migration and reversed the acceleration caused by ibuprofen, whereas Y27632 mimicked the acceleration caused by the profen, which
did not accelerate migration further in the presence of the ROCK inhibitor. The values are the means SEM of 3 (IPA3), or 6 (PD98059, Y27632)
independent experiments. Significant differences versus untreated (*) and IBU-treated cultures (#); p < 0.05, , ##p < 0.01, and ###p<0.001,
ANOVA analysis, Newman-Keuls post-hoc. C) Vanadate (100 M) prevented the delayed migration caused by of 30 M CHF5074 when assayed
24 h post-scratch. The values are the means SEM of 5 independent experiments. versus untreated p < 0.001 and CHF5074-treated cultures
#p < 0.05. ANOVA analysis, Newman-Keuls post-hoc.

M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes

crease (50%) at 6 h (Fig. 7B). IPA3 inhibited this


increase thus confirming the specificity of the inhibitor
(Fig. 7C).
Role of ERK
We also examined ERK1/2 because recent evidence
indicates that it regulates cell polarity [44] and because
a protein-kinase screening in our laboratory had revealed ERK1/2 activation by profens. Ibuprofen and
R-flurbiprofen increased ERK1/2 phosphorylation in
a time-dependent manner but with a different profile
(Fig. 9A). While R-flurbiprofen produced a rapid increase of ERK1/2 activation detectable at 5 min
that returned to basal levels 30 min thereafter, ibuprofen caused a more delayed but sustained ERK1/2 activation. The effect was dependent on concentration
(Fig. 9A, bottom). A second, more robust wave of
ERK1/2 activation was detected at 69 h after the addition of ibuprofen and R-flurbiprofen (Fig. 9B). Again,
the effect of R-flurbiprofen appeared more acute but
transient, and the effect of ibuprofen was more sustained.
Unlike the other profens, CHF5074 tended to decrease ERK1/2 activation within 20 min, and only
produced a slight yet significant increase at 30 min
(Fig. 9A, top). CHF5074 also caused the delayed pERK
increase at 6 h, but it was very small compared to that
caused by the other two profens (Fig. 9B).
We next examined the implication of ERK1/2 in the
stellation and migration by using the ERK1/2 inhibitor
PD980549. The drug had no effect on the stellation
caused by profens (Supplementary Fig. 7) thus precluding a role on the stress-fiber disorganization. By
contrast, PD980549 reduced the emission of organized
protrusions in the moving front (Fig. 8A), and very significantly retarded wound closure (Fig. 8B). PD98059
also prevented the acceleration caused by ibuprofen
(Fig. 8B). Overall, these data suggest that ERK1/2
may govern directional movement in astrocytes and,
hence, that the different profiles of ERK1/2 activation
among profens might have contributed to the differing
effects on polarity and migration. If this is the case,
we reasoned that enhancing ERK1/2 activation could
improve motion in CHF5074-treated astrocytes. Since
ERK1/2 activators acting directly on the kinases do not
exist, we tried to maintain ERK1/2 activation with the
phosphatase inhibitor vanadate. As shown in Fig. 8C,
vanadate did accelerate migration in CHF5074-treated
cells, thus supporting that the smaller ERK1/2 acti-

1149

vation caused by CHF5074, as compared to the other


profens, contributed to the impaired migration.
Finally, the comparable profiles of Cdc42 and
ERK1/2 modulation by profens prompted us to test
whether the two enzymes were related. We examined if DN-Cdc42 inhibited ERK1/2, or if PD98059
inhibited Cdc42-GTP loading by using ibuprofen as a
clear-cut activator of both enzymes. We found that the
ibuprofen-elicited increase in pERK was not affected
by DN-Cdc42 overexpression (data not shown), whereas the increase in Cdc42-GTP contents was partially
inhibited by PD98059 (Fig. 10). This suggests that
ERK1/2 controls Cdc42 activation.

DISCUSSION
Astrocytes, in addition to regulating brain homeostasis and neurotransmission, play a key role in the protective responses launched in the brain by insults of deleterious nature, including bacterial infection, trauma, or
accumulation of A plaques in AD. The main finding
of this study is that ibuprofen and ibuprofen derivatives
that are actively investigated in AD therapeutics regulate cytoskeleton dynamics in astrocytes in a manner independent of secretases, COX, PPAR, and dependent
on RhoGTPases, PAK, and ERK. That PPAR was not
involved is at variance with a recent study reporting that
PPAR mediates the inhibition of RhoA by ibuprofen
in neurons [45]. Thus, different Rho-dependent signaling may exist in astrocytes and neurons. We assayed
stellation and migration because they uncover different
aspects of cytoskeleton modulation and Rho-GTPase
interplays. Stellation is the result of two steps: i) disruption of stress fibers, a network of actomyosin bundles that attach cells to substrates and causes cell body
retraction, and ii) emission of processes that do require
the support of a newly assembled cytoskeleton. Migration, in turn, involves the emission of a unique leading
edge, and requires cyclic episodes of actin remodeling
and adhesion/deadhesion to the substrate.
The three profens induced stellation in astrocytes
concomitant to stress-fiber disruption. Evidence shows
that stress-fiber homeostasis in cells in culture is controlled by RhoGTPases. RhoA, via ROCK/MLCK,
promotes stress-fiber assembly [21,39], while Cdc42
and Rac1 via PAK may antagonize RhoA by inhibiting MLCK [41]. That RhoA-dependent pathways contributed to the profen-mediated stellation is supported
by three pieces of evidence: i) the preventive effect of
LPA, ii) the preventive effect of CA-RhoA, and by iii)

1150

M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes

Fig. 9. Regulation of ERK1/2 activation by profens. A) Concentration- and time-response curves at short times; B) Responses at long times.
Cells were incubated with profens at the indicated times and concentrations, and processed for western blot analysis of pERK and total ERK. The
data are the means SEM of 59 determinations, except for the effect of CHF5074 at short times that was performed 3 times. p < 0.05; p <
0.01, ANOVA analysis, Newman-Keuls post-hoc. At short times ibuprofen and R-flurbiprofen but not CHF5074 stimulated ERK1/2. There was
a second wave of activation by 6 h that was the least pronounced with CHF5074; C) Blot showing together short and long term increases in ERK
by ibuprofen.

M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes

Fig. 10. ERK1/2 regulates Cdc42. Cells were treated with ibuprofen
plus/minus the ERK1/2 inhibitor PD9850 (50 M), and Cdc42-GTP
loading measured by GLISA. The ibuprofen-elicited Cdc42 activation partially depended on ERK1/2. Values are the means SEM
of 3 independent determinations. p < 0.01 compared to baseline,
and #p < 0.05 compared to the effect in the absence of PD9850,
ANOVA analysis, Newman-Keuls post-hoc.

GLISA data showing that profens can reduce RhoAGTP formation. Of note, only CHF5074 had an effect
on RhoA-GTP loading. It is worth stressing that decreases of basal RhoA-GTP contents have seldom been
reported. For example, studies reporting that ibuprofen promotes regeneration via RhoA in spinal cord injury do not show direct decreases in basal RhoA by
the profen [17,18,45]. Rather, additional activation as
with LPA appears necessary to put on display that a
given factor down-regulates RhoA [17,46,47]. Perhaps
the GLISA is not sensitive enough to detect small but
functionally relevant decreases in RhoA-GTP contents.
The role of Cdc42 in the stellation caused by profens
was complex. On the one hand, inhibition of Cdc42
with DN-Cdc42 completely prevented the effect of the
three profens, indicating a strict need for active Cdc42
for stress-fiber disassembly to occur. However, among
profens, only ibuprofen and R-flurbiprofen activated
Cdc42, while CHF5074 caused inhibition. We postulate that actions of CHF5074 on other targets (RhoA
and PAK) leading to stress-fiber disassembly may have
compensated the lack of activation of Cdc42.
The negative results with the Rac1 inhibitor NSC237
66 do not support that Rac1 counteracts RhoA in astrocytes as shown elsewhere. Still, profens caused clearcut changes in Rac1 activation. Of note, aside from
its role as a cytoskeleton regulatory protein, Rac1 is a
component of NADPH oxidase [48]. Thus, it is tempt-

1151

ing to speculate that profens may regulate oxidative


stress in astrocytes via Rac1.
Unexpectedly, profen-elicited stellation appeared
dependent on PAK activation, as judged by the inhibitory effect of IPA3 and the increase in pPAK. That the
latter was not robust could be attributed to the already
high basal levels, or perhaps profens may also regulate
PAK by modulating its access to downstream targets.
Finally, despite numerous reports supporting a Cdc42to-PAK link [41,43,49], DN-Cdc42 overexpression did
not alter pPAKser contents nor did IPA3 affect Cdc42
activation as judged by GLISA (data not shown), indicating that PAK is not directly upstream nor downstream Cdc42 in astrocytes. Overall, the data suggests
that profens induce stellation by inhibiting RhoA while
independently stimulating Cdc42 and PAK (Fig. 11A).
Recent reports support a life of PAK dependent on PIX
and independent of Rho-GTPases [49].
Migration requires a highly orchestrated regulation
of polarity, direction sensing and movement. There is
some consensus that Cdc42 or Rac1 account for the
formation of the leading edge, while RhoA regulates
the adhesion/deadhesion of the rear end by controlling
the actomyosin-fiber contraction and the formation of
focal adhesions (FA) [26]. The turnover of FA correlates directly with FA kinase activity, and inversely
with the activation of RhoA, which is inhibited by FAK
(Fig. 11) [50]. The different effects of profens on migration came unexpected in view of evidence that inhibition of RhoA-dependent pathways, common to the
three drugs, accelerates migration in astrocytes [24,25].
Moreover, the profen that appeared to inhibit RhoA the
most, CHF5074, produced the greatest deceleration.
Loss of polarity appeared to be the cause, as judged by
the severe disarray of astrocyte processes at the moving front. Cells produced multiple processes indicating defective formation of a single, leading protrusion
properly directed towards the chemotactic cues. This
is exactly the same phenotype resulting from overexpressing DN mutants of Cdc42 [26,51]. Therefore, the
loss of polarity caused by CHF5074 could be attributed
to the detected decrease in Cdc42 activation, and the
enhanced polarity by ibuprofen and R-flurbiprofen to
the increased activation of this Rho-GTPase.
ERK1/2 appeared to intervene in the paradoxical effects of profens on migration, taken together the following evidence. First, ERK1/2 inhibition arrested cells
indicating a key role of the kinase in astrocyte directional movement. Second, ERK1/2 activation was lower or less sustained with the ibuprofen derivatives than
with ibuprofen itself, that is, there was a correlation

1152

M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes

Fig. 11. Model of profen actions. A) Stellation, showing signaling pathways and targets of the tools used (DN-Cdc42, CA-RhoA or IPA3) (left),
and targets of profens (right). Regarding stellation, profens may lead to stress fiber (SF) disassembly by targeting RhoA, Cdc42 and PAK, all
which converge into myosin light chain kinase (MLCK). B) Migration. During migration Rho-GTPase-dependent signaling is compartmentalized
in the front and rear ends of the cells. Polarity is mediated by ERK1/2/Cdc42, while motion requires cycles of attachment and detachment to the
substrate regulated by RhoA/ focal adhesion kinase (FAK) dependent signaling. When depicted in blue, FAK or RhoA are active, and when in
red inactive. Profens may act in two steps: 1) inhibition of RhoA, thus promoting movement, and/or 2) activation of ERK1/2, thus promoting
polarity and further enhancing movement via FAK. Establishment of polarity and migration may require above-threshold actions on all the steps
regulated by ERK1/2, so that the differing effects of profens on ERK1/2 may underlie different effects on polarity and motion.

between the length of ERK1/2 activation and the migration rates. Third, ERK1/2 inhibition prevented the
acceleration caused by ibuprofen. Last, maintenance
of ERK1/2 activation with vanadate restored migration
in CHF5074-treated cells.
That ERK1/2 activated Cdc42, at least partially, is
supported by: i) the correlative regulation of both enzymes by profens. When examined at short times,

ibuprofen and R-flurbiprofen increased Cdc42-GTP


and pERK contents, whereas CHF5074 tended to inhibit both; and ii) the inhibition of ibuprofen-elicited
Cdc42 activation by the ERK1/2 inhibitor PD98059. It
is not clear why R-flurbiprofen did not accelerate astrocyte migration despite the apparent increase in polarity in the moving front. Recent evidence indicates
that aside from regulating polarity, ERK1/2 may pro-

M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes

mote movement by the activation of FAK [52]. We


speculate that the increase in ERK1/2 by R-flurbiprofen
may be sufficient to enhance the formation of leading
edges, but insufficient to accelerate the turnover of focal adhesions. Overall, it appears that migration may
be exquisitely regulated by ERK1/2 activity gradients
acting on both polarity and motion. Schematic representations of possible targets of profens, their implication in effects on astrocyte stellation and migration
together with the tools utilized in the study are shown
in Fig. 11. In summary, for stellation (Fig. 11A) we
posit that profens induce cytoskeleton disarrangement
by concerted actions on RhoA, Cdc42 and PAK, all
which converge into inhibiting MLCK. A key idea in
migration (Fig. 11B) is that differences among profens
may result from the extent of ERK1/2 activation acting
on compartmentalized Rho-GTPase-signaling governing polarity and motion. We do acknowledge, however,
that the model requires further testing because a limitation of the study is that measurements in whole cell
extracts do not inform on compartmentalized actions
of Rho-GTPases.
The field of neuroinflammation in AD has taken several unexpected turns from the Rotterdam epidemiological study reporting in 2001 a 80% decrease in the
risk of developing AD in long-term users of NSAIDs,
to the ensuing failure of some NSAIDs and derivatives like R-flurbiprofen in Phase III clinical trials,
and now back to a possible redemption of NSAIDs in
view of the highly protective effects of naproxen reported in ADAPT. Two may have been the confounding factors: wrong timing of administration in clinical trials, and wrong assumptions on molecular and
cellular targets. The view is emerging that diseasemodifying drugs, including NSAIDs, will be efficacious only if administered preventively before neurodegeneration is irreparable. The molecular and functional targets of NSAIDs, in turn, have been arguably
the most elusive question in anti-inflammatory therapeutics in AD. Naproxen is not a -secretase modulator [15] suggesting that the protective effects revealed
by ADAPT are -secretase-independent. These data
confirm epidemiological analyses showing no greater
protective effects by -secretase-modulating NSAIDs
than by other NSAIDs [37]. The attention hence shifts
to alternative targets. The recent report that ibuprofen promotes axon growth by inhibiting RhoA [17,
18] points to Rho-GTPases as therapeutic targets of
NSAIDs. Rho-GTPases, as cytoskeleton modulatory
enzymes, control cellular responses requiring fine coordination of position changes, be these at large (i.e.

1153

cellular migration) or small scale (i.e., receptor docking


at membranes).
Reactive astrocytes are a hallmark of AD where they
characteristically cluster around plaques. Evidence
points to A as a major activator of astrocytes [53]. The
potential role of astrocytes in AD pathogenesis embodies the characteristic neuroprotective and detrimental
duality attributed to microglia and inflammatory cascades at large. On the one hand, reactive astrocytes
may neglect supportive functions to neurons including
control of glucose homeostasis, production of gluthatione, or glutamate uptake [54]. On the other hand,
astrocytes can phagocytose A [55], and release cytokines like IL6 [56] or chemokines like MCP1 [57] that
stimulate recruitment of local or blood-borne phagocytes, which contribute to A clearance. At least three
of these detrimental or protective phenomena are regulated by Rho-GTPases, and hence arise as potential
targets of profens: migration to plaques, translocation of glutamate transporters to the membrane [58],
and A phagocytosis [59]. Here, we have shown that
profens regulate cytoskeleton dynamics in astrocytes
via Rho-GTPases. Current research is aimed at determining whether profens modulate astrocyte migration
in vivo, A clearance, or reverse via RhoA inhibition
the decrease in astrocyte glutamate transporters reported in AD [60,61]. The endeavor of further clarifying
NSAID targets is justified by a meta-analysis of epidemiological data indicating a 58% reduction of AD
incidence by NSAIDs [62]. If this figure is translated
into patient numbers, NSAID-based therapeutics may
still be a worth pursuing strategy to decrease the socioeconomical burdens of AD.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors thank Dr. Bruno P. Imbimbo from Chiesi
Farmaceutici (Parma, Italy) for providing CHF5074
and GLISA kits, and the culture technician Cristina
Gutierrez at UAB for her excellent job in astrocyte culture preparations. The study was supported by grants
0601030 and 0601031 from the Marato-TV3 Foundation (Barcelona, Catalunya) to EG and AG respectively.
Authors disclosures available online (http://www.jalz.com/disclosures/view.php?id=584).
REFERENCES
[1]

Imbimbo BP, Solfrizzi V, Panza F (2010) Are NSAIDs useful


to treat Alzheimers disease or mild cognitive impairment?
Front Aging Neurosci 2, 12.

1154
[2]
[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]
[12]

[13]

[14]

[15]

M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes


Mrak RE, Griffin WS (2005) Glia and their cytokines in progression of neurodegeneration. Neurobiol Aging 26, 349-354.
Weggen S, Eriksen JL, Das P, Sagi SA, Wang R, Pietrzik
CU, Findlay KA, Smith TE, Murphy MP, Bulter T, Kang
DE, Marquez-Sterling N, Golde TE, Koo EH (2001) A subset
of NSAIDs lower amyloidogenic Abeta42 independently of
cyclooxygenase activity. Nature 414, 212-216.
Morihara T, Chu T, Ubeda O, Beech W, Cole GM (2002)
Selective inhibition of Abeta42 production by NSAID Renantiomers. J Neurochem 83, 1009-1012.
Eriksen JL, Sagi SA, Smith TE, Weggen S, Das P, McLendon DC, Ozols VV, Jessing KW, Zavitz KH, Koo EH, Golde
TE (2003) NSAIDs and enantiomers of flurbiprofen target
gamma-secretase and lower Abeta 42 in vivo. J Clin Invest
112, 440-449.
Peretto I, Radaelli S, Parini C, Zandi M, Raveglia LF, Dondio
G, Fontanella L, Misiano P, Bigogno C, Rizzi A, Riccardi B,
Biscaioli M, Marchetti S, Puccini P, Catinella S, Rondelli I,
Cenacchi V, Bolzoni PT, Caruso P, Villetti G, Facchinetti F, Del
GE, Moretto N, Imbimbo BP (2005) Synthesis and biological
activity of flurbiprofen analogues as selective inhibitors of
beta-amyloid(1)(-)(42) secretion. J Med Chem 48, 5705-5720.
Imbimbo BP, Del GE, Cenacchi V, Volta R, Villetti G,
Facchinetti F, Riccardi B, Puccini P, Moretto N, Grassi F,
Ottonello S, Leon A (2007) In vitro and in vivo profiling
of CHF5022 and CHF5074 Two beta-amyloid1-42 lowering
agents. Pharmacol Res 55, 318-328.
Kukar T, Prescott S, Eriksen JL, Holloway V, Murphy MP, Koo
EH, Golde TE, Nicolle MM (2007) Chronic administration of
R-flurbiprofen attenuates learning impairments in transgenic
amyloid precursor protein mice. BMC Neurosci 8, 54.
Wilcock GK, Black SE, Hendrix SB, Zavitz KH, Swabb EA,
Laughlin MA (2008) Efficacy and safety of tarenflurbil in mild
to moderate Alzheimers disease: a randomised phase II trial.
Lancet Neurol 7, 483-493.
Green RC, Schneider LS, Amato DA, Beelen AP, Wilcock
G, Swabb EA, Zavitz KH (2009) Effect of tarenflurbil on
cognitive decline and activities of daily living in patients with
mild Alzheimer disease: a randomized controlled trial. JAMA
302, 2557-2564.
Imbimbo BP (2009) Why did tarenflurbil fail in Alzheimers
disease? J Alzheimers Dis 17, 757-760.
Imbimbo BP, Hutter-Paier B, Villetti G, Facchinetti F, Cenacchi V, Volta R, Lanzillotta A, Pizzi M, Windisch M (2009)
CHF5074, a novel gamma-secretase modulator, attenuates
brain beta-amyloid pathology and learning deficit in a mouse
model of Alzheimers disease. Br J Pharmacol 156, 982-993.
Imbimbo BP, Giardino L, Sivilia S, Giuliani A, Gusciglio
M, Pietrini V, Del GE, DArrigo A, Leon A, Villetti G,
Calza L (2010) CHF5074, a novel gamma-secretase modulator, restores hippocampal neurogenesis potential and reverses contextual memory deficit in a transgenic mouse model of
Alzheimers disease. J Alzheimers Dis 20, 159-173.
Martin BK, Szekely C, Brandt J, Piantadosi S, Breitner JC,
Craft S, Evans D, Green R, Mullan M (2008) Cognitive function over time in the Alzheimers Disease Anti-inflammatory
Prevention Trial (ADAPT): results of a randomized, controlled
trial of naproxen and celecoxib. Arch Neurol 65, 896-905.
Takahashi Y, Hayashi I, Tominari Y, Rikimaru K, Morohashi
Y, Kan T, Natsugari H, Fukuyama T, Tomita T, Iwatsubo T
(2003) Sulindac sulfide is a noncompetitive gamma-secretase
inhibitor that preferentially reduces Abeta 42 generation. J
Biol Chem 278, 18664-18670.

[16]
[17]

[18]

[19]

[20]

[21]

[22]

[23]

[24]

[25]

[26]
[27]
[28]

[29]

[30]

[31]

[32]

[33]

Jaffe AB, Hall A (2005) Rho GTPases: biochemistry and


biology. Annu Rev Cell Dev Biol 21, 247-269.
Fu Q, Hue J, Li S (2007) Nonsteroidal anti-inflammatory drugs
promote axon regeneration via RhoA inhibition. J Neurosci
27, 4154-4164.
Wang X, Budel S, Baughman K, Gould G, Song KH, Strittmatter SM (2009) Ibuprofen enhances recovery from spinal cord
injury by limiting tissue loss and stimulating axonal growth. J
Neurotrauma 26, 81-95.
Zhou Y, Su Y, Li B, Liu F, Ryder JW, Wu X, Gonzalez-DeWhitt
PA, Gelfanova V, Hale JE, May PC, Paul SM, Ni B (2003) Nonsteroidal anti-inflammatory drugs can lower amyloidogenic
Abeta42 by inhibiting Rho. Science 302, 1215-1217.
Leuchtenberger S, Kummer MP, Kukar T, Czirr E, Teusch
N, Sagi SA, Berdeaux R, Pietrzik CU, Ladd TB, Golde TE,
Koo EH, Weggen S (2006) Inhibitors of Rho-kinase modulate
amyloid-beta (Abeta) secretion but lack selectivity for Abeta42. J Neurochem 96, 355-365.
Abe K, Misawa M (2003) Astrocyte stellation induced by Rho
kinase inhibitors in culture. Brain Res Dev Brain Res 143,
99-104.
Avalos AM, Arthur WT, Schneider P, Quest AF, Burridge K,
Leyton L (2004) Aggregation of integrins and RhoA activation are required for Thy-1-induced morphological changes in
astrocytes. J Biol Chem 279, 39139-39145.
John GR, Chen L, Rivieccio MA, Melendez-Vasquez CV,
Hartley A, Brosnan CF (2004) Interleukin-1beta induces a
reactive astroglial phenotype via deactivation of the Rho
GTPase-Rock axis. J Neurosci 24, 2837-2845.
Holtje M, Hoffmann A, Hofmann F, Mucke C, Grosse G, Van
RN, Kettenmann H, Just I, hnert-Hilger G (2005) Role of
Rho GTPase in astrocyte morphology and migratory response
during in vitro wound healing. J Neurochem 95, 1237-1248.
Boran MS, Garcia A (2007) The cyclic GMP-protein kinase
G pathway regulates cytoskeleton dynamics and motility in
astrocytes. J Neurochem 102, 216-230.
Etienne-Manneville S (2008) Polarity proteins in glial cell
functions. Curr Opin Neurobiol 18, 488-494.
Agullo L, Baltrons MA, Garcia A (1995) Calcium-dependent
nitric oxide formation in glial cells. Brain Res 686, 160-168.
Wojciak-Stothard B, Potempa S, Eichholtz T, Ridley AJ (2001)
Rho and Rac but not Cdc42 regulate endothelial cell permeability. J Cell Sci 114, 1343-1355.
Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the
quantitation of microgram quantities of protein utilizing the
principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72, 248-254.
Mitchell JA, Akarasereenont P, Thiemermann C, Flower RJ,
Vane JR (1993) Selectivity of nonsteroidal antiinflammatory
drugs as inhibitors of constitutive and inducible cyclooxygenase. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 11693-11697.
Kukar TL, Ladd TB, Bann MA, Fraering PC, Narlawar R,
Maharvi GM, Healy B, Chapman R, Welzel AT, Price RW,
Moore B, Rangachari V, Cusack B, Eriksen J, Jansen-West
K, Verbeeck C, Yager D, Eckman C, Ye W, Sagi S, Cottrell
BA, Torpey J, Rosenberry TL, Fauq A, Wolfe MS, Schmidt
B, Walsh DM, Koo EH, Golde TE (2008) Substrate-targeting
gamma-secretase modulators. Nature 453, 925-929.
Avramovich Y, Amit T, Youdim MB (2002) Non-steroidal antiinflammatory drugs stimulate secretion of non-amyloidogenic
precursor protein. J Biol Chem 277, 31466-31473.
Leuchtenberger S, Maler J, Czirr E, Ness J, Lichtenthaler SF,
Esselmann H, Pietrzik CU, Wiltfang J, Weggen S (2009) Nonsteroidal anti-inflammatory drugs and ectodomain shedding of
the amyloid precursor protein. Neurodegener Dis 6, 1-8.

M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes


[34]

[35]

[36]

[37]

[38]

[39]

[40]

[41]

[42]

[43]

[44]

[45]

[46]

[47]

Jaradat MS, Wongsud B, Phornchirasilp S, Rangwala SM,


Shams G, Sutton M, Romstedt KJ, Noonan DJ, Feller DR
(2001) Activation of peroxisome proliferator-activated receptor isoforms and inhibition of prostaglandin H(2) synthases by
ibuprofen, naproxen, and indomethacin. Biochem Pharmacol
62, 1587-1595.
Lehmann JM, Lenhard JM, Oliver BB, Ringold GM, Kliewer
SA (1997) Peroxisome proliferator-activated receptors alpha
and gamma are activated by indomethacin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs. J Biol Chem 272, 34063410.
Sastre M, Dewachter I, Rossner S, Bogdanovic N, Rosen
E, Borghgraef P, Evert BO, Dumitrescu-Ozimek L, Thal
DR, Landreth G, Walter J, Klockgether T, van LF, Heneka MT (2006) Nonsteroidal anti-inflammatory drugs repress
beta-secretase gene promoter activity by the activation of
PPARgamma. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 443-448.
Szekely CA, Green RC, Breitner JC, Ostbye T, Beiser AS,
Corrada MM, Dodge HH, Ganguli M, Kawas CH, Kuller LH,
Psaty BM, Resnick SM, Wolf PA, Zonderman AB, WelshBohmer KA, Zandi PP (2008) No advantage of A beta 42lowering NSAIDs for prevention of Alzheimer dementia in six
pooled cohort studies. Neurology 70, 2291-2298.
Totsukawa G, Yamakita Y, Yamashiro S, Hartshorne DJ, Sasaki Y, Matsumura F (2000) Distinct roles of ROCK (Rhokinase) and MLCK in spatial regulation of MLC phosphorylation for assembly of stress fibers and focal adhesions in 3T3
fibroblasts. J Cell Biol 150, 797-806.
Suidan HS, Nobes CD, Hall A, Monard D (1997) Astrocyte
spreading in response to thrombin and lysophosphatidic acid
is dependent on the Rho GTPase. Glia 21, 244-252.
Martinez SE, Lazaro-Dieguez F, Selva J, Calvo F, Piqueras
JR, Crespo P, Claro E, Egea G (2007) Lysophosphatidic acid
rescues RhoA activation and phosphoinositides levels in astrocytes exposed to ethanol. J Neurochem 102, 1044-1052.
Sanders LC, Matsumura F, Bokoch GM, de LP (1999) Inhibition of myosin light chain kinase by p21-activated kinase.
Science 283, 2083-2085.
Gao Y, Dickerson JB, Guo F, Zheng J, Zheng Y (2004) Rational
design and characterization of a Rac GTPase-specific small
molecule inhibitor. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 7618-7623.
Deacon SW, Beeser A, Fukui JA, Rennefahrt UE, Myers C,
Chernoff J, Peterson JR (2008) An isoform-selective, smallmolecule inhibitor targets the autoregulatory mechanism of
p21-activated kinase. Chem Biol 15, 322-331.
Bisel B, Wang Y, Wei JH, Xiang Y, Tang D, Miron-Mendoza
M, Yoshimura S, Nakamura N, Seemann J (2008) ERK regulates Golgi and centrosome orientation towards the leading
edge through GRASP65. J Cell Biol 182, 837-843.
Dill J, Patel AR, Yang XL, Bachoo R, Powell CM, Li S (2010)
A molecular mechanism for ibuprofen-mediated RhoA inhibition in neurons. J Neurosci 20, 963-972.
Sakai J, Oike M, Hirakawa M, Ito Y (2003) Theophylline
and cAMP inhibit lysophosphatidic acid-induced hyperresponsiveness of bovine tracheal smooth muscle cells. J Physiol
549, 171-180.
Hirakawa M, Karashima Y, Watanabe M, Kimura C, Ito Y,

[48]
[49]

[50]

[51]

[52]

[53]

[54]

[55]

[56]

[57]

[58]

[59]

[60]

[61]

[62]

1155

Oike M (2007) Protein kinase A inhibits lysophosphatidic


acid-induced migration of airway smooth muscle cells. J Pharmacol Exp Ther 321, 1102-1108.
Hordijk PL (2006) Regulation of NADPH oxidases: the role
of Rac proteins. Circ Res 98, 453-462.
Lucanic M, Cheng HJ (2008) A RAC/CDC-42-independent
GIT/PIX/PAK signaling pathway mediates cell migration in
C. elegans. PLoS Genet 4, e1000269.
Ren XD, Kiosses WB, Sieg DJ, Otey CA, Schlaepfer DD,
Schwartz MA (2000) Focal adhesion kinase suppresses Rho
activity to promote focal adhesion turnover. J Cell Sci 113,
3673-3678.
Srinivasan S, Wang F, Glavas S, Ott A, Hofmann F, Aktories
K, Kalman D, Bourne HR (2003) Rac and Cdc42 play distinct
roles in regulating PI(3,4,5)P3 and polarity during neutrophil
chemotaxis. J Cell Biol 160, 375-385.
Teranishi S, Kimura K, Nishida T (2009) Role of formation of
an ERK-FAK-paxillin complex in migration of human corneal
epithelial cells during wound closure in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci 50, 5646-5652.
Nagele RG, Wegiel J, Venkataraman V, Imaki H, Wang KC
(2004) Contribution of glial cells to the development of amyloid plaques in Alzheimers disease. Neurobiol Aging 25, 663674.
Fuller S, Munch G, Steele M (2009) Activated astrocytes: a
therapeutic target in Alzheimers disease? Expert Rev Neurother 9, 1585-1594.
Wyss-Coray T, Loike JD, Brionne TC, Lu E, Anankov R, Yan
F, Silverstein SC, Husemann J (2003) Adult mouse astrocytes
degrade amyloid-beta in vitro and in situ. Nat Med 9, 453-457.
Schwaninger M, Neher M, Viegas E, Schneider A, Spranger
M (1997) Stimulation of interleukin-6 secretion and gene transcription in primary astrocytes by adenosine. J Neurochem 69,
1145-1150.
Madrigal JL, Leza JC, Polak P, Kalinin S, Feinstein DL (2009)
Astrocyte-derived MCP-1 mediates neuroprotective effects of
noradrenaline. J Neurosci 29, 263-267.
Holtje M, Hofmann F, Lux R, Veh RW, Just I, hnert-Hilger
G (2008) Glutamate uptake and release by astrocytes are enhanced by Clostridium botulinum C3 protein. J Biol Chem
283, 9289-9299.
Cordle A, Koenigsknecht-Talboo J, Wilkinson B, Limpert A,
Landreth G (2005) Mechanisms of statin-mediated inhibition
of small G-protein function. J Biol Chem 280, 34202-34209.
Li S, Mallory M, Alford M, Tanaka S, Masliah E (1997) Glutamate transporter alterations in Alzheimer disease are possibly
associated with abnormal APP expression. J Neuropathol Exp
Neurol 56, 901-911.
Cross AJ, Slater P, Simpson M, Royston C, Deakin JF, Perry RH, Perry EK (1987) Sodium dependent D-[3H]aspartate
binding in cerebral cortex in patients with Alzheimers and
Parkinsons diseases. Neurosci Lett 79, 213-217.
Etminan M, Gill S, Samii A (2003) Effect of non-steroidal antiinflammatory drugs on risk of Alzheimers disease: systematic
review and meta-analysis of observational studies. BMJ 19,
128.

RESULTADOS

SUPPLEMENTARY FIGURE LEGEND

Supplementary Figures 1-4 Time and dose response of profen-elicited stellation


under phase contrast. Astrocytes were incubated with ibuprofen (100-500 M), Rflurbirprofen (100-500 M), or CHF5074 (10-30 M) for 0.5-3 h as indicated on the
figures. Profens caused a time and dose dependent soma retraction and process
emission. Scale bar, 25 m.
Supplementary Figure 5. Lack of effect of COX and secretase inhibitors. Cells
were incubated with 10 M NS398 (COX2 inhibitor), 25 M TAPI (-secretase
inhibitor), 2 M DAPT (secretase inhibitor) or 1 M BACE inhibitor IV for 30 min, and
then incubated with 250 M R-flurbiprofen for 3 additional hours. Cells were then
immunostained for GFAP.
Supplementary Figure. 6. Ibuprofen-mediated stellation is PPAR independent.
Cells were incubated with 20 M GW9226 (PPAR receptor antagonist) before adding
250 M ibuprofen, or pioglitazone (30-100 M).Cells were immunostained with GFAP.
Supplementary Figure 7. Lack of effect of ERK inhibitor in the stellation. Cells
were incubated with 50 M PD98059 (ERK inhibitor) prior adding 250 M Rflurbiprofen. Cells wereimmunostained with GFAP.

132

Discusin

1.

DISCUSIN

Inflamacin

cerebral

como

diana

teraputica

en

enfermedades neurodegenerativas

El campo de la neuroinflamacin se encuentra en constante evolucin por el gran


esfuerzo de investigacin que se le est dedicando. El concepto de que la inflamacin
es un proceso daino en el curso de las patologas del SNC est empezando a
cambiar y actualmente se considera que, a no ser que el proceso inflamatorio se
instaure de manera crnica, la inflamacin resulta beneficiosa ya que puede estar
participando en procesos de regeneracin y/o de mejora funcional. Los efectos
perjudiciales de los astrocitos, cuya reactividad va muy a menudo asociada a todo tipo
de patologas del SNC, han sido cuestionados en experimentos en los que se ha
observado un empeoramiento funcional tras eliminar qumicamente los astrocitos
reactivos (Faulkner et al., 2004b), sugiriendo que pueden desarrollar funciones
neuroprotectoras y participar en procesos reparacin. Los astrocitos juegan un papel
en el desarrollo y evolucin de patologas de distinto tipo, ya sean de origen traumtico
como la lesin de espina dorsal, de origen isqumico o en enfermedades
neurodegenerativas. En el caso particular de la AD, los astrocitos expresan toda la
maquinaria necesaria para el procesamiento del APP, y en condiciones inflamatorias
incrementan la produccin de A (Lee et al., 2008;Nagele et al., 2004). Son capaces
de migrar alrededor de las placas

donde participan en la cascada inflamatoria.

Adems, en estados avanzados de la AD, los astrocitos reactivos pierden algunas de


las funciones que desempean en el control de la homeostasis cerebral, como la
recaptacin de glutamato o la sntesis de glutatin, negligiendo su funcin de soporte a
la actividad neuronal (revisado en (Steele and Robinson, 2010;Fuller et al., 2010)).
Una nueva visin de la reactividad astrocitaria en la que la activacin glial resulta
beneficiosa en diferentes aspectos empieza a ser aceptada. La expresin de ciertos
genes inflamatorios durante la reactividad astrocitaria, como la MCP1 provoca la
atraccin y diferenciacin de precursores neurales a los sitios lesionados (Yan et al.,
2007). Recientemente, la migracin astrocitaria est siendo considerada como una
parte esencial del proceso inflamatorio, ya que molculas inflamatorias como la MMP9
o la NOS2 participan en este proceso (Hsieh et al., 2010;Wang et al., 2010) y puede
resultar beneficiosa ya que la presencia de astrocitos alrededor de los focos
lesionados limita el dao al tejido circundante por su capacidad de encapsular las
clulas inflamatorias infiltradas (Renault-Mihara et al., 2008). Todo esto convierte a los
astrocitos en dianas teraputicas relevantes en el estudio de los fenmenos
141

DISCUSIN

inflamatorios asociados a las patologas del SNC que cursan con un componente
inflamatorio.
FGF2 participa en la regulacin de la reaccin inflamatoria astrocitaria. Otros
dogmas en el campo de la neuroinflamacin han sido revisados y molculas ya
conocidas van adquiriendo nuevas funciones, a menudo inesperadas.

Algunas

interleuquinas con un claro papel pro-inflamatorio como la IL-1 han sido implicadas
tambin en fenmenos de regeneracin ya que regulan la diferenciacin de
precursores neurales (Wang et al., 2007). Otra interleuquina, la IL-6, es tambin un
potente agente diferenciador para los astrocitos (Nakanishi et al., 2007). En vista de
estas observaciones, es interesante preguntarse si otras molculas cuya expresin se
ve aumentada durante la inflamacin, como son las neurotrofinas, participan tambin
en la evolucin de este proceso. El FGF2 en particular aumenta su expresin en
astrocitos reactivos alrededor de las placas de A (Stopa et al., 1990a), pero tambin
en situaciones traumticas (Chadashvili and Peterson, 2006). El papel de las
neurotrofinas y factores de crecimiento en la neuroinflamacin es poco claro y
nosotros hemos mostrado en el trabajo 1 que el FGF2, adems de las funciones
neurotrficas que se le atribuyen, es un regulador clave en el desarrollo de procesos
de activacin astrocitaria. Hemos observado que el FGF2 ejerce un efecto
inmunomodulador a dos niveles, controlando la expresin de genes inflamatorios y la
motilidad de los astrocitos, dos procesos que como hemos mostrado estn
relacionados. Nuestros resultados son relevantes en el conocimiento de los procesos
moleculares que tienen lugar durante la activacin glial, y muestran nuevas funciones
del FGF2 en los astrocitos.
Los AINES son capaces de regular aspectos importantes de la reactividad
astrocitaria. El estudio de los mecanismos celulares y moleculares que conducen a la
aparicin y evolucin de la AD constituye uno de los temas centrales de la
neurociencia actual. La AD es una patologa para la que no existe tratamiento, y
teniendo en cuenta el impacto socio-econmico que supone en nuestra sociedad cada
vez ms envejecida, la bsqueda de frmacos capaces de modificar su curso y
mejorar la calidad de vida de las personas afectadas y sus familiares, representa un
reto para numerosos cientficos. El uso de frmacos que inhiben los receptores de
NMDA, uno de los pocos tratamientos aprobados para la AD, como la memantina
consigue disminuir la muerte neuronal por excitotoxicidad (Volbracht et al., 2006) que
se produce en la evolucin de la AD y mejora de manera transitoria algunos de los
sntomas cognitivos, aunque su empleo no consiga frenar el avance de esta
142

DISCUSIN

enfermedad. Evidencias recientes muestran que los enfermos de AD, pasan por una
larga fase asintomtica que puede durar aos, durante la cual se van acumulando los
cambios celulares y moleculares, como son la aparicin de las placas de A y ovillos
neurofibrilares as como la activacin glial, que conducen luego a los sntomas de la
patologa (revisado en (Jack, Jr. et al., 2010). Esto hace pensar que la falta de xito de
la mayora de tratamientos que se han ensayado para la AD podra deberse a que han
sido administrados demasiado tarde en la evolucin de la patologa, cuando los daos
acumulados son difcilmente reparables (Imbimbo et al., 2010), coincidiendo
temporalmente con la aparicin de los primero sntomas. Siguiendo esta lgica, parece
razonable pensar que una buena estrategia para modificar el curso de la AD sera
iniciar el tratamiento antes de que aparezcan los primeros signos de la patologa con la
intencin de evitar la acumulacin de daos irreversibles en el SNC modificando as el
curso de la AD, como proponemos en (Lichtenstein et al., 2010)
Hemos centrado nuestro estudio en los AINEs porque representan unos excelentes
candidatos para esta estrategia preventiva. A pesar de los datos negativos obtenidos
en ensayos clnicos con pacientes ya afectados, numerosos estudios epidemiolgicos
han asociado el uso crnico de algunos AINEs con un reduccin promedio del 50% del
riesgo de padecer la enfermedad (Szekely et al., 2004), aunque se desconoce el
mecanismo de accin. Los AINEs, a pesar de los problemas gstricos que puede
producir su uso prolongado, son frmacos seguros, en el sentido de que han sido
ampliamente usadas para multitud de indicaciones sin presentar efectos secundarios
notables. Adems, son frmacos que actan a travs de distintas dianas y su
estructura puede ser modificada para alterar la afinidad que presente respecto a ellas
(Imbimbo et al., 2007). Hemos mostrado en el trabajo 2 que el tratamiento con AINEs
produce cambios morfolgicos en astrocitos en cultivo, asociados a una regulacin de
la motilidad celular a travs de la modulacin de la va Rho GTPasas/PAK/ERK. Estos
nuevos efectos de estos frmacos podran representar uno de los mecanismos a
travs de los cuales los AINEs reducen la aparicin de la AD.

143

DISCUSIN

2. Nuevo papel de las cascadas de kinasas en la sealizacin


inflamatoria
La expresin de las citoquinas y otros genes considerados proinflamatorios puede ser
regulado a dos niveles, a nivel transcripcional y post-transcripcional (Clark et al.,
2009;Ferreiro et al., 2010) y representa uno de los sntomas de la reactividad
astrocitaria. Algunas rutas de sealizacin como calcineurina-NFAT, JAK/STAT o NFkB son bien conocidas en este proceso pero en los ltimos aos un nmero creciente
de vas de transduccin de seales han sido implicadas en la reactividad astrocitaria y
en la expresin de genes inflamatorios. Entre ellas, se encuentran las MAPK que
participan en la respuesta de las clulas frente a una gran cantidad de estmulos
inflamatorios, lo que ha suscitado un inters en su estudio como posibles dianas
antiinflamatorias (Munoz and Ammit, 2010). Las MAPK son mediadores clave en la
respuesta transcripcional de organismos eucariotas frente a seales extracelulares.
Controlan la expresin de genes a travs de la fosforilacin y regulacin de diversos
factores de trancripcin, protenas co-reguladores y protenas presentes en la
cromatina (Whitmarsh, 2007). Un buen ejemplo de esta regulacin es la fosforilacin
por parte de JNK de c-Jun, que conlleva una mayor actividad trancripcional del
complejo AP-1 en los promotores de algunos genes inflamatorios como MMP9 (Wang
et al., 2009a)..
Por otra parte, otras kinasas ms conocidas por su papel regulador de procesos
morfolgicos como la formacin de especializaciones de membrana o la migracin
celular como es el caso de PAK y FAK , han sido implicadas recientemente en
fenmenos de activacin glial y de expresin de genes inflamatorios, evidencia que
hemos corroborado en nuestro trabajo,
2.1 Sealizacin inflamatoria por FGF2
El tratamiento con FGF2 produce en astrocitos la modulacin de algunos genes
inflamatorios. Hemos detectado en respuesta a FGF2 la induccin de MCP1 de
manera dosis dependiente monitorizando su expresin por PCR en tiempo real y
Western Blot as como su concentracin extracelular por ELISA. Adems, hemos
detectado por WB que la presencia de FGF2 induce la expresin de COX2 en
astrocitos. Por otro lado hemos observado que FGF2 producen la inhibicin de la
expresin de ICAM1 inducida por LPS a nivel de ARN (RT-PCR) y protena (ELISA).

144

DISCUSIN

Hemos identificado que los efectos inmunomoduladores de FGF2 estn mediados por
la actividad de ERK, JNK y FAK.
FGFR2 inicia la sealizacin por FGF2 en astrocitos. Nuestros datos indican que la
sealizacin por FGF2 se inicia en astrocitos a travs de la activacin del receptor
FGFR2. La comparacin por Western Blot de la expresin de los FGFR1-3 en
astrocitos respecto a diferentes lneas celulares muestra que el FGFR2 es el de
expresin mayoritaria en nuestros cultivos. Adems, la reduccin de su expresin
mediante shRNA produce una disminucin significativa en la activacin de las kinasas
ERK y JNK y en la produccin de MCP1 (datos no mostrados) en respuesta a FGF2.
Estos datos coinciden con observaciones in vivo que muestran que la expresin de
FGFR2 se localiza principalmente en astrocitos y aumenta como consecuencia de
lesiones (Chadashvili and Peterson, 2006). Adicionalmente hemos observado que la
expresin de este receptor disminuye en respuesta al tratamiento con el factor
desapareciendo totalmente alrededor de las 12 horas y volviendo al nivel basal a las
24 horas de tratamiento. Este efecto probablemente constituya un mecanismo de las
clulas para controlar la sealizacin por FGF2 y evita la sobre-estimulacin.
A pesar de que varios estudios atribuyen funciones nucleares a los FGFRs y que
hemos detectado pequeas cantidades de FGFR2 en el ncleo de astrocitos en
condiciones basales, no hemos observado que el FGFR2 se transloque al ncleo en
respuesta a FGF2 como ha sido descrito para el FGFR1 (Reilly et al., 2004;Maher,
1996). Puede que este efecto sea exclusivo del FGFR1. En cuanto a la sealizacin
por FGFR2, poco se conoce sobre las vas de sealizacin activadas por este
receptor, aunque el hecho de que los dominios intracelulares de los 4 receptores
presenten una alta homologa sugiere que todos ellos puedan sealizar a travs de
vas similares.
ERK, JNK y FAK median los efectos de FGF2 sobre la expresin de genes
inflamatorios. Hemos mostrado que la actividad de ERK, JNK y FAK median los
efectos del FGF2 sobre la modulacin de genes inflamatorios: induccin de COX2 y
MCP1 e inhibicin de la ICAM1. Existen evidencias en la literatura que implican las
kinasas en las que hemos centrado nuestro trabajo en la regulacin de estos genes.
ERK est involucrada en la expresin de COX2 en respuesta a IL-1 (Fukushima et al.,
2005), mientras que JNK, junto con ERK, participa tambin en la induccin de este gen
en respuesta a ADN bacteriano (Yeo et al., 2003). Ambas MAPK promueven la
expresin de MCP1 en astrocitos tras el tratamiento con agentes inflamatorios como el
145

DISCUSIN

TNF y IL-1 (Thompson and Van Eldik, 2009). La activacin de FAK tras la interaccin
de -integrinas con sus ligandos resulta en la inhibicin de ICAM1 (Yasuda et al.,
2001), y esta kinasa participa tambin en la induccin de MCP1 en clulas
mesangiales (Kanegae et al., 2005). Es importante destacar que la MAPK p38 no
participa en los efectos observados del FGF2 a pesar de tener un papel clave en la
induccin de muchos genes inflamatorios como la MCP1 (Thompson and Van Eldik,
2009), juzgado por la ausencia de fosforilacin de esta kinasa por Western Blot en
respuesta a FGF2 y la falta de efecto de su inhibidor farmacolgico sobre la sntesis y
liberacin de MCP1 (datos nuestros no mostrados).
Activacin jerrquica de kinasas en respuesta a FGF2. En muchos casos, es
necesaria la coordinacin de mltiples vas de MAPK para conseguir un aumento en la
expresin de genes proinflamatorios. Por ejemplo, en algunos contextos se consigue
una potente expresin de TNF cuando las cuatro vas de MAPK (ERK1/2, JNK, p38 y
ERK5), estn activadas (Zu 2000). En concordancia con estos resultados hemos
demostrado que existe una complicada red de interacciones entre ERK, JNK y FAK,
que resultan en la amplificacin de los efectos del FGF2 sobre la regulacin de genes
inflamatorios. En un primer lugar las MAPK ERK y JNK son activadas en cuestin de
minutos en respuesta a FGF2, participando en la induccin temprana (4-6h) de MCP1
y COX2 (a un nivel notablemente inferior en el caso de la ERK) que hemos detectado
por distintos mtodos bioqumicos. Ms tarde en la va de sealizacin del FGF2,
alrededor de a las 4h, se produce la activacin de FAK que tambin participa en la
expresin de estos genes. El examen de la jerarqua de activacin mediante del uso
de inhibidores farmacolgicos, revela que existe una regulacin recproca de ERKJNK, y FAK-JNK mientras que FAK es capaz de estimular ERK pero no al contrario.
Atendiendo al curso temporal de su fosforilacin, ms tardo y duradero, FAK podra
ejercer una funcin de mantenimiento en la sealizacin inmunoreguladora de FGF2,
participando en la regulacin de MCP1 e ICAM1 a travs de ERK/JNK, y de manera
relativamente independiente a la ERK, pero dependiente de JNK a la expresin de la
COX2. Es interesante destacar la especificidad de las kinasas en la regulacin de los
genes, siendo la induccin de COX2 en gran parte independiente de ERK, a pesar de
lo descrito en otros trabajos (Fukushima et al., 2005).

146

DISCUSIN

Figura1.Representacinesquemticadelasvasdesealizacinimplicadasenlos
efectorinmunoreguladoresdelFGF2enastrocitos

En la bibliografa se encuentran precedentes para el cross-talk de kinasas que


describimos. JNK es capaz de fosforilar a Raf (la MAPKKK de la va ERK), mientras
que MEK (la MAPKK de ERK) puede fosforilar a JNK en oocitos de Xenopus,
resultando en un loop de retroalimentacin positivo (Adler et al., 2005). La sntesis de
algunas interleuquinas dependientes de ERK y JNK requiere de la actividad de FAK
(Neff et al., 2003). El hecho que la activacin de estas kinasas sea dependiente de las
dems no excluye que cada una de ellas sea esencial en la sealizacin de FGF2 y
este observacin se corrobora en el estudio de la expresin de MCP1, en la que es
necesario inhibir ERK y JNK simultneamente para bloquear totalmente la sntesis de
esta quimiocina en respuesta a FGF2.
Efecto de FGF2 sobre la expresin de genes en respuesta a LPS. Para simular las
condiciones inflamatorias en las que la expresin de FGF2 se ve incrementada en el
cerebro, hemos utilizado el LPS, un bien conocido inductor de genes inflamatorios en
todo tipo de clulas. El LPS sealiza a travs del receptor TLR4, que tambin puede
ser activado por ligandos endgenos que se originan como resultado de trauma o
lesin (Gorina et al., 2011). As, el estudio de la sealizacin por TLR4 es
fisiolgicamente relevante, ya que participan en la respuesta innata de los astrocitos
frente a infecciones cerebrales de origen bacteriano, pero tambin frente a

147

DISCUSIN

enfermedades neurodegenerativas y otros desrdenes neurolgicos como la isquemia


y su modulacin por FGF2 no haba sido estudiada hasta ahora.
Es importante remarcar que la dosis de LPS escogida, 10 ng/ml, es relativamente baja
en comparacin con la que usan otros autores, pudiendo llegar a encontrar en la
literatura trabajos donde es necesario 1g/ml (100 veces superior) de LPS para
observar una respuesta (Lin et al., 2011). El tratamiento con LPS produce de manera
rpida (30min) una activacin robusta y duradera del factor de transcripcin NF-B
para el cual se hallan secuencias consenso especficas en los promotores de los
genes de COX2, MCP1, ICAM1 y en la mayora de genes inflamatorios. Estas
observaciones indican que: 1) los astrocitos son muy sensibles al LPS, posiblemente
debido a que expresan constitutivamente altos niveles de TLR4 (Bowman et al.,
2003b) y 2) el tratamiento con LPS es un buen control positivo en nuestro modelo ya
que produce la expresin de MCP1, COX2 en mayores niveles que el FGF2 adems
de inducir ICAM1.
El cotratamiento de FGF2 y LPS produce un efecto sumatorio. El tratamiento de
nuestros cultivos con FGF2 y LPS simultneamente resulta en 1) un aumento
significativo en los niveles de expresin de MCP1 y COX2, respecto a los niveles que
se alcanzan con FGF2 o LPS por separado, y 2) la inhibicin total de la induccin de
ICAM producida por LPS. En ocasiones el cotratamiento con varios agentes
inmunoreguladores, provoca un efecto sinrgico en la induccin de genes alcanzando
niveles superiores a la suma de los que provocan cada uno por separado (Spooren et
al., 2010). Este no es el caso de FGF2 y LPS que producen un efecto aditivo en el
control de MCP1 y COX2, un hecho que podra explicarse por la participacin de vas
de sealizacin paralelas activadas por LPS como la de NF-B sobre la sealizacin
de FGF2.
Efecto inhibidor de FGF2 sobre la expresin de ICAM. El efecto inhibidor del FGF2
0sobre la expresin de ICAM debe producirse a nivel trancripcional o regulando la
estabilidad del mensajero, dado que se observa ya una disminucin de la cantidad de
ARN mensajero inducido por el tratamiento con LPS. En este caso el LPS nos permite
estudiar el papel del FGF2 sobre genes que no induce per se. Sobre el control de
ICAM, FGF2 parece actuar de manera similar a otros factores de crecimiento, como el
TGF- con un claro efecto represor sobre la expresin de molculas de adhesin
intercelular como ICAM y VCAM (Shrikant et al., 1996a). Un hecho curioso en la
regulacin de ICAM es que las mismas vas que son necesarias para su induccin por
148

DISCUSIN

LPS son tambin las responsables de su inhibicin. Hemos mostrado por ensayos de
Western Blot que la sealizacin por FGF2 provoca la fosforilacin de la kinasas ERK,
JNK y FAK de una manera robusta y sostenida en el tiempo. El LPS activa tambin
ERK y JNK pero de una manera mucho ms leve y transitoria, y FAK participa tambin
en la induccin de ICAM ya que en presencia de su inhibidor, como tambin ocurre
con el PD98 y el SP60, los niveles de ICAM se reducen. Este dato aparentemente
contradictorio podra tener su origen precisamente en el patrn diferencial de
activacin de las kinasas, siendo necesaria su activacin prolongada para observar los
efectos represores de FGF2 sobre la expresin de ICAM. La inhibicin parcial de ICAM
con los inhibidores farmacolgicos de las kinasas en respuesta a LPS revela que otras
vas estn implicadas en la sealizacin de LPS. El pool de ICAM remanente podra
ser regulado por el factor de transcripcin NF-B, que hemos visto que se activa de
manera duradera (hasta las 48h) por LPS, y que puede ser activado por vas
independientes de las MAPK y la FAK en respuesta a la activacin del TLR4, como es
la va de IRAK/TRAF/IKK (O'Neill, 2002).
El efecto de FGF2 es independiente de NF-kB. A diferencia del LPS, FGF2 no
promueve la translocacin nuclear de NF-B, contrariamente a lo que se ha propuesto
en otros trabajos (Vandermoere et al., 2005), ni modifica su activacin en respuesta a
LPS. Por lo tanto, los efectos inmunoreguladores de FGF2 en astrocitos son
independientes de este factor de transcripcin. Aunque disponemos de datos
preliminares mostrando que el factor de transcripcin CREB es fosforilado
probablemente por efecto de ERK (datos no mostrados) en respuesta a FGF2, no
hemos examinado en detalle qu papel desenvuelve en la regulacin de genes
inflamatorios. Poco se conoce de su funcin en la inflamacin, pero existen estudios
mostrando efectos positivos (Spooren et al., 2010), como negativos sobre la expresin
de genes inflamatorios (Galea and Feinstein, 1999b;Wen et al., 2010). Resultara
interesante indagar en la participacin de CREB en los efectos del FGF2, as como
determinar la posible participacin de otros factores de transcripcin activados por
FGF2, como Stat3 (Deo et al., 2002), AP1 (Kim et al., 2003) o ATF4 (Malabanan et al.,
2008).

2.2 Regulacin de las kinasas PAK y ERK por los profenos


Nuestro estudio ha determinado que distintos AINES, entre ellos algunos profenos
como el ibuprofeno, R-flurbiprofeno y CHF5074, adems del naproxeno, la
indometacina, el diclofenca y el sulindac sulfato producen de manera dosis-

149

DISCUSIN

dependiente la estelacin de astrocitos. sta se caracterizada por la desorganizacin


del citoesqueleto de actina asociado a la prdida de fibras de estrs y por la emisin
de procesos ricos en GFAP.
PAK es activada por los profenos y participan en la estelacin. Las kinasas de la
familia PAK han sido tradicionalmente consideradas como efectoras de las GTPasas
Rac1 y cdc42, y su activacin participa en el control del citoesqueleto y la transduccin
de seales extracelulares (Szczepanowska, 2009). En el SNC se conoce que
participan en numerosos procesos fisiolgicos neuronales como son la migracin de
precursores neurales, el establecimiento de la polaridad y la morfologa y la formacin
de las espinas dendrticas, participando en la transmisin sinptica normal (revisado
en (Nikolic, 2008)). Algunos trabajos empiezan a atribuir al mal funcionamiento e
incorrecta localizacin de las RhoGTPasas (Huesa et al., 2010) y de PAK (Ma et al.,
2008;Salminen et al., 2008) un papel en la AD, lo cual hace fisiolgicamente relevante
su estudio en nuestro trabajo. Su papel en la morfologa astrocitaria no haba sido
caracterizado hasta ahora, y la reciente generacin del IPA3, un inhibidor especfico
para esta kinasa (Deacon et al., 2008) nos ha permitido identificar algunas de sus
funciones en astrocitos. Hemos mostrado que la inhibicin de PAK en nuestros cultivos
mediante el tratamiento con IPA3, previene la estelacin inducida por los AINES
sugiriendo que la actividad de PAK es necesaria para que este fenmeno tenga lugar.
En esta lnea de evidencias, hemos observado que el tratamiento con AINES produce
un ligero, pero estadsticamente significativo aumento en los niveles de fosforilacin de
PAK en Ser144, pero no en Thr423 que es el residuo que se suele usar como
marcador de la activacin de esta kinasa denotando que sus mecanismos de
activacin son diversos y poco caracterizados. Los estudios de WB revelan que, ya en
condiciones basales, se detectan altos niveles de PAK fosforilada sugiriendo que juega
un papel en la fisiologa astrocitaria, lo cual hemos puesto de manifiesto observando
los cambios que produce el IPA3 sobre la morfologa astrocitaria. En efecto, hemos
mostrado que en presencia de este inhibidor, los astrocitos presentan un mayor
nmero de fibras de estrs y stas muestran un aspecto ms robusto y desarrollado.
Estos resultados sugieren que en condiciones basales PAK ejerce una regulacin
negativa sobre la formacin de las fibras de estrs probablemente regulando
negativamente la actividad de la MLCK, kinasa capaz de regular la formacin y
estabilidad de las fibras de estrs, como ha sido descrito (Wirth et al., 2003).

150

DISCUSIN

Figura2.Representacinesquemticadelasvasdesealizacinimplicadasenla
estelacinastrocitariaproducidaporlosprofenos

La activacin de PAK en respuesta a los AINES es independiente de las RhoGTPasas. El mecanismo de activacin de la PAK puede producirse por distintos
mecanismos, siendo el mejo establecido el que se produce por su interaccin con las
GTPasas Rac y cdc42 activadas (Szczepanowska, 2009). La unin transitoria de Rac
o cdc42-GTP produce en PAK cambios conformacionales que liberan su dominio
cataltico de interacciones inhibitorias, permitiendo su autofosforilacin y dimerizacin
necesarias para su correcta actividad (Lei et al., 2005). En nuestro modelo, los niveles
de fosforilacin de PAK no se ven afectados por la inhibicin farmacolgica de Rac1,
ni por la sobreexpresin del mutante dominante negativo de cdc42 (datos no
mostrados). Tampoco el aumento producido por el tratamiento con profenos sugiriendo
que estos regulan la actividad de esta kinasa por mecanismos independientes de las
GTPasas. En esta lnea, algunos autores han mostrado que PAK puede ser activada
por la interaccin con la protena -Pix (Lucanic and Cheng, 2008) y si los AINES
regulan la PAK a travs de este mecanismo queda por determinar.
ERK es activada por los profenos. Otro hallazgo importante de esta tesis, es que el
tratamiento con profenos produce en nuestros cultivos la fosforilacin de la kinasa
ERK. Este descubrimiento es relevante por el gran nmero de procesos en los que
interviene esta kinasa, como son la activacin de factores de transcripcin y la
subsecuente expresin de genes aunque nosotros hayamos centrado nuestro inters
en su participacin en la migracin. Es importante destacar que la activacin de ERK
parece ser especfica de la va de sealizacin de los profenos, ya que otras MAPK,
151

DISCUSIN

como JNK o p38, o Akt no son fosforiladas en respuesta a estos frmacos (datos no
mostrados). Hemos determinado tambin que la fosforilacin de ERK es dependiente
de dosis, que se produce de manera muy temprana (en cuestin de minutos) y que es
duradera en el tiempo (hasta las 24h). Aunque los tres profenos que hemos estudiado
con ms profundidad son capaces de provocar la activacin de esta kinasa, lo hacen
con un patrn distinto, siendo el ms potente el ibuprofeno. Resultara sumamente
interesante estudiar si a travs de la fosforilacin de ERK los AINES son capaces de
promover la transcripcin gnica, con la intencin de identificar genes mediadores del
efecto protector de estos frmacos sobre la aparicin de la AD.
La activacin de ERK no participa directamente en la estelacin astrocitaria.
Curiosamente la activacin de ERK no media los efectos de los profenos sobre la
estelacin astrocitaria, ya que esta no se ve modificada por la presencia de PD98,
inhibidor de ERK, a pesar de lo descrito en la literatura (Heffron and Mandell, 2005).
Estos datos estn en consonancia con el hecho de que la activacin de ERK ocurre de
manera independiente a la actividad de la GTPasas que s participan en la estelacion.
En efecto ERK es fosforilada a pesar de interferir en la actividad de las Rho-GTPasas
ya sea mediante aproximacin farmacolgica o por sobreexpresin de mutantes
dominantes negativos o constitutivamente activos (datos no mostrados). A pesar de
esto, hemos observado que s existe una regulacin en el sentido contrario, ya que
ERK parece estar regulando la actividad de cdc42, dado que la presencia de PD98
inhibe la activacin de esta GTPasa, juzgada por su unin a GTP, en respuesta a
ibuprofeno. La asociacin funcional de ERK y cdc42 ha sido descrita en algunos
artculos (Szczur et al., 2006), y est relacionada con la adquisicin de la polaridad
celular como la que hemos observado en astrocitos tratados con alguno de los
profenos en el scratch wound assay.

152

DISCUSIN

3. Nuevo papel de las RhoGTPasas en la sealizacin


inflamatoria
3.1 Dianas de los AINES en astrocitos
Con la intencin de acotar las dianas de los profenos en el efecto de la estelacin
hemos utilizado un abordaje farmacolgico. Hemos observado que este efecto se
produce por la modulacin que ejercen los AINES sobre algunas RhoA-GTPasas de
manera independiente a otras dianas conocidas de estos frmacos.
La estelacin producida por los AINES es independiente de COX2, las
secretasas y PPAR. Para empezar, la estelacin no es dependiente de COX2, la
diana mejor establecida de los AINES, ya que no se reproduce con NS398, el inhibidor
farmacolgico para esta enzima. Es importante remarcar este hecho ya que los
ensayos clnicos que se han llevado a cabo con el celecoxib (inhibidor especfico de
COX2) no han dado resultados positivos (Lyketsos et al., 2007), por lo tanto nuestros
resultados apoyan la teora de que el efecto protector de los AINEs es independiente
de la inhibicin de la COX2. Adems como hemos mostrado en esta tesis, COX2 no se
expresa en condiciones basales, pero puede ser inducida por el tratamiento con LPS o
FGF2.
Por otro lado se ha propuesto que los AINEs pueden modular la produccin del A a
travs de la regulacin de las secretasas de dos maneras: 1) reprimiendo a nivel
transcripcional la expresin de la -secretasa (Sastre et al., 2006), y 2) incidiendo en el
cociente de produccin de A40/A42 a travs de la modulacin de la actividad de la
-secretasa (Weggen et al., 2001;Morihara et al., 2002) o a travs de la interaccin
directa con APP (Leuchtenberger et al., 2009). El control sobre las secretasas podra
explicar la capacidad de los profenos de reducir el nmero y la superficie de placas en
algunos modelos animales de AD (Heneka et al., 2005). A pesar de estas evidencias y
que nuestros cultivos de astrocitos expresan las -, - y -secretasas, el efecto de los
profenos es independiente de su actividad ya que no se reproduce con inhibidores
farmacolgicos de las tres secretasas. Adems, el naproxeno, uno de los pocos AINEs
que no altera la actividad de la -secretasa (Weggen et al., 2001;Takahashi et al.,
2003), se comporta de manera muy similar a los dems en cuanto a estelacin y
aceleracin de la migracin, reforzando la idea de que las secretasas no intervienen
en los efectos que hemos estudiado en astrocitos.

153

DISCUSIN

Asimismo el pioglitazone, un ligando sinttico de los receptores nucleares PPAR no


reproduce los efectos de los AINEs a pesar de que algunos de ellos, como el
ibuprofeno son capaces de inducir la actividad trancripcional PPAR-dependiente
(Lehmann et al., 1997). La independencia de la expresin gnica para la estelacin
producida por los AINEs se corrobora por el hecho de que no se revierten en
presencia de inhibidores de la transcripcin gnica, ni de la traduccin proteica,
adems de ser un efecto observable al cabo de minutos despus del tratamiento.
De todos estos resultados podemos concluir que los efectos observados en astrocitos
en cultivo tras el tratamiento con AINES, estelacin y migracin, no estn mediados
por su posible accin sobre la COX2, las secretasas o los PPAR. Esto no excluye que
los AINES actuando sobre estas dianas puedan tener otros efectos sobre los
astrocitos.

3.2 Modulacin de las Rho-GTPasa por los AINEs


En los estudios bioqumicos hemos reducido la lista de AINES, cindonos a ensayar
los efectos de los profenos, ibuprofeno, R-Flurbiprofeno y CHF5074, por razones
prcticas y porque al inicio de este estudio eran los frmacos ms prometedores en
ensayos clnicos de AD. El hecho de que los dems AINEs produzcan un efecto
parecido a los profenos, sobre la estelacin y migracin astrocitarias (naproxeno e
indometacina) nos permite especular que desencadenan la activacin de las mismas
vas de sealizacin.
Los profenos regulan negativamente RhoA. Hemos observado que la estelacin
astrocitaria producida por los profenos es dependiente de la modulacin negativa de la
RhoA, ya que el efecto se revierte cuando los astrocitos expresan una forma
constitutivamente activa de esta protena, o por el cotratamiento con un conocido
activador de las vas dependientes de RhoA como es el LPA (Ramakers and
Moolenaar, 1998). Adems el estudio del estado de activacin de la RhoA, inferido por
su unin a GTP mediante G-LISA, revela que los profenos son capaces de reducir el
aumento de Rho-GTP producido por LPA. Hemos escogido esta estrategia porque,
como en muchos otros trabajos (Dill et al., 2010;Fu et al., 2007b), no hemos sido
capaces, a excepcin del CHF5074, de detectar alteraciones sobre los niveles basales
de Rho-GTP. El aumento en la unin a GTP producida por LPA nos ha permitido
observar el efecto negativo de los profenos sobre la activacin de RhoA. Posibles
explicaciones para estas observaciones son que las tcnicas utilizadas para estudiar el
154

DISCUSIN

estado de activacin de esta protena, como los pull-downs o incluso el G-LISA, no


sean suficientemente sensibles para detectar pequeos cambios en la unin a GTP
que son funcionalmente relevantes para la modificacin de la morfologa celular. Otra
posibilidad sera que la modulacin de los profenos se produzca, adems, a nivel del
acceso que tiene la RhoA a su efectores. Resulta curioso que el CHF5074, cuya
estructura haba sido diseada para aumentar su especificidad hacia las secretasas,
en base a la estructura del R-Flurbiprofeno (Imbimbo et al., 2007), sea tambin el
profeno con mayor capacidad de inhibir a la Rho. Estas observaciones podran abogar
por una modulacin de la RhoA por parte de los profenos dependiente de su accin
sobre las secretasas, que fue descrita en un solo trabajo (Zhou et al., 2003) pero que
no ha podido ser reproducida en trabajos posteriores (Leuchtenberger et al., 2006). El
abordaje utilizado mediante el tratamiento con LPA y el uso de mutantes
constitutivamente activos de la RhoA, nos permite afirmar que, en general, los AINES
regulan negativamente las vas dependientes de la RhoA, aunque desconocemos a
qu nivel.
RhoA como diana teraputica en astrocitos. Nuestos resultados concuerdan con un
nmero creciente de publicaciones que muestran que la RhoA es inhibida por algunos
AINEs como el ibuprofeno. En estos estudios se ha estudiado la capacidad del
ibuprofeno de inhibir RhoA en neuronas, promoviendo la regeneracin axonal en
lesiones de espina dorsal (Wang et al., 2009c) o en condiciones no permisivas para el
crecimiento de los axones (Fu et al., 2007b). Por lo tanto nuestros resultados
demuestran que el tratamiento con AINES adems de tener efectos sobre las
neuronas puede afectar algunas funciones astrocitarias que deben de tenerse en
cuenta. Se ha propuesto que el mecanismo de accin de los profenos sobre la
inhibicin de la RhoA podra pasar por la activacin de los PPAR (Dill et al., 2010)
aunque los autores no explican con detalle de que manera un receptor nuclear puede
incidir, por efectos no genmicos, sobre la actividad de la RhoA. En nuestro modelo, la
estelacin no es dependiente de los PPAR, ya que no se reproduce con un ligando
de estos receptores como el pioglitazone, ni se revierte en presencia de un inhibidor
farmacolgico de estos receptores. La diana sobre la que actan los AINEs para
modular la actividad de las Rho-GTPasas queda por lo tanto por determinar y el
conocimiento de sta sera de vital importancia para el diseo de nuevos frmacos y
estrategias para el tratamiento de la AD.
Los profenos modulan Rac1 y cdc42. Adicionalmente a la regulacin de la RhoA,
hemos mostrado en este trabajo que los profenos son capaces de modular la actividad
155

DISCUSIN

de otras GTPasas involucradas en el control del citoesqueleto como son la Rac1 y la


cdc42. Estos resultados muestran por primera vez que algunos AINES pueden incidir
en la actividad de estas GTPasas. Hemos observado por G-LISA que el tratamiento
con ibuprofeno y R-Flurbiprofeno resulta en una activacin estadsticamente
significativa de estas dos GTPasas, mientras que el CHF5074 ejerce una regulacin
negativa sobre ellas. La inhibicin de la cdc42 mediante la sobreexpresin adenoviral
de una mutante dominante negativo revela que esta GTPasa participa en el fenmeno
de estelacin inducido por los profenos, mientras que la presencia del inhibidor
farmacolgico de la Rac1, no revierte el efecto de los profenos. A pesar de esto, la
observacin detallada de los cultivos muestra que la inhibicin de la Rac1 produce una
reduccin en el nmero y la longitud de los procesos emitidos por los astrocitos
tratados con profenos (datos nuestros no mostrados), por lo que Rac1 activada por el
ibuprofeno y R-Flurbiprofeno podra estar participando en la generacin y ramificacin
de los procesos astrocitarios durante la estelacin. Los datos aparentemente
contradictorios obtenidos con CHF5074 sobre la regulacin de la Rac1 y la cdc42 en
comparacin con el ibuprofeno y el R-flurbiprofeno, pueden ser explicados por la
posible existencia de mecanismos compensatorios. La fuerte inhibicin del CHF5074
sobre la RhoA, o la activacin de la PAK podran sobrellevar la falta de activacin de
Rac1 y cdc42 y permitir la desintegracin de las fibras de estrs necesaria para la
emisin de procesos.

4. Nuevo papel de la migracin en la respuesta inflamatoria


Para estudiar los fenmenos de migracin astrocitaria in vitro hemos escogido el
modelo del scratch wound assay. Este ensayo altamente reproducible y fcilmente
cuantificable permite estudiar simultneamente procesos como la adquisicin de un
fenotipo polarizado y la migracin celular (Etienne-Manneville, 2006). A diferencia de
otras tcnicas no es necesaria la generacin de un gradiente quimiotctico para que
las clulas migren, ya que la simple eliminacin de las interacciones clula-clula a
travs de la formacin de un espacio libre de clulas, permite a los astrocitos migrar.
Las caractersticas de este ensayo nos han permitido estudiar los diferentes efectos de
algunos AINES sobre la migracin astrocitaria.
La migracin astrocitaria es parte de la respuesta inflamatoria. Es una
consideracin reciente la de incluir a la migracin astrocitaria como parte de la
reaccin

infamatoria

post-traumtica

en

el

desarrollo

de

enfermedades

neurodegenerativas. En esta lnea, en los ltimos aos un nmero creciente de

156

DISCUSIN

mediadores considerados inflamatorios han sido implicados en fenmenos de


migracin de clulas gliales, entre ellos MMP-9, TGF-, NOS2, endotelina, COX2 o
S100 (Bianchi et al., 2011;Hsieh et al., 2010;Wang et al., 2010). La MMP-9 parece
ser el punto de convergencia de muchos los factores pro-migratorios, posiblemente por
su funcin proteoltica sobre numerosos componentes de la matriz extracelular que
permite el avance de los astrocitos a travs de los tejidos. Aunque se conoce que el
FGF2 induce la expresin de las metaloproteinasas MMP-2 y MMP-9 en la migracin
de clulas de msculo liso vascular (Kenagy et al., 1997), la participacin de la MMP9
en los efectos del FGF2 en astrocitos queda por determinar. Nosotros aadimos a
esta lista de mediadores inflamatorios que participan en la migracin astrocitaria, el
FGF2, MCP1 y COX2.
4.1 FGF2 promueve la migracin astrocitaria
MCP1 participa en los efectos promigratorios de FGF2. MCP1 es bien conocida
por ser un potente reclutador de macrfagos que migran a los tejidos daados en
respuesta a esta quimiocina (Rollins, 1996;Bell et al., 1996). En el SNC, la produccin
de MCP1 se induce de manera rpida en diversas condiciones inflamatorias y est
asociada a la infiltracin de macrfagos provenientes del torrente sanguneo y a la
activacin microglial (Semple et al., 2010a). Los ratones transgnicos que
sobreexpresan esta quimicocina en el SNC muestran una robusta acumulacin de
macrfagos en el cerebro (Fuentes et al., 1995), mientras que los KO muestran un
reduccin en la infiltracin leucocitaria tras la isquemia o trauma (Hughes et al.,
2002;Semple et al., 2010a). A pesar de que se considera que la principal fuente de
MCP1 en el SNC son los astrocitos (Rezaie et al., 2002), poco se conoce sobre el
posible papel autocrino de MCP1 sobre los astrocitos. Estudios recientes ha
demostrado que la deficiencia en MCP1 resulta en una reaccin inflamatoria
exacerbada y con un patrn temporal retrasado, tanto en modelos murinos de trauma,
donde se observan mayores niveles de marcadores inflamatorios como IL-1, IL-6, GCSF o CCL3 (Semple et al., 2010a) como en cultivos de astrocitos provenientes del
ratn MCP1 -/- que presentan una mayor produccin de IL-6 o TNF frente a diversos
estmulos inflamatorios como LPS o IL-1 (Semple et al., 2010b). Queda por
determinar si en nuestro modelo la liberacin de MCP1 produce efectos similares a los
descritos, siendo responsable de la inhibicin de ICAM1.
Nosotros mostramos que MCP1 participa en el fenotipo promigratorio que adquieren
los astrocitos tratados con FGF2, en consonancia con otros estudios que ponen de
manifiesto la capacidad de MCP1 de inducir quimiotaxis en astrocitos (Quinones et al.,
157

DISCUSIN

2008;Wyss-Coray et al., 2003b). Asimismo, ejerce funciones neuroprotectoras


(Madrigal et al., 2009b) y participa en el reclutamiento de precursores neurales (Yan et
al., 2007). De todos estos resultados se puede inferir que MCP1 expresado por los
astrocitos en condiciones patolgicas es un factor clave en el control de la expresin
de genes inflamatorios y fenmenos de regeneracin y que puede resultar una diana
interesante en el desarrollo de nuevas estrategias teraputicas.
El mecanismo de accin de MCP1, y las vas de sealizacin que participan en su
efecto no estn bien caracterizados. Se conoce que sealiza principalmente a travs
del receptor CCR2, pero algunas evidencias sealan que en su respuesta podran
participar otros receptores todava no conocidos (Quinones et al., 2008). No hemos
caracterizado la presencia de CCR2 en nuestros cultivos, pero su presencia, aunque
algo controvertida, se ha detectado en astrocitos humanos (Andjelkovic et al., 2002) y
de ratn (Quinones et al., 2008). La activacin del CCR2 conlleva la activacin de la
kinasa Akt y el factor de trancripcin NF-B (Quinones et al., 2008) en astrocitos. En
leucocitos se ha descubierto que la trasmigracin endotelial inducida por MCP1 se
debe principalmente a los mediadores lipdicos que se producen tras la activacin del
receptor CCR2, entre ellos los leucotrienos y el PAK (Reichel et al., 2009). RhoA y
PKC han sido implicadas en la respuesta del endotelio a MCP1 (Stamatovic et al.,
2006;Ashida et al., 2001); as la regulacin de la RhoA y las dems Rho-GTPasas
podra tambin mediar los efectos de MCP1 en la migracin astrocitaria.
COX2 participa en los efectos promigratorios de FGF2. COX2 es una isoforma
inducible de las cicloxigenasas cuya expresin se encuentra aumentada en la mayora
de procesos patolgicos del SNC. Su expresin est asociada a la produccin de
diversas prostaglandinas, muchas de las cules se desconoce su funcin. La
prostaglandina que se ha sido mejor estudiada es la prostaglanida E2, que es
considerada como un mediador citotxico de la neuroinflamacin (Huang et al., 2005).
Sin embargo decubrimientos recientes denotan que los efectos de la prostaglandina
E2 pueden ser dependientes del contexto, promoviendo la muerte neuronal en algunos
casos y mostrando una accin neuroprotectora en otros (Gendron et al., 2005). Existen
cuatro receptores de prostaglandinas distintos, todos ellos de membrana y asociados a
protenas G. En astrocitos se ha localizado in vivo la presencia de los receptores EP2
y EP3 (Bilak et al., 2004) e in vitro el EP2 (Hutchinson et al., 2009). La activacin del
receptor EP2 en respuesta al tratamiento con activadores farmacolgicos especficos o
con prostaglandina E2, resulta en astrocitos en la sntesis y secrecin de la
neurotrofina BDNF (Hutchinson et al., 2009), que en muchos modelos de muerte
158

DISCUSIN

neuronal tiene un claro papel neuroprotector. Los astrocitos responden al glutamato


sinptico mediante oscilaciones de la concentracin de calcio intracelular. stas
provocan la liberacin de pulsos de prostaglandinas, entre ellas la E2, que
desempean funciones importantes en el acoplamiento neurovascular (Zonta et al.,
2003) y la gliotransmisin (Domercq et al., 2006). En los ltimos aos se estn
haciendo esfuerzos para identificar nuevas funciones de las prostaglandinas en el
campo de la neurociencia pero tambin del cncer.
Numerosas evidencias de estudios moleculares, animales y en humanos apoyan la
hiptesis de que la sobreexpresin de COX2 y el incremento en la produccin de
prostaglandinas desarrollan un papel importante en la carcinognesis. En efecto la
sobreexpresin de COX2 se observa en la mayora de lesiones pre-neoplsicas y se
intensifica durante la progresin del cncer y en la formacin de metstasis. Por el
contrario el tratamiento con AINES o inhibidores especficos de la COX2 parecen tener
efectos beneficiosos tanto a nivel preventivo como teraputico (revisado en (Harris,
2007)). En la misma lnea de evidencia, la sobreexpresin de COX2, o el tratamiento
con prostaglandina E2 exgena son capaces de aumentar la migracin de clulas
cancerosas, a travs de un mecanismo que involucra al receptor de prostaglandinas
EP1 (Yang et al., 2010). Hemos mostrado en este trabajo que la actividad de la COX2
es necesaria en la aceleracin de la migracin en astrocitos producida por el FGF2,
apoyando los resultados del trabajo de (Chiu et al., 2010), en el que los autores
observan que un aumento en la expresin de la COX2 es necesario para la migracin
astrocitaria inducida por TPA. No conocemos a travs de que prostaglandinas en
particular ni a travs de qu receptor EP media sus acciones la COX2 inducida por
FGF2

en

nuestro

modelo,

la

sealizacin

travs

del

eje

prostaglandinas/receptores EP debe ser explorado en profundidad en fenmenos de


activacin glial, analizando exactamente cules son las prostaglandinas y los
receptores implicados
ICAM no participa en los efectos promigratorios de FGF2. Nuestros resultados
muestran que, a pesar de que el FGF2 es capaz de reducir la expresin de ICAM1
inducida por estmulos inflamatorios como el LPS,

la activacin de ICAM1 con

anticuerpos especficos (Etienne-Manneville et al., 1999), que reproducen la


interaccin que se produce con su receptores Mac1 y LFA1, no interviene en la
migracin astrocitaria en nuestro modelo. Estos datos no estn en concordancia con
otros estudios que muestran que ICAM participa en la migracin de clulas de
condrosarcoma (Fong et al., 2011) y es bien conocido su papel en la migracin de
linfocitos sobre monocapes endoteliales (Adamson et al., 1999) y en la migracin
159

DISCUSIN

transedotelial (Etienne-Manneville et al., 2000). Puede que el efecto de ICAM sobre la


migracin sea especfico del tipo celular, o que el hecho de que ICAM participe en la
supervivencia de clulas cancerosas (Gallicchio et al., 2008) enmascare los resultados
obtenidos en el campo del cncer. Adems, puede que no se reproduzcan en nuestro
modelo todas las complejas interacciones con otros tipos celulares y con la matriz
extracelular que se dan in vivo. La presencia del receptor Mac-1 en microgla sugiere
que las interacciones astrocito-microgla podran producirse, por lo menos en parte, a
travs de ICAM. Por lo tanto no podemos descartar que la reduccin en los niveles de
ICAM producida por el tratamiento con FGF2, est regulando in vivo, de manera
indirecta, a travs de la interaccin con otras clulas, la migracin astrocitaria.
LPS no induce migracin astrocitaria A pesar de que el LPS es capaz de inducir la
expresin de genes inflamatorios como MCP1 y COX2 en mayor grado y de manera
ms sostenida que el FGF2, el primero no parece tener efecto sobre la migracin
astrocitaria (resultados nuestros no publicados). Estos resultados aparentemente
contradictorios podran tener su origen precisamente en el distinto patrn de expresin
que muestran MCP1 y COX2 en respuesta a FGF2 o LPS, o, probablemente a otros
fenmenos asociados. Hemos mostrado en el trabajo 2 que las Rho-GTPasas
participan en la migracin astrocitaria. Se conoce que el FGF2 es capaz de modular la
actividad de estas protenas, en particular tiene un efecto inhibidor sobre la Rho y
activador sobre la Rac1 y la cdc42. Estos cambios aceleran y promueven la migracin
de clulas endoteliales de crnea (Lee and Kay, 2006b), y podran estar asociados a
los drsticos cambio morfolgicos producidos por el FGF2 en astrocitos ((Heffron and
Mandell, 2005) y nuestros resultados) y relacionados con el establecimiento de la
polaridad celular. El LPS, en cambio, es capaz de activar la RhoA durante la expresin
de genes inflamatorios (Polk et al., 2007;Shimizu et al., 2007) y podra causar una
mayor estabilidad de las fibras de estrs, la desintegracin de las cuales es necesaria
para la formacin y el alargamiento del proceso gua y el retraimiento de la parte
trasera de la clula durante procesos de migracin. Por otro lado la regulacin
diferencial de los dos factores sobre la expresin de la ICAM1 podra explicar las
diferencias en la migracin. El incremento de ICAM1 en la membrana de astrocitos,
producido por LPS, podra estar favoreciendo la interaccin con otras clulas, como la
microgla, que expresa el receptor de ICAM 1, LFA-1. La interaccin de estas dos
protenas promueve tambin la activacin de RhoA, que como hemos visto resulta en
un retraso en la migracin.

160

DISCUSIN

EL hecho de que la actividad de la COX2 sea necesaria para el efecto acelerador del
FGF2 en el scracth wound assay, no es contradictorio con la mayor capacidad
migratoria que muestran los astrocitos tratados con un antinflamatorio no esteroideo
como el ibuprofeno. Las COX son uno de los targets ms bien establecidos de los
AINEs, que son capaces de inhibir estos enzimas reduciendo la produccin de
prostaglandinas. La generacin del espacio libre de clulas en nuestro modelo no va
asociado con la induccin de la expresin de la COX2, por lo tanto este enzima no
parece ser esencial para la migracin en condiciones control. En este trabajo hemos
mostrado que el FGF2 induce su expresin y que al inhibir su actividad, se disminuye
el efecto acelerador proporcionado por el factor. Ya que ni la generacin de la herida,
ni el tratamiento con ibuprofeno inducen la expresin de COX2, los efectos positivos
del ibuprofeno sobre la migracin astrocitaria parecen ser independientes de la
inhibicin de la COX2 lo que representa otra evidencia de que existen dianas
adicionales para los AINEs, y que ibuprofeno y FGF2 promueven las migracin por
mecanismos distintos.
Posible papel de las kinasas activadas por FGF2 en la migracin. Es interesante
preguntarse a qu nivel participan las kinasas activadas por el FGF2 en el fenotipo
promigratorio, es decir si participan per se en los cambios morfolgicos necesarios
para que las clulas migren o si su contribucin es nicamente la expresin de genes
inflamatorios, como la MCP1 o la COX2, que, como hemos mostrado, son partcipes
en el cierre de la herida. Se conoce que la ERK est implicada en el establecimiento
de la polaridad celular y que FAK es el principal regulador de la estabilidad de las
adhesiones focales, la dinmica de las cuales es un proceso clave en el avance de las
clulas.
Poco se conoca del papel de JNK en la migracin astrocitaria hasta que en durante la
elaboracin de esta trabajo aparecieron dos estudios implicando a esta kinasa (Hsieh
et al., 2010;Wang et al., 2010). No queda claro si la participacin de la JNK es directa
o bien mediada por la induccin de MMP9. En otros tipos celulares el rol de JNK en
procesos de migracin est mejor establecido; en clulas epiteliales se observa JNK
fosforilada nicamente en las clulas que forman la primera lnea de avance del frente
de migracin (Altan and Fenteany, 2004), y tiene un papel claro en macrfagos (Iijima
et al., 2005;Guma et al., 2011), o en clulas tumorales (Zhang et al., 2010b;Mishra et
al., 2010) en fibroblastos en respuesta a FGF2 (Kanazawa et al., 2010) o en microgla
en respuesta a la activacin del receptor RAGE (Bianchi et al., 2011).

161

DISCUSIN

Desde el punto de vista mecanstico JNK participa en la migracin regulando


diferentes procesos, ya que se ha establecido que participa en la formacin de
lamelipodios de manera independiente a la expresin de genes (Altan and Fenteany,
2004), y que se localiza un pool de JNK fosforilada en las adhesiones focales (Almeida
et al., 2000), donde puede regular la migracin por fosforilacin de algunos sustratos
como la paxilina (Huang et al., 2003). Tambin participa en la desintegracin de la
uniones adherentes a travs de la fosforilacin de la -catenina, pudiendo regular
tambin la uniones clula-clula que se establecen durante la migracin celular (Lee et
al., 2009).
De todos estos datos bibliogrficos y del hecho que la inhibicin de la migracin
astrocitaria es menor con el inhibidor de la COX2 (NS398) o el anticuerpo bloquante
de la MCP1 que con los inhibidores de ERK, JNK y FAK, se deduce que las tres
kinasas juegan probablemente un papel per se en la migracin, de manera adicional a
la expresin de COX2 y MCP1. As, el efecto autocrino del FGF2 sobre los astrocitos
que resulta en la estimulacin de la migracin por parte del FGF2, debera tenerse en
cuenta adems de los efectos trficos que ejerce sobre las neuronas a la hora de
considerar el mecanismo regenerador del factor en casos de dao cerebral.

4.2 Los profenos en la migracin astrocitaria


Una vez caracterizadas las vas involucradas en la estelacin astrocitaria hemos
centrado nuestro inters en encontrar repercusiones funcionales para los efectos de
los profenos. Como la migracin es un proceso necesario para la acumulacin de
astrocitos reactivos alrededor de las placa durante la AD, hemos considerado que era
fisiolgicamente relevante el estudio de la modulacin de la motilidad astrocitaria por
parte de lo profenos. La presencia de astrocitos alrededor de las placas tiene todava
un significado funcional controvertido. Algunos autores sugieren que los astrocitos son
capaces de fagocitar el A presente en las placas (Wyss-Coray et al., 2003a). Otros
ponen en evidencia que los astrocitos reactivos participan en el dao neuronal
presente durante la AD por mecanismos dependientes del estrs oxidativo o por la
liberacin de citoquinas neurotxicas. Esta controversia podra deberse, entre otros
factores, al estado en el que se hayan realizado las observaciones, ya que los
astrocitos pierdan su funcin protectora en los estados ms avanzados de la patologa
(Fuller et al., 2010). Estas observaciones deberan reevaluarse atendiendo al nuevo
modelo de progresin temporal de la AD (Jack, Jr. et al., 2010), en el que la migracin
temprana de astrocitos a los primeros focos donde empiezan a formarse nuevas
162

DISCUSIN

placas podra ser beneficioso y podra representar uno de los mecanismos a travs de
los cules los AINES son beneficiosos frenando la apararicin de la AD.
Hemos determinado que las protenas moduladas por los AINES implicadas en la
regulacin de la motilidad astrocitaria en el scratch wound assay son RhoA, PAK y la
va ERK/cdc42. En las primeras fases de la migracin, es imprescindible que las
clulas adopten un fenotipo polarizado para desplazarse en la direccin correcta
(Osmani et al., 2006). La adopcin de un fenotipo polarizado es un proceso complejo
que requiere el correcto posicionamiento de algunos orgnulos como el centro
organizador de microtbulos o el retculo endoplasmtico-Golgi y la formacin de
especializaciones de la membrana plasmtica como los filopodios que emiten los
astrocitos y que representan el frente de migracin de estas clulas (EtienneManneville, 2008). Estos cambios se consiguen a travs de vas de sealizacin
especficas, que pasan por la activacin de ERK y cdc42 (Etienne-Manneville, 2004).
La activacin de cdc42 est asociada con la adopcin de un fenotipo polarizado.
En nuestros experimentos, las clulas control se polarizan en las primeras horas
despus de la generacin de la zona libre de clulas, pero en menor grado que las
clulas tratadas con AINES como el ibuprofeno, el R-flurbiprofeno, el naproxeno o la
indometacina. El CHF5074 representa una excepcin en este grupo de frmacos,
porque a pesar de que los astrocitos tratados con este profeno emiten filopodios, estos
son ms numerosos y finos, y no se colocan perpendicularmente a la zona libre de
clulas como es el caso de los dems profenos. Estas observaciones, que revelan un
defecto en la polarizacin en respuesta a CHF5074, casan con el hecho de que este
frmaco muestra un efecto inhibidor sobre la cdc42, mientras que el ibuprofeno y el Rflurbiprofeno aumentan su actividad. De esta manera la activacin de la cdc42 en
astrocitos en respuesta a los AINES parece estar relacionada con la polaridad.
Desafortunadamente no hemos conseguido determinar si la inhibicin de esta
GTPasa, mediante la sobreexpresin del mutante dominante negativo de cdc42,
revierte los efectos de los profenos sobre la polaridad astrocitaria, ya que la infeccin
adenoviral necesaria para la sobreexpresin del mutante parece tener efectos per se
sobre la migracin. Tanto la infeccin con virus que contienen el vector control, como
los mutante cdc42DN, estimulan la migracin respecto a las clulas no infectadas
(datos no mostrados) lo que dificulta la correcta interpretacin de los resultados.
ERK y polaridad. Por otro lado las diferencias observadas entre los tres profenos en
la migracin correlacionan con el patrn de activacin de ERK. As, el ibuprofeno, que
163

DISCUSIN

de los tres profenos ensayados es el que estimula ERK en mayor grado y de una
manera ms duradera, es tambin aqul que permite un ms rpido cierre del rea
libre de clulas. Contrariamente, el CHF5074 que resulta en una inhibicin de la
migracin, es tambin aqul que activa la va de ERK en menor grado. Este efecto
inhibitorio sobre la migracin puede ser revertido por un inhibidor de fosfatasas como
el ortovanadato, sugiriendo que los defectos en la activacin de ERK por parte del
CHF5074 son responsables de los efectos de este frmaco sobre la migracin de los
astrocitos. Tampoco podemos descartar la participacin de ERK en la induccin de
algn gen, la identidad del cual queda por determinar, que resulte en un efecto
promotor de la migracin y que su expresin sea especfica de los profenos que
estimulan en mayor grado la va de ERK. Paralelamente, hemos mostrado tambin
que ERK participa en la activacin de cdc42, lo que concuerde con todo lo discutido
hasta ahora sobre la polarizacin y motilidad.

Figura3.Representacinesquemticadelasvasdesealizacinimplicadasenla
aceleracindelamigracinastrocitariaproducidaporlosprofenos.

Rho y PAK participan en la aceleracin de la migracin por parte de los AINES.


Paralelamente, las actividades del eje Rho-ROCK y de PAK ejercen efectos opuestos
sobre la migracin astrocitaria. RhoA y su kinasa efectora ROCK parecen estar
reprimiendo la emisin de procesos y la desintegracin de las fibras de estrs
necearios para permitir el avance de las clulas. En apoyo a esta idea, el inhibidor de
ROCK provoca una aceleracin en la migracin, simulando el efecto del los profenos,
lo que sugiere que la inhibicin de la actividad de la Rho mediada por estos frmacos
participa en su modulacin sobre la motilidad. Por otro lado, el tratamiento con IPA3
provoca el efecto contrario, bloqueo de la emisin de procesos y prevencin de la
164

DISCUSIN

adquisicin del fenotipo polarizado mediado por el ibuprofeno, concomitante a un


enlentecimiento en la migracin. Estos resultados sugieren que la inhibicin de las vas
dependientes de Rho junto con la activacin de PAK es necesarias para que tenga
lugar el efecto de los profenos sobre la migracin astrocitaria.

5. Conclusiones, valor teraputico y perspectivas


5.1 FGF2
Nuestros resultados ponen de manifiesto que FGF2 ejerce un papel autocrino sobre
los astrocitos. Ya que en el SNC este tipo celular es la fuente mayoritaria de esta
neurotrofina, y los niveles de FGF2 aumentan en numerosas situaciones patolgicas,
el conocimiento de los efectos de FGF2 sobre los astrocitos representa un avance
importante en el entendimiento de los procesos moleculares que tienen lugar durante
la activacin glial. Mostramos por primera vez que FGF2 ejerce un efecto
inmunomodulador sobre los astrocitos controlando la expresin de genes inflamatorios
como MCP1, COX2 o ICAM1, concomitante a la promocin de la migracin. Por lo
tanto hemos puesto de manifiesto que los factores de crecimiento y otras
neurotrofinas, adems de las interleuquinas y quimiocinas, juegan un papel importante
en la inflamacin en el SNC, aspecto a tener en cuenta en el estudio de enfermedades
neurodegenerativas. En esta lnea, resultara interesante estudiar los efectos de FGF2
en modelos murinos de enfermedades como la AD o PD, cruzando animales que
sobrexpresan FGF2 especficamente en astrocitos con cepas diseadas para
reproducir los sntomas de estas patologas y ver cmo afecta los mayores niveles de
FGF2 en el desarrollo de estas patologas.
Por otro lado, nuestras observaciones relacionan la expresin de genes inflamatorios
como MCP1 y COX2 con la migracin y representan una evidencia ms de que la
migracin astrocitaria debe ser considerada como una parte de la respuesta
inflamatoria como est siendo propuesto recientemente por algunos autores. Este
aspecto debe ser incluido en la revisin del modelo inflamatorio que tiene lugar
durante el transcurso de enfermedades neurodegenerativas.

5.2 AINES
Hemos mostrado que el tratamiento con AINES produce en astrocitos cambios
morfolgicos asociados a la modulacin de su motilidad. Esto se produce de manera

165

DISCUSIN

independiente a las dianas establecidas de los AINES, como son la COX2, las
secretesas y los PPAR, y es dependiente del nuevo eje Rho-GTPasas/PAK/ERK que
nosotros hemos identificado.
Nuestro estudio ha desentraado algunos de los posibles mecanismos moleculares y
celulares del efecto preventivo de los AINES sobre la aparicin de la AD. Debera
tenerse en cuenta que los AINEs son frmacos que modulan mltiples dianas, cada
una de las cuales participa en diferentes aspectos de la evolucin de la AD. El
componente anti-inflamatorio podra venir dado por la inhibicin de la COX2
acompaada de la activacin de los receptores PPAR, potentes represores de la
expresin de genes inflamatorios, mientras que la modulacin de

las secretasas

reducira la produccin de A disminuyendo la presencia de placas amiloides.


Nosotros aadimos a esta hipottica visin del efecto protector de los AINEs la
regulacin de la motilidad astrocitaria a travs de la modulacin del eje RhoGTPasas/PAK/ERK, la cual deberan de tenerse en cuenta en el diseo de nuevos
frmacos o estrategias ideados para prevenir o modificar el curso de esta patologa. La
administracin de algunos AINES como el ibuprofeno en las fases asintomticas de la
AD, podra estar promoviendo que los astrocitos migren de manera ms pronunciada a
los focos donde se estn generando las incipientes placas de amiloide, retrasando o
evitando su formacin.
Dada su capacidad de modular la motilidad astrocitaria, el uso de AINES podra
revelarse til en otras patologas o situaciones traumticas como la seccin de espina
dorsal, en la que estos frmacos promueven el crecimiento axonal de las neuronas a
travs de la modulacin de la RhoA. El control sobre la migracin astocitaria podra
resultar adicionalmente en un regulacin sobre la formacin o composicin de la
cicatriz glial resultando en mejoras funcionales. Estos aspectos deberan ser
examinados con detenimiento por el gran potencial que representan.
Teniendo en cuenta que algunos AINES pueden activar los receptores nucleares
PPAR, y la va de las ERK, que es capaz de fosforilar y activar numeroso factores de
transcripcin, no es descabellado pensar que estos frmacos pueden promover la
transcripcin de genes. El estudio del patrn de expresin gnica en respuesta a
AINES mediante la tcnica de microarrays en modelos animales de AD se presenta
como

una

atractiva

estrategia

para

la

identificacin

de

putativos

genes

neuroprotectores, el conocimiento de los cuales supondra un gran avance en el


estudio de la AD.

166

DISCUSIN

167

Conclusiones

168

CONCLUSIONES

Durante el desarrollo de esta tesis doctoral se ha llegado a las siguientes


conclusiones:

Trabajo 1
1.1 FGF2 ejerce un efecto inmunomodulador sobre la expresin de genes
inflamatorios en astrocitos:
-El tratamiento con FGF2 produce la expresin de MCP1 y COX2
- El co-tratamiento con FGF2 y LPS produce un efecto sumatorio en la expresin de
MCP1 y COX2.
-FGF2 inhibe la expresin de ICAM1 inducida por LPS.
1.2 Los efectos inmunomoduladores de FGF2 son dependientes de
- La activacin del FGFR2
- Las vas de sealizacin de ERK, JNK y FAK e independiente del factor de
transcripcin NF-B
- Las quinasas que median los efectos de FGF2 muestran una activacin jerrquica,
existiendo una regulacin recproca de ERK-JNK, y FAK-JNK mientras que FAK es
capaz de estimular ERK pero no al contrario.
1.3 FGF2 produce una aceleracin en la migracin astrocitaria dependiente de MCP1,
COX2 y FAK/ERK/JNK.

Trabajo 2
2.1 El tratamiento con AINEs provoca de manera dosis dependiente la estelacin
astrocitaria.
2.2 Ibuprofeno, naproxeno e indometacina aceleran la migracin astrociataria,
mientras que el R-Flurbiprofeno no tiene efecto y el CHF5074 la retrasa. Este efecto
diferencial sobre la migracin astrocitaria est relacionado con la adopcin de un
fenotipo polarizado a travs del grado de activacin del eje ERK/cdc42.
2.3 Los efectos de los profenos estn mediados por su modulacin sobre las RhoGTPasas y las kinasas ERK y PAK y de manera independiente de de COX2, las
secretasas y los PPAR:
-Ibuprofeno, R-Flurbiprofeno y CHF5074 regulan a la baja las vas dependientes de
RhoA.
-Ibuprofeno y R-Flurbiprofeno activan Rac1 y cdc42, mientras que el CHF5074 las
inhibe.
169

CONCLUSIONES

-La activacin de las vas de sealizacin dependientes de ERK y PAK por parte de
los profenos participa en la modulacin de la migracin astrocitaria.

170

Otras publicaciones

171

Perspective Article

published: 25 October 2010


doi: 10.3389/fnagi.2010.00142

AGING NEUROSCIENCE

Staging anti-inflammatory therapy in Alzheimers disease


Mathieu P. Lichtenstein1, Paulina Carriba1, Roser Masgrau1, Aurora Pujol 2,3 and Elena Galea1,2*
Institut de Neurocincies, Universitat Autnoma de Barcelona, Barcelona, Spain
Institut Catal de Recerca i Estudis Avanats, Barcelona, Spain
3
Institut dInvestigaci Biomdica de Bellvitge, Hospitalet de Llobregat, Barcelona, Spain
1
2

Edited by:
Paul G. Luiten, University of Groningen,
Netherlands Antilles
Reviewed by:
Ana I. Duarte, University of Coimbra,
Portugal
Jose G. Castao, Universidad
Autnoma de Madrid, Spain
*Correspondence:
Elena Galea, Institute of Neurocincies,
Edifici M, Universitat Autnoma de
Barcelona, 08193 Bellaterra, Barcelona,
Spain.
e-mail: galea.inc@gmail.com

The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) in Alzheimers disease (AD) is


controversial because conclusions from numerous epidemiological studies reporting delayed
onset of AD in NSAID users have not been corroborated in clinical trials. The purpose of this
personal view is to revise the case for NSAIDs in AD therapeutics in light of: (i) the last report
from the only primary prevention trial in AD, ADAPT, which, although incomplete, points to
significant protection in long-term naproxen users, and (ii) the recently proposed dynamic
model of AD evolution. The model contends that there is a clinical silent phase in AD that can
last up to 20years, the duration depending on life style habits, genetic factors, or cognitive
reserve. The failure of many purported disease-modifying drugs in AD clinical trials is forcing
the view that treatments will only be efficacious if administered pre-clinically. Here we will
argue that NSAIDs failed in clinical trials because they are disease-modifying drugs, and they
should be administered in early stages of the disease. A complete prevention trial in cognitively
normal individuals is thus called for. Further, the shift of anti-inflammatory treatment to early
stages uncovers a knowledge void about the targets of NSAIDs in asymptomatic individuals.
AD researchers have mostly relied on post-mortem analysis of A plaque-laden brains from
demented patients or animal models, thus drawing conclusions about AD pathogenesis based on
late symptoms. We will discuss evidence in support that defective, not excessive, inflammation
underlies AD pathogenesis, that NSAIDs are multifunctional drugs acting on inflammatory and
non-inflammatory targets, and that astrocytes and microglia may play differing roles in disease
progression, with an emphasis of ApoE4 as a key, undervalued target of NSAIDs. According
to a meta-analysis of epidemiological data, NSAIDs afford an average protection of 58%. If this
figure is true, and translated into patient numbers, NSAID treatment may revive as a worth
pursuing strategy to significantly reduce the socio-economical burden imposed by AD.
Keywords: ibuprofen, naproxen, astrocytes, ApoE, microglia, biomarkers

Introduction
A group of leading Alzheimers disease (AD) experts have recently
integrated available information about the five best characterized
biomarkers into a dynamic model of disease evolution overtime
(Jack etal., 2010). This groundbreaking contribution provides a
framework to select individuals for clinical trials, and decide upon
outcome measurements. According to the model, AD progresses in
a continuum where stages can be defined by biomarkers. There is a
damaging phase wherein amyloid (A) and hyperphosphorylated
tau accumulate (phase 1), followed by a phase of synaptic and metabolic alterations (phase 2), which leads to a final stage when clinical
symptoms cognitive impairment and brain atrophy are detected
(phase 3). This model fairly recapitulates the emerging view that
there is a clinically silent phase in AD that can last up 20years before
dementia is manifest. Henceforth, any therapy for AD will need to
be contrasted with this paradigm. This is the case of non-steroidal
anti-inflammatory drugs (NSAIDs). The field of neuroinflammation in AD has taken several unexpected turns from the Rotterdam
epidemiological study reporting, in 2001, a 80% decrease in the risk
of developing AD in long-term users of NSAIDs, to the ensuing
failure of some NSAIDs and derivatives like R-flurbiprofen in phase

Frontiers in Aging Neuroscience

III clinical trials. In this review we will argue that wrong timing of
drug administration, incomplete knowledge, and biased assumptions about of the role of neuroinflammation in neurodegeneration
may have led to the current impasse. Revision of anti-inflammatory
treatments in the light of the dynamic model of AD progression
will thus provide new research and clinical directions.

Epidemiological data and clinical trials


The epidemiological studies and clinical trials that, in striking number
over 40 , have been developed to examine the benefits of NSAID
in AD have been thoroughly described elsewhere (Imbimbo etal.,
2010). The results are paradoxical: while the epidemiological data
points to a reduced incidence of AD in NSAID users, most of the
ensuing clinical trials in AD or mild cognitive impairment (MCI)
have shown no effect or even detrimental effects. These results have
casted serious doubts on epidemiological analyses and, therefore, on
NSAID-based therapeutics for AD after the initial hype in the 90s.
In hindsight, among the several explanations put forth to explain
the discrepancy between epidemiological data and clinical trials
including wrong choice of NSAID or dosage in clinical trials, recall
bias in epidemiological studies, or that arthritis, not NSAIDs, is the

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October 2010 | Volume 2 | Article 142 | 1

Lichtenstein etal.

NSAIDs for Alzheimer

protective factor a research group in Baltimore may have got it


right. They argued that, since protection was only observed after
sustained uptake well before the onset of AD, NSAIDs were preventive and would not work in clinical trials with patients. To test this
idea, they launched in 2000 a primary prevention trial, the ADAPT
trial, to test the effect of naproxen (a dual cycloxygenase type 1, COX1
and 2, COX2 inhibitor) and celecoxib (a selective COX2 inhibitor)
in healthy volunteers, 70-years-old in average. Unfortunately, the
ADAPT trial was cancelled after 2years and a half over concerns of
cardiovascular damage by COX2 inhibitors, although the group have
kept reporting the progression of AD incidence overtime. At the time
of cancellation, no protection was observed by NSAID, and even the
cohort taking naproxen appeared to fare worse than the placebo
group. However, 2years later (i.e., 4years after the start of the treatment) the data indicated (70% protection in naproxen users (Hayden
etal., 2007). That is, naproxen conferred protection to people in the
path to have dementia if they were at least 4years shy of developing
clinical signs. The evidence supports that NSAIDs need to be taken
during preclinical phases of AD, and would validate the conclusions
of epidemiological data. It is worth stressing that numerous clinical
trials for AD with purported disease-modifying drugs have spectacularly failed in the last years (Sabbagh, 2009). These sobering results
have prompted the view that disease-modifying drugs, including
NSAIDs, will be efficacious only if administered preventively before
neurodegeneration is well advanced. According to a meta-analysis
of epidemiological data (Szekely etal., 2004), NSAIDs reduce AD
incidence by an average of 58%. If this figure is translated into patient
numbers, anti-inflammatory treatment arises as a worth pursuing
strategy to significantly reduce the socio-economical burden caused
by AD. But first, a complete prevention trial is necessary. The ADAPT
trial illustrates the difficulties of primary prevention trial design,
including selecting individuals on their way toward AD, tracking
disease progression, and deciding upon most efficient treatment
drugs and protocols. Considering that the average onset of AD is
65- to 70-years-old, and that NSAIDs work only if taken 4 years
before the disease is clinically detected, participants in the prevention
trial should be 60- to 65-years-old. Are currently available cognitive,
neuroimaging, and blood tests valid to include individuals in the
trial, and to measure outcomes? The experience accumulated by the
Alzheimers Disease Cooperative Study (ADCS) dictates that A42
contents in cerebrospinal fluid (CSF) can be used for subject selection ((193pg/ml, cut-off value), while fluorodeoxyglucose (FDG)
contents and hippocampal volume are appropriate surrogate markers
for disease progression (Aisen, 2010; Jack etal., 2010). The former can
be traced by positron emission tomography (PET), while the latter
is routinely assessed with magnetic resonance (MRI). Importantly,
participants should carry the allele 4 of apolipoprotein E (ApoE4)
because, according to epidemiological data, NSAIDs are effective only
in this subpopulation (Int Veld etal., 2001; Yip etal., 2005; Hayden
etal., 2007; Szekely etal., 2008), which brings up the next question
about the target of NSAIDs.

Molecular, cellular, and functional targets


of NSAIDs
The quest for the underpinnings of NSAID-mediated protection is confounded by two factors. One, the realization that AD
progresses in stages implies that NSAID actions may differ with

Frontiers in Aging Neuroscience

the stage of disease progression. Two, NSAIDs may be multifunctional drugs targeting non-inflammatory molecules aside from
cyclooxygenases(COXs).
In the model of AD progression, asymptomatic phases 1 and 2
are the target zones for preventive therapy (Figure 1), and presumably where NSAIDs are acting upon according to epidemiological
data. Decreased CSF-A42 defines phase 1, while increased CSFtau, decreased PET-FDG, and decrease of hippocampal volume are
signs of neuronal injury and dysfunction in phase 2 (Jack etal.,
2010). The inflammation associated to these preclinical phases is
not well characterized. In general, neuroinflammation has grown
to be a too wide term encompassing a body of standard reactions
against tissue damage or infection, with little consideration for
specifics of disease, stage of disease progression, brain area, or
cell type. In AD, researchers have mostly relied on post-mortem
brains from demented patients, plaque-laden transgenic models,
or cell cultures. The use of these materials has imposed a biased
view of inflammation in AD pathogenesis, based on observations
pertaining phase 3, which place microglia-derived neurotoxins as
culprit of the disease (see below). A single study illustrates this
misconception. Jacobsen etal. (2006) have reported dendrite damage, memory deficits and behavioral alterations in a transgenicmouse model of AD months before A plaques appear. Glial cells,
the holders of the innate immune system, could not account for
this early damage because reactive astrocytes and microglia were
visible later, in parallel with plaque deposition. Whether a subtle
earlier glia response went unnoticed, or if a second wave of damage followed the plaque-associated canonical inflammation was
not determined. In order to understand the modus operandi of
NSAIDs it is necessary to: (i) define stages 13 in animal models,
and (ii) focus on asymptomatic or early stages in disease progression in mice and humans. Specifically, we have to clarify the role
of glial cells on: (i) mitochondrial damage, production of reactive
oxygen species (ROS), and oxidative lesions to proteins or nucleic
acids, (ii) metabolic impairment, as defined by PET-FDG, and (iii)
decreases in hippocampal volume, all preclinical or early signs of
damage in humans (Fox etal., 1999; Nunomura etal., 2001; Petrie
etal., 2009; Martinez etal., 2010). In AD transgenic mice, oxidative
damage to lipids occurs before A deposition (Pratico etal., 2001),
and an interplay exists between A production and oxidative damage (Tamagno etal., 2002; Lustbader etal., 2004). Whether glial
cells reinforce or attenuate these cascades, and if astrocytes and
microglia have different roles, remain unknown.
The possible multifunctional nature of NSAIDs is supported by
cumulative evidence showing that the drugs, other than COX, can
target -secretase (Weggen etal., 2003), Rho-GTPases (Fu etal.,
2007), and peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR)
(Nicolakakis etal., 2008). The -secretase mediates production of
A, while Rho-GTPases regulate several phenomena relevant to
AD including axon growth (Fu etal., 2007), tau phosphorylation
(Sayas etal., 1999), and astrocyte motility (Lichtenstein etal., 2010).
Finally, PPARs are powerful modulators of inflammation (Pascual
etal., 2005), oxidative stress (Nunomura etal., 2001; Kang etal.,
2005), and A production via BACE (Sastre etal., 2006).
The real molecular target of NSAIDs has been arguably the
most elusive question in anti-inflammatory therapeutics in AD.
In the early 90s it was thought that NSAIDs prevented via COX2

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October 2010 | Volume 2 | Article 142 | 2

Lichtenstein etal.

NSAIDs for Alzheimer

Figure 1 | Integration of NSAID actions in the dynamic model of AD


evolution. Adapted from Jack etal. (2010). Dysfunctional astrocytes would exert
a primary role in early disease events by promoting A accumulation, and by
affecting neurovascular coupling, metabolic homeostasis, or synaptic plasticity.
Microglia activation would be secondary to A accumulation and neuronal

the detrimental effects of chronic microglia activation. The failure


of clinical trials with COX2 inhibitors and corticosteroids, together
with the fortuitous finding that some NSAIDs modulated -secretase,
thereby decreasing the production of A42, prompted researchers
and companies to modify the chemical structure of NSAIDs to
increase specificity and potency toward -secretase. R-flurbiprofen
was born (Kukar etal., 2007) but failed in Phase III clinical trial
(Green etal., 2009), probably because, as we believe now, diseasemodifying drugs are only effective pre-clinically. Of note, naproxen
is not a -secretase modulator (Takahashi et al., 2003), suggesting that the protective effects revealed by the recent ADAPT trial
follow-up are -secretase-independent. Whether NSAIDs act on
PPAR receptors and/or Rho-GTPases in vivo is unknown, but it
is desirable that they did, in view of the large number of possible
beneficial actions (Table 1). Efforts to streamline NSAID specificity
may thus render therapeutically weaker drugs, and should await
further characterization of NSAID targets. Finally, COX1 should
be redeemed back for now as a possible target in view of recent
evidence indicating robust protective effects of triflusal in a AD
mouse model (Choi etal., 2009; Coma etal., 2010).

The role of ApoE4


The startling conclusion from the epidemiological data that NSAIDs
are protective exclusively in ApoE4 carriers (Int Veld etal., 2001;
Yip etal., 2005; Hayden etal., 2007; Szekely etal., 2008) places the
lipoprotein as a possible target of NSAIDs. Although inheritance of
ApoE4 allele is the strongest known risk factor for the development
of sporadic AD (Ertekin-Taner, 2010), the mechanisms underlying
this correlation are not well understood. ApoE4 carriers actually
experience memory loss beginning in their fifties (Caselli et al.,

Frontiers in Aging Neuroscience

damage. NSAID effects would depend on the stage of disease progression.


Initially, the drugs would be beneficial by counteracting ApoE4-mediated
detrimental effects, whereas in advanced stages NSAID may offer no protection,
or become detrimental by further blocking faulty microglia/myeloid cell attempts
at A clearance and tissue repair.

Table 1 | Possible targets of NSAIDs.


Molecular target

Functional target References

PPAR

Inflammation (via NFkB)

Pascual etal. (2005)

Oxidative stress

Nunomura etal. (2001),

Kang etal. (2005)

Apoptosis

Fuenzalida etal. (2007)

Cerebrovascular protection

Nicolakakis etal. (2008)

BACE

Sastre etal. (2006)

Rho-GTPases

Axon growth

Fu etal. (2007)

Tau phosphorylation

Sayas etal. (1999)

Astrocyte motility

Lichtenstein etal. (2010)

COX

Microglia modulation

Choi etal. (2009)

ApoE

Astrocyte dysfunction

Zhong etal. (2009)

-Secretase

Reduction of Ab42

Weggen etal. (2003)

2009), strongly indicating that ApoE4-related damage is an early


event in disease progression. ApoE controls cholesterol homeostasis. Most of the evidence indicates that ApoE promotes the clearance
and/or degradation of A via the physical interaction between the
two proteins, and that ApoE4 performs this function worse than
ApoE3 or ApoE2 (Kim etal., 2009), thereby contributing to A
accumulation in the brain. Moreover, ApoE is immunomodulatory
(Pocivavsek etal., 2009), and the allele matters: ApoE4 is associated to greater production of pro-inflammatory cytokines than
ApoE3 in mice challenged with lipopolysaccharide (Vitek etal.,
2009). This indicates that apoE4 protein may alter inflammation
partly by dose effects (i.e., a net decrease in ApoE production), and
partly by being qualitatively different than ApoE3.

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October 2010 | Volume 2 | Article 142 | 3

Lichtenstein etal.

NSAIDs for Alzheimer

Surprisingly, despite this evidence, ApoE4 has not been at the


center stage of AD therapeutics. The principal cells that secrete ApoE
in the brain are astrocytes and, to a lesser extent, microglia. A recent
structural analysis of ApoE isoforms has revealed that domain interaction and protein misfolding caused by a difference in a single
amino acid distinguish ApoE4 from ApoE3 and ApoE2 (Zhong
etal., 2009). The introduction of an ApoE4-like domain interaction
in mice results in endoplasmic reticulum (ER) stress in astrocytes,
associated to severe cognitive deficits (Zhong etal., 2009). This indicates that astrocyte dysfunction affecting neurovascular coupling,
synaptic plasticity, metabolic homeostasis all phenomena controlled by astrocytes , along with impaired clearance of A and
altered inflammation, may underlie ApoE4-related damage in AD.
Conversion of ApoE4 into ApoE3 by disrupting the domain interaction with small molecules is currently being pursued as a therapeutic approach (Ye etal., 2005). It is tempting to speculate that some
NSAIDs may act as domain-interaction disruptors, and/or reverse
early astrocyte alterations associated to ApoE4 expression.

The role of microglia


The clustering of microglia around plaques in post-mortem AD
brains (Haga etal., 1989) has contributed to three central tenets
in the field of neuroinflammation and AD. One is that microglia, challenged by A, release neurotoxic factors like ROS, reactive nitrogen species, and elements of the complement system, as
well as inflammatory mediators including interleukin-1 (IL-1),
monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1), interleukin-6 (IL-6),
tumor necrosis factor- (TNF-), which engage other cells, including astrocytes and vascular cells, in a complex interplay of signaling loops that amplify the inflammatory reaction, and cause great
damage to neurons. The second tenet is that pathology arises when
microglia is chronically activated, either due to persistence of the
inducers, or a failure in the resolution mechanisms. And the third
tenet is that microglia contributes to removal of A plaques by
phagocytosis. The terms classic and alternative have been coined
to define the pro-inflammatory versus the phagocytic status of
microglia activation, the latter being associated to production of
growth factors (De etal., 2003). Careful perusal of the evidence
offers, however, the following, alternative angles to these tenets.
While a wealth of data from brains from diseased individuals and mouse models demonstrates that microglia express proinflammatory mediators, data is scant in support that these cause
disease; information is also lacking about the dynamic interplay
of functional microglia phenotypes overtime. The noxious role of
microglia is largely based on: (i) immunohistochemical correlations (Griffin etal., 1995; Arends etal., 2000; Vehmas etal., 2003);
and (ii) in vitro findings, cultures being a pathological condition
because the mechanical stress implicit in the isolation procedure
renders microglia overly reactive (Streit, 2010). Moreover, cultures
are prepared from postnatal microglia, which may not recapitulate
the decline of microglial functions in aging (Sastre and Gentleman,
2010). Alternatively, mitochondrial alterations and oxidative damage, the early signs of damage in AD, may be directly caused by
soluble A (Tamagno et al., 2002; Lustbader et al., 2004), and/
or be secondary to vascular, metabolic, and synaptic alterations
caused by ApoE4-harboring dysfunctional astrocytes. As to the
notion that sustained inflammation is detrimental, a recent study

Frontiers in Aging Neuroscience

reports that chronic overexpression of IL-1( in the hippocampus


of APP/PS1 transgenic animals results in decreased plaque burden
and insoluble A peptide, with no alterations in A( processing or
APP expression (Shaftel et al., 2007). The increased number of
peri-plaque microglia points to increased A phagocytosis as the
underlying mechanism, consistent with the observation that microglia expresses phagocytic markers (Jimenez etal., 2008). Thus, there
is a basis to support that microglia are phagocytes, but the following
points have to be made.
(i) Resident microglia has little phagocytic capacity toward A
according to animal models (Simard et al., 2006; Majumdar
etal., 2008; Grathwohl et al., 2009). The phagocytic potential
can be enhanced or restored with inflammatory agents such
as IL-1 (Shaftel et al., 2007), lipopolysaccharide (Herber
etal., 2004), or granulocyte colony stimulating factor (G-CSF)
(Sanchez-Ramos et al., 2009). That is, classic inflammation
activates the alternative phenotype. It follows that inhibition
of the former may cause inhibition of the latter. A proportion
of brain phagocytes are blood or bone-marrow derived monocytes, which infiltrate the brain and cluster around A plaques
(Malm et al., 2005; Simard et al., 2006; Butovsky et al., 2007;
Town etal., 2008). Interestingly, monocyte recruitment depends
on the chemoattractant MCP-1 (El etal., 2007), pointing to a
cross-talk between cerebral and peripheral immune systems.
(ii) Ultrastructural analysis of post-mortem brains from AD
patients reveals no sign of A fibers in the lysosomal system of
peri-plaque microglia (Wisniewski etal., 1992), despite the fact
that they express the phagocyte marker human leukocyte antigen type DR (HLA-DR) (McGeer etal., 1987). This suggests
defective activation. Currently, researchers are pursuing various
means to activate A phagocytosis in brain by resident or infiltrated cells. Strategies include immunotherapy (Schenk etal.,
2004), or infusion of A-specific T-cells (Ethell etal., 2006).
(iii) Microglia or myeloid cells can also contribute to A removal
through the release of proteolytic enzymes (Jiang etal., 2008),
or the component system element C3 (Wyss-Coray et al.,
2002). Activation of the complement system would thus have
a protective rather than the allegedly detrimental role in AD.
Overall, it appears that the inflammatory activation of microglia
detected in clinical stages of AD, or in plaque-laden transgenicmouse brains, is destined, however inefficiently, to remove A and
to promote repair implicating the peripheral immune system.

Conclusions and perspectives of antiinflammatory treatment in Alzheimers disease


Surveillance, coordinated recruitment of immune cells, removal of
damaging elements, and tissue repair, that is, the set of sequential
reactions known as inflammation, are functions of the innate
immune system in the brain, as elsewhere. We postulate that a defective rather than an excessive inflammatory response contributes to
AD pathogenesis. Our view has three core ideas (Figure 1):
(i) One is that ApoE4 plays a key role in early disease pathogenesis
by damaging astrocytes, the principal holders of the lipoprotein. Consequences of astrocyte dysfunction would be: (a) A

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October 2010 | Volume 2 | Article 142 | 4

Lichtenstein etal.

NSAIDs for Alzheimer

build-up due to impaired clearance/degradation, (b) alterations


of functions depending on astrocytes (neurovascular coupling,
metabolic homeostasis, and synaptic activity), which will be further impaired by excess A, and (c) impaired release of growth
factors (e.g., fibroblast growth factor type 2), cytokines (e.g.,
IL-6) or chemokines (e.g., MCP-1), thus hindering neuronal
protection and the full completion of inflammatory cascades.
(ii) The second idea is that microglia becomes progressively activated overtime, although sub-optimally, in response to fibrillar A accumulation and, in later stages of the disease, due to
signals released by dying cells.
(iii) NSAID actions depend on the stage of disease progression.
Early administration of NSAIDs would delay disease progression by multitargeted actions on ApoE4, A production,
oxidative damage, tau hyperphosphorylation, or synaptic
plasticity (Table 1). Available knowledge is incomplete to
understand how NSAIDs may regulate overtime the complex
spectrum of microglia phenotypes, but we posit that late
administration of NSAIDs in the course of the disease as
in clinical trials may interfere with the cross-talk between

References
Aisen, P. (2010). Treating before symptoms-ADCS invites ideas for clinical trials in very early AD. Alzforum
http://www.alzforum.org/res/for/
journal/detail.asp?liveID=180.
Arends, Y. M., Duyckaerts, C., Rozemuller,
J. M., Eikelenboom, P., and Hauw, J.
J. (2000). Microglia, amyloid and
dementia in alzheimer disease. A correlative study. Neurobiol. Aging 21,
3947.
Butovsky, O., Kunis, G., KoronyoHamaoui, M., and Schwartz, M.
(2007). Selective ablation of bone
marrow-derived dendritic cells
increases amyloid plaques in a mouse
Alzheimers disease model. Eur. J.
Neurosci. 26, 413416.
Caselli, R. J., Dueck, A. C., Osborne,
D., Sabbagh, M. N., Connor, D. J.,
Ahern, G. L., Baxter, L. C., Rapcsak,
S. Z., Shi, J., Woodruff, B. K., Locke,
D. E., Snyder, C. H., Alexander, G. E.,
Rademakers, R., and Reiman, E. M.
(2009). Longitudinal modeling of
age-related memory decline and the
APOE epsilon4 effect. N. Engl. J. Med.
361, 255263.
Choi, S. H., Aid, S., and Bosetti, F. (2009).
The distinct roles of cyclooxygenase-1
and -2 in neuroinflammation: implications for translational research. Trends
Pharmacol. Sci. 30, 174181.
Coma, M., Sereno, L., Da Rocha-Souto,
B., Scotton, T. C., Espana, J., Sanchez,
M. B., Rodriguez, M., Agullo, J.,
Guardia-Laguarta, C., Garcia-Alloza,
M., Borrelli, L. A., Clarimon, J., Lleo,
A., Bacskai, B. J., Saura, C. A., Hyman,
B. T., and Gomez-Isla, T. (2010).
Triflusal reduces dense-core plaque
load, associated axonal alterations

Frontiers in Aging Neuroscience

and i nflammatory changes, and


rescues cognition in a transgenic
mouse model of Alzheimers disease.
Neurobiol. Dis. 38, 482491.
De, S. R., Jmone-Cat, M. A., Tirassa, P., and
Minghetti, L. (2003). Apoptotic PC12
cells exposing phosphatidylserine promote the production of anti-inflammatory and neuroprotective molecules
by microglial cells. J. Neuropathol. Exp.
Neurol. 62, 208216.
El, K.J., Toft, M., Hickman, S. E., Means,
T. K., Terada, K., Geula, C., and Luster,
A. D. (2007). Ccr2 deficiency impairs
microglial accumulation and accelerates progression of Alzheimer-like
disease. Nat. Med. 13, 432438.
Ertekin-Taner, N. (2010). Genetics of
Alzheimer disease in the pre- and
post-GWAS era. Alzheimers Res.
Ther. 2, 3.
Ethell, D. W., Shippy, D., Cao, C.,
Cracchiolo, J. R., Runfeldt, M., Blake,
B., and Arendash, G. W. (2006). Abetaspecific T-cells reverse cognitive decline
and synaptic loss in Alzheimers mice.
Neurobiol. Dis. 23, 351361.
Fox, N. C., Warrington, E. K., and Rossor,
M. N. (1999). Serial magnetic resonance imaging of cerebral atrophy in
preclinical Alzheimers disease. Lancet
353, 2125.
Fu, Q., Hue, J., and Li, S. (2007).
Nonsteroidal anti-inflammatory
drugs promote axon regeneration
via RhoA inhibition. J. Neurosci. 27,
41544164.
Fuenzalida, K., Quintanilla, R., Ramos, P.,
Piderit, D., Fuentealba, R. A., Martinez,
G., Inestrosa, N. C., and Bronfman,
M. (2007). Peroxisome proliferatoractivated receptor gamma up-regulates the Bcl-2 anti-apoptotic protein

brain and peripheral immune systems, thus hampering


efforts to remove A and cellular debris prior to tissue repair
and regeneration.
In summary, the motto for NSAID therapeutics in AD should be
the earlier the better. In order to test these ideas necessary efforts
are: (i) a prevention trial with a non-selective NSAID in ApoE4
carriers, (ii) to define the dynamic evolution of inflammation in
AD with an emphasis on preclinical stages; (iii) to define the particulars of microglia and astrocytes, e.g., regulation and role of
classic and alternative phenotypes (in both glia types); (iv) to
define the biological role of ApoE in glia, and (v) to characterize
the molecular targets of NSAIDs and their effect on different glia
phenotypes.
The slow progression of AD, while complicating our understanding of the disease, gives opportunities for intervention. The
duration of the clinically silent phases seems to be influenced by
genetic and lifestyle factors, and by cognitive reserve, an indication
of brain resiliency. Future research will clarify whether routinary
protocols for AD prevention should include NSAIDs.
in neurons and induces mitochondrial
stabilization and protection against
oxidative stress and apoptosis. J. Biol.
Chem. 282, 37006370015.
Grathwohl, S. A., Kalin, R. E., Bolmont, T.,
Prokop, S., Winkelmann, G., Kaeser,
S. A., Odenthal, J., Radde, R., Eldh, T.,
Gandy, S., Aguzzi, A., Staufenbiel, M.,
Mathews, P. M.,Wolburg, H., Heppner, F.
L., and Jucker, M. (2009). Formation and
maintenance of Alzheimers disease betaamyloid plaques in the absence of microglia. Nat. Neurosci. 12, 13611363.
Green, R. C., Schneider, L. S., Amato, D.
A., Beelen, A. P., Wilcock, G., Swabb, E.
A., and Zavitz, K. H. (2009). Effect of
tarenflurbil on cognitive decline and
activities of daily living in patients
with mild Alzheimer disease: a randomized controlled trial. JAMA 302,
25572564.
Griffin, W. S., Sheng, J. G., Roberts, G. W.,
and Mrak, R. E. (1995). Interleukin-1
expression in different plaque types
in Alzheimers disease: significance in
plaque evolution. J. Neuropathol. Exp.
Neurol. 54, 276281.
Haga, S., Akai, K., and Ishii, T. (1989).
Demonstration of microglial cells in
and around senile (neuritic) plaques in
the Alzheimer brain. An immunohistochemical study using a novel monoclonal antibody. Acta Neuropathol. 77,
569575.
Hayden, K. M., Zandi, P. P., Khachaturian,
A. S., Szekely, C. A., Fotuhi, M.,
Norton, M. C., Tschanz, J. T., Pieper,
C. F., Corcoran, C., Lyketsos, C. G.,
Breitner, J. C., and Welsh-Bohmer, K.
A. (2007). Does NSAID use modify
cognitive trajectories in the elderly?
The Cache County study. Neurology
69, 275282.

www.frontiersin.org

Herber, D. L., Roth, L. M., Wilson, D.,


Wilson, N., Mason, J. E., Morgan, D.,
and Gordon, M. N. (2004). Timedependent reduction in Abeta levels
after intracranial LPS administration
in APP transgenic mice. Exp. Neurol.
190, 245253.
Imbimbo, B. P., Solfrizzi, V., and Panza,
F. (2010). Are NSAIDs useful to treat
Alzheimers disease or mild cognitive
impairment? Front. Ag. Neurosci. 2, 19.
doi: 10.3389/fnagi.2010.00019.
Int Veld, B. A., Ruitenberg, A., Hofman,
A., Launer, L. J., van Duijn, C. M.,
Stijnen, T., Breteler, M. M., and
Stricker, B. H. (2001). Nonsteroidal
antiinflammatory drugs and the risk
of Alzheimers disease. N. Engl. J. Med.
345, 15151521.
Jack, C. R. Jr., Knopman, D. S., Jagust, W.
J., Shaw, L. M., Aisen, P. S., Weiner, M.
W., Petersen, R. C., and Trojanowski,
J. Q. (2010). Hypothetical model of
dynamic biomarkers of the Alzheimers
pathological cascade. Lancet Neurol. 9,
119128.
Jacobsen, J. S., Wu, C. C., Redwine, J. M.,
Comery, T. A., Arias, R., Bowlby, M.,
Martone, R., Morrison, J. H., Pangalos,
M. N., Reinhart, P. H., and Bloom, F.
E. (2006). Early-onset behavioral and
synaptic deficits in a mouse model of
Alzheimers disease. Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 103, 51615166.
Jiang, Q., Lee, C. Y., Mandrekar, S.,
Wilkinson, B., Cramer, P., Zelcer,
N., Mann, K., Lamb, B., Willson, T.
M., Collins, J. L., Richardson, J. C.,
Smith, J. D., Comery, T. A., Riddell,
D., Holtzman, D. M., Tontonoz, P.,
and Landreth, G. E. (2008). ApoE promotes the proteolytic degradation of
Abeta. Neuron 58, 681693.

October 2010 | Volume 2 | Article 142 | 5

Lichtenstein etal.

Jimenez, S., Baglietto-Vargas, D., Caballero,


C., Moreno-Gonzalez, I., Torres, M.,
Sanchez-Varo, R., Ruano, D., Vizuete,
M., Gutierrez, A., and Vitorica, J. (2008).
Inflammatory response in the hippocampus of PS1M146L/APP751SL
mouse model of Alzheimers disease:
age-dependent switch in the microglial
phenotype from alternative to classic.
J. Neurosci. 28, 1165011661.
Kang, K. W., Lee, S. J., and Kim, S. G.
(2005). Molecular mechanism of nrf2
activation by oxidative stress. Antioxid.
Redox. Signal 7, 16641673.
Kim, J., Basak, J. M., and Holtzman, D.
M. (2009). The role of apolipoprotein
E in Alzheimers disease. Neuron 63,
287303.
Kukar, T., Prescott, S., Eriksen, J. L., Holloway,
V., Murphy, M. P., Koo, E. H., Golde, T.
E., and Nicolle, M. M. (2007). Chronic
administration of R-flurbiprofen
attenuates learning impairments in
transgenic amyloid precursor protein
mice. BMC Neurosci. 8, 54.
Lichtenstein, M., Carriba, P., WojciakStothard, B., Baltrons, M. A.,
Petersen, J., Garca, A., and Galea, E.
(2010). Secretase-independent and
RhoGTPase/ERK/PAK regulation of
cytoskeleton dynamics and motility
in astrocytes by NSAIDs and derivatives. J. Alzheimers Dis. doi: 10.3233/
JAD-2010-101332.
Lustbader, J. W., Cirilli, M., Lin, C., Xu, H.
W., Takuma, K., Wang, N., Caspersen,
C., Chen, X., Pollak, S., Chaney, M.,
Trinchese, F., Liu, S., Gunn-Moore, F.,
Lue, L. F., Walker, D. G., Kuppusamy,
P., Zewier, Z. L., Arancio, O., Stern, D.,
Yan, S. S., and Wu, H. (2004). ABAD
directly links Abeta to mitochondrial
toxicity in Alzheimers disease. Science
304, 448452.
Majumdar, A., Chung, H., Dolios, G.,
Wang, R., Asamoah, N., Lobel, P., and
Maxfield, F. R. (2008). Degradation
of fibrillar forms of Alzheimers amyloid beta-peptide by macrophages.
Neurobiol Aging 29, 707715.
Malm, T. M., Koistinaho, M., Parepalo, M.,
Vatanen, T., Ooka, A., Karlsson, S., and
Koistinaho, J. (2005). Bone-marrowderived cells contribute to the recruitment of microglial cells in response to
beta-amyloid deposition in APP/PS1
double transgenic Alzheimer mice.
Neurobiol. Dis. 18, 134142.
Martinez, A., Portero-Otin, M., Pamplona,
R., and Ferrer, I. (2010). Protein targets of
oxidative damage in human neurodegenerative diseases with abnormal protein
aggregates. Brain Pathol. 20, 281297.
McGeer, P. L., Itagaki, S., Tago, H., and
McGeer, E. G. (1987). Reactive microglia in patients with senile dementia
of the Alzheimer type are positive for
the histocompatibility glycoprotein
HLA-DR. Neurosci. Lett. 79, 195200.

Frontiers in Aging Neuroscience

NSAIDs for Alzheimer

Nicolakakis, N., Aboulkassim, T., Ongali,


B., Lecrux, C., Fernandes, P., RosaNeto, P., Tong, X. K., and Hamel, E.
(2008). Complete rescue of cerebrovascular function in aged Alzheimers
disease transgenic mice by antioxidants and pioglitazone, a peroxisome
proliferator-activated receptor gamma
agonist. J. Neurosci. 28, 92879296.
Nunomura, A., Perry, G., Aliev, G., Hirai,
K., Takeda, A., Balraj, E. K., Jones, P. K.,
Ghanbari, H., Wataya, T., Shimohama,
S., Chiba, S., Atwood, C. S., Petersen,
R. B., and Smith, M. A. (2001).
Oxidative damage is the earliest event
in Alzheimer disease. J. Neuropathol.
Exp. Neurol. 60, 759767.
Pascual, G., Fong, A. L., Ogawa, S., Gamliel,
A., Li, A. C., Perissi, V., Rose, D. W.,
Wilson, T. M., Rosenfeld, M. G., and
Glass, K. G. (2005). A SUMOylationdependent pathway mediates transrepression of inflammatory response
genes by PPAR-gamma. Nature 437,
759763.
Petrie, E. C., Cross, D. J., Galasko, D.,
Schellenberg, G. D., Raskind, M. A.,
Peskind, E. R., and Minoshima, S. (2009).
Preclinical evidence of Alzheimer
changes: convergent cerebrospinal fluid
biomarker and fluorodeoxyglucose
positron emission tomography findings. Arch. Neurol. 66, 632637.
Pocivavsek, A., Burns, M. P., and Rebeck,
G. W. (2009). Low-density lipoprotein
receptors regulate microglial inflammation through c-Jun N-terminal
kinase. Glia 4, 444453.
Pratico, D., Uryu, K., Leight, S.,
Trojanoswki, J. Q., and Lee, V. M.
(2001). Increased lipid peroxidation
precedes amyloid plaque formation in
an animal model of Alzheimer amyloidosis. J. Neurosci. 21, 41834187.
Sabbagh, M. N. (2009). Drug development
for Alzheimers disease: where are we
now and where are we headed? Am. J.
Geriatr. Pharmacother. 7, 167185.
Sanchez-Ramos, J., Song, S., Sava, V.,
Catlow, B., Lin, X., Mori, T., Cao,
C., and Arendash, G. W. (2009).
Granulocyte colony stimulating factor decreases brain amyloid burden
and reverses cognitive impairment in
Alzheimers mice. Neuroscience 163,
5572.
Sastre, M., Dewachter, I., Rossner, S.,
Bogdanovic, N., Rosen, E., Borghgraef,
P., Evert, B. O., Dumitrescu-Ozimek,
L., Thal, D. R., Landreth, G., Walter,
J., Klockgether, T., van Leuven, F.,
Heneka, M. T. (2006). Nonsteroidal
anti-inflammatory drugs repress betasecretase gene promoter activity by the
activation of PPARgamma. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 103, 443448.
Sastre, M., and Gentleman, S. M. (2010).
NSAIDs: how they work and their prospects as therapeutics in Alzheimers

disease. Front. Ag. Neurosci. 2, 20. doi:


10.3389/fnagi.2010.00020.
Sayas, C. L., Moreno-Flores, M. T., Avila,
J., and Wandosell, F. (1999). The neurite retraction induced by lysophosphatidic acid increases Alzheimers
disease-like Tau phosphorylation. J.
Biol. Chem. 274, 3704637052.
Schenk, D., Hagen, M., and Seubert, P.
(2004). Current progress in betaamyloid immunotherapy. Curr. Opin.
Immunol. 16, 599606.
Shaftel, S. S., Kyrkanides, S., Olschowka, J. A.,
Miller, J. N., Johnson, R. E., and OBanion,
M. K. (2007). Sustained hippocampal IL-1 beta overexpression mediates
chronic neuroinflammation and ameliorates Alzheimer plaque pathology. J.
Clin. Invest. 117, 15951604.
Simard, A. R., Soulet, D., Gowing, G.,
Julien, J. P., and Rivest, S. (2006). Bone
marrow-derived microglia play a critical role in restricting senile plaque formation in Alzheimers disease. Neuron
49, 489502.
Streit, W. J. (2010). Microglial activation
and neuroinflammation in Alzheimers
disease: a critical examination of recent
history. Front. Ag. Neurosci. 2, 22. doi:
10.3389/fnagi.2010.00022.
Szekely, C. A., Breitner, J. C., Fitzpatrick,
A. L., Rea, T. D., Psaty, B. M., Kuller, L.
H., Zandi, P. P. (2008). NSAID use and
dementia risk in the Cardiovascular
Health Study: role of APOE and
NSAID type. Neurology 70, 1724.
Szekely, C. A., Thorne, J. E., Zandi, P. P.,
Ek, M., Messias, E., Breitner, J. C., and
Goodman, S. N. (2004). Nonsteroidal
anti-inflammatory drugs for the prevention of Alzheimers disease: a systematic review. Neuroepidemiology 23,
159169.
Takahashi, Y., Hayashi, I., Tominari, Y.,
Rikimaru, K., Morohashi, Y., Kan, T.,
Natsugari, H., Fukuyama, T., Tomita,
T., and Iwatsubo, T. (2003). Sulindac
sulfide is a noncompetitive gammasecretase inhibitor that preferentially
reduces Abeta 42 generation. J. Biol.
Chem. 278, 1866418670.
Tamagno, E., Bardini, P., Obbili, A., Vitali,
A., Borghi, R., Zaccheo, D., Pronzato,
M. A., Danni, O., Smith, M. A., Perry,
G., and Tabaton, M. (2002). Oxidative
stress increases expression and activity
of BACE in NT2 neurons. Neurobiol.
Dis. 10, 279288.
Town, T., Laouar, Y., Pittenger, C., Mori,
T., Szekely, C. A., Tan, J., Duman, R.
S., and Flavell, R. A. (2008). Blocking
TGF-beta-Smad2/3 innate immune
signaling mitigates Alzheimer-like
pathology. Nat. Med. 14, 681687.
Vitek, M. P., Brown, C. M., and Colton,
C. A. (2009). APOE genotypespecific differences in the innate
immune response. Neurobiol. Aging 9,
13501360.

www.frontiersin.org

Vehmas, A. K., Kawas, C. H., Stewart, W.


F., and Troncoso, J. C. (2003). Immune
reactive cells in senile plaques and cognitive decline in Alzheimers disease.
Neurobiol. Aging 24, 321331.
Weggen, S., Eriksen, J. L., Sagi, S. A.,
Pietrzik, C. U., Ozols, V., Fauq, A.,
Golde, T. E., Koo, E. H. (2003).
Evidence that nonsteroidal anti-inflammatory drugs decrease amyloid
beta 42 production by direct modulation of gamma-secretase activity. J.
Biol. Chem. 278, 3183131837.
Wisniewski, H. M., Wegiel, J., Wang, K. C.,
and Lach, B. (1992). Ultrastructural
studies of the cells forming amyloid in
the cortical vessel wall in Alzheimers disease. Acta Neuropathol. 84, 117127.
Wyss-Coray, T., Yan, F., Lin, A. H., Lambris,
J. D., Alexander, J. J., Quigg, R. J.,
Masliah, E. (2002). Prominent neurodegeneration and increased plaque
formation in complement-inhibited
Alzheimers mice. Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 99, 1083710842.
Ye, S., Huang, Y., Mullendorff, K., Dong,
L., Giedt, G., Meng, E. C., Cohen, F.
E., Kuntz, I. D., Weisgraber, K. H., and
Mahley, R. W. (2005). Apolipoprotein
(apo) E4 enhances amyloid beta peptide production in cultured neuronal
cells: apoE structure as a potential
therapeutic target. Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 102, 1870018705.
Yip, A. G., Green, R. C., Huyck, M.,
Cupples, L. A., and Farrer, L. A. (2005).
Nonsteroidal anti-inflammatory drug
use and Alzheimers disease risk: the
MIRAGE Study. BMC Geriatr. 5, 2.
Zhong, N., Ramaswamy, G., and
We i s g r a b e r, K . H . ( 2 0 0 9 ) .
Apolipoprotein E4 domain interaction
induces endoplasmic reticulum stress
and impairs astrocyte function. J. Biol.
Chem. 284, 2727327280.
Conflict of Interest Statement: The
authors declare that the research was
conducted in the absence of any commercial or financial relationships that
could be construed as a potential conflict
of interest.
Received: 30 July 2010; accepted: 16
September 2010; published online: 25
October 2010.
Citation: Lichtenstein MP, Carriba P,
Masgrau R, Pujol A and Galea E (2010)
Staging anti-inflammatory therapy in
Alzheimers disease. Front. Ag. Neurosci.
2:142. doi: 10.3389/fnagi.2010.00142
Copyright 2010 Lichtenstein, Carriba,
Masgrau, Pujol and Galea. This is an
open-access article subject to an exclusive
license agreement between the authors and
the Frontiers Research Foundation, which
permits unrestricted use, distribution, and
reproduction in any medium, provided the
original authors and source are credited.

October 2010 | Volume 2 | Article 142 | 6

BIBLIOGRAFA

Bibliografa

178

BIBLIOGRAFA

AbbottNJ,RonnbackL,HanssonE(2006)Astrocyteendothelialinteractionsatthebloodbrain
barrier.NatRevNeurosci7:4153.
AbeK,MisawaM(2003)AstrocytestellationinducedbyRhokinaseinhibitorsinculture.Brain
ResDevBrainRes143:99104.
AbrahamS,SweetT,SawayaBE,RappaportJ,KhaliliK,AminiS(2005)Cooperativeinteraction
ofC/EBPbetaandTatmodulatesMCP1genetranscriptioninastrocytes.JNeuroimmunol
160:219227.
AdamsonP,EtienneS,CouraudPO,CalderV,GreenwoodJ(1999)Lymphocytemigration
throughbrainendothelialcellmonolayersinvolvessignalingthroughendothelialICAM1viaa
rhodependentpathway.JImmunol162:29642973.
ADAPTTrialgroup(2006)Cardiovascularandcerebrovasculareventsintherandomized,
controlledAlzheimer'sDiseaseAntiInflammatoryPreventionTrial(ADAPT).PLoSClinTrials
1:e33.
AdlerV,QuY,SmithSJ,IzotovaL,PestkaS,KungHF,LinM,FriedmanFK,ChieL,ChungD,
BoutjdirM,PincusMR(2005)FunctionalinteractionsofRafandMEKwithJunNterminal
kinase(JNK)resultinapositivefeedbackloopontheoncogenicRassignalingpathway.
Biochemistry44:1078410795.
AggarwalS,GuptaS(1998)Apossibleroleformultidrugresistanceassociatedproteininthe
secretionofbasicfibroblastgrowthfactorbyosteogenicsarcomacellline(MG63).IntJOncol
13:13311334.
AgulhonC,PetraviczJ,McMullenAB,SwegerEJ,MintonSK,TavesSR,CasperKB,FiaccoTA,
McCarthyKD(2008)Whatistheroleofastrocytecalciuminneurophysiology?Neuron59:932
946.
AkiyamaH,KawamataT,YamadaT,TooyamaI,IshiiT,McGeerPL(1993)Expressionof
intercellularadhesionmolecule(ICAM)1byasubsetofastrocytesinAlzheimerdiseaseand
someotherdegenerativeneurologicaldisorders.ActaNeuropathol85:628634.
AleshinS,GrabeklisS,HanckT,SergeevaM,ReiserG(2009)Peroxisomeproliferatoractivated
receptor(PPAR)gammapositivelycontrolsandPPARalphanegativelycontrolscyclooxygenase
2expressioninratbrainastrocytesthroughaconvergenceonPPARbeta/deltaviamutual
controlofPPARexpressionlevels.MolPharmacol76:414424.
AlmeidaEA,IlicD,HanQ,HauckCR,JinF,KawakatsuH,SchlaepferDD,DamskyCH(2000)
Matrixsurvivalsignaling:fromfibronectinviafocaladhesionkinasetocJunNH(2)terminal
kinase.JCellBiol149:741754.
AltanZM,FenteanyG(2004)cJunNterminalkinaseregulateslamellipodialprotrusionand
cellsheetmigrationduringepithelialwoundclosurebyageneexpressionindependent
mechanism.BiochemBiophysResCommun322:5667.
AndjelkovicAV,SongL,DzenkoKA,CongH,PachterJS(2002)FunctionalexpressionofCCR2by
humanfetalastrocytes.JNeurosciRes70:219231.

179

BIBLIOGRAFA

AoyagiA,NishikawaK,SaitoH,AbeK(1994)Characterizationofbasicfibroblastgrowthfactor
mediatedaccelerationofaxonalbranchinginculturedrathippocampalneurons.BrainRes
661:117126.
ArmelinHA(1973)Pituitaryextractsandsteroidhormonesinthecontrolof3T3cellgrowth.
ProcNatlAcadSciUSA70:27022706.
ArnaudE,TouriolC,BoutonnetC,GensacMC,VagnerS,PratsH,PratsAC(1999)Anew34
kilodaltonisoformofhumanfibroblastgrowthfactor2iscapdependentlysynthesizedbyusing
anonAUGstartcodonandbehavesasasurvivalfactor.MolCellBiol19:505514.
AshidaN,AraiH,YamasakiM,KitaT(2001)DistinctsignalingpathwaysforMCP1dependent
integrinactivationandchemotaxis.JBiolChem276:1655516560.
AvalosAM,ArthurWT,SchneiderP,QuestAF,BurridgeK,LeytonL(2004)Aggregationof
integrinsandRhoAactivationarerequiredforThy1inducedmorphologicalchangesin
astrocytes.JBiolChem279:3913939145.
AviezerD,GolemboM,YayonA(2003)Fibroblastgrowthfactorreceptor3asatherapeutic
targetforAchondroplasiageneticshortlimbeddwarfism.CurrDrugTargets4:353365.
AyasollaK,KhanM,SinghAK,SinghI(2004)Inflammatorymediatorandbetaamyloid(2535)
inducedceramidegenerationandiNOSexpressionareinhibitedbyvitaminE.FreeRadicBiol
Med37:325338.
AzariasG,PerretenH,LengacherS,PoburkoD,DemaurexN,MagistrettiPJ,ChattonJY(2011)
GlutamatetransportdecreasesmitochondrialpHandmodulatesoxidativemetabolismin
astrocytes.JNeurosci31:35503559.
BachooRM,KimRS,LigonKL,MaherEA,BrennanC,BillingsN,ChanS,LiC,RowitchDH,Wong
WH,DePinhoRA(2004)Moleculardiversityofastrocyteswithimplicationsforneurological
disorders.ProcNatlAcadSciUSA101:83848389.
BalasingamV,TejadaBergesT,WrightE,BouckovaR,YongVW(1994)Reactiveastrogliosisin
theneonatalmousebrainanditsmodulationbycytokines.JNeurosci14:846856.
BaldaufK,ReymannKG(2005)InfluenceofEGF/bFGFtreatmentonproliferation,early
neurogenesisandinfarctvolumeaftertransientfocalischemia.BrainRes1056:158167.
BalyasnikovaIV,PelligrinoDA,GreenwoodJ,AdamsonP,DragonS,RazaH,GaleaE(2000)
Cyclicadenosinemonophosphateregulatestheexpressionoftheintercellularadhesion
moleculeandtheinduciblenitricoxidesynthaseinbrainendothelialcells.JCerebBloodFlow
Metab20:688699.
BanisadrG,GosselinRD,MechighelP,RosteneW,KitabgiP,MelikPS(2005)Constitutive
neuronalexpressionofCCR2chemokinereceptoranditscolocalizationwithneurotransmitters
innormalratbrain:functionaleffectofMCP1/CCL2oncalciummobilizationinprimary
culturedneurons.JCompNeurol492:178192.
BarrancoQuintanaJL,AllamMF,DelCastilloAS,NavajasRF(2005)[RiskfactorsforAlzheimer's
disease].RevNeurol40:613618.

180

BIBLIOGRAFA

BecherB,PratA,AntelJP(2000)Brainimmuneconnection:immunoregulatorypropertiesof
CNSresidentcells.Glia29:293304.
BeenkenA,MohammadiM(2009)TheFGFfamily:biology,pathophysiologyandtherapy.Nat
RevDrugDiscov8:235253.
BehlC(2005)OxidativestressinAlzheimer'sdisease:implicationsforpreventionandtherapy.
SubcellBiochem38:6578.
BellMD,TaubDD,PerryVH(1996)Overridingthebrain'sintrinsicresistancetoleukocyte
recruitmentwithintraparenchymalinjectionsofrecombinantchemokines.Neuroscience
74:283292.
BenvenisteEN,TangLP,LawRM(1995)DifferentialregulationofastrocyteTNFalpha
expressionbythecytokinesTGFbeta,IL6andIL10.IntJDevNeurosci13:341349.
BertolliniC,RagozzinoD,GrossC,LimatolaC,EusebiF(2006)Fractalkine/CX3CL1depresses
centralsynaptictransmissioninmousehippocampalslices.Neuropharmacology51:816821.
BertramL,TanziRE(2005)Thegeneticepidemiologyofneurodegenerativedisease.JClin
Invest115:14491457.
BianchiR,KastrisianakiE,GiambancoI,DonatoR(2011)S100Bproteinstimulatesmicroglia
migrationviaRAGEdependentupregulationofchemokineexpressionandrelease.JBiol
Chem286:72147226.
BilakM,WuL,WangQ,HaugheyN,ConantK,StHC,AndreassonK(2004)PGE2receptors
rescuemotorneuronsinamodelofamyotrophiclateralsclerosis.AnnNeurol56:240248.
BirnbaumY,YeY,RosanioS,TavackoliS,HuZY,SchwarzER,UretskyBF(2005)Prostaglandins
mediatethecardioprotectiveeffectsofatorvastatinagainstischemiareperfusioninjury.
CardiovascRes65:345355.
BishopAL,HallA(2000)RhoGTPasesandtheireffectorproteins.BiochemJ348Pt2:241255.
BlancoA,AlvarezS,FresnoM,MunozFernandezMA(2010)Amyloidbetainduces
cyclooxygenase2andPGE2releaseinhumanastrocytesinNFkappaBdependentmanner.J
AlzheimersDis22:493505.
BottcherRT,NiehrsC(2005)Fibroblastgrowthfactorsignalingduringearlyvertebrate
development.EndocrRev26:6377.
BowmanCC,RasleyA,TranguchSL,MarriottI(2003a)Culturedastrocytesexpresstolllike
receptorsforbacterialproducts.Glia43:281291.
BowmanCC,RasleyA,TranguchSL,MarriottI(2003b)Culturedastrocytesexpresstolllike
receptorsforbacterialproducts.Glia43:281291.
BoxerAL,MorenoH,RudyB,ZiffEB(1999)FGF2potentiatesCa(2+)dependentinactivationof
NMDAreceptorcurrentsinhippocampalneurons.JNeurophysiol82:33673377.

181

BIBLIOGRAFA

BrandoliC,SannaA,DeBernardiMA,FollesaP,BrookerG,MocchettiI(1998)Brainderived
neurotrophicfactorandbasicfibroblastgrowthfactordownregulateNMDAreceptorfunction
incerebellargranulecells.JNeurosci18:79537961.
BraunA,DangJ,JohannS,BeyerC,KippM(2009)Selectiveregulationofgrowthfactor
expressioninculturedcorticalastrocytesbyneuropathologicaltoxins.NeurochemInt55:610
618.
BrunetJF,AllamanI,MagistrettiPJ,PellerinL(2010)Glycogenmetabolismasamarkerof
astrocytedifferentiation.JCerebBloodFlowMetab30:5155.
BushTG,PuvanachandraN,HornerCH,PolitoA,OstenfeldT,SvendsenCN,MuckeL,Johnson
MH,SofroniewMV(1999)Leukocyteinfiltration,neuronaldegeneration,andneurite
outgrowthafterablationofscarforming,reactiveastrocytesinadulttransgenicmice.Neuron
23:297308.
BushongEA,MartoneME,JonesYZ,EllismanMH(2002)ProtoplasmicastrocytesinCA1
stratumradiatumoccupyseparateanatomicaldomains.JNeurosci22:183192.
CarmonaMA,MuraiKK,WangL,RobertsAJ,PasqualeEB(2009)GlialephrinA3regulates
hippocampaldendriticspinemorphologyandglutamatetransport.ProcNatlAcadSciUSA
106:1252412529.
ChadashviliT,PetersonDA(2006)Cytoarchitectureoffibroblastgrowthfactorreceptor2
(FGFR2)immunoreactivityinastrocytesofneurogenicandnonneurogenicregionsofthe
youngadultandagedratbrain.JCompNeurol498:115.
ChalkiadakiG,NikitovicD,BerdiakiA,KatonisP,KaramanosNK,TzanakakisGN(2011)Heparin
playsakeyregulatoryroleviaap53/FAKdependentsignalinginmelanomacelladhesionand
migration.IUBMBLife63:109119.
ChangYP,FangKM,LeeTI,TzengSF(2006)Regulationofmicroglialactivitiesbyglialcellline
derivedneurotrophicfactor.JCellBiochem97:501511.
ChiuWT,ShenSC,ChowJM,LinCW,ShiaLT,ChenYC(2010)Contributionofreactiveoxygen
speciestomigration/invasionofhumanglioblastomacellsU87viaERKdependentCOX
2/PGE(2)activation.NeurobiolDis37:118129.
ClarkA,DeanJ,TudorC,SaklatvalaJ(2009)PosttranscriptionalgeneregulationbyMAP
kinasesviaAUrichelements.FrontBiosci14:847871.
ClarkeWE,BerryM,SmithC,KentA,LoganA(2001)Coordinationoffibroblastgrowthfactor
receptor1(FGFR1)andfibroblastgrowthfactor2(FGF2)traffickingtonucleiofreactive
astrocytesaroundcerebrallesionsinadultrats.MolCellNeurosci17:1730.
ClausP,DoringF,GringelS,MullerOstermeyerF,FuhlrottJ,KraftT,GrotheC(2003)
Differentialintranuclearlocalizationoffibroblastgrowthfactor2isoformsandspecific
interactionwiththesurvivalofmotoneuronprotein.JBiolChem278:479485.
ColasantiM,DiPT,PersichiniT,SogosV,PrestaM,LauroGM(1995)Inhibitionofinducible
nitricoxidesynthasemRNAexpressionbybasicfibroblastgrowthfactorinhumanmicroglial
cells.NeurosciLett195:4548.

182

BIBLIOGRAFA

CorderEH,SaundersAM,RischNJ,StrittmatterWJ,SchmechelDE,GaskellPC,Jr.,RimmlerJB,
LockePA,ConneallyPM,SchmaderKE,.(1994)ProtectiveeffectofapolipoproteinEtype2
alleleforlateonsetAlzheimerdisease.NatGenet7:180184.
CorderEH,SaundersAM,StrittmatterWJ,SchmechelDE,GaskellPC,SmallGW,RosesAD,
HainesJL,PericakVanceMA(1993)GenedoseofapolipoproteinEtype4alleleandtheriskof
Alzheimer'sdiseaseinlateonsetfamilies.Science261:921923.
CordleA,LandrethG(2005)3Hydroxy3methylglutarylcoenzymeAreductaseinhibitors
attenuatebetaamyloidinducedmicroglialinflammatoryresponses.JNeurosci25:299307.
CranwellBruceLA(2010)DrugsforAlzheimer'sdisease.MedsurgNurs19:5153.
CummingsJ(2010)Whatcanbeinferredfromtheinterruptionofthesemagacestattrialfor
treatmentofAlzheimer'sdisease?BiolPsychiatry68:876878.
D'SaC,GrossJ,FranconeVP,MorestDK(2007)Plasticityofsynapticendingsinthecochlear
nucleusfollowingnoiseinducedhearinglossisfacilitatedintheadultFGF2overexpressor
mouse.EurJNeurosci26:666680.
DaiZ,PengHB(1995)Presynapticdifferentiationinducedinculturedneuronsbylocal
applicationofbasicfibroblastgrowthfactor.JNeurosci15:54665475.
DanboltNC(2001)Glutamateuptake.ProgNeurobiol65:1105.
delaTorreJC(1997)CerebromicrovascularpathologyinAlzheimer'sdiseasecomparedto
normalaging.Gerontology43:2643.
DeSB(2007)LossoffunctionpresenilinmutationsinAlzheimerdisease.TalkingPointonthe
roleofpresenilinmutationsinAlzheimerdisease.EMBORep8:141146.
DeaconSW,BeeserA,FukuiJA,RennefahrtUE,MyersC,ChernoffJ,PetersonJR(2008)An
isoformselective,smallmoleculeinhibitortargetstheautoregulatorymechanismofp21
activatedkinase.ChemBiol15:322331.
DeoDD,AxelradTW,RobertEG,MarcheselliV,BazanNG,HuntJD(2002)Phosphorylationof
STAT3inresponsetobasicfibroblastgrowthfactoroccursthroughamechanisminvolving
plateletactivatingfactor,JAK2,andSrcinhumanumbilicalveinendothelialcells.Evidencefor
adualkinasemechanism.JBiolChem277:2123721245.
DevoreEE,GrodsteinF,vanRooijFJ,HofmanA,StampferMJ,WittemanJC,BretelerMM
(2010)Dietaryantioxidantsandlongtermriskofdementia.ArchNeurol67:819825.
DhillonNK,WilliamsR,CallenS,ZienC,NarayanO,BuchS(2008)RolesofMCP1in
developmentofHIVdementia.FrontBiosci13:39133918.
DietrichJB(2002)TheadhesionmoleculeICAM1anditsregulationinrelationwiththeblood
brainbarrier.JNeuroimmunol128:5868.
DillJ,PatelAR,YangXL,BachooR,PowellCM,LiS(2010)Amolecularmechanismfor
ibuprofenmediatedRhoAinhibitioninneurons.JNeurosci30:963972.

183

BIBLIOGRAFA

DomercqM,BrambillaL,PilatiE,MarchalandJ,VolterraA,BezziP(2006)P2Y1receptor
evokedglutamateexocytosisfromastrocytes:controlbytumornecrosisfactoralphaand
prostaglandins.JBiolChem281:3068430696.
DonoR,TexidoG,DusselR,EhmkeH,ZellerR(1998)Impairedcerebralcortexdevelopment
andbloodpressureregulationinFGF2deficientmice.EMBOJ17:42134225.
DringenR,HirrlingerJ(2003)Glutathionepathwaysinthebrain.BiolChem384:505516.
EdbauerD,WinklerE,RegulaJT,PesoldB,SteinerH,HaassC(2003)Reconstitutionofgamma
secretaseactivity.NatCellBiol5:486488.
EkmarkLewenS,LewenA,IsraelssonC,LiGL,FarooqueM,OlssonY,EbendalT,HilleredL
(2010)VimentinandGFAPresponsesinastrocytesaftercontusiontraumatothemurinebrain.
RestorNeurolNeurosci28:311321.
ElHageN,WuG,AmbatiJ,BruceKellerAJ,KnappPE,HauserKF(2006)CCR2mediates
increasesinglialactivationcausedbyexposuretoHIV1Tatandopiates.JNeuroimmunol
178:916.
EtienneS,AdamsonP,GreenwoodJ,StrosbergAD,CazaubonS,CouraudPO(1998)ICAM1
signalingpathwaysassociatedwithRhoactivationinmicrovascularbrainendothelialcells.J
Immunol161:57555761.
EtienneMannevilleS(2004)Cdc42thecentreofpolarity.JCellSci117:12911300.
EtienneMannevilleS(2006)Invitroassayofprimaryastrocytemigrationasatooltostudy
RhoGTPasefunctionincellpolarization.MethodsEnzymol406:56578.:565578.
EtienneMannevilleS(2008)Polarityproteinsinglialcellfunctions.CurrOpinNeurobiol
18:488494.
EtienneMannevilleS,ChaverotN,StrosbergAD,CouraudPO(1999)ICAM1coupledsignaling
pathwaysinastrocytesconvergetocyclicAMPresponseelementbindingprotein
phosphorylationandTNFalphasecretion.JImmunol163:668674.
EtienneMannevilleS,MannevilleJB,AdamsonP,WilbournB,GreenwoodJ,CouraudPO
(2000)ICAM1coupledcytoskeletalrearrangementsandtransendotheliallymphocyte
migrationinvolveintracellularcalciumsignalinginbrainendothelialcelllines.JImmunol
165:33753383.
EugeninEA,D'AversaTG,LopezL,CalderonTM,BermanJW(2003)MCP1(CCL2)protects
humanneuronsandastrocytesfromNMDAorHIVtatinducedapoptosis.JNeurochem
85:12991311.
EugeninEA,OsieckiK,LopezL,GoldsteinH,CalderonTM,BermanJW(2006)CCL2/monocyte
chemoattractantprotein1mediatesenhancedtransmigrationofhumanimmunodeficiency
virus(HIV)infectedleukocytesacrossthebloodbrainbarrier:apotentialmechanismofHIV
CNSinvasionandNeuroAIDS.JNeurosci26:10981106.
EvansSJ,ChoudaryPV,NealCR,LiJZ,VawterMP,TomitaH,LopezJF,ThompsonRC,MengF,
SteadJD,WalshDM,MyersRM,BunneyWE,WatsonSJ,JonesEG,AkilH(2004)Dysregulation

184

BIBLIOGRAFA

ofthefibroblastgrowthfactorsysteminmajordepression.ProcNatlAcadSciUSA
101:1550615511.
FabryZ,WaldschmidtMM,HendricksonD,KeinerJ,LoveHomanL,TakeiF,HartMN(1992)
Adhesionmoleculesonmurinebrainmicrovascularendothelialcells:expressionandregulation
ofICAM1andLgp55.JNeuroimmunol36:111.
FagelDM,GanatY,ChengE,SilbereisJ,OhkuboY,MentLR,VaccarinoFM(2009)Fgfr1is
requiredforcorticalregenerationandrepairafterperinatalhypoxia.JNeurosci29:12021211.
FaulknerJR,HerrmannJE,WooMJ,TanseyKE,DoanNB,SofroniewMV(2004a)Reactive
astrocytesprotecttissueandpreservefunctionafterspinalcordinjury.JNeurosci24:2143
2155.
FaulknerJR,HerrmannJE,WooMJ,TanseyKE,DoanNB,SofroniewMV(2004b)Reactive
astrocytesprotecttissueandpreservefunctionafterspinalcordinjury.JNeurosci24:2143
2155.
FeinsteinDL,HenekaMT,GavrilyukV,DelloRC,WeinbergG,GaleaE(2002)Noradrenergic
regulationofinflammatorygeneexpressioninbrain.NeurochemInt41:357365.
FerreiroI,BarraganM,GubernA,BallestarE,JoaquinM,PosasF(2010)Thep38SAPKis
recruitedtochromatinviaitsinteractionwithtranscriptionfactors.JBiolChem285:31819
31828.
FerriCP,PrinceM,BrayneC,BrodatyH,FratiglioniL,GanguliM,HallK,HasegawaK,Hendrie
H,HuangY,JormA,MathersC,MenezesPR,RimmerE,ScazufcaM(2005)Globalprevalence
ofdementia:aDelphiconsensusstudy.Lancet366:21122117.
FiaccoTA,AgulhonC,McCarthyKD(2009)Sortingoutastrocytephysiologyfrom
pharmacology.AnnuRevPharmacolToxicol49:151174.
FifeBT,HuffnagleGB,KuzielWA,KarpusWJ(2000)CCchemokinereceptor2iscriticalfor
inductionofexperimentalautoimmuneencephalomyelitis.JExpMed192:899905.
FilosaA,PaixaoS,HonsekSD,CarmonaMA,BeckerL,FeddersenB,GaitanosL,RudhardY,
SchoepferR,KlopstockT,KullanderK,RoseCR,PasqualeEB,KleinR(2009)Neuronglia
communicationviaEphA4/ephrinA3modulatesLTPthroughglialglutamatetransport.Nat
Neurosci12:12851292.
FlajoletM,WangZ,FutterM,ShenW,NuangchamnongN,BendorJ,WallachI,NairnAC,
SurmeierDJ,GreengardP(2008)FGFactsasacotransmitterthroughadenosineA(2A)
receptortoregulatesynapticplasticity.NatNeurosci11:14021409.
FlanneryS,BowieAG(2010)Theinterleukin1receptorassociatedkinases:criticalregulators
ofinnateimmunesignalling.BiochemPharmacol80:19811991.
FlannerySM,KeatingSE,SyzmakJ,BowieAG(2011)HUMANINTERLEUKIN1RECEPTOR
ASSOCIATEDKINASE2(IRAK2)ISESSENTIALFORTOLLLIKERECEPTORMEDIATED
TRANSCRIPTIONALANDPOSTTRANSCRIPTIONALREGULATIONOFTNF{alpha}.JBiolChem.

185

BIBLIOGRAFA

FloresC,RodarosD,StewartJ(1998)Longlastinginductionofastrocyticbasicfibroblast
growthfactorbyrepeatedinjectionsofamphetamine:blockadebyconcurrenttreatmentwith
aglutamateantagonist.JNeurosci18:95479555.
FloresC,StewartJ(2000)Basicfibroblastgrowthfactorasamediatoroftheeffectsof
glutamateinthedevelopmentoflonglastingsensitizationtostimulantdrugs:studiesinthe
rat.Psychopharmacology(Berl)151:152165.
FlorkiewiczRZ,AnchinJ,BairdA(1998)Theinhibitionoffibroblastgrowthfactor2exportby
cardenolidesimpliesanovelfunctionforthecatalyticsubunitofNa+,K+ATPase.JBiolChem
273:544551.
FlorkiewiczRZ,BairdA,GonzalezAM(1991)MultipleformsofbFGF:differentialnuclearand
cellsurfacelocalization.GrowthFactors4:265275.
FlugelA,HagerG,HorvatA,SpitzerC,SingerGM,GraeberMB,KreutzbergGW,SchwaigerFW
(2001)NeuronalMCP1expressioninresponsetoremotenerveinjury.JCerebBloodFlow
Metab21:6976.
FongYC,LinCY,SuYC,ChenWC,TsaiFJ,TsaiCH,HuangCY,TangCH(2011)CCN6enhances
ICAM1expressionandcellmotilityinhumanchondrosarcomacells.JCellPhysiol.
ForgetC,StewartJ,TrudeauLE(2006a)ImpactofbasicFGFexpressioninastrocyteson
dopamineneuronsynapticfunctionanddevelopment.EurJNeurosci23:608616.
ForgetC,StewartJ,TrudeauLE(2006b)ImpactofbasicFGFexpressioninastrocyteson
dopamineneuronsynapticfunctionanddevelopment.EurJNeurosci23:608616.
FraticelliTorresAI,MatosOcasioF,ThompsonKJ(2010)Glutamatetransportersare
differentiallyexpressedinthehippocampusduringtheearlystagesofonedayspatiallearning
task.EthnDis20:S132.
FredericksonRC,SilverJ(1991)Glialcells.Theunsungheroesofthebrain.Onecompany's
view.Biotechnology(NY)9:10421049.
FriedhoffP,vonBM,MandelkowEM,MandelkowE(2000)Structureoftauproteinand
assemblyintopairedhelicalfilaments.BiochimBiophysActa1502:122132.
FrohmanEM,VayuvegulaB,GuptaS,vandenNS(1988)Norepinephrineinhibitsgamma
interferoninducedmajorhistocompatibilityclassII(Ia)antigenexpressiononcultured
astrocytesviabeta2adrenergicsignaltransductionmechanisms.ProcNatlAcadSciUSA
85:12921296.
FuQ,HueJ,LiS(2007a)Nonsteroidalantiinflammatorydrugspromoteaxonregenerationvia
RhoAinhibition.JNeurosci27:41544164.
FuQ,HueJ,LiS(2007b)Nonsteroidalantiinflammatorydrugspromoteaxonregenerationvia
RhoAinhibition.JNeurosci27:41544164.
FuentesME,DurhamSK,SwerdelMR,LewinAC,BartonDS,MegillJR,BravoR,LiraSA(1995)
Controlledrecruitmentofmonocytesandmacrophagestospecificorgansthroughtransgenic
expressionofmonocytechemoattractantprotein1.JImmunol155:57695776.

186

BIBLIOGRAFA

FukushimaH,JimiE,OkamotoF,MotokawaW,OkabeK(2005)IL1inducedreceptoractivator
ofNFkappaBligandinhumanperiodontalligamentcellsinvolvesERKdependentPGE2
production.Bone36:267275.
FullerS,MunchG,SteeleM(2009)Activatedastrocytes:atherapeutictargetinAlzheimer's
disease?ExpertRevNeurother9:15851594.
FullerS,SteeleM,MunchG(2010)Activatedastrogliaduringchronicinflammationin
Alzheimer'sdiseasedotheyneglecttheirneurosupportiveroles?MutatRes690:4049.
GaleaE,FeinsteinDL(1999a)Regulationoftheexpressionoftheinflammatorynitricoxide
synthase(NOS2)bycyclicAMP.FASEBJ13:21252137.
GaleaE,FeinsteinDL(1999b)Regulationoftheexpressionoftheinflammatorynitricoxide
synthase(NOS2)bycyclicAMP.FASEBJ13:21252137.
GaleaE,HenekaMT,DelloRC,FeinsteinDL(2003a)Intrinsicregulationofbraininflammatory
responses.CellMolNeurobiol23:625635.
GaleaE,HenekaMT,DelloRC,FeinsteinDL(2003b)Intrinsicregulationofbraininflammatory
responses.CellMolNeurobiol23:625635.
GaleaE,ReisDJ,FeinsteinDL(1994)Cloningandexpressionofinduciblenitricoxidesynthase
fromratastrocytes.JNeurosciRes37:406414.
GallicchioM,RosaAC,DianzaniC,BrucatoL,BenettiE,CollinoM,FantozziR(2008)Celecoxib
decreasesexpressionoftheadhesionmoleculesICAM1andVCAM1inacoloncancercellline
(HT29).BrJPharmacol153:870878.
GaoYJ,ZhangL,JiRR(2010)SpinalinjectionofTNFalphaactivatedastrocytesproduces
persistentpainsymptommechanicalallodyniabyreleasingmonocytechemoattractant
protein1.Glia58:18711880.
GaspariniL,OnginiE,WenkG(2004)Nonsteroidalantiinflammatorydrugs(NSAIDs)in
Alzheimer'sdisease:oldandnewmechanismsofaction.JNeurochem91:521536.
GavilletM,AllamanI,MagistrettiPJ(2008)Modulationofastrocyticmetabolicphenotypeby
proinflammatorycytokines.Glia56:975989.
GavrilyukV,HorvathP,WeinbergG,FeinsteinDL(2001)A27bpregionoftheinduciblenitric
oxidesynthasepromoterregulatesexpressioninglialcells.JNeurochem78:129140.
GendronTF,BrunetteE,TauskelaJS,MorleyP(2005)ThedualroleofprostaglandinE(2)in
excitotoxicityandpreconditioninginducedneuroprotection.EurJPharmacol517:1727.
GiraudSN,CaronCM,PhamDinhD,KitabgiP,NicotAB(2010)Estradiolinhibitsongoing
autoimmuneneuroinflammationandNFkappaBdependentCCL2expressioninreactive
astrocytes.ProcNatlAcadSciUSA107:84168421.
GiulianD,WoodwardJ,YoungDG,KrebsJF,LachmanLB(1988)Interleukin1injectedinto
mammalianbrainstimulatesastrogliosisandneovascularization.JNeurosci8:24852490.

187

BIBLIOGRAFA

GlabinskiAR,BalasingamV,TaniM,KunkelSL,StrieterRM,YongVW,RansohoffRM(1996)
Chemokinemonocytechemoattractantprotein1isexpressedbyastrocytesaftermechanical
injurytothebrain.JImmunol156:43634368.
GomezPinillaF,DaoL,ChoiJ,RybaEA(2000)DiazepaminducesFGF2mRNAinthe
hippocampusandstriatum.BrainResBull53:283289.
GomezPinillaF,DaoL,SoV(1997)PhysicalexerciseinducesFGF2anditsmRNAinthe
hippocampus.BrainRes764:18.
GomezPinillaF,LeeJW,CotmanCW(1992)BasicFGFinadultratbrain:cellulardistribution
andresponsetoentorhinallesionandfimbriafornixtransection.JNeurosci12:345355.
GomezPinillaF,SoV,KesslakJP(1998)Spatiallearningandphysicalactivitycontributetothe
inductionoffibroblastgrowthfactor:neuralsubstratesforincreasedcognitionassociatedwith
exercise.Neuroscience85:5361.
GonzalezAM,BerryM,MaherPA,LoganA,BairdA(1995)Acomprehensiveanalysisofthe
distributionofFGF2andFGFR1intheratbrain.BrainRes701:201226.
GorelickPB(2004)RiskfactorsforvasculardementiaandAlzheimerdisease.Stroke35:2620
2622.
GorinaR,FontNievesM,MarquezKisinouskyL,SantaluciaT,PlanasAM(2011)AstrocyteTLR4
activationinducesaproinflammatoryenvironmentthroughtheinterplaybetweenMyD88
dependentNFkappaBsignaling,MAPK,andJak1/Stat1pathways.Glia59:242255.
GorinaR,SantaluciaT,PetegniefV,EjarqueOrtizA,SauraJ,PlanasAM(2009)Astrocytesare
verysensitivetodevelopinnateimmuneresponsestolipidcarriedshortinterferingRNA.Glia
57:93107.
GotohN(2008)RegulationofgrowthfactorsignalingbyFRS2familydocking/scaffoldadaptor
proteins.CancerSci99:13191325.
GrahamBM,RichardsonR(2011)Fibroblastgrowthfactor2altersthenatureofextinction.
LearnMem18:8084.
GreenRC,SchneiderLS,AmatoDA,BeelenAP,WilcockG,SwabbEA,ZavitzKH(2009)Effectof
tarenflurbiloncognitivedeclineandactivitiesofdailylivinginpatientswithmildAlzheimer
disease:arandomizedcontrolledtrial.JAMA302:25572564.
GreenwoodJ,EtienneMannevilleS,AdamsonP,CouraudPO(2002)Lymphocytemigration
intothecentralnervoussystem:implicationofICAM1signallingatthebloodbrainbarrier.
VasculPharmacol38:315322.
GrieshammerU,MinowadaG,PisentiJM,AbbottUK,MartinGR(1996)Thechicklimbless
mutationcausesabnormalitiesinlimbbuddorsalventralpatterning:implicationsforthe
mechanismofapicalridgeformation.Development122:38513861.
GringelS,vanBJ,HaastertK,GrotheC,ClausP(2004)Nuclearfibroblastgrowthfactor2
interactsspecificallywithsplicingfactorSF3a66.BiolChem385:12031208.

188

BIBLIOGRAFA

GrotheC,TimmerM(2007)Thephysiologicalandpharmacologicalroleofbasicfibroblast
growthfactorinthedopaminergicnigrostriatalsystem.BrainResRev54:8091.
GumaM,RonacherLM,FiresteinGS,KarinM,CorrM(2011)JNK1deficiencylimits
macrophagemediatedantigeninducedarthritis.ArthritisRheum.
GuoH,JinYX,IshikawaM,HuangYM,vanderMeidePH,LinkH,XiaoBG(1998)Regulationof
betachemokinemRNAexpressioninadultratastrocytesbylipopolysaccharide,
proinflammatoryandimmunoregulatorycytokines.ScandJImmunol48:502508.
HalassaMM,FellinT,HaydonPG(2007)Thetripartitesynapse:rolesforgliotransmissionin
healthanddisease.TrendsMolMed13:5463.
HarrisRE(2007)Cyclooxygenase2(cox2)andtheinflammogenesisofcancer.SubcellBiochem
42:93126.
HashimotoK(2010)Brainderivedneurotrophicfactorasabiomarkerformooddisorders:an
historicaloverviewandfuturedirections.PsychiatryClinNeurosci64:341357.
HatchNE(2010)FGFsignalingincraniofacialbiologicalcontrolandpathologicalcraniofacial
development.CritRevEukaryotGeneExpr20:295311.
HaydenKM,ZandiPP,KhachaturianAS,SzekelyCA,FotuhiM,NortonMC,TschanzJT,Pieper
CF,CorcoranC,LyketsosCG,BreitnerJC,WelshBohmerKA(2007)DoesNSAIDusemodify
cognitivetrajectoriesintheelderly?TheCacheCountystudy.Neurology69:275282.
HeffronDS,MandellJW(2005)OpposingrolesofERKandp38MAPkinasesinFGF2induced
astroglialprocessextension.MolCellNeurosci28:779790.
HenekaMT,SastreM,DumitrescuOzimekL,HankeA,DewachterI,KuiperiC,O'BanionK,
KlockgetherT,vanLF,LandrethGE(2005)AcutetreatmentwiththePPARgammaagonist
pioglitazoneandibuprofenreducesglialinflammationandAbeta142levelsinAPPV717I
transgenicmice.Brain128:14421453.
HerxLM,YongVW(2001)Interleukin1betaisrequiredfortheearlyevolutionofreactive
astrogliosisfollowingCNSlesion.JNeuropatholExpNeurol60:961971.
HoltjeM,HoffmannA,HofmannF,MuckeC,GrosseG,VanRN,KettenmannH,JustI,hnert
HilgerG(2005)RoleofRhoGTPaseinastrocytemorphologyandmigratoryresponseduringin
vitrowoundhealing.JNeurochem95:12371248.
HozumiI,AquinoDA,NortonWT(1990)GFAPmRNAlevelsfollowingstabwoundsinratbrain.
BrainRes534:291294.
HsiehHL,WangHH,WuWB,ChuPJ,YangCM(2010)Transforminggrowthfactorbeta1
inducesmatrixmetalloproteinase9andcellmigrationinastrocytes:rolesofROSdependent
ERKandJNKNFkappaBpathways.JNeuroinflammation7:88.
HsuanSL,KlintworthHM,XiaZ(2006)Basicfibroblastgrowthfactorprotectsagainstrotenone
induceddopaminergiccelldeaththroughactivationofextracellularsignalregulatedkinases
1/2andphosphatidylinositol3kinasepathways.JNeurosci26:44814491.

189

BIBLIOGRAFA

HuangC,RajfurZ,BorchersC,SchallerMD,JacobsonK(2003)JNKphosphorylatespaxillinand
regulatescellmigration.Nature424:219223.
HuangTL(2010)Omega3fattyacids,cognitivedecline,andAlzheimer'sdisease:acritical
reviewandevaluationoftheliterature.JAlzheimersDis21:673690.
HuangY,LiuJ,WangLZ,ZhangWY,ZhuXZ(2005)Neuroprotectiveeffectsofcyclooxygenase2
inhibitorcelecoxibagainsttoxicityofLPSstimulatedmacrophagestowardmotorneurons.Acta
PharmacolSin26:952958.
HuesaG,BaltronsMA,GomezRamosP,MoranA,GarciaA,HidalgoJ,FrancesS,SantpereG,
FerrerI,GaleaE(2010)AltereddistributionofRhoAinAlzheimer'sdiseaseandAbetaPP
overexpressingmice.JAlzheimersDis19:3756.
HughesPM,AllegriniPR,RudinM,PerryVH,MirAK,WiessnerC(2002)Monocyte
chemoattractantprotein1deficiencyisprotectiveinamurinestrokemodel.JCerebBlood
FlowMetab22:308317.
HutchinsonAJ,ChouCL,IsraelDD,XuW,ReganJW(2009)ActivationofEP2prostanoid
receptorsinhumanglialcelllinesstimulatesthesecretionofBDNF.NeurochemInt54:439
446.
IijimaN,YanagawaY,ClinganJM,OnoeK(2005)CCR7mediatedcJunNterminalkinase
activationregulatescellmigrationinmaturedendriticcells.IntImmunol17:12011212.
ImbimboBP,DelGE,CenacchiV,VoltaR,VillettiG,FacchinettiF,RiccardiB,PucciniP,Moretto
N,GrassiF,OttonelloS,LeonA(2007)InvitroandinvivoprofilingofCHF5022andCHF5074
Twobetaamyloid142loweringagents.PharmacolRes55:318328.
ImbimboBP,GiardinaGA(2011)gammaSecretaseInhibitorsandModulatorsforthe
TreatmentofAlzheimer'sDisease:DisappointmentsandHopes.CurrTopMedChem.
ImbimboBP,SolfrizziV,PanzaF(2010)AreNSAIDsusefultotreatAlzheimer'sdiseaseormild
cognitiveimpairment?FrontAgingNeurosci2.
InnocentiB,ParpuraV,HaydonPG(2000)Imagingextracellularwavesofglutamateduring
calciumsignalinginculturedastrocytes.JNeurosci20:18001808.
IshiharaA,SaitoH,NishiyamaN(1992)Basicfibroblastgrowthfactorameliorateslearning
deficitsinbasalforebrainlesionedmice.JpnJPharmacol59:713.
IshiyamaJ,SaitoH,AbeK(1991)Epidermalgrowthfactorandbasicfibroblastgrowthfactor
promotethegenerationoflongtermpotentiationinthedentategyrusofanaesthetizedrats.
NeurosciRes12:403411.
IssaR,AlQteishatA,MitsiosN,SakaM,KrupinskiJ,TarkowskiE,GaffneyJ,SlevinM,KumarS,
KumarP(2005)ExpressionofbasicfibroblastgrowthfactormRNAandproteininthehuman
brainfollowingischaemicstroke.Angiogenesis8:5362.
ItohN(2010)Hormonelike(endocrine)Fgfs:theirevolutionaryhistoryandrolesin
development,metabolism,anddisease.CellTissueRes342:111.

190

BIBLIOGRAFA

ItohN,OrnitzDM(2008)FunctionalevolutionaryhistoryofthemouseFgfgenefamily.Dev
Dyn237:1827.
IwasakiA,MedzhitovR(2004)Tolllikereceptorcontroloftheadaptiveimmuneresponses.
NatImmunol5:987995.
JackCR,Jr.,KnopmanDS,JagustWJ,ShawLM,AisenPS,WeinerMW,PetersenRC,
TrojanowskiJQ(2010)HypotheticalmodelofdynamicbiomarkersoftheAlzheimer's
pathologicalcascade.LancetNeurol9:119128.
JanssenIM,SturtzS,SkipkaG,ZentnerA,GarridoMV,BusseR(2010)Ginkgobilobain
Alzheimer'sdisease:asystematicreview.WienMedWochenschr160:539546.
JensenP,GramsbergenJB,ZimmerJ,WidmerHR,MeyerM(2011)Enhancedproliferationand
dopaminergicdifferentiationofventralmesencephalicprecursorcellsbysynergisticeffectof
FGF2andreducedoxygentension.ExpCellRes.
JeralaR(2007)StructuralbiologyoftheLPSrecognition.IntJMedMicrobiol297:353363.
JohnGR,ChenL,RivieccioMA,MelendezVasquezCV,HartleyA,BrosnanCF(2004)
Interleukin1betainducesareactiveastroglialphenotypeviadeactivationoftheRhoGTPase
Rockaxis.JNeurosci24:28372845.
KacemK,LacombeP,SeylazJ,BonventoG(1998)Structuralorganizationoftheperivascular
astrocyteendfeetandtheirrelationshipwiththeendothelialglucosetransporter:aconfocal
microscopystudy.Glia23:110.
KalariaRN(1999)ThebloodbrainbarrierandcerebrovascularpathologyinAlzheimer's
disease.AnnNYAcadSci893:113125.
KalilK,SzebenyiG,DentEW(2000)Commonmechanismsunderlyinggrowthconeguidance
andaxonbranching.JNeurobiol44:145158.
KanazawaS,FujiwaraT,MatsuzakiS,ShingakiK,TaniguchiM,MiyataS,TohyamaM,SakaiY,
YanoK,HosokawaK,KuboT(2010)bFGFregulatesPI3kinaseRac1JNKpathwayand
promotesfibroblastmigrationinwoundhealing.PLoSOne5:e12228.
KanegaeK,TamuraM,KabashimaN,SerinoR,TokunagaM,OikawaS,NakashimaY(2005)
Synergisticinductionofmonocytechemoattractantprotein1byintegrinsandplateletderived
growthfactorviafocaladhesionkinaseinmesangialcells.NephrolDialTransplant20:2080
2088.
KangK,SongMR(2010)DiverseFGFreceptorsignalingcontrolsastrocytespecificationand
proliferation.BiochemBiophysResCommun395:324329.
KasaiM,JikohT,FukumitsuH,FurukawaS(2010)FGF2responsiveandspinalcordresident
cellsimprovelocomotorfunctionafterspinalcordinjury.JNeurotrauma.
KenagyRD,HartCE,StetlerStevensonWG,ClowesAW(1997)Primatesmoothmusclecell
migrationfromaorticexplantsismediatedbyendogenousplateletderivedgrowthfactorand
basicfibroblastgrowthfactoractingthroughmatrixmetalloproteinases2and9.Circulation
96:35553560.

191

BIBLIOGRAFA

KhorooshiR,BabcockAA,OwensT(2008)NFkappaBdrivenSTAT2andCCL2expressionin
astrocytesinresponsetobraininjury.JImmunol181:72847291.
KimHJ,LeeMH,ParkHS,ParkMH,LeeSW,KimSY,ChoiJY,ShinHI,KimHJ,RyooHM(2003)
Erkpathwayandactivatorprotein1playcrucialrolesinFGF2stimulatedprematurecranial
sutureclosure.DevDyn227:335346.
KiyotaT,YamamotoM,XiongH,LambertMP,KleinWL,GendelmanHE,RansohoffRM,IkezuT
(2009)CCL2acceleratesmicrogliamediatedAbetaoligomerformationandprogressionof
neurocognitivedysfunction.PLoSOne4:e6197.
KlegerisA,GiassonBI,ZhangH,MaguireJ,PelechS,McGeerPL(2006)Alphasynucleinandits
diseasecausingmutantsinduceICAM1andIL6inhumanastrocytesandastrocytomacells.
FASEBJ20:20002008.
KnightsV,CookSJ(2010)DeregulatedFGFreceptorsastherapeutictargetsincancer.
PharmacolTher125:105117.
KochH,HuhSE,ElsenFP,CarrollMS,HodgeRD,BedogniF,TurnerMS,HevnerRF,RamirezJM
(2010)ProstaglandinE2inducedsynapticplasticityinneocorticalnetworksoforganotypicslice
cultures.JNeurosci30:1167811687.
KonietzkoU,MullerCM(1994)Astrocyticdyecouplinginrathippocampus:topography,
developmentalonset,andmodulationbyproteinkinaseC.Hippocampus4:297306.
KrizJ(2006)Inflammationinischemicbraininjury:timingisimportant.CritRevNeurobiol
18:145157.
KuboT,YamashitaT(2007)RhoROCKinhibitorsforthetreatmentofCNSinjury.RecentPat
CNSDrugDiscov2:173179.
KukarT,PrescottS,EriksenJL,HollowayV,MurphyMP,KooEH,GoldeTE,NicolleMM(2007)
ChronicadministrationofRflurbiprofenattenuateslearningimpairmentsintransgenic
amyloidprecursorproteinmice.BMCNeurosci8:54.
KunoM,NemotoK,NinomiyaN,InagakiE,KubotaM,MatsumotoT,YokotaH(2009)The
novelselectivetolllikereceptor4signaltransductioninhibitortak242preventsendotoxaemia
inconsciousGuineapigs.ClinExpPharmacolPhysiol36:589593.
KurokawaT,SasadaR,IwaneM,IgarashiK(1987)CloningandexpressionofcDNAencoding
humanbasicfibroblastgrowthfactor.FEBSLett213:189194.
LaingKJ,SecombesCJ(2004)TroutCCchemokines:comparisonoftheirsequencesand
expressionpatterns.MolImmunol41:793808.
LandrethGE,HenekaMT(2001)Antiinflammatoryactionsofperoxisomeproliferator
activatedreceptorgammaagonistsinAlzheimer'sdisease.NeurobiolAging22:937944.
LarnerAJ(2010)Cholinesteraseinhibitors:beyondAlzheimer'sdisease.ExpertRevNeurother
10:16991705.
LauffenburgerDA(1996)Cellmotility.Makingconnectionscount.Nature383:390391.

192

BIBLIOGRAFA

LeeHP,ZhuX,CasadesusG,CastellaniRJ,NunomuraA,SmithMA,LeeHG,PerryG(2010)
AntioxidantapproachesforthetreatmentofAlzheimer'sdisease.ExpertRevNeurother
10:12011208.
LeeJG,KayEP(2006a)FGF2inducedwoundhealingincornealendothelialcellsrequires
Cdc42activationandRhoinactivationthroughthephosphatidylinositol3kinasepathway.
InvestOphthalmolVisSci47:13761386.
LeeJG,KayEP(2006b)FGF2inducedwoundhealingincornealendothelialcellsrequires
Cdc42activationandRhoinactivationthroughthephosphatidylinositol3kinasepathway.
InvestOphthalmolVisSci47:13761386.
LeeJW,LeeYK,YukDY,ChoiDY,BanSB,OhKW,HongJT(2008)Neuroinflammationinduced
bylipopolysaccharidecausescognitiveimpairmentthroughenhancementofbetaamyloid
generation.JNeuroinflammation5:37.
LeeMH,KoriaP,QuJ,AndreadisST(2009)JNKphosphorylatesbetacateninandregulates
adherensjunctions.FASEBJ23:38743883.
LeeSJ,BenvenisteEN(1999)Adhesionmoleculeexpressionandregulationoncellsofthe
centralnervoussystem.JNeuroimmunol98:7788.
LeeSJ,DrabikK,VanWagonerNJ,LeeS,ChoiC,DongY,BenvenisteEN(2000)ICAM1induced
expressionofproinflammatorycytokinesinastrocytes:involvementofextracellularsignal
regulatedkinaseandp38mitogenactivatedproteinkinasepathways.JImmunol165:4658
4666.
LehmannJM,LenhardJM,OliverBB,RingoldGM,KliewerSA(1997)Peroxisomeproliferator
activatedreceptorsalphaandgammaareactivatedbyindomethacinandothernonsteroidal
antiinflammatorydrugs.JBiolChem272:34063410.
LeiM,RobinsonMA,HarrisonSC(2005)TheactiveconformationofthePAK1kinasedomain.
Structure13:769778.
LeissringMA,MurphyMP,MeadTR,AkbariY,SugarmanMC,JannatipourM,AnlikerB,Muller
U,SaftigP,DeSB,WolfeMS,GoldeTE,LaFerlaFM(2002)Aphysiologicsignalingroleforthe
gammasecretasederivedintracellularfragmentofAPP.ProcNatlAcadSciUSA99:4697
4702.
LenhardT,SchoberA,SuterCrazzolaraC,UnsickerK(2002)Fibroblastgrowthfactor2requires
glialcelllinederivedneurotrophicfactorforexertingitsneuroprotectiveactionson
glutamatelesionedhippocampalneurons.MolCellNeurosci20:181197.
LeuchtenbergerS,KummerMP,KukarT,CzirrE,TeuschN,SagiSA,BerdeauxR,PietrzikCU,
LaddTB,GoldeTE,KooEH,WeggenS(2006)InhibitorsofRhokinasemodulateamyloidbeta
(Abeta)secretionbutlackselectivityforAbeta42.JNeurochem96:355365.
LeuchtenbergerS,MalerJ,CzirrE,NessJ,LichtenthalerSF,EsselmannH,PietrzikCU,Wiltfang
J,WeggenS(2009)Nonsteroidalantiinflammatorydrugsandectodomainsheddingofthe
amyloidprecursorprotein.NeurodegenerDis6:18.

193

BIBLIOGRAFA

LiA,GuoH,LuoX,ShengJ,YangS,YinY,ZhouJ,ZhouJ(2006)Apomorphineinduced
activationofdopaminereceptorsmodulatesFGF2expressioninastrocyticculturesand
promotessurvivalofdopaminergicneurons.FASEBJ20:12631265.
LiAJ,SuzukiS,SuzukiM,MizukoshiE,ImamuraT(2002)Fibroblastgrowthfactor2increases
functionalexcitatorysynapsesonhippocampalneurons.EurJNeurosci16:13131324.
LichtensteinMP,CarribaP,MasgrauR,PujolA,GaleaE(2010)Stagingantiinflammatory
therapyinAlzheimer'sdisease.FrontAgingNeurosci2:142.
LiewFY,XuD,BrintEK,O'NeillLA(2005)Negativeregulationoftolllikereceptormediated
immuneresponses.NatRevImmunol5:446458.
LimGP,YangF,ChuT,ChenP,BeechW,TeterB,TranT,UbedaO,AsheKH,FrautschySA,Cole
GM(2000)Ibuprofensuppressesplaquepathologyandinflammationinamousemodelfor
Alzheimer'sdisease.JNeurosci20:57095714.
LimGP,YangF,ChuT,GahtanE,UbedaO,BeechW,OvermierJB,HsiaoAshecK,FrautschySA,
ColeGM(2001)IbuprofeneffectsonAlzheimerpathologyandopenfieldactivityinAPPsw
transgenicmice.NeurobiolAging22:983991.
LinMS,SunYY,ChiuWT,ChangCY,HungCC,ShieFS,TsaiSH,LinJW,HungKS,LeeYH(2011)
CurcuminattenuatestheexpressionandsecretionofRANTESfollowingspinalcordinjuryin
vivoandlipopolysaccharideinducedastrocytereactivationinvitro.JNeurotrauma.
LinY,WangF(2010)FGFsignallinginprostatedevelopment,tissuehomoeostasisand
tumorigenesis.BiosciRep30:285291.
LucanicM,ChengHJ(2008)ARAC/CDC42independentGIT/PIX/PAKsignalingpathway
mediatescellmigrationinC.elegans.PLoSGenet4:e1000269.
LustbaderJW,etal.(2004)ABADdirectlylinksAbetatomitochondrialtoxicityinAlzheimer's
disease.Science304:448452.
LyketsosCG,BreitnerJC,GreenRC,MartinBK,MeinertC,PiantadosiS,SabbaghM(2007)
NaproxenandcelecoxibdonotpreventADinearlyresultsfromarandomizedcontrolledtrial.
Neurology68:18001808.
MaQL,YangF,CalonF,UbedaOJ,HansenJE,WeisbartRH,BeechW,FrautschySA,ColeGM
(2008)p21activatedkinaseaberrantactivationandtranslocationinAlzheimerdisease
pathogenesis.JBiolChem283:1413214143.
MadrigalJL,GarciaBuenoB,HinojosaAE,PolakP,FeinsteinDL,LezaJC(2010)Regulationof
MCP1productioninbrainbystressandnoradrenalinemodulatingdrugs.JNeurochem
113:543551.
MadrigalJL,LezaJC,PolakP,KalininS,FeinsteinDL(2009a)AstrocytederivedMCP1mediates
neuroprotectiveeffectsofnoradrenaline.JNeurosci29:263267.
MadrigalJL,LezaJC,PolakP,KalininS,FeinsteinDL(2009b)AstrocytederivedMCP1mediates
neuroprotectiveeffectsofnoradrenaline.JNeurosci29:263267.

194

BIBLIOGRAFA

MagistrettiPJ,PellerinL,RothmanDL,ShulmanRG(1999)Energyondemand.Science
283:496497.
MaherPA(1996)NuclearTranslocationoffibroblastgrowthfactor(FGF)receptorsinresponse
toFGF2.JCellBiol134:529536.
MalabananKP,KanellakisP,BobikA,KhachigianLM(2008)Activationtranscriptionfactor4
inducedbyfibroblastgrowthfactor2regulatesvascularendothelialgrowthfactorA
transcriptioninvascularsmoothmusclecellsandmediatesintimalthickeninginratarteries
followingballooninjury.CircRes103:378387.
MalleiA,ShiB,MocchettiI(2002)Antidepressanttreatmentsinducetheexpressionofbasic
fibroblastgrowthfactorincorticalandhippocampalneurons.MolPharmacol61:10171024.
MartaM,MeierUC,LobellA(2009)Regulationofautoimmuneencephalomyelitisbytolllike
receptors.AutoimmunRev8:506509.
MartinezGrasI,PerezNievasBG,GarciaBuenoB,MadrigalJL,ndresEstebanE,Rodriguez
JimenezR,HoenickaJ,PalomoT,RubioG,LezaJC(2011)Theantiinflammatoryprostaglandin
15dPGJ(2)anditsnuclearreceptorPPARgammaaredecreasedinschizophrenia.SchizophrRes
128:1522.
MasonJM,MorrisonDJ,BassitB,DimriM,BandH,LichtJD,GrossI(2004)Tyrosine
phosphorylationofSproutyproteinsregulatestheirabilitytoinhibitgrowthfactorsignaling:a
dualfeedbackloop.MolBiolCell15:21762188.
MattsonMP(1997)Cellularactionsofbetaamyloidprecursorproteinanditssolubleand
fibrillogenicderivatives.PhysiolRev77:10811132.
MatyszakMK(1998)InflammationintheCNS:balancebetweenimmunologicalprivilegeand
immuneresponses.ProgNeurobiol56:1935.
McCarthyKD,deVJ(1978)Alpahadrenergicreceptormodulationofbetaadrenergic,
adenosineandprostaglandinE1increasedadenosine3':5'cyclicmonophosphatelevelsin
primaryculturesofglia.JCyclicNucleotideRes4:1526.
McCarthyKD,deVJ(1980)Preparationofseparateastroglialandoligodendroglialcellcultures
fromratcerebraltissue.JCellBiol85:890902.
McGeerPL,McGeerEG(2004)Inflammationandthedegenerativediseasesofaging.AnnNY
AcadSci1035:10416.:104116.
McKeehanWL,WuX,KanM(1999)Requirementforanticoagulantheparansulfateinthe
fibroblastgrowthfactorreceptorcomplex.JBiolChem274:2151121514.
McKeonRJ,JurynecMJ,BuckCR(1999)Thechondroitinsulfateproteoglycansneurocanand
phosphacanareexpressedbyreactiveastrocytesinthechronicCNSglialscar.JNeurosci
19:1077810788.
MeeuwsenS,PersoonDeenC,BsibsiM,RavidR,vanNoortJM(2003)Cytokine,chemokine
andgrowthfactorgeneprofilingofculturedhumanastrocytesafterexposureto
proinflammatorystimuli.Glia43:243253.

195

BIBLIOGRAFA

MessersmithDJ,MurtieJC,LeTQ,FrostEE,ArmstrongRC(2000)Fibroblastgrowthfactor2
(FGF2)andFGFreceptorexpressioninanexperimentaldemyelinatingdiseasewithextensive
remyelination.JNeurosciRes62:241256.
MidwoodKS,PiccininiAM,SacreS(2009)TargetingTolllikereceptorsinautoimmunity.Curr
DrugTargets10:11391155.
MiklicS,JuricDM,CarmanKrzanM(2004)DifferencesintheregulationofBDNFandNGF
synthesisinculturedneonatalratastrocytes.IntJDevNeurosci22:119130.
MiklossyJ,DoudetDD,SchwabC,YuS,McGeerEG,McGeerPL(2006)RoleofICAM1in
persistinginflammationinParkinsondiseaseandMPTPmonkeys.ExpNeurol197:275283.
MishraP,SenthivinayagamS,RangasamyV,SondarvaG,RanaB(2010)Mixedlineagekinase
3/JNK1axispromotesmigrationofhumangastriccancercellsfollowinggastrinstimulation.
MolEndocrinol24:598607.
MohammadiM,OlsenSK,IbrahimiOA(2005a)Structuralbasisforfibroblastgrowthfactor
receptoractivation.CytokineGrowthFactorRev16:107137.
MohammadiM,OlsenSK,IbrahimiOA(2005b)Structuralbasisforfibroblastgrowthfactor
receptoractivation.CytokineGrowthFactorRev16:107137.
MohammadiM,OlsenSK,IbrahimiOA(2005c)Structuralbasisforfibroblastgrowthfactor
receptoractivation.CytokineGrowthFactorRev16:107137.
MojsilovicPetrovicJ,CallaghanD,CuiH,DeanC,StanimirovicDB,ZhangW(2007)Hypoxia
induciblefactor1(HIF1)isinvolvedintheregulationofhypoxiastimulatedexpressionof
monocytechemoattractantprotein1(MCP1/CCL2)andMCP5(Ccl12)inastrocytes.J
Neuroinflammation4:12.
MolteniR,LipskaBK,WeinbergerDR,RacagniG,RivaMA(2001)Developmentalandstress
relatedchangesofneurotrophicfactorgeneexpressioninananimalmodelofschizophrenia.
MolPsychiatry6:285292.
MorgensternDA,AsherRA,FawcettJW(2002)ChondroitinsulphateproteoglycansintheCNS
injuryresponse.ProgBrainRes137:313332.
MoriharaT,ChuT,UbedaO,BeechW,ColeGM(2002)SelectiveinhibitionofAbeta42
productionbyNSAIDRenantiomers.JNeurochem83:10091012.
MorrisonRS,SharmaA,deVJ,BradshawRA(1986)Basicfibroblastgrowthfactorsupportsthe
survivalofcerebralcorticalneuronsinprimaryculture.ProcNatlAcadSciUSA83:75377541.
MulliganSJ,MacVicarBA(2004)Calciumtransientsinastrocyteendfeetcausecerebrovascular
constrictions.Nature431:195199.
MunchG,RobinsonSR(2002)PotentialneurotoxicinflammatoryresponsestoAbeta
vaccinationinhumans.JNeuralTransm109:10811087.
MunozFJ,InestrosaNC(1999)Neurotoxicityofacetylcholinesteraseamyloidbetapeptide
aggregatesisdependentonthetypeofAbetapeptideandtheAChEconcentrationpresentin
thecomplexes.FEBSLett450:205209.
196

BIBLIOGRAFA

MunozL,AmmitAJ(2010)Targetingp38MAPKpathwayforthetreatmentofAlzheimer's
disease.Neuropharmacology58:561568.
MurtieJC,ZhouYX,LeTQ,ArmstrongRC(2005)Invivoanalysisofoligodendrocytelineage
developmentinpostnatalFGF2nullmice.Glia49:542554.
NageleRG,WegielJ,VenkataramanV,ImakiH,WangKC,WegielJ(2004)Contributionofglial
cellstothedevelopmentofamyloidplaquesinAlzheimer'sdisease.NeurobiolAging25:663
674.
NakanishiM,NiidomeT,MatsudaS,AkaikeA,KiharaT,SugimotoH(2007)Microgliaderived
interleukin6andleukaemiainhibitoryfactorpromoteastrocyticdifferentiationofneural
stem/progenitorcells.EurJNeurosci25:649658.
NarumiyaS,TanjiM,IshizakiT(2009)Rhosignaling,ROCKandmDia1,intransformation,
metastasisandinvasion.CancerMetastasisRev28:6576.
NearyJT,BakerL,JorgensenSL,NorenbergMD(1994)ExtracellularATPinducesstellationand
increasesglialfibrillaryacidicproteincontentandDNAsynthesisinprimaryastrocytecultures.
ActaNeuropathol87:813.
NedergaardM,RansomB,GoldmanSA(2003)Newrolesforastrocytes:redefiningthe
functionalarchitectureofthebrain.TrendsNeurosci26:523530.
NeffL,ZeiselM,DruetV,TakedaK,KleinJP,SibiliaJ,WachsmannD(2003)ERK1/2andJNKs
dependentsynthesisofinterleukins6and8byfibroblastlikesynoviocytesstimulatedwith
proteinI/II,amodulinfromoralstreptococci,requiresfocaladhesionkinase.JBiolChem
278:2772127728.
NelsonAD,SvendsenCN(2006)LowconcentrationsofextracellularFGF2aresufficientbut
notessentialforneurogenesisfromhumanneuralprogenitorcells.MolCellNeurosci..
NeufeldG,GospodarowiczD(1985)Theidentificationandpartialcharacterizationofthe
fibroblastgrowthfactorreceptorofbabyhamsterkidneycells.JBiolChem260:1386013868.
NewmanEA(2001)PropagationofintercellularcalciumwavesinretinalastrocytesandMuller
cells.JNeurosci21:22152223.
NickelW(2005)Unconventionalsecretoryroutes:directproteinexportacrosstheplasma
membraneofmammaliancells.Traffic6:607614.
NikolicM(2008)ThePak1kinase:animportantregulatorofneuronalmorphologyand
functioninthedevelopingforebrain.MolNeurobiol37:187202.
NorenbergMD(1979)Distributionofglutaminesynthetaseintheratcentralnervoussystem.J
HistochemCytochem27:756762.
NumakawaT,YokomakuD,KiyosueK,AdachiN,MatsumotoT,NumakawaY,TaguchiT,
HatanakaH,YamadaM(2002)Basicfibroblastgrowthfactorevokesarapidglutamaterelease
throughactivationoftheMAPKpathwayinculturedcorticalneurons.JBiolChem277:28861
28869.
O'BrienC(1996)AugusteD.andAlzheimer'sdisease.Science273:28.
197

BIBLIOGRAFA

O'NeillLA(2002)SignaltransductionpathwaysactivatedbytheIL1receptor/tolllikereceptor
superfamily.CurrTopMicrobiolImmunol270:4761.
OberheimNA,TakanoT,HanX,HeW,LinJH,WangF,XuQ,WyattJD,PilcherW,OjemannJG,
RansomBR,GoldmanSA,NedergaardM(2009)Uniquelyhominidfeaturesofadulthuman
astrocytes.JNeurosci29:32763287.
OrtegaS,IttmannM,TsangSH,EhrlichM,BasilicoC(1998)Neuronaldefectsanddelayed
woundhealinginmicelackingfibroblastgrowthfactor2.ProcNatlAcadSciUSA95:5672
5677.
OsmaniN,VitaleN,BorgJP,EtienneMannevilleS(2006)ScribcontrolsCdc42localizationand
activitytopromotecellpolarizationduringastrocytemigration.CurrBiol16:23952405.
PachterJS,deVriesHE,FabryZ(2003)Thebloodbrainbarrieranditsroleinimmuneprivilege
inthecentralnervoussystem.JNeuropatholExpNeurol62:593604.
PalssonMcDermottEM,O'NeillLA(2004)Signaltransductionbythelipopolysaccharide
receptor,Tolllikereceptor4.Immunology113:153162.
PanenkaW,JijonH,HerxLM,ArmstrongJN,FeighanD,WeiT,YongVW,RansohoffRM,
MacVicarBA(2001)P2X7likereceptoractivationinastrocytesincreaseschemokinemonocyte
chemoattractantprotein1expressionviamitogenactivatedproteinkinase.JNeurosci
21:71357142.
ParriHR,CrunelliV(2003)TheroleofCa2+inthegenerationofspontaneousastrocyticCa2+
oscillations.Neuroscience120:979992.
PatelMN,McNamaraJO(1995)Selectiveenhancementofaxonalbranchingofcultured
dentategyrusneuronsbyneurotrophicfactors.Neuroscience69:763770.
PechanPA,ChowdhuryK,GerdesW,SeifertW(1993)Glutamateinducesthegrowthfactors
NGF,bFGF,thereceptorFGFR1andcfosmRNAexpressioninratastrocyteculture.Neurosci
Lett153:111114.
PeknyM,PeknaM(2004)AstrocyteintermediatefilamentsinCNSpathologiesand
regeneration.JPathol204:428437.
PellerinL(2005)Howastrocytesfeedhungryneurons.MolNeurobiol32:5972.
PengH,MyersJ,FangX,StachowiakEK,MaherPA,MartinsGG,PopescuG,BerezneyR,
StachowiakMK(2002)IntegrativenuclearFGFR1signaling(INFS)pathwaymediatesactivation
ofthetyrosinehydroxylasegenebyangiotensinII,depolarizationandproteinkinaseC.J
Neurochem81:506524.
PereaG,NavarreteM,AraqueA(2009)Tripartitesynapses:astrocytesprocessandcontrol
synapticinformation.TrendsNeurosci32:421431.
PerezJA,ClintonSM,TurnerCA,WatsonSJ,AkilH(2009)AnewroleforFGF2asan
endogenousinhibitorofanxiety.JNeurosci29:63796387.

198

BIBLIOGRAFA

PetersCM,RogersSD,PomonisJD,EgnaczykGF,KeyserCP,SchmidtJA,GhilardiJR,MaggioJE,
MantyhPW(2003)Endothelinreceptorexpressioninthenormalandinjuredspinalcord:
potentialinvolvementininjuryinducedischemiaandgliosis.ExpNeurol180:113.
PetraviczJ,FiaccoTA,McCarthyKD(2008)LossofIP3receptordependentCa2+increasesin
hippocampalastrocytesdoesnotaffectbaselineCA1pyramidalneuronsynapticactivity.J
Neurosci28:49674973.
PfeiferM,BoncristianoS,BondolfiL,StalderA,DellerT,StaufenbielM,MathewsPM,JuckerM
(2002)CerebralhemorrhageafterpassiveantiAbetaimmunotherapy.Science298:1379.
PolkWW,EllisME,KushleikaJV,SimmondsPL,WoodsJS(2007)RhoAregulationofNFkappaB
activationismediatedbyCOX2dependentfeedbackinhibitionofIKKinkidneyepithelialcells.
AmJPhysiolCellPhysiol293:C1160C1170.
PollockNS,tkinsonLeadbeaterK,JohnstonJ,LaroucheM,WilderingWC,McFarlaneS(2005)
Voltagegatedpotassiumchannelsregulatetheresponseofretinalgrowthconestoaxon
extensionandguidancecues.EurJNeurosci22:569578.
PratE,BaronP,MedaL,ScarpiniE,GalimbertiD,ArdolinoG,CataniaA,ScarlatoG(2000)The
humanastrocytomacelllineU373MGproducesmonocytechemotacticprotein(MCP)1upon
stimulationwithbetaamyloidprotein.NeurosciLett283:177180.
PraticoD,ClarkCM,LiunF,RokachJ,LeeVY,TrojanowskiJQ(2002)Increaseofbrainoxidative
stressinmildcognitiveimpairment:apossiblepredictorofAlzheimerdisease.ArchNeurol
59:972976.
PratsH,KaghadM,PratsAC,KlagsbrunM,LeliasJM,LiauzunP,ChalonP,TauberJP,AmalricF,
SmithJA,.(1989)Highmolecularmassformsofbasicfibroblastgrowthfactorareinitiatedby
alternativeCUGcodons.ProcNatlAcadSciUSA86:18361840.
QinL,LiG,QianX,LiuY,WuX,LiuB,HongJS,BlockML(2005)Interactiveroleofthetolllike
receptor4andreactiveoxygenspeciesinLPSinducedmicrogliaactivation.Glia52:7884.
QuinonesMP,KalkondeY,EstradaCA,JimenezF,RamirezR,MahimainathanL,MummidiS,
ChoudhuryGG,MartinezH,AdamsL,MackM,ReddickRL,MaffiS,HaralambousS,ProbertL,
AhujaSK,AhujaSS(2008)RoleofastrocytesandchemokinesystemsinacuteTNFalpha
induceddemyelinatingsyndrome:CCR2dependentsignalspromoteastrocyteactivationand
survivalviaNFkappaBandAkt.MolCellNeurosci37:96109.
QuintanaA,MolineroA,BorupR,NielsenFC,CampbellIL,PenkowaM,HidalgoJ(2008)Effect
ofastrocytetargetedproductionofIL6ontraumaticbraininjuryanditsimpactonthecortical
transcriptome.DevNeurobiol68:195208.
RaibleF,BrandM(2004)DivideetImperathemidbrainhindbrainboundaryanditsorganizer.
TrendsNeurosci27:727734.
RamakersGJ,MoolenaarWH(1998)RegulationofastrocytemorphologybyRhoAand
lysophosphatidicacid.ExpCellRes245:252262.
ReichelCA,RehbergM,LerchenbergerM,BerberichN,BihariP,KhandogaAG,ZahlerS,
KrombachF(2009)Ccl2andCcl3mediateneutrophilrecruitmentviainductionofprotein
synthesisandgenerationoflipidmediators.ArteriosclerThrombVascBiol29:17871793.
199

BIBLIOGRAFA

ReillyJF,MizukoshiE,MaherPA(2004)Liganddependentandindependentinternalizationand
nucleartranslocationoffibroblastgrowthfactor(FGF)receptor1.DNACellBiol23:538548.
ReinesSA,BlockGA,MorrisJC,LiuG,NesslyML,LinesCR,NormanBA,BaranakCC(2004)
Rofecoxib:noeffectonAlzheimer'sdiseaseina1year,randomized,blinded,controlledstudy.
Neurology62:6671.
ReinhardC,HebertSS,DeSB(2005)Theamyloidbetaprecursorprotein:integratingstructure
withbiologicalfunction.EMBOJ24:39964006.
RenaultMiharaF,OkadaS,ShibataS,NakamuraM,ToyamaY,OkanoH(2008)Spinalcord
injury:emergingbeneficialroleofreactiveastrocytes'migration.IntJBiochemCellBiol
40:16491653.
ReussB,DonoR,UnsickerK(2003)Functionsoffibroblastgrowthfactor(FGF)2andFGF5in
astroglialdifferentiationandbloodbrainbarrierpermeability:evidencefrommousemutants.
JNeurosci23:64046412.
ReussB,LeungDS,OhlemeyerC,KettenmannH,UnsickerK(2000)Regionallydistinct
regulationofastroglialneurotransmitterreceptorsbyfibroblastgrowthfactor2.MolCell
Neurosci16:4258.
ReussB,UnsickerK(2000)Survivalanddifferentiationofdopaminergicmesencephalic
neuronsarepromotedbydopaminemediatedinductionofFGF2instriatalastroglialcells.
MolCellNeurosci16:781792.
RezaieP,TrilloPazosG,EverallIP,MaleDK(2002)Expressionofbetachemokinesand
chemokinereceptorsinhumanfetalastrocyteandmicroglialcocultures:potentialroleof
chemokinesinthedevelopingCNS.Glia37:6475.
riasRomeroLE,VillamarCruzO,PachecoA,KosoffR,HuangM,MuthuswamySK,ChernoffJ
(2010)ARacPaksignalingpathwayisessentialforErbB2mediatedtransformationofhuman
breastepithelialcancercells.Oncogene29:58395849.
RidetJL,MalhotraSK,PrivatA,GageFH(1997)Reactiveastrocytes:cellularandmolecularcues
tobiologicalfunction.TrendsNeurosci20:570577.
RivaMA,MolteniR,RacagniG(1998a)DifferentialregulationofFGF2andFGFR1inrat
corticalastrocytesbydexamethasoneandisoproterenol.BrainResMolBrainRes57:3845.
RivaMA,MolteniR,RacagniG(1998b)DifferentialregulationofFGF2andFGFR1inrat
corticalastrocytesbydexamethasoneandisoproterenol.BrainResMolBrainRes57:3845.
RivestS(2003)Molecularinsightsonthecerebralinnateimmunesystem.BrainBehavImmun
17:1319.
RobelS,BerningerB,GotzM(2011)Thestemcellpotentialofglia:lessonsfromreactive
gliosis.NatRevNeurosci12:88104.
RodriguezC,LopezP,PozoM,DuceAM,LopezPelaezM,FernandezM,AlemanyS(2008)
COX2expressionandErk1/Erk2activitymediateCotinducedcellmigration.CellSignal
20:16251631.

200

BIBLIOGRAFA

RollinsBJ(1996)Monocytechemoattractantprotein1:apotentialregulatorofmonocyte
recruitmentininflammatorydisease.MolMedToday2:198204.
RostworowskiM,BalasingamV,ChabotS,OwensT,YongVW(1997)Astrogliosisinthe
neonatalandadultmurinebrainposttrauma:elevationofinflammatorycytokinesandthe
lackofrequirementforendogenousinterferongamma.JNeurosci17:36643674.
SaboSL,IkinAF,BuxbaumJD,GreengardP(2003)Theamyloidprecursorproteinandits
regulatoryprotein,FE65,ingrowthconesandsynapsesinvitroandinvivo.JNeurosci23:5407
5415.
SalminenA,SuuronenT,KaarnirantaK(2008)ROCK,PAK,andTollofsynapsesinAlzheimer's
disease.BiochemBiophysResCommun371:587590.
SantarelliL,SaxeM,GrossC,SurgetA,BattagliaF,DulawaS,WeisstaubN,LeeJ,DumanR,
ArancioO,BelzungC,HenR(2003)Requirementofhippocampalneurogenesisforthe
behavioraleffectsofantidepressants.Science301:805809.
SastreM,DewachterI,LandrethGE,WillsonTM,KlockgetherT,vanLF,HenekaMT(2003)
Nonsteroidalantiinflammatorydrugsandperoxisomeproliferatoractivatedreceptorgamma
agonistsmodulateimmunostimulatedprocessingofamyloidprecursorproteinthrough
regulationofbetasecretase.JNeurosci23:97969804.
SastreM,DewachterI,RossnerS,BogdanovicN,RosenE,BorghgraefP,EvertBO,Dumitrescu
OzimekL,ThalDR,LandrethG,WalterJ,KlockgetherT,vanLF,HenekaMT(2006)Nonsteroidal
antiinflammatorydrugsrepressbetasecretasegenepromoteractivitybytheactivationof
PPARgamma.ProcNatlAcadSciUSA103:443448.
SatoK,HoriuchiY,JinY,MalchinkhuuE,KomachiM,KondoT,OkajimaF(2011)Unmaskingof
LPA1receptormediatedmigrationresponsetolysophosphatidicacidbyinterleukin1beta
inducedattenuationofRhosignalingpathwaysinratastrocytes.JNeurochem117:164174.
SaundersAM,SchmaderK,BreitnerJC,BensonMD,BrownWT,GoldfarbL,GoldgaberD,
ManwaringMG,SzymanskiMH,McCownN,.(1993)ApolipoproteinEepsilon4allele
distributionsinlateonsetAlzheimer'sdiseaseandinotheramyloidformingdiseases.Lancet
342:710711.
SchenkD,etal.(1999)ImmunizationwithamyloidbetaattenuatesAlzheimerdiseaselike
pathologyinthePDAPPmouse.Nature400:173177.
SchummersJ,YuH,SurM(2008)Tunedresponsesofastrocytesandtheirinfluenceon
hemodynamicsignalsinthevisualcortex.Science320:16381643.
SempleBD,ByeN,RancanM,ZiebellJM,MorgantiKossmannMC(2010a)RoleofCCL2(MCP
1)intraumaticbraininjury(TBI):evidencefromsevereTBIpatientsandCCL2/mice.JCereb
BloodFlowMetab30:769782.
SempleBD,FrugierT,MorgantiKossmannMC(2010b)CCL2modulatescytokineproductionin
culturedmouseastrocytes.JNeuroinflammation7:67.:67.
SerranoPerezMC,MartinED,VaqueroCF,AzcoitiaI,CalvoS,CanoE,TranqueP(2011)
ResponseoftranscriptionfactorNFATc3toexcitotoxicandtraumaticbraininsults:
identificationofasubpopulationofreactiveastrocytes.Glia59:94107.
201

BIBLIOGRAFA

ShaoY,EnkvistMO,McCarthyKD(1994)Glutamateblocksastroglialstellation:effectof
glutamateuptakeandvolumechanges.Glia11:110.
SherringtonR,etal.(1995)Cloningofagenebearingmissensemutationsinearlyonset
familialAlzheimer'sdisease.Nature375:754760.
ShimizuS,TaharaM,OgataS,HashimotoK,MorishigeK,TasakaK,MurataY(2007)
InvolvementofnuclearfactorkBactivationthroughRhoA/RhokinasepathwayinLPSinduced
IL8productioninhumancervicalstromalcells.MolHumReprod13:181187.
ShrikantP,LeeSJ,KalvakolanuI,RansohoffRM,BenvenisteEN(1996a)Stimulusspecific
inhibitionofintracellularadhesionmolecule1geneexpressionbyTGFbeta.JImmunol
157:892900.
ShrikantP,LeeSJ,KalvakolanuI,RansohoffRM,BenvenisteEN(1996b)Stimulusspecific
inhibitionofintracellularadhesionmolecule1geneexpressionbyTGFbeta.JImmunol
157:892900.
SimardM,ArcuinoG,TakanoT,LiuQS,NedergaardM(2003)Signalingatthegliovascular
interface.JNeurosci23:92549262.
SimardM,NedergaardM(2004)Theneurobiologyofgliainthecontextofwaterandion
homeostasis.Neuroscience129:877896.
SirisinhaS(2011)Insightintothemechanismsregulatingimmunehomeostasisinhealthand
disease.AsianPacJAllergyImmunol29:114.
SmallDH(1998)Theroleoftheamyloidproteinprecursor(APP)inAlzheimer'sdisease:does
thenormalfunctionofAPPexplainthetopographyofneurodegeneration?NeurochemRes
23:795806.
SmallwoodPM,MunozSanjuanI,TongP,MackeJP,HendrySH,GilbertDJ,CopelandNG,
JenkinsNA,NathansJ(1996)Fibroblastgrowthfactor(FGF)homologousfactors:new
membersoftheFGFfamilyimplicatedinnervoussystemdevelopment.ProcNatlAcadSciUS
A93:98509857.
SmithKM,OhkuboY,MaragnoliME,RasinMR,SchwartzML,SestanN,VaccarinoFM(2006)
MidlineradialgliatranslocationandcorpuscallosumformationrequireFGFsignaling.Nat
Neurosci9:787797.
SmitsHA,RijsmusA,vanLoonJH,WatJW,VerhoefJ,BovenLA,NottetHS(2002)Amyloid
betainducedchemokineproductioninprimaryhumanmacrophagesandastrocytes.J
Neuroimmunol127:160168.
SpoorenA,KooijmanR,LintermansB,VanCK,VermeulenL,HaegemanG,GerloS(2010)
CooperationofNFkappaBandCREBtoinducesynergisticIL6expressioninastrocytes.Cell
Signal22:871881.
StachowiakMK,FangX,MyersJM,DunhamSM,BerezneyR,MaherPA,StachowiakEK(2003)
IntegrativenuclearFGFR1signaling(INFS)asapartofauniversal"feedforwardandgate"
signalingmodulethatcontrolscellgrowthanddifferentiation.JCellBiochem90:662691.

202

BIBLIOGRAFA

StamatovicSM,DimitrijevicOB,KeepRF,AndjelkovicAV(2006)ProteinkinaseCalphaRhoA
crosstalkinCCL2inducedalterationsinbrainendothelialpermeability.JBiolChem281:8379
8388.
SteeleML,RobinsonSR(2010)Reactiveastrocytesgiveneuronslesssupport:implicationsfor
Alzheimer'sdisease.NeurobiolAging.
StopaEG,GonzalezAM,ChorskyR,CoronaRJ,AlvarezJ,BirdED,BairdA(1990a)Basic
fibroblastgrowthfactorinAlzheimer'sdisease.BiochemBiophysResCommun171:690696.
StopaEG,GonzalezAM,ChorskyR,CoronaRJ,AlvarezJ,BirdED,BairdA(1990b)Basic
fibroblastgrowthfactorinAlzheimer'sdisease.BiochemBiophysResCommun171:690696.
StreitWJ,MrakRE,GriffinWS(2004)Microgliaandneuroinflammation:apathological
perspective.JNeuroinflammation1:14.
SulJY,OroszG,GivensRS,HaydonPG(2004)AstrocyticConnectivityintheHippocampus.
NeuronGliaBiol1:311.
SuzukiR,OkudaM,AsaiJ,NagashimaG,ItokawaH,MatsunagaA,FujimotoT,SuzukiT(2006)
Astrocytescoexpressaquaporin1,4,andvascularendothelialgrowthfactorinbrainedema
tissueassociatedwithbraincontusion.ActaNeurochirSuppl96:398401.:398401.
SzczepanowskaJ(2009)InvolvementofRac/Cdc42/PAKpathwayincytoskeletal
rearrangements.ActaBiochimPol56:225234.
SzczurK,XuH,AtkinsonS,ZhengY,FilippiMD(2006)RhoGTPaseCDC42regulates
directionalityandrandommovementviadistinctMAPKpathwaysinneutrophils.Blood
108:42054213.
SzebenyiG,DentEW,CallawayJL,SeysC,LuethH,KalilK(2001)Fibroblastgrowthfactor2
promotesaxonbranchingofcorticalneuronsbyinfluencingmorphologyandbehaviorofthe
primarygrowthcone.JNeurosci21:39323941.
SzekelyCA,ThorneJE,ZandiPP,EkM,MessiasE,BreitnerJC,GoodmanSN(2004)
NonsteroidalantiinflammatorydrugsforthepreventionofAlzheimer'sdisease:asystematic
review.Neuroepidemiology23:159169.
TakahashiY,HayashiI,TominariY,RikimaruK,MorohashiY,KanT,NatsugariH,FukuyamaT,
TomitaT,IwatsuboT(2003)Sulindacsulfideisanoncompetitivegammasecretaseinhibitor
thatpreferentiallyreducesAbeta42generation.JBiolChem278:1866418670.
TakanohashiA,YabeT,SchwartzJP(2005)Pigmentepitheliumderivedfactorinducesthe
productionofchemokinesbyratmicroglia.Glia51:266278.
TamagnoE,BardiniP,ObbiliA,VitaliA,BorghiR,ZaccheoD,PronzatoMA,DanniO,SmithMA,
PerryG,TabatonM(2002)OxidativestressincreasesexpressionandactivityofBACEinNT2
neurons.NeurobiolDis10:279288.
TanakaT,SaitoH,MatsukiN(1996)Basicfibroblastgrowthfactormodulatessynaptic
transmissioninculturedrathippocampalneurons.BrainRes723:190195.

203

BIBLIOGRAFA

TanumaN,SakumaH,SasakiA,MatsumotoY(2006)Chemokineexpressionbyastrocytesplays
aroleinmicroglia/macrophageactivationandsubsequentneurodegenerationinsecondary
progressivemultiplesclerosis.ActaNeuropathol112:195204.
TeghanemtA,ProhinarP,GioanniniTL,WeissJP(2007)Transferofmonomericendotoxinfrom
MD2toCD14:characterizationandfunctionalconsequences.JBiolChem282:3625036256.
TekkokSB,BrownAM,WestenbroekR,PellerinL,RansomBR(2005)Transferofglycogen
derivedlactatefromastrocytestoaxonsviaspecificmonocarboxylatetransporterssupports
mouseopticnerveactivity.JNeurosciRes81:644652.
TerauchiA,JohnsonVenkateshEM,TothAB,JavedD,SuttonMA,UmemoriH(2010)Distinct
FGFspromotedifferentiationofexcitatoryandinhibitorysynapses.Nature465:783787.
ThibeaultI,LaflammeN,RivestS(2001)Regulationofthegeneencodingthemonocyte
chemoattractantprotein1(MCP1)inthemouseandratbraininresponsetocirculatingLPS
andproinflammatorycytokines.JCompNeurol434:461477.
ThompsonWL,VanEldikLJ(2009)Inflammatorycytokinesstimulatethechemokines
CCL2/MCP1andCCL7/MCP3throughNFkBandMAPKdependentpathwaysinratastrocytes
[corrected].BrainRes1287:4757.
TooyamaI,KawamataT,WalkerD,YamadaT,HanaiK,KimuraH,IwaneM,IgarashiK,McGeer
EG,McGeerPL(1993)Lossofbasicfibroblastgrowthfactorinsubstantianigraneuronsin
Parkinson'sdisease.Neurology43:372376.
TooyamaI,McGeerEG,KawamataT,KimuraH,McGeerPL(1994)Retentionofbasicfibroblast
growthfactorimmunoreactivityindopaminergicneuronsofthesubstantianigraduring
normalaginginhumanscontrastswithlossinParkinson'sdisease.BrainRes656:165168.
TripathiRB,McTigueDM(2008)Chronicallyincreasedciliaryneurotrophicfactorandfibroblast
growthfactor2expressionafterspinalcontusioninrats.JCompNeurol510:129144.
UboguEE,CossoyMB,RansohoffRM(2006)Theexpressionandfunctionofchemokines
involvedinCNSinflammation.TrendsPharmacolSci27:4855.
UmemoriH,LinhoffMW,OrnitzDM,SanesJR(2004)FGF22anditscloserelativesare
presynapticorganizingmoleculesinthemammalianbrain.Cell118:257270.
VaccarinoFM,SchwartzML,RaballoR,NilsenJ,RheeJ,ZhouM,DoetschmanT,CoffinJD,
WylandJJ,HungYT(1999)Changesincerebralcortexsizearegovernedbyfibroblastgrowth
factorduringembryogenesis.NatNeurosci2:246253.
vanKempenLC,CoussensLM(2002)MMP9potentiatespulmonarymetastasisformation.
CancerCell2:251252.
vanCD,MullerM,HamprechtB(1978)AdenosineinhibitstheaccumulationofcyclicAMPin
culturedbraincells.Nature276:839841.
vanEJ,KeYD,LiuX,DelerueF,KrilJJ,GotzJ,IttnerLM(2010)Sodiumselenatemitigatestau
pathology,neurodegeneration,andfunctionaldeficitsinAlzheimer'sdiseasemodels.ProcNatl
AcadSciUSA107:1388813893.

204

BIBLIOGRAFA

VandermoereF,ElYazidiBelkouraI,AdriaenssensE,LemoineJ,HondermarckH(2005)The
antiapoptoticeffectoffibroblastgrowthfactor2ismediatedthroughnuclearfactorkappaB
activationinducedviainteractionbetweenAktandIkappaBkinasebetainbreastcancercells.
Oncogene24:54825491.
VermaS,KumarM,NerurkarVR(2011)Cyclooxygenase2inhibitorblockstheproductionof
WestNilevirusinducedneuroinflammatorymarkersinastrocytes.JGenVirol92:507515.
VolbrachtC,vanBJ,ZhuC,BlomgrenK,LeistM(2006)Neuroprotectivepropertiesof
memantineindifferentinvitroandinvivomodelsofexcitotoxicity.EurJNeurosci23:2611
2622.
WangDD,BordeyA(2008)Theastrocyteodyssey.ProgNeurobiol86:342367.
WangHH,HsiehHL,WuCY,SunCC,YangCM(2009a)Oxidizedlowdensitylipoproteininduces
matrixmetalloproteinase9expressionviaap42/p44andJNKdependentAP1pathwayin
brainastrocytes.Glia57:2438.
WangHH,HsiehHL,YangCM(2010)Nitricoxideproductionbyendothelin1enhances
astrocyticmigrationviathetyrosinenitrationofmatrixmetalloproteinase9.JCellPhysiol.
WangX,BudelS,BaughmanK,GouldG,SongKH,StrittmatterSM(2009b)Ibuprofenenhances
recoveryfromspinalcordinjurybylimitingtissuelossandstimulatingaxonalgrowth.J
Neurotrauma26:8195.
WangX,BudelS,BaughmanK,GouldG,SongKH,StrittmatterSM(2009c)Ibuprofenenhances
recoveryfromspinalcordinjurybylimitingtissuelossandstimulatingaxonalgrowth.J
Neurotrauma26:8195.
WangX,FuS,WangY,YuP,HuJ,GuW,XuXM,LuP(2007)Interleukin1betamediates
proliferationanddifferentiationofmultipotentneuralprecursorcellsthroughtheactivationof
SAPK/JNKpathway.MolCellNeurosci36:343354.
WangZL,ChengSM,MaMM,MaYP,YangJP,XuGL,LiuXF(2008)IntranasallydeliveredbFGF
enhancesneurogenesisinadultratsfollowingcerebralischemia.NeurosciLett446:3035.
WegehingelS,ZeheC,NickelW(2008)Reroutingoffibroblastgrowthfactor2totheclassical
secretorypathwayresultsinposttranslationalmodificationsthatblockbindingtoheparan
sulfateproteoglycans.FEBSLett582:23872392.
WeggenS,EriksenJL,DasP,SagiSA,WangR,PietrzikCU,FindlayKA,SmithTE,MurphyMP,
BulterT,KangDE,MarquezSterlingN,GoldeTE,KooEH(2001)AsubsetofNSAIDslower
amyloidogenicAbeta42independentlyofcyclooxygenaseactivity.Nature414:212216.
WenAY,SakamotoKM,MillerLS(2010)TheroleofthetranscriptionfactorCREBinimmune
function.JImmunol185:64136419.
WhitmarshAJ(2007)Regulationofgenetranscriptionbymitogenactivatedproteinkinase
signalingpathways.BiochimBiophysActa1773:12851298.
WilhelmssonU,LiL,PeknaM,BertholdCH,BlomS,EliassonC,RennerO,BushongE,Ellisman
M,MorganTE,PeknyM(2004)Absenceofglialfibrillaryacidicproteinandvimentinprevents

205

BIBLIOGRAFA

hypertrophyofastrocyticprocessesandimprovesposttraumaticregeneration.JNeurosci
24:50165021.
WilloughbyKA,KleindienstA,MullerC,ChenT,MuirJK,EllisEF(2004)S100Bproteinis
releasedbyinvitrotraumaandreducesdelayedneuronalinjury.JNeurochem91:12841291.
WirthA,SchroeterM,KockHauserC,ManserE,ChalovichJM,DeLanerolleP,PfitzerG(2003)
Inhibitionofcontractionandmyosinlightchainphosphorylationinguineapigsmoothmuscle
byp21activatedkinase1.JPhysiol549:489500.
WolburgH,LippoldtA(2002)Tightjunctionsofthebloodbrainbarrier:development,
compositionandregulation.VasculPharmacol38:323337.
WonCL,OhYS(2000)cAMPinducedstellationinprimaryastrocytecultureswithregional
heterogeneity.BrainRes887:250258.
WoodwardWR,NishiR,MeshulCK,WilliamsTE,CoulombeM,EckensteinFP(1992)Nuclear
andcytoplasmiclocalizationofbasicfibroblastgrowthfactorinastrocytesandCA2
hippocampalneurons.JNeurosci12:142152.
WuT,WuH,WangJ,WangJ(2011)Expressionandcellularlocalizationofcyclooxygenasesand
prostaglandinEsynthasesinthehemorrhagicbrain.JNeuroinflammation8:22.
WyssCorayT,LoikeJD,BrionneTC,LuE,AnankovR,YanF,SilversteinSC,HusemannJ(2003a)
Adultmouseastrocytesdegradeamyloidbetainvitroandinsitu.NatMed9:453457.
WyssCorayT,LoikeJD,BrionneTC,LuE,AnankovR,YanF,SilversteinSC,HusemannJ(2003b)
Adultmouseastrocytesdegradeamyloidbetainvitroandinsitu.NatMed9:453457.
XiaMQ,HymanBT(1999)Chemokines/chemokinereceptorsinthecentralnervoussystemand
Alzheimer'sdisease.JNeurovirol5:3241.
XuQ,WangS,JiangX,ZhaoY,GaoM,ZhangY,WangX,TanoK,KaneharaM,ZhangW,IshidaT
(2007)Hypoxiainducedastrocytespromotethemigrationofneuralprogenitorcellsvia
vascularendothelialfactor,stemcellfactor,stromalderivedfactor1alphaandmonocyte
chemoattractantprotein1upregulationinvitro.ClinExpPharmacolPhysiol34:624631.
YabeT,SanagiT,SchwartzJP,YamadaH(2005)Pigmentepitheliumderivedfactorinduces
proinflammatorygenesinneonatalastrocytesthroughactivationofNFkappaBandCREB.
Glia50:223234.
YanYP,SailorKA,LangBT,ParkSW,VemugantiR,DempseyRJ(2007)Monocyte
chemoattractantprotein1playsacriticalroleinneuroblastmigrationafterfocalcerebral
ischemia.JCerebBloodFlowMetab27:12131224.
YangSF,ChenMK,HsiehYS,ChungTT,HsiehYH,LinCW,SuJL,TsaiMH,TangCH(2010)
ProstaglandinE2/EP1signalingpathwayenhancesintercellularadhesionmolecule1(ICAM1)
expressionandcellmotilityinoralcancercells.JBiolChem285:2980829816.
YasudaM,TanakaY,TamuraM,FujiiK,SugayaM,SoT,TakenoyamaM,YasumotoK(2001)
Stimulationofbeta1integrindownregulatesICAM1expressionandICAM1dependent
adhesionoflungcancercellsthroughfocaladhesionkinase.CancerRes61:20222030.

206

BIBLIOGRAFA

YeoSJ,YoonJG,YiAK(2003)Myeloiddifferentiationfactor88dependentposttranscriptional
regulationofcyclooxygenase2expressionbyCpGDNA:tumornecrosisfactoralphareceptor
associatedfactor6,adivergingpointintheTolllikereceptor9signaling.JBiolChem
278:4059040600.
YokotaY,EomTY,StancoA,KimWY,RaoS,SniderWD,AntonES(2010)Cdc42andGsk3
modulatethedynamicsofradialglialgrowth,interradialglialinteractionsandpolarityinthe
developingcerebralcortex.Development137:41014110.
YongVW,MoumdjianR,YongFP,RuijsTC,FreedmanMS,CashmanN,AntelJP(1991)Gamma
interferonpromotesproliferationofadulthumanastrocytesinvitroandreactivegliosisinthe
adultmousebraininvivo.ProcNatlAcadSciUSA88:70167020.
YoungPearseTL,BaiJ,ChangR,ZhengJB,LoTurcoJJ,SelkoeDJ(2007)Acriticalfunctionfor
betaamyloidprecursorproteininneuronalmigrationrevealedbyinuteroRNAinterference.J
Neurosci27:1445914469.
YuJA,DeakinNO,TurnerCE(2010)EmergingroleofpaxillinPKLinregulationofcelladhesion,
polarityandmigration.CellAdhMigr4:342347.
ZhangC,BrowneA,ChildD,TanziRE(2010a)Curcumindecreasesamyloidbetapeptidelevels
byattenuatingthematurationofamyloidbetaprecursorprotein.JBiolChem285:28472
28480.
ZhangH,IssekutzAC(2002)Downmodulationofmonocytetransendothelialmigrationand
endothelialadhesionmoleculeexpressionbyfibroblastgrowthfactor:reversalbytheanti
angiogenicagentSU6668.AmJPathol160:22192230.
ZhangX,ZhouZ,WangD,LiA,YinY,GuX,DingF,ZhenX,ZhouJ(2009)Activationof
phosphatidylinositollinkedD1likereceptormodulatesFGF2expressioninastrocytesviaIP3
dependentCa2+signaling.JNeurosci29:77667775.
ZhangYH,WangSQ,SunCR,WangM,WangB,TangJW(2010b)InhibitionofJNK1expression
decreasesmigrationandinvasionofmousehepatocellularcarcinomacelllineinvitro.Med
Oncol.
ZhaoL,BrintonRD(2004)Suppressionofproinflammatorycytokinesinterleukin1betaand
tumornecrosisfactoralphainastrocytesbyaV1vasopressinreceptoragonist:acAMP
responseelementbindingproteindependentmechanism.JNeurosci24:22262235.
ZhaoM,LiD,ShimazuK,ZhouYX,LuB,DengCX(2007)Fibroblastgrowthfactorreceptor1is
requiredforlongtermpotentiation,memoryconsolidation,andneurogenesis.BiolPsychiatry
62:381390.
ZhouY,SuY,LiB,LiuF,RyderJW,WuX,GonzalezDeWhittPA,GelfanovaV,HaleJE,MayPC,
PaulSM,NiB(2003)NonsteroidalantiinflammatorydrugscanloweramyloidogenicAbeta42
byinhibitingRho.Science302:12151217.
ZhouYX,FlintNC,MurtieJC,LeTQ,ArmstrongRC(2006)Retrovirallineageanalysisof
fibroblastgrowthfactorreceptorsignalinginFGF2inhibitionofoligodendrocyteprogenitor
differentiation.Glia54:578590.

207

BIBLIOGRAFA

ZontaM,SebelinA,GobboS,FellinT,PozzanT,CarmignotoG(2003)Glutamatemediated
cytosoliccalciumoscillationsregulateapulsatileprostaglandinreleasefromculturedrat
astrocytes.JPhysiol553:407414.

208

Agraments

Aquesta tesi no hagus estat possible sense lajuda, els consells i el recolzament de moltes
persones. Tantes, com totes les persones que formen part del Departament de Bioqumica i
delsdiferentslaboratorispelsqueelmeugruphaanatpassant.
De ben segur que no imaginava, aquell dia de setembre fa quasi set anys sortint de lIBB
desprs de lentrevista amb la Elena, que tal nit com aquesta em trobaria valorant
lexperincia dhaver fet una tesi doctoral i adonantme de com he canviat tant a nivell
personalcomcientficidelmuntdecosesqueheaprs.Moltesdaquestscosesleshideca
lElena.Recordoqueaquelldiavamestarparlantsobreelsastrcits,unscllulesqueapenes
haviasentitnomenardurantlacarrera,queexpressavenfactorsdecreixementsnuclearsique
elsneurotransmissorserenantiinflamatoris...Esticcontent,passateldesconcertinicialperla
novetatquerepresentavapermitotall,dhavertriatferlatesiambtu.Den,eltempsha
passat i sn molts el aspectes, crec, en els que he millorat. Des de com planificar un
experiment,finsacomfuncionaunlaboratori.Aprendreaperseverar,inotenirpordanara
contracorrent. Grcies per permetrem conixer el mn de la neurocincia i per alimentar i
educarlamevacuriositatiinterscientfic.
TotvacomenarallaboratorideNeuroqumicadelIBBonvaigtenirlasortdeconixerala
Judit,companyadepenesialegriesduranttotalamevaestadaalaUAB.Detuheaprsque
elsreptespermoltsdursquesemblin,snsuperables.Emquedoambelteuenfocalegredela
vida i la teva personalitat inquieta. Estic content, que malgrat lpoca dura que ens va tocar
passaralprincipi,lescosesshaginarreglatpelsdos,per....aranotadormisiposataescriure
ja!! Agraments tamb per a la Paula i la Marian i records per a tota la gent maca que he
conegutalIBB.
Desprsdelprimeranydetesi,elgrupvacrixeramblarribadadelaGemaipocdesprs,vaig
aterrisar al laboratori dels Pepes, del departament de bioqumica de medicina. Un
departamentenormepledegentbenavingudaalqueemvanfacilitarlentradalaVidiilAna,
antiguescompanyesdecarrera,quejuntamblaMontse,hansiguttambcompanyesdetesi.
Ana,Vidi,nosabeucomushetrobatafaltarenaquestadarreraetapadelatesi,lespausesper
posarnosaldia,lacompanyiafinsaalteshoresdelanit,lestiradadorellesperfermesortir
dellaboratoriquanjanhihaviaprou,els`vaaaaaquesemprefuncionaven...Lesdues,enser
lesprimeres,mheuguiatenladuraexperinciadeserdoctorimheufetcostatsempreque
ho he necessitat. Daquesta primera etapa al departament agrair als Pepes la bona acollida
que em van donar al seu despatx i laboratori. Alfredo, Bruna, Nahuai, Rut quants records i
ancdotes!! Us dec gaireb tot el que he aprs sobre els westerns i les mltiples virgueries
possiblesperaprofitaralmximlesmembranes!Quanteshoresacultiusambvosaltres!
ElgrupvaseguircreixentamblarribadadelaPaulinailaSlviai,denou,ensvammudaralpis
dabaix, cosa que vam viure al principi de manera traumtica, per a la que ens vam anar

acostumant amb larribada de la mquina de gel, el destillador daigua i laire acondicionat.


Gema, Slvia, Paulina grcies per la sensaci de grup que vaig tenir treballant amb vosaltres.
Esperopoderseguircompartintambvosaltresaquestestrobadesquefemdetantentant.Al
nouvinguts: Luis, Ruben, Patricia, Roger, grcies per animar la ltima etapa de la meva tesi.
nimspelqueusqueda!
Unadelesnovetatsdeldescensalesmazmorresvanserelvens.Malgratlesparetsdepaper
(us recordo: se sent tot), els Sauras i la Tina han sigut els millors vens possibles i han creat
molt bon ambient del pis dabaix. Sergi, Judit quantes hores passades fora, comentant i
fumant, heu viscut molts moments en directe de la meva tesi i sempre mheu donat bons
consells.Elsa,Jorge,Arnaldo,Judit,Marta,Roco,Ester,Llusiunllargetc...sougenials,allon
treballi a partir dara vull tenir uns vens com vosaltres. Tamb grcies pel trfic illcit de
materialilassessoramentinformtic.
Mar i Cris. Sort en t lINc de poder comptar amb vosaltres. Els vostres consells sempre han
ajudatamillorarlamevafeina.Cris,grciespelsinfinitscultiusiperfertreballaralasalade
cultius fos sempre un plaer. Espero que aconsegueixis tot all que et proposis perqu tho
mereixes.Maremquedoamblatevatranquillitatilesganesqueposesentotallquefas.A
tutambetdesitjoqueacabislastesiaviat!
A tots els companys i excompanys de departament: Arantza, Mireia, Tatiana, Gerard, Santi,
Roger, David, Albert, Miki, Marta, Laura, Daniel, Anna, Victria, Naty, Eli, Noe, lex, Irene,
Guillem,Arnau,Susana,Elisabet,alsdesecretariaisegurqueemdeixoalgusagraeixohaver
fetlamevaestadaagradablealdepartament,facilitarmelescosesirecolzarme.
TothagusestatdiferentsinohagusformatpartdelaBandsambant,quantspoblesiciutats
hemvisitatjunts,quanteshorespassadesambeltambor.Elnostregroovehaestatlabanda
sonora daquesta tesi, i la vostra companyia ha estat de ben segur el millor antdot quan la
frustracinoemdeixavaavanar.Atotsunaabraadaieldesigdequeelquefemnosacabi
mai.
Atotelsmeusamics,Mart,Ferran,Maria,AnnaB.,Nria,AnnaP,Neus,Ricard,Roser,Vidi,
Ana,famesde10anysqueenconeixemisemprehiheuestat!Grciespertot,consells,bons
moments, nims. Espero poder seguir veient com ens fems grans junts. Jordi, malgrat la
distncia, sempre has estat molt present, quantes vegades mhe preguntat, que faria ell en
aquestasituaci?Nocanvis,iesperopodertenirteapropdenouaviat!
AenPacoperfermecostat,perentendreisuportarelsmeushorarisespecials.
A la meva mare i a tota la meva famlia per estar amb mi i convncerme de que tot el que
estava fent realment valia la pena i que les coses benfetessaconsegueixenambpacinciai
esfor.