Determinacin de protenas, carbohidratos y lpidos en semillas

de

ajonjol germinadas y sin germinar

Objetivo: encontrar la variacin de los compuestos de reserva de la semilla de ajonjol en su

germinacin para llegar a plntula y su relacin metablica.
Palabras clave: germinacin, lpidos, carbohidratos, protenas, ajonjol, ciclo del glioxilato.
Germinacin de las semillas de ajonjol
El ajonjol es una semilla con un alto contenido de aceite que va del 55 al 50% de su peso total. La semilla de
ajonjol requiere temperaturas altas y uniformes de entre 27 y 30C para germinar.

Es muy importante lavarse muy bien las manos antes de iniciar las manipulaciones para evitar
que las semillas se contaminen.

Pese tres lotes de semillas de ajonjol, cada uno de 0.5 g.

Cada lote de semillas se coloca en un frasco Gerber NO estril. Las semillas se desinfectan con 25
mL de una solucin de hipoclorito de sodio al 1% por 5 min., para facilitar el lavado el frasco se tapa con
una capa de gasa sujetada por una liga y las semillas se enjuagan perfectamente con agua estril,
hasta que el olor del cloro desaparezca.

Etiquete sus frascos Gerber estriles y humedezca el papel filtro del frasco con agua estril,
introduzca las semillas a cada frasco (con la ayuda de una esptula) cuidando que no queden por
debajo del papel filtro, agrgueles agua estril resbalndola por la pared del frasco, suficiente para
iniciar el proceso, pero sin dejar a las semillas totalmente cubiertas de agua para evitar que se
ahoguen.

Ponga a incubar sus frascos a 28 C, y revise sus semillas al siguiente da para verificar que tengan el
agua suficiente; si es necesario agrgueles ms agua. OJO NO confundan las raicillas con
contaminacin!

Las semillas se dejan incubar cuatro das. El da de la prctica pese tres lotes de semillas de ajonjol,
cada uno de 0.5 g.

DETERMINACIN DE PROTENAS

1. Los lotes de semillas sin germinar y germinadas se muelen en morteros fros, y se les agrega a cada uno 10 mL de
amortiguador de fosfatos pH 7.5, MgCl 3 mM para homogeneizarlos.

2. Los homogeneizados se centrifugan a 15 000 rpm durante 15 min.

3. Si es necesario, los sobrenadantes se filtran para que queden claros y se mantienen en fro mientras se utilizan.
4. Se toman 150 L y se colocan en un tubo de microfuga, se agregan 75 L de TCA 10%, esto se hace por
duplicado para cada lote. Se agita en un vrtex.

5. Los tubos se centrifugan a 10 000 rpm, por 5 min en una microfuga.

6.

El sobrenadante se descarta y el precipitado se resuspende en 3 mL de una solucin 1:1 de SDS 10% y NaOH
0.8 N.

7. Se lee a 280 nm contra un blanco de la solucin SDS/NaOH .

8. Para realizar los clculos de concentracin de protenas tome en cuenta los valores del y el PM de la albmina.

DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS

1. Los lotes de semillas sin germinar y germinadas se muelen en morteros fros, y se les agrega a cada uno 5 mL de
etanol al 75% fro, se filtran los homogeneizados en tubos de centrifuga, se agregan 5 mL mas de etanol a cada
mortero para lavarlos y aadirlo a los tubos.

2. Los homogeneizados se centrifugan a 15 000 rpm durante 15 min.

3. Si es necesario, los sobrenadantes se filtran para que queden claros y se mantienen en fro mientras se utilizan.
4. Preparar tubos con los reactivos que se indican en la tabla 1:
Tabla 1.
Tubos

Sol. patrn de glucosa (mL)

0.02
5

0.05

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

H2O destilada

0.97
5

0.95

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

Extracto enzimtico sin germinar diluido 1:20

10

11

12

0.9

0.9

0.9

0.9

1.0

0.1

Extracto enzimtico sin germinar diluido 1:50

0.1

Extracto enzimtico germinado diluido 1:20

0.1

Extracto enzimtico sin germinar diluido 1:50

0.1

Los tubos se agitan en el vrtex

Los siguientes pasos se realizan en la campana de extraccin!!!
Tubos

10

11

12

Fenol 5% (mL)

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

Los tubos se agitan con cuidado en el vrtex

Tubos

10

11

12

H2SO4

1.8

1.8

1.8

1.8

1.8

1.8

1.8

1.8

1.8

1.8

1.8

1.8

Agite con cuidado en el vrtex pues la reaccin es exotrmica y la temperatura puede aumentar hasta 110C.

Deje enfriar a temperatura ambiente no en hielo.

Lea los tubos a 485 nm en el espectrofotmetro.

El tubo 12 corresponde al blanco de reactivos.

DETERMINACIN DE LPIDOS

1. Se pesan dos vasos de precipitados de 50 mL y se marcan: lote sin germinar y lote germinado.
2. Los dos lotes de semillas se muelen en morteros fros y se homogeneizan con 10 mL de cloroformo-metanol fro,
evite que las semillas germinadas lleven agua squelas con papel.

3. Los homogeneizados se filtran con gasa en tubos de centrfuga de 50 mL.

4. Se centrifuga a 3 000 rpm durante 5 min.
5. Se colectan los sobrenadantes en otros tubos de centrifuga con ayuda de una pipeta pasteur.
6. Los precipitados se vuelven a homogeneizar con 5 mL de cloroformo-metanol cada uno y los sobrenadantes se
pasan a otros tubos de centrfuga.

7. Se centrifuga a 3000 rpm durante 5 min.

8. Si se observa que los sobrenadantes tienen agua, se agregan 10 mg de sulfato de sodio anhidro.
9. Los dos sobrenadantes de cada lote de semillas, se juntan en sus respectivos vasos con ayuda de una pipeta
pasteur.

10. Se eliminan los solventes mediante calentamiento en bao mara.

11. Los vasos se pesan.
12. Calcule la cantidad de lpidos presente en cada muestra por diferencia de pesos entre los vasos vacos y los vasos
con lpidos despus de eliminar los solventes (si us sulfato de sodio, descuente el peso de ste del peso final de
su vaso de precipitado).

RESULTADOS
Reporte para cada lote de semillas germinadas y sin germinar:
semillas sin germinar
mg
de
protena/mL
homogeneizado

de

mg de protena/g de semilla
g de carbohidrato/ mL de
homogeneizado
g de carbohidrato/ g de
semilla
mg de lpido/g de semilla

semillas germinadas (4
das)

Anlisis
Conclusiones
Apndice
Composicin Nutricional:
Los datos de la composicin nutricional se deben interpretar por 100 g de la porcin comestible.
COMPUESTO
Caloras
Agua
Protena
Grasa
Cenizas
Carbohidratos
Fibra
Calcio
Hierro
Fsforo
Vitamina C

CANTIDAD
570 Kcal
3g
17.81 g
48 g
8g
26.19 g
9.3 g
420 mg
2.51 mg
762 mg
0.0 mg

Fuente: http://www.nal.usda.gov/fnic/cgi-bin/nut_search.pl

La planta contiene entre 50% y 60% de aceites los cuales son de alta estabilidad, dada la presencia de
antioxidantes naturales como la sesamolina, sesamina y sesamol. La composicin de sus aceites vara segn
las variedades.