DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES

RESUMEN:
El presente trabajo se realiz con el propsito de obtener los parmetros cinticos
del cultivo de la levadura Kluyveromyces marxianus ATCC-16045 utilizando como
fuente de carbono y energa xilosa, con fuentes de nitrgeno y vitaminas a pH 6.086
a 6.793; a 30C y en un volumen de 210ml. Se utilizo el mtodo de determinacin
de la concentracin celular por densidad ptica (D.O.) y la determinacin de
azcares reductores se realiz por el mtodo de DNS (Bruner R., 1964), el cual se
basa en que el cido 3,5 Dinitrosaliclico en medio alcalino reacciona con el grupo
reductor de la xilosa. Se obtuvo un rendimiento promedio de: biomasa de 0,32 g/g
xilosa y concentracin celular 0.73 g/L al final de la fermentacin. A partir de la
biomasa obtenida se pudieron obtener los parmetros cinticos los cuales fueron un
max = 0,47 hr-1, un tiempo de duplicacin td=1,47 hr, lo cual se encuentra dentro de
los parmetros establecidos para las levaduras.
I. INTRODUCCION:
La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es una
etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Como ya se
explic, los componentes de los medios constituyen los efectores externos de
naturaleza qumica que desempean un rol esencial en los procesos ya que deben
cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formacin de productos y
adems suministrar energa para la sntesis de metabolitos y para el mantenimiento
celular.
No obstante que los microorganismos varan considerablemente respecto de los
nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distincin de las siguientes
categoras de componentes: a) Macronutrientes, agregados en cantida des de gramos
por litro que estn representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg; b)
Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca,
Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos
por litro; y c) Factores de crecimiento, que estn constitudos generalmente por
componentes orgnicos suministrados en baja concentracin y que no son

sintetizados ni metabolizados por las clulas, sino incorporados a estructuras

celulares y de funcin metablica especfica, como vitaminas, algunos aminocidos,
cidos grasos no saturados, etc..
Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza qumica de los
componentes, en 1) medios sintticos o medios qumicamente definidos, y 2)
medios complejos en cuya composicin intervienen sustancias de origen animal o
vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maz, harina de soja, etc.
que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas, pero que son
qumicamente indefinidas y de composicin variable.
En el estudio de los medios de cultivo es conveniente considerar en primer lugar el
diseo para tratar a continuacin la formulacin y optimizacin de los mismos.
Diseo
El diseo de un medio de fermentacin tiene como finalidad la eleccin de los
componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formacin de productos
correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe tener en cuenta
todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los
sustratos a ser empleados como son los requerimientos nutricionales del
microorganismo y algunos especficos del proceso, la disponibilidad real de los
componentes y consideraciones sobre las materias primas.
Requerimientos nutricionales
En el proceso respiratorio de las levaduras hay diferentes compuestos que pueden
ser utilizados como fuente de carbono tales como algunas pentosas (D-Xilosa, DRibosa); polisacridos (almidn); alcoholes de azcar; cidos orgnicos, como el
lctico, actico, ctrico; y algunos otros sustratos orgnicos.
Otro factor esencial est determinado por las condiciones del cultivo, si es aerobio o
anaerobio. El 02 es uno de los oxidantes ms comunes en el metabolismo energtico.
En la ausencia del 0 2, el S04 son utilizados como aceptores de electrones por algunas
bacterias. Las fuentes de carbono cumplen tambin el rol de ser fuente de energa.
Otro requerimiento nutricional est constituido por las fuentes de nitrgeno que
pueden ser de naturaleza inorgnica u orgnica. El nitrgeno es utilizado para la
biosntesis de protenas, cidos nucleicos y polmeros de la pared celular.

Para la sntesis de protena se requieren en general L-aminocidos, aunque tambin

son necesarios algunos aminocidos de la serie D como D-alanina y D-asprtico
para su incorporacin a la pared de las clulas. En algunos casos se requieren
tambin pptidos de histidina. Los requerimientos de otros macronutrientes como el
P y el S son suministrados en forma de K 2HP04 y S04 (o aminocidos azufrados). El
fsforo se incorpora en cidos nucleicos, y polmeros celulares. El S es asimilado
para la sntesis de aminocidos azufrados, y adems se necesita para la biotina,
coenzima A, tiamina y otros componentes. Los requerimientos de K y Mg son
tambin esenciales. Una parte importante del primero est unida al RNA de manera
que los requerimientos de K aumentan con los factores que influyen en el aumento
del RNA de las clulas, como la velo cidad de crecimiento. El in K actua como
coenzima y probablemente acta como catin en la estructura aninica de varios
componentes celulares. El in Mg es esencial para la estabilidad de los ribosomas y
actua como cofactor en numerosas reacciones del metabolismo. Tanto el K como el
Mg se incorporan a los medios en forma de sales como fosfato y sulfato. Los
requerimientos de factores de crecimiento comprenden ciertos aminocidos y
vitaminas del grupo B como tiamina, riboflavina, cido pantottico, niacina, etc.,
que representan para muchas bacterias y levaduras factores esenciales en los medios
sin los cuales no se produce crecimiento celular. La mayor parte de las vitaminas
son constituyentes de co-enzimas. Otros factores de crecimiento son las purinas,
poliaminas, putrescinas, cte..
El diseo correcto tiene que ver con las caractersticas bioqumicas propias y
evolucin de los parmetros de cada proceso. Por ejemplo, un proceso caracterizado
por un descenso continuo de pH, debido al uso de una sal de amonio como fuente de
nitrgeno, obliga a considerar en su diseo algn agregado que no corresponda a
una exigencia nutricional, como es el caso del control de pH del mismo. Este puede
efectuarse por agregados al medio de agentes "buffer" como mezclas de fosfatos o
de carbonato de calcio o como ms generalmente se hace, con agregados peridicos
de soluciones alcalinas que pueden efectuarse en forma ms conveniente mediante
un control automtico de pH. (S.J. Pirt. Blackwel 1975)
Para lo cual se planteo los siguientes objetivos:
1. Disear el medio de cultivo utilizando como fuente de carbono xilosa para el
crecimiento de la cepa Kluyveromyces marxianus ATCC-16045.

2. Determinacin de los parmetros cinticos de la cepa Kluyveromyces

marxianus ATCC-16045.
II. METODOLOGIA EXPERIMENTAL:
Para la formulacin del diseo de cultivo se tiene en cuenta los siguientes
requerimientos nutricionales para el cultivo de Kluyveromyces marxianus
ATCC-16045.

Para el Diseo del medio de cultivo.

Macronutrientes

pH

C, N, Mg, S, K y P
3.5

Estado: Medio lquido

Requerimientos nutricionales: Para ello utilizamos un Medio de
cultivo mnimo.
Fuente de carbono y energa

Xilosa

Fuente de N

cloruro de amonio

Fuente de Mg y S

sulfato de magnesio
heptahidratado

Fuente de K

fosfato dicido de
potasio

Fuente de P

fosfato dicido de
potasio

Preparacin de los materiales para el medio de cultivo

1. Lavar y secar todos los materiales de vidrio a utilizar.
2. Luego colocarlos en la estufa en posicin vertical los vasos precipitados,
matracez y tubos de ensayo.

3. Las pipetas a utilizar deber ser puestas en la estufa previamente recubierta de

papel aluminio.
4. Esterilizar a 121 C por 15 minutos.
5. Pesar la xilosa requerida y los dems fuentes de nutrientes.

6. En un matraz de 125ml diluir las sales con 80ml de agua destilada.

7. En un matraz de 125ml diluir la xilosa con 100 ml de agua destilada.
8. Colocar los matraces previamente recubierto con papel aluminio en el
autoclave.

9. Esterilizar a 121 C por 15 minutos.

10. En un matraz de 1 L agregar las 3 disoluciones antes hechas.
11. Elaborar la curva de calibracin para la determinacin de azucares
reductores por el mtodo del DNS.
Determinacin de la cintica de crecimiento de la biomasa.
Determinacin de los parmetros cinticos: uM.
1. Preparar 1 matraces con una concentracin determinada de xilosa.
Para ello diluimos y utilizamos la curva de calibracin para azucares
reductores, determinando as la concentracin en el matraz en toda la
fermentacion.
2. Inoculamos los matraces con un 1mL e incubamos,
3. Utilizando la curva de calibracin determinamos al cabo de tiempos
determinados la concentracin final de clulas.
4. Utilizando la ecuacin ln(X/ X0) = t, determinamos distintos valores
de .
5. Se halla el valor de m,.
dX / dt = m X .()
m = ln(X/ X0)/ t

Determinacin del contenido de azcares reductores mediante el mtodo del

DNS.
La preparacin del reactivo DNS se requiere de lo siguiente:
10 g /L de cido 3,5 dinitrosalicilico (DNS)
200 mL / L de NaOH 2N
300 g/L de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado
Para la preparacin de este reactivo, se disuelve el tartrato en
aproximadamente 500 600 mI de agua, paralelamente se disuelve el cido
DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 litro y se
agita hasta la completa disolucin de todos los componentes, para
posteriormente aforar hasta un litro.
Se precisa realizar los siguientes pasos para el anlisis de la muestra:

1. Se aade un volumen del reactivo DNS a un volumen de muestra a

analizar.

2. Se mantiene la mezcla en un bao de agua a ebullicin durante 5

minutos para luego dejar enfriar.
3. Se aaden 10 volmenes de agua destilada.

4. Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco.

5. La concentracin se obtiene interceptando la medida de absorbancia

en la curva de calibrado.
La curva de calibrado para el azcar se obtiene a partir de muestras de
concentracin conocida y analizadas segn este procedimiento.
Determinacin de la concentracin celular por densidad ptica.
El mtodo se basa en el aument de la turbidez del medio, al incrementarse la
concentracin de microorganismo s, esto puede ser detectado fcilmente por
espectrofotometra a 640 nm. Para sta determinacin es necesario que
previamente' se elabore una curva de calibrado, para lo cual las concentraciones
de microorganismos en el medio son determinadas por peso seco de acuerdo al
siguiente procedimiento:
1. Se toma una muestra de volumen conocido, y se centrifuga a 1200 rpm
durante 20 minutos.
2. Se elimina el sobrenadante y se resuspende el centrifugado con agua
destilada. 3.- Se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a fin de
eliminar restos de sustrato que pudieran alterar la determinacin.
3. Se elimina el sobrenadante, se redisueIve el precipitado y se seca en la
estufa a 80C hasta peso constante.

III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:

Material Biolgico:
Cepa liofilizada de Kluyveromyces marxianus ATCC-16045.
Medio de Cultivo:
Agar
Peptona
Extracto de Levadura
Agua destilada.
Xilosa
Reactivos:
K2HPO4
DNS (ACIDO DINITROSALICILICO)
NH4Cl
MgSO4.7H2O
KCl
Instrumentos:
Balanza analtica:

El espectrofotmetro

La autoclave

La centrifuga

El shaker

 La incubadora

Horno de esterilizacion (la estufa)

Agitador.

Asa bacteriolgica.
Mechero bunsen.
Tubos de ensayo con tapa para medio de cultivo.
Fiola 100ml.
Papel para hacer los capachos de muestra.
Esptula.
Micro pipeta.
Botellas bacas de nctares.
Matraz de 200ml.
Picetas.
IV.

RESULTADOS Y DISCUSIN:
4.1 Caracterizacin Del medio de fermentacin
Los resultados obtenidos para el diseo de la composicin del medio de
fermentacin se presentan en la sgte tabla
Para un medio de fermentacin de 210ml para una produccin de 1.9g/l

Nutriente

Fuente

C5H10O5
Extracto de
levadura

C
(aminocidos)

% de
% de
elemento elemento
en
en
Levadura nutriente
50.00
40.00
----

----

Y X S g
g

S g
l

S g

0.48

3.97

0.834

------

1.00

0.21

K2HPO4
NH4Cl
MgSO4.7H2O
MgSO4.7H2O
KCl

P
N
S
Mg
K

0.25
9.00
0.25
0.5
4.00

17.816
26.17
13.01
9.756
52.35

71.26
2.91
52.04
19.51
13.09

0.26
0.98
0.14
0.14
0.22

0.054
0.206
0.030
0.030
0.046

4.2 Cintica de Crecimiento por Lotes de Cultivo de Kluyveromyces

Marxianus ATCC 16045.
La presencia de una concentracin elevada de extracto de levadura y la
inclusin de factores (temperatura y agitacin) de crecimiento en el medio de
cultivo favoreci el crecimiento de Kluyveromyces marxianus ATCC 16045.
Probablemente el incremento del crecimiento fue por la inclusin de estos
factores fue debido a que la xilosa es un monosacrido y es fcil para la
levadura aprovechar la fuente de carbono que esta molcula pose, lo cual
favorece a la produccin de etanol como producto de la fermentacin..
En el medio de cultivo el extracto de levadura tuvo un efecto estimulante
sobre el crecimiento porque hubo una mayor actividad fermentativa (por Ej.
mejor degradacin de azcares) as tambin reportaron Kurman (1988),
citado por Gomes et al. (1998) y Leveau et al. (2000). Segn ste
compilador, las vitaminas necesarias estn presentes en la leche en
concentraciones generalmente suficiente, pero la adicin de extracto de
levadura rico en vitamina mejora el crecimiento de las levaduras.
El medio de cultivo debe aportar todos los elementos necesarios para las
sntesis celulares y para cubrir las necesidades energticas de las levaduras.
Se han propuesto varias formulas brutas de la biomasa de las levaduras. Es
el compuesto mayoritario de la clula de levadura: alrededor del 50% del
peso seco.
Los compuestos carbonados son utilizados por las levaduras a la vez como
fuente de energa y como fuente de carbono.

Segn las levaduras, la

capacidad de utilizar ciertos compuestos carbonados varia: algunas levaduras

pueden utilizar una amplia gama de compuestos pero otros asimilan
solamente un numero pequeo de ellos. Pero varias especies pueden utilizar

el metanol y han sido cultivadas como fuente de protena los principales

gneros involucrados son; cndida, Hansenula, Pichica y Torulopsis.
VEENHUIS y col, (1983) han realizado una revisin del metabolismo del
metanol por las levaduras.
El nitrgeno es cuantitativamente el segundo constituyente aportado por el
medio de cultivo. Es utilizado por las clulas en los aminocidos, los
nucletidos y algunas vitaminas.
de nitrgeno.

Pueden ser utilizadas numerosas fuentes

Todas las levaduras son capaces de utilizar el nitrgeno en

forme de ion amonio. Los iones amonio pueden ser aportados en el medio
por el cloruro amoniaco, el nitrato amnico, el fosfato amnico y sobre todo
el sulfato amnico, mejor compuesto pues aporta al mismo tiempo el azufre
necesario para la sntesis de ciertos aminocidos. Algunas levaduras son
capaces de utilizar los nitritos y los nitratos, en particular las de los gneros
Hansenula, Pachysolen, Citeromyces y ciertas especies de Cndida y de
Trichosporon. Esta capacidad se utiliza en taxonoma (KREGER VAN RIJ,
1984).
En los medios de cultivo, los nitritos forman a pH inferior a 6 acido nitroso
que es toxico para las clulas. La mayor parte de los aminocidos pueden
ser utilizados como fuente de nitrgeno. Sin embargo, segn los
aminocidos, la tasa de crecimiento de la levadura vara.

Las mezclas de

aminocidos permiten un mejor crecimiento que un solo aminocido. Si

estn disponibles simultneamente varias fuentes de nitrgeno estas no van
hacer utilizadas a la misma velocidad sino que la levadura va a consumir
preferencialmente la mejor. (COOPER 1982) define una buena fuente de
nitrgeno por tres criterios: penetracin rpida, conversin rpida en la
clula con el mnimo de tapas en amoniaco o acido glutamico o en los dos y
sin efecto secundario toxico.
El fsforo se halla incluido en los cidos nucledos y los nucletidos di y tri
fosfato. Se encuentra tambin en forma de polmeros lineales de polifosfato
que juegan un papel importante en la regulacin del metabolismo celular.
(KULAEV y VAGABOV 1983).

La concentracin en iones fosfatos ( PO43 ) regula la sntesis de los lpidos

y los glcidos. El fosforo es asimilado por la clula en forma de iones
ortofosfato ( H 2 PO4 ) las fuentes de fosforo en el medio de cultivo deben
estar constituidas por el dihidrogenofosfato de potasio ( KH 2 PO4 ) o por el
hidrogenofosfato disdico ( Na 2 HPO4 ). En condicin limitante de fosforo
en el medio, la clula sintetiza una fosfatasa acida (fosfomonoesteresa),
localizada en la pared que libera fosforo a partir de los esteres fosfricos
(SCHURR y YAGIL, 1971).
EL 60% del azufre esta incorporado en las protenas. El 5% esta en forma de
sulfato inorgnico libre el resto esta en forma de enlace disulfuro y en
aminocidos sulfurados libres. El azufre esta igualmente presente en algunas
vitaminas. La fuente de azufre mas frecuentemente utilizada en los medios
de cultivo es el sulfato amnico. (PARRY y col, 1976).
El potasio es el elemento mineral cualitativamente ms importante en la
levadura. Tiene papeles fisiolgicos importantes:
Catin regulador: por cada penetracin de un catin metlico divalente,
hay excrecin de 2K+ (FUHRMANN y ROTHSTEIN, 1968).
A PH acido, el potasio estimula la fermentacin y la respiracin (PENA,
1980).
Acta como efector de numerosas enzimas: piruvato quinasa, aldolasa,
aldehdo deshidrogenasa y permeasa (ATPasa) (MAIORELLA Y col.
1984).
Interviene en la estructura de los ARN.

El magnesio es necesario para el buen funcionamiento de un centenar de

enzimas del metabolismo; juega el papel:

De activador de las enzimas glicoliticas.

De estimador de la sntesis de los cidos grasos.
De regulador de las ATPasas de las membranas.
Participa con el potasio en la penetracin del fosfato.

El magnesio esta igualmente implicado en la estructura de los ribosomas, de

las membranas celulares y de los cidos nucleicos.

Una carencia de

magnesio en la fermentacin alcohlica conlleva una produccin de acido

actico. El magnesio es aportado en los medios de cultivo en forma de
sulfato o de cloruro de magnesio. La adicin de manganeso permite un
aumento del nivel de nitrgeno, de la sntesis de las protenas y del
rendimiento celular (WALTON y PRINGLE 1980).
La temperatura corriente de cultivo de las levaduras se sita entre 25 y 30C
que permite efectivamente el crecimiento de la mayor parte de las levaduras.
Sin embargo estas temperaturas no son reguladas a las temperaturas ptimas
de crecimiento que las levaduras que se encuentran en su hbitat natural.
Siendo la membrana citoplasmtica de las clulas cultivadas a temperatura
elevada mas resistente a las desnaturalizaciones trmicas que la de las
clulas cultivadas a baja temperatura. (WALTON y PRINGLE 1980).
De acuerdo la composicin del medio de cultivo se observa que el
crecimiento de la Kluyveromyces Marxianus ATCC-16045 es ptimo lo cual
demuestra que el medio es propicio para el desarrollo del cultivo y cumple
con los requerimientos mnimos que necesita las clulas para crecer.
En la tabla 01 se muestra los valores experimentales del crecimiento en
funcin al tiempo de fermentacin y en la Fig. 01

se observ que el

crecimiento celular se observo que el extracto de levadura como fuente de

aminocidos, favoreci a que no exista una fase de latencia tan prolongada y
as obtener una curva de crecimiento mas notoria y pronunciada;
originndose una fase exponencial de crecimiento ocurri durante las
primeras 2 a 4.5 h. siguientes a la inoculacin. El retrazo observado
probablemente fue por el tiempo necesario requerido por la levadura para
adecuarse al nuevo medio de fermentacin.

Tabla 01: Cintica de crecimiento en el tiempo de fermentacin.

Concentracin
Tiempo (h)

Abs.

clulas (g/l); X

Ln(X)

0,121

0,15

1,83258146

0,129

0,17

1,77195684

0,147

0,19

1,66073121

0,346

0,46

0,77652879

3,5

0,371

0,5

0,69314718

0,424

0,57

0,56211892

4,5

0,454

0,61

0,49429632

0,46

0,62

-0,4780358

6,5

0,508

0,68

0,38566248

0,528

0,71

0,34249031

0,73

0,31471074

9,5

0,538

Fig.1: Curva de crecimiento de la Kluyveromyces Marxianus utilizando

como fuente de energa a la xilosa

En la tabla 02 y fig. 02 se observa que la cintica de consumo de la xilosa se

encuentra en funcin a la velocidad de crecimiento de la Kluyveromyces
Marxianus ATCC-16045, probablemente debido a que la fuente de carbono
es destinado a la formacin de productos y a la manutencin de las clulas
por esta razn el crecimiento se ve afectado y solo se observa un crecimiento
mximo de 0,73 g/l a pesar de que el medio de cultivo fue diseado para 1,9
g/l; para esto el valor reportado de rendimiento de sustrato en clulas Y x/s
= 0,48 g/g y en la experiencia solo se obtuvo un rendimiento de sustrato en
clulas de Y x/s = 0,32 g/g lo cual favorece el crecimiento de las clulas.

Tabla 02: Cintica de consumo de xilosa en funcin al crecimiento de la

Kluyveromyces Marxianus ATCC-16045 en el tiempo de
fermentacin.

Tiempo (h)Xilosa (g/l)Biomasa (g/l)

0

3,15

0,15

3,05

0,17

2,9

0,19

2,65

0,46

3,5

2,55

0,5

2,33

0,57

4,5

2,25

0,61

2,22

0,62

6,5

2,18

0,68

1,86

0,71

9,5

Fig.2:

1,39

0,73

Curva de crecimiento de la Kluyveromyces Marxianus y

consumo de la xilosa en el tiempo de fermentacin.

El pH inicial de la experiencia fue calibrada a 3,5 en la solucin de sales

pero al adicionar el extracto de levadura al medio de fermentacin sin haber
regulado el pH antes este hizo que vari de un pH de 3,5 a 6,086 en el medio
en lo cual se inicio la fermentacin.
El efecto de variacin del pH en la fermentacin influye en el crecimiento lo
cual demuestra que el pH en donde aumento y se prolongo por 2,5 hr fue
para un rango de 6,186 hasta 6,564, formndose para valores mayores de pH

la fase latencia y posteriormente un crecimiento lento lo cual se pudo

apreciar en la cintica realizada. Las levaduras crecen bien en medios con el
pH ajustado entre 3.5 y 3.8, el grado de tolerancia a los acidos varia segn la
cepa y la especie, desde pH 2.2 a 8.0. (Pelczar J. Michael, 1982)

Tabla 03: Variacin de pH en el tiempo.

TIEMPO

PH

6,086

6,104

6,186

6,260

3,5

6,460

6,564

4,5

6,643

6,724

6,5

6,753

6,767

9,5

6,793

Fig.3: Variacin de pH en el tiempo.

Fig.4: Curva de crecimiento de la Kluyveromyces Marxianus y efecto del

pH en la biomasa.

Esta experiencia realizada con la Kluyveromyces Marxianus ATCC-16045 y

utilizando como fuente de carbono a la xilosa y un medio definido de
nutrientes dio como resultado los siguientes parmetros cineticos obtenidos
experimentalmente en laboratorio, los cuales se presentan en la tabla 04.

Tabla 04: Parmetros cinticos determinados en la experiencia realizada de la

Kluyveromyces Marxianus ATCC-16045 utilizando xilosa como
fuente de carbono.

V.

Parmetro cintico

Valor obtenido experimentalmente

m (h-1)

0,47

td (h)

1,47

Yx/s (g/g)

0,32

Xmax (g/l)

0,73

CONCLUSIONES:
1. De acuerdo la composicin del medio de cultivo se observa que el
crecimiento de la Kluyveromyces Marxianus ATCC-16045 es ptimo lo cual
establece que la relacin entre el medio de cultivo y la levadura es propicio
para el desarrollo del cultivo y cumple con los requerimientos mnimos de
nutrientes que necesitan las clulas para su crecimiento.
2. Se obtuvo las siguientes parmetros cinticos en la fermentacin con xilosa
con 3,97 g/l como fuente de carbono; como fuente de aminocidos el
extracto de levadura con 0,1 g/l; como fiuente de nitrogeno el cloruro de
amonio con 0,98 g/l; como fuente de fosforo y potasio el fosfato dicido de
potasio con 0,26 g/l; como fuente de magnesio y azufre el sulfato de
magnesio heptahidratado con 0,14 g/l y como fuente de potasio el cloruro de
potasio con 0,22 g/l ; para un volumen de 210ml para este medio se obtuvo
un max = 0,47 hr-1, un tiempo de duplicacin td=1,47 hr, se obtuvo un
rendimiento de sustrato en clulas de 0,32 g de celulas/g de xilosa, se logro

desarrollo de la Kluyveromyces marxianus ATCC 16045 hasta una

concentracin de 0,73 g/l.
3. El efecto de variacin del pH de 6.086 a 6.793 en la fermentacin influye en
el crecimiento lo cual afecto solo en la formacin de productos y en la
utilizacin de la xilosa para su manutencin de la clula.
4. Se demuestra que la velocidad de crecimiento esta en funcin al nutriente
utilizado y las variables que mas afectan a este crecimiento es la
concentracin de extracto de levadura y xilosa, la temperatura, el pH y la
velocidad de agitacin (rpm).

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFIA

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Microbiologia, Pelczar J. M.; Reid D. R. y Chan E.C.S. 2da Edicin, 1982.
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(2000).

Microbiologa

Industrial.

Los

Microorganismos de Inters Industrial. Editorial Acribia S. A. Zaragoza.

Gomes, A. M. P. y Malcata, F. X. (1999). Agentes probiticos em alimentos:
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Spring Harbor

ANEXOS:
ANEXO 01:
DISEO DEL MEDIO DE ACTIVACIN Y DE FERMENTACIN:
Para el diseo del medio de cultivo se baso en la composicin qumica promedio de las
levaduras en base seca:
Tabla A1.1: Composicin qumica promedia de levaduras
Elemento % en peso, base seca
Carbono
50.00
Hidrogeno
12.00
Oxigeno
24.00
Nitrgeno
9.00
Magnesio
0.50
Fsforo
0.25
Azufre
0.25

Calcio
Potasio
Hierro
Otros

0.30
4.00
0.50
0.01

PARA LA XILOSA: %C nutriente = 40%; %C. en biomasa= 50%

Fuente de carbono y energa: xilosa (C5 H10 O5), M= 150 g

Y XC

X %C.ennutriente

0.6
S %C.enbiomasa

Y XC

40%
0.6 0.48 g
g
50%

Si:

X 2 g

X Y X S S

S f S Y X C X
2g
X
l
S C
Y X C 0.48 g
S C 4.17 g

Si: S f 0

PARA K2HPO4:

Y X P

X % P.ennutriente

S % P.enbiomasa

% P.ennutriente

Y X P

31 100
17.816%
31 39 2 1 16 4

17.816%
71.264 g
0.25%
g

2g
X
l
S p
0.028 g 1.5 0.042 g
Y X p 71.264 g
l
l

S p 0.042 g

Y X K

% K .ennutriente
% K .enbiomasa
39 2
100 44.83%
174

% K .ennutriente

44.83 g

11.21g

2g
X
l
S K
Y X K 11.21g

Y X K 11.21g
g

S K 0.1784 g 1.5
l

S K 0.2676 g

PARA NH4Cl:

Y X N

% N .ennutriente
% N .enbiomasa

% N .ennutriente

Y X N

14
100 26.17%
53.5

26.17%
2.91g
9%
g

2g
X
l
S N
Y X N 2.91g

S N 0.6873g 1.5
l

S N 1.031g

PARA MgSO4.7H2O:

Y X S

% S .ennutriente
% S .enbiomasa

% S .ennutriente

Y X S

32
100 13.01%
246

13.01
52.04 g
0.25
g

2g
X
l
S S
Y X S 52.04 g

S S 0.0384 g 1.5
l

S S 0.0576 g

Y X Mg

% Mg.ennutriente
% Mg.enbiomasa

% Mg.ennutriente

Y X Mg

S Mg

24
100 9.756%
246

9.756
19.51g
0.5
g

2g
X
l

X
Y Mg 19.51g

S Mg 0.1025 g 1.5
l

S Mg 0.1538 g

PARA KCl:

Y X K

% K .ennutriente
% K .enbiomasa

% K .ennutriente

Y X K

39
100 52.35%
74.5

52.35%
13.09 g
4%
g

Y X K 13.09 g

2g
X
l
S K
Y X K 13.09 g

S K 0.1528 g 1.5
l

S K 0.2292 g

Tabla A1.2: Para un medio de fermentacin de 210ml para una produccin de

1.9g/l

Nutriente

Fuente

C
C5H10O5
Extracto de
C, N,
levadura
(aminocidos)
K2HPO4
P
NH4Cl
N
MgSO4.7H2O
S
MgSO4.7H2O
Mg
KCl
K

% de
% de
elemento elemento
en
en
Levadura nutriente
50.00
40.00

Y X S g
g

S g
l

S g

0.48

3.97

0.834

----

----

----

1.00

0.21

0.25
9.00
0.25
0.5
4.00

17.816
26.17
13.01
9.756
52.35

71.26
2.91
52.04
19.51
13.09

0.26
0.98
0.14
0.14
0.22

0.054
0.206
0.030
0.030
0.046

ANEXO 02:
DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN CELULAR POR
DENSIDAD PTICA (D.O.)
Fundamento
El mtodo se basa en el aumento de la turbidez del medio al incrementar la
concentracin de microorganismos, lo que puede ser detectado fcilmente por un
espectrofotmetro a una densidad ptica de 640 nm. Para esta determinacin fue
necesario previamente confeccionar una curva de calibrado, lo cual, la concentracin
celular en el medio (Fig. A1) fue determinado por peso seco.
Procedimiento para obtener el peso seco
1 Se tom una muestra de 5 mL de medio y se centrifug a 1200 rpm. durante 20
min..
2 Se elimin el sobrenadante y se resuspendi los pellets en agua destilada.

Se volvi a centrifugar en las mismas condiciones a fin de eliminar restos de

sustratos que pudieron alterar la determinacin.

Se elimin el sobrenadante, se redisolvi los pellets y se sec en la estufa a 80

C hasta peso constante.

El mismo procedimiento se hizo con un medio estril para corregir el peso

seco obtenido con respecto al peso de los slidos

Preparacin de la curva de calibrado

Para construir la curva de calibrado se determin la densidad ptica de cada
dilucin de concentracin conocida. En los resultados presentados a continuacin,
Tabla; A2.1; se determin su promedio y se grafic D.O. vs materia celular seca (g.L -1),
los cuales fueron sometidos a regresin lineal mostrndose en las Figs. A2.1, para
Kluyveromyces Marxianus ATCC-16045.

Tabla A2.1. Datos experimentales para obtener la curva calibrado del crecimiento
de Kluyveromyces Marxianus ATCC-16045
Materia Seca (M.S.) Densidad ptica
g.L-1

(640 nm)

0,92

0,672

0,36

0,297

0,18

0,16

0,14

0,067

Donde: y = 0.00316 + 0.73764x

R2 = 0.9893

y: Densidad ptica (640 nm)

x : Materia Seca gL-1

Figura. A2.1. Curva de calibrado de la materia seca celular de Kluyveromyces

Marxianus ATCC-16045
ANEXO 03:
DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES
Fundamento
La determinacin de azcares reductores se realiz por el mtodo de DNS, el cual
se basa en que el cido 3,5 Dinitrosaliclico en medio alcalino reacciona con el grupo
reductor de la xilosa, formando un compuesto de color anaranjado oscuro cuya
intensidad es proporcional a la cantidad de azcares reductores.
Preparacin del Reactivo DNS
La preparacin del reactivo DNS requiri de lo siguiente:
10 g.L-1 de cido 3,5 Dinitrosaliclico (DNS).
200 mL/L de NaOH 2 N.
300 g.L-1 de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado
Para la preparacin se disolvi el tartrato en aproximadamente 500 o 600 mL. de
agua, paralelamente se disolvi el DNS en NaOH. Ambas soluciones se mezclaron en
un matraz aforado de 1 L. y se agit

hasta la completa disolucin de todos los

componentes para posteriormente aforar hasta 1 L.

Procedimiento
Se mezcl 1 volumen de reactivo DNS con 1 volumen de muestra a analizar y 1
volumen de agua, para obtener una mejor lectura de la concentracin de la xilosa, luego
se mantuvo la mezcla en un bao de agua en ebullicin durante 5 min. para despus
dejar enfriar en bao de hielo durante tres min.. Posteriormente se aadi 10 volmenes
de agua destilada, se agit y se dej enfriar durante 10 min. para luego leer la
absorbancia a 540 nm., utilizando agua y reactivo DNS como blanco.
Preparacin de la curva de Calibrado de Xilosa
Para construir la curva de calibrado se determin la absorbancia de cada solucin
de concentracin conocida de acuerdo al tratamiento descrito anteriormente. En los
resultados presentados a continuacin, tabla A3.1,

se grafic Absorbancia vs

concentracin (g.L-1), los cuales fueron sometidos a regresin lineal mostrndose en la

Fig. A3.1 para xilosa.
Tabla A3.1. Datos experimentales para obtener la curva de calibrado de xilosa

Concentracin xilosa g.l-1 Absorbancia 540 nm

Donde:

0,502

1,6

0,421

1,2

0,341

0,317

0,8

0,294

0,4

0,217

0,2

0,181

y = 0,09225 + 0.21318x

y: Absorbancia 540 nm

R2 = 0,91722491

x : Concentracin Xilosa g.L-1

Figura. A3.1. Curva de calibrado de Xilosa, utilizando el reactivo DNS