UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE FARMACIA

DEGRADACION ENZIMATICA DE LA BIOMASA DE

Onopordum nervosum Bois

Memoria presentada para optar al

Grado de Doctor por Mara Jas Negro
Alvarez

Directora: Dra.Carmen Martin Moreno

Ponente:Dr Angel Jimenez Solves
MADRID. 1991

A mis padres

Este trabajo de investigacin se ha desarrollado en la Divisin dc Biomasa del Instituto de

Energas Renovables del Centro de Investigaciones Energticas Medioambientales y
Tecnolgicas (tDIEMATL con la ayuda de una Seca del Instituto de Estudios de la
Energa.
Quiero expresar mi agradecimiento:
A la Dra Carmen Marda Moreno, directora de este trabajo, por su constante inters
y apoyo prestado, y por sus orientaciones en la realizacin y redaccin de esta memoria.
A a Dra. Rosa Mara Sez Angula, por haber contribuido a mi formacin, no slo
cientfica sino humana, y que habiendo iniciado la direccin de este trabajo, por razones
profesionales no pudo terminarlo.
Al Dr. Angel Jnnez So/ves (Departamento de Rioqumica de la Facultad de
Farmacia) por su amabilidad al aceptar actuar canto pon e,ue en esta Tesis, por la lectura
y acertados comentarios del texto as como por el excelente trato que me ha dispensado.
A) Dr. Jess Fernndez Gonzlez (Departamento de Botnica Agrcola, Escuela
Superior de Ingenieros Agrnomos) por el suministro del material vegetal con que se ita
realizado este trabajo, y por sus orientaciones al comienzo del mismo.
Al Dr. Gonzlo Alntendros (Instituto de Ciencias Medioanbientales,
ayuda en. el tratamiento estadstico de los resultados.

CSIC/

por su

A mis compaeros de la Divisin de Biomasa del IER por su entrega y amistad,

especial,n ente a Jos Maria Martnez y Felicia Sez par su colaboracin en determinados
experimentos.
finalmente quiero dar las gracias a todas aquellas personas que sitj su desinteresada ayuda, este trabajo no hubiese sido posible.

ABREVIATURAS EMPLEADAS
Alt

Azcares Reductores

ATCC

American Type Culture Collection

CBU

Celobiohidrolasa

CC

Conversin de celulosa en glucosa

Ccl.

Celobiosa

CMC

Carboximetilcelulosa

Cv

Coeficiente de variacin

DNS

Ando 3,5-dinitrosaliciiico

DOE

Oepartrnent of Energy

OP

Grado de polimerizacin

Concentracin de enzima

LO

Endoglueanasa

E/S

Relacin enzima-sustrato

ES

Eficacia o eficiencia de sacarificacin

001!

Gluchidrolasa

Glu

Glucosa

IIEC

Hidroxietilcelulosa

MALi

Metilarilter

pNPG

4-nitrofenolglucopiransido

PF

Papel de filtro

SCF

Single Ccli Proteins, protena de organismos unicelulares

Recup.

Recuperacin

SERI

Solar Energy Research Instituto

Srs

Sacarificacin y fermentacin simultnea

SIL

Relacin slido-lquido

01

Unidades Internacionales

Vm

Valor medio

INDICE

Pgina
1. INTRODIJUCION
1.1. MATERIALES LIGNOCELULSIGOS

1.1.1. Fuentes de materiales lignocelulsieos

1,1.2. Composicin y estructura de los materiales lignocelulsicos

1.1.2.1. Estructura de la celulosa, hemicelulosa y lignina

lii .2.2. Organizacin de la pared celular

14

I.2.PROCESOS
DE TRANSFORMACIN
LIGNOCELULOSICOS
I.3.TRANSFORMACIN DE MATERIALES
HIDRLISIS ENZIMTICA

DE

LOS

MATERIALES

18
LIGNOCELULSICOS

PQR
22

1.3.1. Produccin de celufasas

23

1.3.1.1, Caractersticas del complejo celuloltico

23

1,3.11.1. Composicin

23

1.3.1.1.2, Modo de accindecelulasas

26

1.3.1-13. Sinergismo entre los componentes del complejo enzimtico

27

1.3.1 .1.4, Modelos cinticos

29

1.3.1.2. Microorganismos productores de celulasas

30

1.3.1.2,1. Hongos celuloliticos

Al

1.3.1.2,2. Bacterias

31

1.3.1.2.3. Mutantes

33

1.3.1.3. Inductores y sustratos

36

1.3.2. Pretratamientos de los materiales lignocelulsieos

38

1.3.2.1. Pretratamientos fisicos

40

1.3.2.2. Pretratamentos qumicos

4!

1.3.2.3. Pretratamientos biolgicos

42

1.3.3. Procesos de hidrlisis enzimtica

42

1.3.3.1. Recuperacin e inmovilizacin de enzimas

43

1.3,3.2. Separacin de productos de hidrlisis

44

1.3.3.3. recesos dc sacarificacin y fermentacin simultnea y acoplada

1.3.3.4. Utilizacin de cocultivos

45
48

Pgina
2. OBJETO E INTERES DEL TEMA

50

3. MATERIAL Y METODOS

51

3.!. PRODUCCION DE CELULASAS

51

3.1.1. Cepas productoras de celulasas

51

3.1.2. Cepa productora

3.1.3. Medios necesarios para el mantenimiento, caracterizacin, crecimiento

y produccin

51

3.1.3.1. Mediosslidosdecrecimiento

51

3.1.3.2, Medios lquidos para la preparacin del inculo y para la produccin en

fermentador

52

3.1.3.3. Preparacin del inculo

52

3.1.4. Condiciones fisico-quimicas necesarias para [apuestaen marcha de [a

52

produccin en fermentador
3.2. ESTUDIO DEL COMPLEJO CELIJLOLITICO

52

3.2.1. Precipitacin y concentracin del complejo enzimtico

52

3.2.2. Medida de la actividad enzmtica

53

3.2.2.1. Determinacin de la actividad sobre papel de filtro

53

3.2.2.2. Determinacin de la actividad sobre CMC

56

3.2.2.3, Determinacin de la actividad J3-glucosidasa

58

3.2.3. Determinacin de protenas solubles

3.3.CARACTERIZACION DE LA MATERIA PRIMA Y DE LOS PRODUCTOS

DE HIDROLISIS

59

59

3.3.1. Materia prima

59

3.3.2. Caracterizacin de la materia prima

3.3.2.1. l)eterminaein de la humedad

61

3.3.2.2. Determinacin de la solubilidad en NaOH 1%

61

3.3.2.3. Determinacin de la solubilidad en agua (fra y caliente)

61

3.3.2.4. Extracto en ter

61

3.3.2,5. Extracto en alcohol-benceno

SI

3.3.2.0. Anlisis de componentes hidrlisis total con acido sulfrico

61

3.3.2.6.1. Determinacin de lignina (lignina Klason)

62

:i 3 27 1 )eteun nacin de ccii izas

(33

3.2.3.3. 1 )e te ~i i

63

1de

3.4. 1>1< El RATAM 1 ENFOS

uit rge no total

63

Pgina
3.4.1. Molienda

63

3.4.2. Pretratamientos alcalinos

64

3.4.2.1. Pretratamiento con hidrxido sdico

64

3.4.2.2. Pretratamiento con hidrxido clcico

64

3.4.3. Pretratamiento oxidante

64

3.4.3.1. Pretratamiento con perxido de hidrgeno

64

3.4.3.2. Pretratamiento con hipoclorito sdico

64

3.4.4. Pretratamientos cidos

64

3.4.4.1. Pretratamiento con cido cLorhdrico

64

3.4.4.2, Pretratainiento con cido sulfrico

65

3.4.4.3. Pretratamiento con cido actico

65

3.4.5. Pretratamiento con solventes orgnicos

65

3.4.6. l>retratamiento de irradiacin

66

3.4.7. lretratamiento de explosin por vapor

67

3.4.8. Pretratamiento biolgico

69

3.5. HIDROLISIS ENZIMATICA DE BIOMASA LIGNOCELULOSICA

70

3.5.1. Ensayos de hidrlisis enzimtica de la biomasa pretratada

70

4. RESULTADOS Y DSCUSION

71

4.1. Produccin y caracterizacin de celulasas

71

4.1.1. Estudios de produccin enzimtica

71

4.1.2. Caracterizacin del complejo enzimtico

79

4.1.2.1, Influencia del pu y la temperatura

79

4.1,2.2. Influencia de la concentracin de sustrato y de enzima

83

4. [.2.3. Estabilidad del complejo enzirntico

92

4.1.2.4. Estudios de inhibicin por glucosa, celobiosa y etanol.

93

4.1.2.5. Estudios cinticos de la f3-glucosidasa del complejo enzimtico

lOO

4.2.1> retratamientos de la biomasa lignocelulsica de Q.riervosum

4.2.!. Composicin de la materia prima

104
107

Pgina
4.2.2. Pretratamientos

ensayados

107

4.2.2.1. Molienda

107

4.2.2.2. Pretratamientos alcalinos

107

4.2.2.2.1. Pretratamiento alcalino con hidrxido sdico

110

4.2.2.2.2. Pretratamiento alcalino con hidrxido clcico

123

4.2.2.3. Pretratamientos oxidantes

125

4.2.2.3.1. Pretratamiento con perxido de hidrgeno

125

4.2.2.3.2. Pretratamientocon hipoclorito sdico

128

4.2.2.4. Pretratamientos cidos

133

4.2.2.4.1. Pretratamiento con cido clorhdrico

134

4.2.2.4.2, Pretratamiento con cido sulfrico

134

4.2.2.4.3. Pretratamiento con cido actico

134

4.2.2.5. Pretratamiento con radiacin gamma

141

4.2.2.6. Pretratamientos con solventes orgnicos

156

4.2.2.6. Pro tratamiento con etanol y butano! como organosolventes

157

4.2 2.6.2. Pretratamientocon n-butilamina

163

4.2.2W Pretratamiento de explosin por vapor

173

4.2,2.7.1. Pretratarniento de explosin por vapor en medio cido

182

4.2.2.8. retratamiento biolgico

188

4.2.2.9. Estudio comparativo de la eficacia de los distintos pretratamientos

206

4.3. Seguimiento del proceso de hidrlisis del O.nervosum pretratado

212

5. CONCLUSIONES

216

6. BIBLIOGHA FA

219

ANEXO 1 Medios de cultivo y reactivos

233

ANEXO 11 Descripcin de la planta piloto de pretratamiento

237

ANEXO III. justificacin estadstica

239

ANEXO 1V
ndice de figuras
ndice (It tzibltts

285
289

1. INTRODUCCION

1. INTRODUCCION.
1.1. MATERIALES LIGNOCELULOSICOS.
1.1.1.

Fuentes de materiales lignocelulsicos.

Desde hace varios aos y como consecuencia de la crisis energtica mundial, los
cientficos y los tcnicos han fijado su atencin en el potencial energtico que ofrece la
naturaleza en forma de biomasa. Teniendo en cuenta que el valor anual medio de la energa
solar incidente en la tierra es de 3,67 1021kJ., y estimando una eficiencia del proceso de
fotosntesis del 0,07%, se ha cifrado en 1,8 10 t la produccin anual de biomasa primaria
de la que el 40% es celulosa <Kosaric y col., 1983~. Este compuesto, que constituye por tanto
la fuente renovable de carbohidratos ms abundante con la que cuenta el hombre, ha sido.
durante los ltimos aos, y, sigue siendo objeto de numerosos estudios encaminados a Ja
bsqueda de aquellos procesos ms adecuados para su transformacin. Estos estudios, cuya
finalidad fundamental es la obtencin de combustibles o de productos de inters como
materias primas de las industrias qumica y agroalimentaria, han dado lugar a un notable
desarrollo de investigacin y tecnologa en reas diversas tales como la Biologa, la Qumca

o la Ingeniera de procesos.
La celulosa es un polmero de unidades de D-glucosa producido como consecuencia
del proceso de fotosntesis y que se deposita en las paredes celulares de todas las plantas

superiores, en forma de fibras cristalinas que determinan la direccin del crecimiento celular
y confieren la rigidez necesaria para el desarrollo de las plantas terrestres. Aunque la
produccin de celulosa no est confinada nicamente al reino vegetal, ya que algunos hongos. bacterias e incluso invertebrados marinos (tunicados) tambin producen celulosa, la
fuente ms importante de este polmero la constituyen las plantas superiores en las que este

material es sintetizado continuamente mediante fotosntesis.

Sin embargo, la celulosa no se encuentra pura sino asociada a una gran variedad de
otros poliscaridos tales como almidn. pectina, distintas hemicelulosas <constituidas por

polmeros o heteropolmeros de diversas pentosas, hexosas y sus cidos urdnicosi y lignina.

Estos <los ltimos, hemicelulosas y lignina son los polmeros que en mayor proporcin

acompaan a la celulosa en las estructuras vegetales. El algodn, por ejemplo, que es la

forma de celulosa ms pura que existe en la naturaleza, contiene hasta un 6% en peso de
polisacridos no celulsicos. protenas y elementos minerales.
Dentro de las plantas superiores las fuentes de celulosa en orden decreciente de
abundancia son los siguientes:

# Tallos de angiospermas leosas <maderas duras> con un contenido de 40-55% de

celulosa, 24-40% de hemicelulosa y 18-25% de lignina (figura 1>.
# Tallos de gimnospermas leosas (maderas blandas): 45-50% de celulosa, 25-35% de
hemicelulosa y 25-35% de lignina (figura 1).

Tallos de monocotiledneas <herbceas tales como bamb, trigo, arroz, caa de

azcar?, 25-40% de celulosa, 25-30% hemicelulosa y 10-30% de lignina.

# Parnquima celular no lignificado de Las hojas: 15-20% celulosa, 80-85% pectina y
otras hemicelulosas.
t/ Fibras parcialmente lignificadas o deslignificadas de algodn: 80-95% de celulosa,
5-20% hemicelulosa y poca lignina.

Del total de celulosa producida, la mayor proporcin corresponde a las tres primeras
fuentes, sto es, la mayor parte de la celulosa se encuentra lignificada.
Con vistas a su posible utilizacin en procesos de transformacin, la biomasa lignoceluldsica se puede catalogar en tres grupos diferentes. En primer lugar, la biomasa natural
producida espontneamente en las zonas no cultivadas, tanto de tierra firme como en las
zonas martimas. Otro grupo lo constituye la biomasa residual procedente de las explotaciones agrcolas y forestales, as como la generada en las industrias y en los ncleos urbanos.
Y por ltimo, la biomasa producida especialmente para fines energticos en las denominadas
plantaciones de energa. De estas fuentes, las que tienen mayor inters por su abundancia y

la naturaleza de su localizacin, ya que pueden obtenerse concentradas en reas definidas,

son los residuos agrcolas, residuos forestales, residuos de algunos tipos de industria. y los
cultivos energticos <Fernndez, 1.982>.

La biomasa residual ofrece unas perspectivas universales de aprovechamiento ya que

se produce en todo momento como consecuencia de la actividad humana y su eliminacin
constituye normalmente un problema. El reciclado y utilizacin de este tipo de biomasa en
procesos de transformacin supondra diversas ventajas. En primer lugar, se reducira el
deterioro ambiental que produce su acumulacin o eliminacin por vas convencionales, tales
como la incineracin de residuos en tierras de labor, haciendo posible al mismo tiempo, la
recuperacin de elementos minerales y materia orgnica que de otra forma se perderan
total o parcialmente. Por otro lado. al ser una materia que se genera como subproducto de
otras actividades, su coste de produccin quedara casi exclusivamente restringido a los

gastos de recogida en aquellos casos en los que sta no se realizara necesariamente.

Los residuos agrcolas generados en nuestro pas son fundamentalmente de tres
tipos: paja de cereales grano, residuos de cultivos industriales y restos de podas de frutales.
En la tabla 1 se expone el rendimiento medio en residuos agrcolas de los cultivos ms
usuales en Espaa, as como la produccin total de los mismos (Martnez y Rodrguez.
1985>. La composicin qumica de los residuos agrcolas de carcter lignocelulsico ha sido
estudiada por diversos autores. En la tabla II se expresa la composicin media de algunos de
ellos.

2---

Tipo de cultivo

Trigo
Cebada
Avena
Centeno
Maz
Arroz
Sorgo
Cereales Grano
Ctricos
P.pepita
P.hueso
Frutos secos
Olivar
Viedo
Otros

Rendimiento Produccin 10~

medio
t/ha.afio
t/aflo
1,71
2,27
1,73
2,34
10,04
6,94
6,19

5061,8
6437,0
638,0
254,6
3995,8
549,9
267,4

3,07

17204,5

2,00
3,50
2,00

456,4
428,6
202,4

1,50

795,6

1,70
3,50
1,00

5898,0
6084,7
183,5

Frutales

14049,2

Girasol

Algodn
Caa azucar

Cultivos Sud.

1,32
2,15
25,75

567,9
271,4
160,3

1,99

999,6

TABLA 5
Rendimientos y produccin en residuos agrcolas de
algunos cultivos (Martinez y Rodriguez, 1985).

3--

Madera

Madera

blanda

dura
*E x t r a ib le s-s.

ce nizas....~

e Lignina~
Grupos
ace ti
idridos-,~
ron t CO 3

llanas

ac tanos
/

Man anos

<Glucanos 4

Figura 1. Comparacin de la composicin de maderas duras y maderas blandas.

En cuanto al volumen de producciones, el que ocupa el primer lugar es el grupo de

los cereales grano con un 53,3% del total, seguido de los frutales <43,6%? y de los cultivos
industriales <3,1%>. Los residuos de trigo, cebada y maiz

Tipo de residuo

Celulosa Hemicelulosa

y;
Maderas blandas
Maderas duras

4550
4055

Fajas de trigo,
arroz,caiia de
azcar.

2540

TABLA II.

2535
2540
2540

Lignina

y;
2535
1825
10-30

Composicin media de algunos residuos agrcolas

lignocelulsicos. (Fuente: Martnez y Rodrguez,

1985).

constituyen el 484% del total de los residuos agrcolas y el 90% del total de residuos
procedentes de cereales grano. Dentro de los cultivos frutales generadores de residuos los
ms importantes son el olivar y el viedo con un 42% y 43,3% respectivamente de la
produccin de dichos cultivos, y que suponen un 37,1% del total de los residuos agrcolas.
Los cultivos industriales son los que producen menos residuos dada la poca extensin de los
mismos en nuestro pas. El girasol y el algodn son los cultivos de mayor importancia.
seguidos de la caa de azcar.
En el caso de residuos forestales, entre los que se incluyen los residuos de las
industrias de la transformacin primaria de la madera, la produccin anual en Espaa
alcanza aproximadamente 5,1 Mt. El tonelaje de estos residuos podra aumentarse en 2.7
veces. si se limpiasen los bosques espaoles con una frecuencia de 10 aos, que es, segn los

expertos, la periodicidad correcta para dicha actividad. En la tabla III, se dan los datos
generales de produccin y los valores de residuos forestales generados, segn un informe del
Comit de la Energia (1982).

DATOS GENERALES:

Superficie geogrfica (ha>.

Superficie arbolada (ha)...
Corta anual ni c.c
Corta anual (t)
Produccin de ramas (t).
Produccin de lelia (t)

50.210.800
11.702.538
5.391.597
3.234.951,8
736.063,8

240.825,2

RESIDUOS DE CORTA Y ELABORACION DE LA MADERA:

Total

Mt

2.306,5

RESIDUOS FORESTALES:
Residuos totales (Miles de tlalio).

14.098,7

TABLA III: Datos de produccin de residuos forestales en Espaa.

(Informe del Comit de Energa, 1982).

Con respecto a los residuos industriales, hay que sealar que stos estn poco catalogados
en nuestro pas, no existiendo en el momento informaciones detalladas sobre su composicin
y la cantidad generada en los distintos sectores industriales. Centrndonos en la produccin
de residuos celulsicos que son los que aqu nos interesan, el sector de las conservas
vegetales es el que tiene una mayor incidencia en el volumen de dichos residuos.
La produccin total de residuos agrcolas es aproximadamente el 43,5% del total de
la biomasa residual en nuestro pas, mientras que el 6,9% corresponde a residuos forestales.
El 49,6% restante corresponde a residuos ganaderos, slidos urbanos e industriales.
En relacin con los cultivos agroenergticos, se han promovido en el mundo en los
ltimos aos, programas de investigacin y desarrollo para la bsqueda de especies botnicas de caractersticas apropiadas para la obtencin, mediante procesos diversos de transfor-

6--

macin, de combustibles o productos qumicos de alto valor aadido. El volumen y la

incidencia futura de estos cultivos en las cifras globales de produccin de biomasa depender
de los resultados obtenidos, as como de las necesidades concretas del momento.
Los problemas ligados a los procesos de transformacin de materiales lignocelulsicos son, en sus aspectos bsicos, semejantes para todos ellos, por lo que los estudios
realizados con cualquiera de estos sustratos pueden hacerse, en lineas generales, extensivos
al resto. En nuestro caso, el trabajo desarrollado se ha centrado en el estudio del aprovechamiento y transformacin de la biomasa lignocelulsica de Onopordunz neruosum, especie con
la que se viene trabajando, desde hace unos aos, en nuestro pas, como posible cultivo
agroenergtico por diversas razones. Esta especie, endmica de la pennsula Ibrica, con una
productividad total en materia seca anual de alrededor de 20 t/ha (Fernndez, 1980>, presenta unas caractersticas de composicin y rusticidad que le hacen muy apropiada para su
utilizacin como fuente de celulosa, as como para su cultivo en zonas marginales, no aptas
para cultivos tradicionales, de las que existen en nuestro pas unos 18 millones de hectreas.
Es por sto, por lo que al estudio de las caractersticas agronmicas y de los procesos de
transformacin de sta y otras especies de similares caractersticas, se ha dedicado una
especial atencin en nuestro grupo de trabajo, como parte del programa de investigacin
sobre utilizacin de biomasa lignocelulsica como fuente de energa y productos diversos.

1.1.2. Composicin y estructura de las materiales lignocelulsicos.

Los materiales
componentes:

lignocelulsicos

estn formados

fundamentalmente por tres

a> Polisacridos.
Entre los que se encuentran la celulosa y la hemicelulosa, carbohidratos de alto peso
molecular que constituyen del 60 al 80% del total de la composicin de los materiales
lignocelulsicos.
La celulosa es el principal componente de la pared celular de la fibra vegetal y es un
polmero lineal de D-Glucosa, con peso molecular de aproximadamente medio milln. Las
unidades individuales de la molcula estn ligadas por enlaces ~ <1 -*4> formando cadenas
que a su vez se agrupan en estructuras superiores de alto grado de cristalinidad.
La hemicelulosa est compuesta de pequeas cadenas de polisacridos cuyo papel es
suministrar una unin entre la lignina y la celulosa. En su estado natural existe en forma
amorfa con un grado de polimerizacin que no excede de 200 y puede ser dividida en dos
categorias: celulosanos y poliurnidos. Los celulosanos incluyen aquellas hemicelulosas que

7--

son polmeros de hexosas tales como manosa, galactosa y glucosa y pentosas tales como
xilosa y arabnosa. Los poliurnidos son hemicelulosas que contienen grandes cantidades de
cidos hexurnicos y algunos grupos metoxilo, acetilo y carboxilo libres.
b> Lignina.
Es un polmero tridimensional de unidades de fenlpropano ligadas por enlaces ster
y C-C. La lignina confiere rigidez estructural al endurecer y sostener las fibras de polisacridos,
e> Otras sustancias.
Comprenden aquellos materiales no englobados en los apartados anteriores y que en
funcin de su solubilidad en agua o solventes orgnicos neutros se pueden clasificar en:
extraibles y no extraibles. Dentro de la fraccin extraible. se encuentran los terpenos que
son polmeros de isopreno y tienen importancia dado que son fuente de terpenina en procesos industriales, las resinas, que incluyen gran variedad de compuestos no voltiles como
grasas, cidos grasos, alcoholes, resinas cidas. fitosterol. etc, y los fenoles, entre los que se
encuentran los taninos. Tambin dentro de esta fraccin extraible se pueden incluir carbohidratos de bajo peso molecular, alcaloides y lignina soluble.
En la fraccin no extraible se encuentran las sustancias minerales o cenizas. Son
principalmente carbonatos alcalinos, alcalinotrreos y oxalatos. Otro componente importante de esta fraccin lo constituye la slice que se deposita generalmente, en forma de cristal
y es muy abundante en la paja. Pequeas cantidades de sustancias tales como almidn.
pectina y proteinas se encuentran asimismo dentro de la fraccin no extraible.

1.1.2.1. Estructura de la celulosa, hemicelulasa y lignina.

Es, en general, aceptado que la celulosa es un polmero lineal de unidades de Oanhidrogluco-piransido, unido por enlaces ~-1-4-glucosdicos. Es decir, se trata de un 1-4-09-glucano (figura 2>. El anillo de piranosa esta en la conformacin ~c1, lo cual quiere decir
que los grupos -CH2OH y -OH as como los enlaces glucosdicos estn todos en posicin
ecuatorial con respecto al plano medio del anillo.
Cuando la molcula de celulosa est completamente extendida y toma forma de cinta
aplanada, con los grupos -OH sobresaliendo lateralmente, se pueden formar puentes de
hidrgeno inter e intramoleculares. La superficie de la cinta que consiste en tomos de
hidrgeno unidos directamente a carbono es hidrofbica. Estos dos aspectos de la estructura

-8-

z
o

o,
o

e-

eo,

Co

-A

Co
A
E
1-~

--4

o
o
u

4-,

4-,
Ca

a>
o

e-

a>

e
c

0
o
Co
4-,

o)
Ca
a)
o.
a,
CC
Co

molecular son responsables de su estructura supramolecular, y determinan muchas de las

propiedades fsicas y qumicas de la celulosa. El nmero de unidades de glucosa por molcula <grado de polimerizacin) vara desde 1000 hasta 15000D, dependiendo de su origen y de
la extensin de su posible degradacin durante el aislamiento.
Los estudios de espectroscopia infrarroja, resonancia magntica nuclear y difraccin
de rayos X revelan que los puentes de hidrgeno intramoleculares se establecen entre los
grupos hidroxilo en posicin 3 y los tomos de oxgeno de las glucosas adyacentes y entre
los grupos hidroxilo en posicin 6 y los oxgenos de las cadenas adyacentes (figura 3>.
Aunque, considerados individualmente, estos puentes de hidrgeno son enlaces dbiles, la
gran cantidad de ellos que se establece entre las cadenas de glucosa que componen las fibras
de celulosa, le proporcionan una unin fuerte que es la responsable de la formacin de
agregados cristalinos que confieren a la pared celular su enorme resistencia.
Las hemicelulosas, como las celulosas, son polmeros de unidades de anhidroazcar
ligadas por enlaces glucosdicos. Sin embargo, cada molcula de hemicelulosa esta formada
por ms de un tipo de azcar (hexosas o pentosas> y adems presentan ramificaciones y
sustituciones. Todas estas caractersticas le confieren una estructura, en general, no cristalina. En el caso de angiospermas, sus hemicelulosas son mayoritariamente de tipo xilano.
polmero de unidades de D-xilopiranosa (aproximadamente un 35% dc sus residuos estn
acetilados) unidos por enlaces ~<1-*4>.En el caso concreto de las plantas dicotiledneas.
algunos restos de xilosa se encuentran sustituidos por 4-0-metilgiucurnico (figura 4a>. Otra
fraccin importante de las hemicelulosas de angiospermas (25% del total de hemicelulosas

aproximadamente> la constituyen los glucomananos que son polmeros lineales de glucosa y

manosa con predominio de esta ltima. Polisacridos relacionados con los anteriores son los
galactoglucomananos acetilados que se encuentran principalmente en los tejidos de gimnospermas (figura 4b). Las hemicelulosas minoritarias son arabino-4-O-metil glucuronoxilanos,
los cuales son similares a] xilano de angiospermas, pero sustituidos con ramificaciones de

arabinosa.
La lignina es el tercer componente mayoritario de los materiales lignocelulsicos. Es
un polmero aromtico sintetizado por polimerizacin oxidativa de tres alcoholes cinamlicos:
cumarol, coniferol y sinapol (alcohol 4-hidroxi, 4-hidroxi-3-metoxi y 4-hidroxi-3,5dimetiloxicinmico respectivamente). La proporcin de los tres alcoholes precursores difiere
segn se trate de angiospermas o gimnospermas, as como de los grupos taxonmicos,
particularmente entre las primeras. En la lignina de gimnospermas, el 90% corresponde a

derivados de coniferol, mientras que en la de angiospermas corresponde a derivados del

coniferol y del sinapol en proporciones similares (figura 5>.
Estos tres componentes fundamentales de los materiales lignocelulsicos se encuentran localizados en la pared de las clulasvegetales cuya estructura se describe en el siguiente apartado.

lo

7
CH2

Ho

CH2

OH

19-o

A
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--FI-O

OH

CH2

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FI

Ho

CH

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HO
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OH
OH
HO

CHOH
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CH2

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HO

CH-OHOH

OH
a

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HO

HO

CH2OHOH

O -Galp

4anp-

Manp-(1.--4)-j3-O-Gl1V-(h-4)1341 -Man p-(1--A)-fJ-U- ?

(b)

Figura 4. (a) Es tructura del 0acet 1140met Iglucuronoxilano.

Hemicelulosas de tejidos de angiospermas.
(b) Estructura del O-acetil-galactoglucomanano.
Hemicelulosas de

tejidos de gimnospermas.

-12

0120!]

0-CH
C 1-10>1
I-13C0

CH

OC1~l3hH2O>1

c>-i

HO>]

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CH
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OCHSL?H2~I

CH

Sil

)O--- >1

CHO I-1,CO

>

CH
1
en
1

-~

OCH3

cu2oH
Figura 5. EstructUra de la lignina.

13

OCIE3
o

(lEN 1 CELIJI.OSA

O
OCH 3

~H2OR

l-t,CO

1.1.2.2. Organizacin de la pared celular.

El estudio de la arquitectura de la pared celular vegetal revela la existencia de cuatro
capas concntricas morfolgicamente distintas (figura 6>. La capa externa llamada pared
primaria con un espesor de 0,1 mm contiene la tercera parte del contenido total de celulosa.
En esta capa, las microfibrillas elementales de celulosa se encuentran orientadas transversalmente a lo largo del eje de la fibra. La capa siguiente es la pared secundaria, que se forma
durante el crecimiento y maduracin de la clula y contiene tres subcapas, originadas en
distintas fases del desarrollo, la exterior S. la capa intermedia S2 y la capa ms interior
S~. Cada una de estas subcapas contiene microfibrillas con distintas ordenaciones que dan
lugar a la apariencia laminar de la pared celular. Internamente a la pared secundaria se
encuentra el lumen, que es la porcin de clula viva que contiene las sustancias
intracelulares.
La microfibrilla se puede definir como la unidad elemental del tejido fibroso vegetal
y contiene la mayor parte de la celulosa que constituye las distintas capas y subcapas de la
pared celular (la proporcin ms elevada del total de celulosa se encuentra localizada en la
subcapa S2 de la pared secundaria). La seccin de una microfibrilla es de unos 120k por
trmino medio y su longitud ilimitada. Estas microfibrillas estn a su vez constituidas por
fibrillas elementales que se unen lateralmente para dar lugar a la estructura superior. Los
otros componentes de la fibra, hemicelulosas y lignina, estn localizados entre las microfibr-

las. La lignina se encuentra tambin en la lmina intermedia que es la capa que rodea la
clula vegetal, as como en los espacios situados entre las fibras. En la figura 7 se muestra
la distribucin de los componentes qumicos de una pared celular tpica.
Con respecto a la estructura ltima de las cadenas celulsicas que constituyen las
microfibrillas. la difraccin de rayos X y otras tcnicas muestran que estas son parcialmente
cristalinas y parcialmente amorfas. Se considera que por trmino medio la celulosa natural
contiene 15% de zonas amorfas y 85% de zonas cristalinas (figura 8). Aunque se han
sugerido modelos de ordenamientos moleculares para explicar la estructura cristalina de la
celulosa, sta no est todava clara (Chang, 1971>.

11 4

PM.

Figura

L.M.

6. Esquema de la arquitectura de

la pared celular caracterstica de

las fibras vegetales.

L.M.

(lmina media),

primaria),

L.M.C.

(lmina media central),

LS. (pared secundaria).

15

P.M. (pared

loo

1
80

1.

<1>

u,

II

di

a
~

401

II

5-2

L.M PP

PAPEO SECUNDARIA

L.M.C.

Figura

7. Distribucin

aproximada de

los constituyeiites

quimicos en

las

distintas capas de la pared celular.

Lii.

(lmina media), L.M.C. (lmina media compuesta),

primaria).

16

P.P. (pared

zonas de celulosa
amo cfa

cejulosa con estructura

crtstalina

e?

st/e

Figura 8.

Organizacin de la celulosa en la fibra.

17--

.c-

1.2. PROCESOS DE TRANSFORMACION DE LOS MATERIALES

LIGNOCELULOSICOS.
La celulosa y los materiales lignocelulsicos en general, han sido profusamente utilizados a lo largo de la historia de la humanidad en diferentes actividades y con finalidades
diversas tales como combustible o materia prima de industrias de construccin, papeleras o
textiles. A estas aplicaciones tradicionales, se aade hoy da un gran inters por el estudio
de estos materiales como fuente de productos qumicos y energa que podran en su momento sustituir, en buena medida a los de origen fsil no renovable (Alen y Sjstrm. 1985).
Los procesos de transformacin de los materiales lignocelulsicos pueden tener una
finalidad eminentemente energtica, como es el caso de los procesos termoquimicos de
gasificacin, pirlsis o combustin directa, o bien tener por objeto la obtencin de materiales transformados o productos qumicos que pueden ser o no utilizados como fuente de
energa. En este ltimo grupo se encontraran las vas quimcas, bioqumicas o biolgicas de
transformacin.
Los procesos termoquimicos agrupan los tradicionales de combustin directa as

como los procesos de gasificacin y pirlisis que requieren para su desarrollo la puesta a
punto de tecnologa ms complicada. La combustin directa haba quedado relegada, en la
sociedad industrial moderna, a zonas rurales y paises poco desarrollados, pero en la actualidad ha empezado a introducirse en algunas industrias de EEUU y Europa en sistemas de

cogeneracin con produccin simultnea de vapor y electricidad, hornos de secado, calefaccin de viviendas, etc. En el caso de gasificacin o pirlisis, el objetivo es la obtencin de
combustibles lquidos, slidos o gaseosos cuyas densidades calorficas son bastante ms

elevadas que la de los materiales lignocelulsicos de partida, con lo cual se facilita el

transporte y por tanto su utilizacin energtica en puntos alejados de los ncleos en los que

dichos materiales se generan.

Los otros esquemas de transformacin de la biomasa lignocelulsica pueden pretender la modificacin de la estructura y propiedades de dicho material o su descomposicin
total o parcial en las unidades que lo constituyen, fundamentalmente, glucosa o pentosas
para su utilizacin con fines diversos. En el primer grupo, estn los procesos de fermentacin en estado slido cuyo objetivo es el desarrollo de determinadas poblaciones microbianas
sobre los sustratos lignocelulsicos, con lo cual se produce una digestin parcial de estos
sustratos y un aumento de su contenido en nitrgeno. Dependiendo del tipo de sustrato. de
las especies microbianas y de las condiciones de cultivo elegidas, se puede conseguir un

18

producto final enriquecido y de mayor digestibilidad, apropiado para la alimentacin animal,

como en el caso de residuos lignocelulsicos tratados con especies de hongos celuloltcos del
gnero Ckaetomiwn o Trichoderma, o bien, un producto de caractersticas agrobiolgicas
adecuadas para ser empleado como fertilizante o enmienda orgnica, denominado genricamente compost.
La otra posibilidad de transformacin de materiales lignocelulsicos es la de hidrolizar por va qumica o enzimtica las fracciones celulsica y hemicelulsica para obtener los
azcares, fundamentalmente glucosa y algunas pentosas, que los constituyen. Estos azcares pueden ser utilizados como tal o bien sometidos a procesos posteriores de transformacin qumica o biolgica. En el caso de hidrlisis qumica, se emplean cidos como 1-ICI,
H2S04 o MF a altas concentraciones o bajas concentraciones y altas temperaturas y diversos procesos operativos, tales como percoladores, reactores de mezcla completa, reactores
de flujo pistn, etc., desarrollados como resultado de diversos estudios (Thompson y
Grethelein, 1979; Wright y DAgincourt. 1984; Wright y Wyman, 1987; Bergeron y
Werdene, 1989; Calo y 1-badil, 1989; Wyman, 1989>. Adems de algunas plantas de demostracin en Japn se sabe que existen unas 40 plantas industriales en la Unin Sovitica. Los
principales inconvenientes de este proceso de transformacin radican en la heterogeneidad
del hidrolizado obtenido debida a la hidrlisis inespecifica de las distintas tracciones del
material, as como a la aparicin, en mayor o menor proporcin, de productos de degradacin de azcares que se generan durante el proceso. Por otra parte, la necesidad de utilizar
materiales resistentes a la corrosin y de recuperar los cidos utilizados encarecen en gran
medida los costes de inversin y operacion.
La hidrlisis enzimtica de la celulosa consiste en la utilizacin de las enzimas
celulolticas, producidas por algunos hongos y bacterias, para obtener una solucin de glucosa a partir de dicho sustrato que es originalmente insoluble. A diferencia de la hidrlisis
qumica, la enzimtica proporciona un hidrolizado homogneo debido a la alta especificidad
de las enzimas. Sin embargo, y por causa de la propia estructura de la celulosa y de la
barrera que supone la fraccin de lignina, los rendimentos de este tipo de procesos suelen
ser bajos. Puesto que la hidrlisis enzimtica de determinados materiales lignocelulsicos es
el objetivo primordial de este trabajo, se discuten ms adelante todos los problemas que se
plantean en esta va de trasformacin y las soluciones que se han ido aportando para su
puesta a punto.

Los azcares obtenidos en un proceso de hidrlisis, cida o enzimtica, pueden ser

utilizados como tales o sometidos a transformaciones posteriores. Estas transformaciones.
incluyen fermentaciones diversas cuyos objetivos pueden ser la obtencin de productos tales
como etanol, butanol. acetona, cido ctrico, etc, o bien la produccin de biomasa unicelular
(denominada genricamente protena unicelular o SCP) que puede ser utilizada con fines de
alimentacin animal y humana (Linko, 1977 ; Bisara y Ohose, 1981; Chang y col., 1981
Enari, 1983>. Como es evidente, los productos orgnicos antes mencionados pueden ser a su
vez materia prima para la industria qumica de transformacin con lo cual la biomasa se
convierte, as, en fuente de un amplio espectro de productos qumicos.

19--

Para finalizar hay que aadir que cualquier proceso que pretenda el aprovechamiento
de materiales lignocelulsicos debera contemplar, por razones evidentes, la utilizacin no
slo de la fraccin celulsica sino tambin de hemicelulosas y ligninas. Estas fracciones
adems del alto porcentaje en que entran a formar parte de dichos materiales, constituyen
por su composicin una fuente interesante de productos qumicos. En el caso de la lignina
aparte de servir como combustible~ que puede abortar una parte de las necesidades energticas del proceso, puede ser tambin utilizada como materia prima de diversos tratamientos
qumicos destinados a la obtencin de toque de lignina. metanol, vainillina, fenoles, sulfuro
de dimetilo. etc. Adems, la lignina y sus derivados tienen diversas aplicaciones como
resinas de intercambio jnico, agentes dispersantes y como sustrato para fabricacin de
polmeros, colorantes, detergentes, pesticidas, etc.
En la figura 9 se muestra un esquema de los diversos procesos de transformacin de
materiales lignocelulsicos as como de los principales productos que se pueden obtener de
ellos. Aunque muchos de ellos no se desarrollan a escala industrial en la actualidad, el gran
abanico de posibilidades que ofrecen estos materiales hace posible que en un futuro prximo
se desarrollen procesos para el aprovechamiento integral de los mismos.

20

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21--

1.3. TRANSFORMAC~ON DE MATERIALES LIGNOCELULOSICOS POR

ENZIMATICA.
La biodegradacin de la celulosa constituye una etapa esencial en el ciclo del carbono
mediante la cual se mantiene el balance de este elemento en la bioesfera. El grupo de
enzimas, responsable ltimo de este proceso se denomina genricamente celulasas y
corresponde en realidad a una mezcla de distintas actividades enzimticas cuya accin
conjunta produce finalmente la degradacin de la celulosa nativa.
Las celulasas son producidas por plantas superiores, algunos invertebrados y fundamentalmente por microorganismos como bacterias y hongos. Las plantas superiores producen celulasas como agentes morfognicos con objeto de debilitar las paredes celulares ricas
en celulosa en las etapas de crecimiento, diferenciacin o abscisin. Tambin son producidas
por algunos patgenos de plantas para facilitar la penetracin en la misma y la invasin
posterior de los tejidos. En el caso de microorganismos se producen celulasas como agentes
digestivos que permiten la utilizacin de la celulosa como fuente de carbono para su propio
desarrollo. Ls celulasas de microorganismos y concretamente las de origen fngico han
sido las ms ampliamente estudiados por la capacidad de stos de producirlas en grandes
cantidades y de forma extracelular. lo que facilita su separacin en los medios de cultivo.

El estudio de las celulasas y de los organismos que las producen se potenci extraordinariamente a partir de los aos 60, cuando empez a considerarse como una opcin
interesante la utilizacin de la celulosa, para su transformacin en productos valiosos desde
el punto de vista energtico o qumico. Aunque la transformacin de la celulosa por va
qumica (hidrlisis cida> haba sido estudiada con mucha anterioridad e incluso empleada a
nivel industrial, en distintos paises, la posibilidad de hidrolizar la celulosa con unos agentes
mucho ms selectivos y unas condiciones de operacin mucho ms suaves, anim la investigacin del proceso de hidrlisis enzimtica en la que fueron pioneros los trabajos realizados
en los laboratorios del jercito americano en NATICK y que posteriormente, se extendi a
otros muchos laboratorios en otras partes del mundo.
Para situar el estado de desarrollo de este tipo de procesos, las posibilidades que
ofrecen y los problemas que quedan an por resolver, a continuacin se incluye un breve
repaso de cada una de las etapas que constituyen un proceso completo de hidrlisis enzimtica, a saber: produccin de enzimas, pretratamiento del sustrato a hidrolizar y fase de
hidrlisis propiamente dicha.

22--

1.3.1. Produccin de celulasas.

1.3.1.1. Caractersticas del complejo celuloltico.
1.3.1.1.1. Composicin.
El complejo celuloltico, conjunto de enzimas capaces de hidrolizar la celulosa, est
formado por distintos componentes que actan sinrgicamente. Hoy est aceptado que este
sistema enzimtico tiene tres tipos diferentes de actividad cuya denominacin y mecanismo
de accin son los siguientes:
1. Endo-0-glucanasas:
011 ,4)-glucanglucanohidrolasa (EC 3.2.1.4.)
2. Exo-0-glucanasas:
a>

~-<

1,4 >-glucancelobiohidrolasa <CBH> (EC 3.2.1.91> (celobiohidrolasa>.

b>

~-(

1 .4>-glucanglucohidrolasa (GGH> (EC. 3.2.1.74.) (glucohidrolasa>

3. ~-glucosidasa

(EC. 32.1.21>

La endoenzima acta al azar en el interior del polmero hidrolizando enlaces 0<1-44>

y generando nuevos finales de cadena no reductores. Puede actuar sobre celodextrinas y
derivados sustituidos como carboximetilcelulosa <CMC) e hidroxietilcelulosa <1-LEe), as
como sobre celulosa amorfa, pero no acta ni sobre celulosa cristalina ni sobre celobiosa.
Supone aproximadamente un 20% del total de protenas del complejo. La actividad de esta
enzima se ensaya con celulosa soluble y se determina por el incremento de azcares reductores o por la disminucin de la viscosidad del medio de reaccin.
La celobiohidrolasa acta sobre los extremos no reductores de la cadena generados
por la endoglucanasa liberando molculas de celobiosa. Esta enzima tiene actividad sobre
celulosa cristalina y amorfa y sobre celodextrinas, pero no acta sobre derivados sustituidos
ni sobre celobiosa. Entre el 50% y el 80% del sistema celuloltico, lo constituye esta enzima.
Su actividad se determina por incubacin con celulosa cristalina. La otra exoglucanasa. la
glucohidrolasa, se encuentra en poca proporcin y acta sobre los extremos no reductores
liberando unidades de glucosa. Tiene actividad frente a celulosa amorfa, ce!ooligosacridos y
CMC.
La 0-glucosidasa hidroliza celobiosa y oligosacridos de pequeo tamao y es absolutamente necesaria para evitar la fuerte inhibicin que sobre la endoglucanasa y exoglucana-

sa produciria la celobiosa si se acumulara en el medio de reaccin. Su actividad se determina

sobre celobiosa y 4-nitrofenil-0-D-glucopiransido, cuantificando la glucosa o el 4-nitrofenol
liberados, respectivamente, en el medio de reaccion.

23

Las propiedades de los distintos componentes de un complejo enzimtico varan en

gran medida segn el origen del mismo, las condiciones de cultivo de los microorganismos
productores e incluso la manipulacin de los medios. La separacin y la purificacin de las
distintas fracciones enzimticas por tcnicas tales como ultrafiltracin, cromatografa. eleetroforesis, etc., revelan la existencia dentro de dicho grupo de diversos isoenzimas cuyo
nmero depende no slo del proceso de produccin utilizado sino tambin de los esquemas
seguidos para la separacin de dichas fracciones.
La mayor parte de los estudios relizados muestran que las endoglucanasas y exoglucanasas son glucoproteinas con un contenido en hidratos de carbono que puede alcanzar
incluso el 33% del peso molecular total. Algunos autores tambin han encontrado una
pequea proporcin de carbohidratos en la composicin de la 0-glucosidasa. Sin embargo, la
caracterizacin exacta de las distintas fracciones no es sencilla tal y como lo demuestran las
diferencias encontradas en los valores de composicin de aminocidos, contenido en carbohidratos, Pn-, punto isoelctrico. etc. Estos resultados, obtenidos por distintos grupos de
investIgacin para distintos microorganismos celuloliticos, algunos de los cuales se recogen
en las tablas IV, y y VI, ponen de manifiesto la variabilidad del complejo enzimtico
responsable de la hidrlisis de la celulosa.

Peso
Organismo

Punto

Enzima
Plolecular

Isolelctrico

Contenido
Carbohidratos
( % )

Trichoderina
reesei

CMII
CMIII

60.000
60.000

3,9
5,6

(-4-)

Trichoderma
koningii

CBHI
CEBIl

62.000
62.000

3,8
3,95

33
9

Phanerochaete

CBH

48.600

4,3

(+)

chrysosporium

+) Presencia de carbohidratos, pero no se dan datos.

TABLA IV: Celobiohidrolasas

de hongos. (Enari, 1983).

24

Peso

Punto

Molecular

Isoelctrico

Organismo

Trichaderina
reesel

47.700

Trichoderma
reesei

35.000
130.000

Trichoderma
koningii

39.800
39.800

Phanerochaete
chrysosporiun

()

5,74

165.000172.000
175.000182.000

Contenido
Carbohidratos
(%)

(-)
(>

0,01

5,53
5,83

0
12

(-)

()

(-O
(--)

()

Aspergillus
oryzae

218.000

4,3

10

Aspergillus niger

150.000

(-)

0,03

no se dan datos del posible contenido en carbohidratos.

TABLA V: frGlucosidasa de hongos. (Enari, 1983).

25

Organismo

()

Enzima

Peso

Punto

Contenido
Carbohidratos
Molecular Isoelctrico
(%)

Trichoderina
reesei

1
II

20.000
40.000

7,5
4,6

(-0

Trichoderma
koningii

El
EBa
E3b
E4

13.000
48.000
48.000
31.000

4,72
4,32
4,32
5,09

()

Phanerachaete Ti
chrysosporium T2a
lib
T3a
T3b

32.300
36.700
28.300
37.500
37.000

5,32
4,72
4,40
4,65
4,20

10,5
0
7,8
4,7
2,2

No se dan datos

del

TABLA VI: Endoglucanasas

posible contenido

de hongos.

(0
()
()

de carbohidratos.

(Enari,

1983).

1.3.1.1.2. Modo de accin de las celulasas.

Los primeros postulados acerca de la naturaleza del mecanismo de hidrlisis enzmtica fueron enunciados por Reese y col. <1950> basados en el hecho de que algunos organismos podan hidrolizar celulosa nativa mientras que otros, slo hidrolizaban derivados

solubles. Se pens que era un proceso en dos etapas. En la primera de ellas, un componente
enzimtico, al que se denomin Cl iniciara la hidrlisis enzimtica por activacin de las

cadenas de celulosa, y en la segunda, actuara un componente Cx que sera el responsable de

la despolimerizacin y formacin de oligosacridos solubles.
De acuerdo con esta hiptesis, los microorganismos capaces de crecer en celulosa
nativa cristalina formaran enzimas de tipo Cl y Cx, mientras que los microorganismos que

degradaban solamente celulosas modificadas o sustituidas tales como CMC carecerian de la

primera de ellas. El mecanismo propuesto por Reese y col. <1950> era el siguiente:

26

Cl
CELULOSA

-*

Cx
CELULOSA REACTIVA

Wolucosidasa
CELOBIOSA 4 GLUCOSA

Los trabajos realizados posteriormente demostraron que la actividad Cl estaba determinada por una 0-1-4-glucancelobiohidrolasa, que actuaba precisamente sobre las cadenas generadas por la accin del componente Cx, al contrario de lo que se haba planteado en
un principio.
El concepto que se acepta actualmente sobre la accin de celulasas es que tanto las
endoglucanasas como las exoglucanasas actan sinrgicamente sobre celulosa. Las primeras
rompen enlaces en las regiones amorfas, formando extremos no reductores sobre los que
actan las exoglucanasas liberando celobiosa y oligosacridos de bajo Pm que son transformados en glucosa por la ~-glucosidasa. Un esquema del mecanismo de accin se presenta en
la figura LO (Montenecourt y Eveleigh, 19791. De esta forma, la endoglucanasa produce
puntos de ataque para la celobiohidrolasa y sta a su vez deja al descubierto nuevas cadenas
de glucano sobre cuyas regiones amorfas vuelven a actuar las endoglucanasas. El papel de la
0-glucosidasa es clave al hacer desaparecer la celobiosa del medio que, de acumularse,
inhibira la actuacin de las otras enzimas. El mecanismo global de accin del complejo
enzimtico se sigue estudiando actualmente y han aparecido nuevas hiptesis como la de
Eriksson (1979> que se comentar en apartados posteriores, que parece involucrar un nuevo
factor, posiblemente una enzima oxidativa. que sera responsable del comienzo de la hidrlisis de la celulosa.

1.3.1.1.3. Sinergismo entre los componentes del complejo

enzimtico.
El sinergismo que muestran los distintos componentes del complejo enzimtco en
su modo de accin y que ya se ha mencionado en el apartado anterior, es de dos tipos. En

primer lugar. est el sinergismo entre endoglucanasas y exoglucanasas, una de cuyas pruebas ms evidentes fue aportada por Eriksson y Pettersson (1975> que demostraron el
aumento de degradacin de celulosa cristalina y algodn por exo-1-4-frglucanasa cuando
haban sido tratados previamente con endo-I-4-0-glucanasa. La observacin de que sobre
ciertas celulosas, como la celulosa tratada con cido fosfrico, no se detecta este tipo de
fenmeno puede explicarse por el hecho de que la despolimerizacin provocada por dicho
tratamiento cido genera suficientes sitios activos como para que las exoglucanasas no
necesiten la accin de la otra enzima.

27

i(eg iones
amorfas

torita

cristalinas

4,
ENDO-y5 GLUCANASA

(EC.C

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CEI.OU 10111 I>ltOl.ASA

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1 I)AI A

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O L U 003 A

Figura 10. Esquema de la estapas secuenciales en la hidrlisis enzimtica de

la celulosa.

28

La cooperacin entre endoglucanasas y exoglucanasas tambin se ha estudiado en

experimentos cruzados en los que se ha evaluado la actividad enzimtica de mezclas de los

des tipos de enzimas procedentes de microorganismos distintos en cada caso (Woodward,
1991). La adicin de exoglucanasas a filtrados de endoglucanasas produce un aumento de la
actividad celuloltica excepto cuando dichos filtrados proceden de organismos que, como
MyroMeciuzn verracria, no producen exoglucanasas. La ausencia de sinergismo en este
caso se ha interpretrado como una prueba a favor de la hiptesis de que las exoglucanasas
aunque incrementan la degradacin de la celulosa significativamente no son esenciales para
ella. Sin embargo, la comparacin entre los sistemas celulolticos de estos dos tipos de
hongos <los productores de exo y endoglucanasas y los que slo producen estas ltimas>,
debe hacerse con limitaciones puesto que hay evidencias de la existencia de una etapa
oxidativa, como iniciadora de la hidrlisis de celulosa, en hongos no productores de exoglucanasas <Finch y Roberts, 1985>.
El otro sinergismo al que se haca referencia es el existente entre las enzimas
celulolticas propiamente dichas (exo y endoglucanasas> y las enzimas responsables de la
degradacin de la celobiosa que tiene un efecto fuertemente inhibidor sobre las primeras.
Estas enzimas incluyen la Wglucosidasa que hidroliza la celobiosa a glucosa y los oligmeros
cortos, as como las enzimas oxidativas que transforman la celobiosa en cido celobinico.
que a su vez puede ser hidrolizado por la g-glucosidasa a glucosa y gluconolactona.
La contribucin de las enzimas oxidativas, de las que carecen muchos hongos celulolticos y que parecen intervenir asimismo en el proceso de degradacin de lignina, al sinergismo del complejo de celulasas es todavia poco conocida. Con respecto a la frglucosidasa su
efecto sinrgico es difcil de evaluar por el hecho de que tanto la glucosa como la gluconolactona, derivadas de las tranformaciones de la celobiosa. son poderosos inhibidores para esta
enzma. Hay una serie de factores que influyen, sin duda, en la contribucin de esta enzima

al sinergismo del sistema:

1.

Alta velocidad mxima en comparacin con las de exo y endoglucanasas.

2.

Inhibicin por glucosa de magnitud similar a las que experimentan exo y

endoglucanasas por este mismo producto y muy inferior a la inhibicin de

dichas enzimas por celobiosa.

3.

La reaccin catalizada por dicha enzima no parece ser reversible en una tasa

significativa.

1.3.1.1.4.

Modelos cinticos.

Se han realizado numerosos estudios con el objetivo de encontrar modelos cinticos

que se ajusten al proceso de hidrlisis enzimtica de la celulosa. Sin embargo, la complejidad
del sistema celuloltico, la propia naturaleza del sustrato, el modo de accin al azar de las
endoglucanasas y la existencia de inhibicin por productos finales hacen que la aproximacin a modelos cinticos satisfactorios sea bastante difcil.

29

Algunos autores han descrito modelos sencillos en los que se consideran sustratos

solubles sobre los que se estudian individualmente los enzimas del complejo (Howell y
Stuck, 1975; Ladisch y col., 1981; Fujii y Shimizu, 1986>. Estos modelos aunque son de

indudable valor, se apartan mucho de la realidad del proceso de hidrlisis en el que hay que
tener en cuenta como factores esenciales la insolubilidad y la relativa inaccesibilidad del
sustrato.

Moo-Young y col. han trabajado con modelos cinticos mucho ms complejos en los
que se ha considerado la accin de los tres principales componentes del complejo <exo y endo
glucanasas y 0-glucosidasa> as como la inhibicin por glucosa de todos ellos y por celobiosa
y oligosacridos de las dos primeros (Okazaki y Moo-Young, 1978; Fan y Lee, 1983>. Estos

modelos predicen que el sinergismo de exo y endoenzimas depende de la inhibicin por

producto, del grado de polimerizacin y tipo de celulosa, de la concentracin de enzima para
una relacin endo-exo constante y del valor de dicha relacin. Asumen, sin embargo, estos
autores la independencia entre constantes de Michaelis, y longitud de las cadenas celulsicas, hiptesis, por otro lado cuestionada por autores como Hsu y col. (1980>, Wood y
McGrae 11972) que han encontrado una relacin directa entre dichas constantes y la longitud de las cadenas.
El desarrollo de modelos cinticos para la hidrlisis de la celulosa implica tener en
cuenta los aspectos siguientes:
a) la naturaleza de la enzima utilizada, que determina la actividad de cada componente de la
misma.
b> la estructura fsica del sustrato, como indice de cristalinidad, rea superficial asequible.

etc.
c> la interaccin entre la enzima y el sustrato, que incluye todos los aspectos derivados del

proceso: transferencia de materia externa, difusin interna, adsorcin y reaccin.

Aunque complejos en sus formulaciones matemticas, por el gran nmero de parmetros que se deben manejar para integrar los distintos hechos comprobados experimental.
mente, en esencia, la mayora de los modelos apoyan la idea de que la celulosa altamente
cristalina es degradada por la accin cooperativa de endo y exoglucanasas y que la funcin
del resto de los componentes del sistema celuloltico es controlar el nivel de productos de
inhibicin <Ryu y col.. 1984; Camina> y col., 1985: Gusakov y col., 1985a, lSSfib. 1987:
Beidman y col., 1988; Gonzlez y col., 1989>.

1.3.1.2. Microorganismos productores de celulasas

Los microorganismos capaces de crecer sobre celulosa como fuente hidrocarbonada
y. por lo tanto, productores del complejo celuloltco necesario para hidrolizar dicho sustrato,

se encuentran distribuidos en dos grupos fundamentales: bacterias y hongos. Las enzimas

30

producidas por estos microorganismos son, en su mayor parte, extracelulares ya que tienen
que actuar sobre un sustrato macromolecular insoluble, incapaz de penetrar en el interior de
las clulas.
No todos los hongos y bacterias celulolticos estudiados han resultado interesantes
para la obtencin de sus enzimas, ya que algunos de ellos las producen en poca cantidad o
con actividad insuficiente como para producir una degradacin in vitro de celulosa a
compuestos solubles que es la finalidad de un proceso de hidrlisis enzimtica. Tambin hay
organismos que, por carecer de alguna de las enzimas del complejo celuloltico, no son
capaces de digerir celulosa nativa pero si celulosas parcialmente degradadas o derivados
solubles. Estos microorganismos pueden tener inters para la sntesis de algunas enzimas
especificas. En la tabla VII se recoge una relacin de los microorganismos celulolticos ms
estudiados.

1.3.1.2.1. Hongos celulolticos.

De la gran variedad de hongos celulolticos existentes en la naturaleza slo unas
cuantas especies han sido utilizadas por su capacidad de produccin de enzimas celulolticas.
entre ellos: Trichoderma reesel, 7. koningii. 7. lignorum, Spororrichum pnlvurulentzmnt,
Penicilluni (un culosum. ~4spergt/1us weent, Eusarum so/ant, .Afyrot/ecunz verrucarza.
De todos ellos, el que ha tenido un papel ms destacado en los estudios de transformacin
de materiales lignocelulsicos, por su eficiencia para producir un sistema celuloltico completo, ha sido 7.lon.gibrachiatum < T.reesci> aislado al final de los aos 40 en los laboratorios
del ejrcito norteamericano en Nactik. A partir de esta cepa salvaje, se han conseguido
mutantes hperproductores de celulasas que poseen adems, en muchos casos, una alta
actividad xlansica. Algunas de las caractersticas ms destacadas de estas cepas biperproductoras se discuten ms adelante. Con respecto a la ~-glucosidasa, los mejores productores
de esta enzima se han encontrado, sin embargo, entre especies del gnero Aspergillus
<A.niger, A.phoen cus y A.wentii.) (Sternberg y col., 1977; Enari y col., 1981).
1.3.1.2.2.

Bacterias.

Las especies bacterianas capaces de sintetizar enzimas celulolticas se encuentran

tanto entre actinomicetos como entre bacterias verdaderas <Gram + y Gram -1. Algunas son
aerobias tales como los actinomicetos o el gnero Pseudomonas, otras son anaerobios facultativos como Bacllus o CelIu(omonas o, anaerobios estrictos tales como Cfostridium y
Baetero des.
Algunas bacterias producen cantidades importantes de enzimas extracelulares, mientras que otras, aunque no las excretan crecen activamente sobre materiales celulsicos como
es el caso de Ce/lulomonas que, parece producir celulasas ligadas a la membrana celular.
Entre los grupos bacterianos productores de enzimas celuloliticas extracelulares. destaca el
gnero CJostridinin, de gran inters por su capacidad metablica de transformar celulosa

31

A) HONGOS: Mesfilos

Tricliodenna reesei
T.Kaningii
T.Lignonnn
Penicillium funiculosum
P. iriensis
P.variable
Aspergillus ven ti 1
A. niger
A. foetidus
A. fumigatus
Polyparus adus tus
P- tulipiferae
Fusarium solani
Fusarium lini
Sclerotiun rolfsii
Eupeniciflium javanicum
Geotrichum candidum
Armnillariella mellea
Schizophyllum comniune
Manilla sp.

Termf los

Chaetanium thermophile
Humicola spSporotrichum thermophile
Therunaascus aurant lacus
Talaromyces eniersoni i

B) BACTERIAS: Mesfilas

Celivibro fulvus
C.gilvus
C.vulgarus
Pseudoinanas fluorescens
Acetavibrio cellulolyticus
Streptounyces flavogrisens
Ruminococcus sp.
Cellulamonas sp.

Termfilas

C) ACTINOMICETOS:

Clostridium thermocellum

Mesfilos Streptomyces sp.

Termfilos

Thermomonospora sp.
Thermoac tinomycete sp.

TABLA VII. Microorganismos productores de celulasas.

(Kosaric et al.,1983).
32--

directamente en productos tales como etanol, cido actico, acetona, butanol, etc. Sobre este
gnero, se han centrado gran parte de los estudios de bacterias celulolticas con el objetivo

de mejorar sus rendimientos de transformacin, que son bajos, debido a su limitada baja
tolerancia a etanol y a la heterogeneidad de productos que se originan como consecuencia de
su metabolismo <Jhonson y col., 1982; Enari, 1983; Beguin y col., 1985).

1.3.1.2.3. Mutantes.
La bsqueda de mutantes hiperproductores de celulasas ha tenido como objetivo
encontrar nuevas cepas, no sometidas a los estrictos controles genticos y bioqumicos, que
afectan a la sntesis y la actividad de las enzimas, entre las que se incluyen mecanismos de

induccin, represin catablica y represin por producto final <Tabla VIII>.

Inhibicin
Producto
final

catablico

Celobiohidrolasa

Celobiosa

Glucosa o

Endoglucanasa

Celobiosa

metabol tos

Sefarosa

Celobiasa

Glucosa

de la glucosa

Celobiosa

Enzima

TABLA

VIII:

Represor
Inductor

Mecanismo bioqumico del control

Celulosa

de la sntesis

de celulasas en T.reesei.
A partir de la cepa salvaje de T.reesei QM6a, aislada en los laboratorios de Natick. y del
mutante QM9414, obtenido a partir de ella por tratamiento en acelerador lineal, se han ido
obteniendo distintas series de mutantes hiperproductores que se recogen en el esquema de
la figura 11. Aunque algunos de ellos, como el Rut-C-30, producen hasta 20 veces ms
protenas extracelulares que las cepas originales, se siguen buscando organismos ms eficientes con objeto de abaratar la fase de obtencin de enzimas, que constituye. en trminos
econmicos, alrededor del 60% del coste global de un proceso de hidrlisis enzimtica
(Nevalainen y col.. 1980; Bisaria y Ohose, 1981; Bailey y Nevalainen. 1981; Labudov y col..
1981: Tangnu y col., 1981; Ghosh, T.K. y col., 1982: Mandels, 1982; Mishra y col., 1982;
Enari, 1983: Montenecourt, 1983). En la tabla IX se comparan las actividades producidas
por distintos microorganismos celulolticos y mutantes obtenidos a partir de ellos.

33--

E. Longibrachiatuin

QN 6a <cepa silvestre)
<Natick, 1950)

Uy

acelerador lineal

QN 9123

117
(Rutgers, 1976)

(Natick,USA 1969)

acelerador lineal

NG14 (1977)

series!.

<Ce trusCorp.USA)

Rut NC 14

QN 9414

(Natick, 1971)

(Rutgers,USA 1978)

series VTTD
(VTT Finlandia)

series CL
MHC
(Bratislava

Checoslovaquia)

Uy

(Universidad

Paul Sabatier,
Francia)

RutC 30
(Ru

tge rs , 19 78)

MG (Instituto
Gulbenkian,
Portugal).
Rut-C 30 E
(Rutgers, 1979)
UVKabicidina

TK QA1
UVKabicidina
(Natick, 1977)

(IV
MCC-77
(Natick,1977)

MCC-SO

Figura llt Genealoga de los mutantes hiperproductores de celulasas.

34

En los ltimos aos, se han realizado nuevos estudios en el campo de la

Organismo

Celobiohidrolasa
(UI/m xlO )

Pestalotiopsis
westerdijkii 0M38
Penicillium
iriensis QM 9624
Trichoderma
reesei 014 6a
T.reesei QM 9123
Sclerotium
rolfsii CXC 142
S.rolfsii UV8
T.reesei QN 9414
flreesei MCG-77
T.xeesei NG14
T.reesei C30

2,93

50

0,15

11,58

81

0,77

18,91

59

0,3

0,55

29,26

96
200

1,68

11

190
110
100
135
150

18
0,5
0,9
1,35
0,3

TABLA IX:

Endoglucanasa Celobiasa Actividad PF

(IU/ml)
<UI/m)
(JI/m)

57,0
60,8
58,9

1,4
2,0
9,5
10,5
14,6
14,0

Actividades enzimticas obtenidas en cultivos de

diferentes cepas de microorganismos celulolticos.

(Kosaric et al., 1983).

ingeniera gentica con el objetivo de donar genes de celulasas en organismos de rpida

divisin <Montenecourt. 1983; Shoemaker y col., 1983: Teeri y col., 1983; Colmer y Wilson,
1983; Wilson y Walker, 1991>. Los principales obstculos encontrados en este caso han sido,

por un lado, la dificultad de donacin directa de genes de un organismo eucariota en

bacterias y por otro, el hecho de que las celulasas producidas por Treesel son glicoproteinas
y E.coli. el microorganismo utilizado tradicionalmente en ensayos de donacin, carece del
sistema bioqumico de glicosilacin de protenas. No obstante existe tanto inters por la
gentica que en la actualidad hay muchos grupos de investigacin trabajando en este tema.

Recientemente se ha conocido la estructura del centro activo de la celobiohidrolasa II. Esta

enzima est formada por 477 aminocidos y su centro activo est situado entre el aminocido 175 y el 184, lo que aumenta la posibilidad de disminuir el tamao de la enzima al

35

permitir eliminar los aminocidos no esenciales para la actividad aumentando, de esta

forma, la penetracin de la enzima en la compleja estructura de la celulosa (Genencor,
1989>. Mediante el empleo de avanzadas tcnicas de ingeniera gentica, parece confirmarse
la posibilidad de expresin de dichos genes en levaduras, lo cual, supondra la ventaja
adicional de poder reunir en un mismo microorganismo, la facultad de hidrolizar celulosa a
glucosa y de fermentar la glucosa hasta etanol <Van Arsdell y col., 1987; Love y Streiff,
1987 ; Honda y col., 1987>. La actividad en este rea de investigacin ha sido tan grande en
los ltimos diez aos que en 1989 existen ms de 30 diferentes genes de celulasas aislados
<Glick y Pasternak, 1989>. Se esperan grandes avances en los prximos aos.
En la actualidad, las enzimas utilizadas en los procesos de hidrlisis enzimtica son
obtenidas de cultivos en estado slido o sumergidos de mutantes de T.reesei (Esterbauer y
col., 1991>. Algunas de ellas se producen a escala industrial y se encuentran en el mercado
mientras que otras son producidas especficamente para los procesos en que son utilizadas.
1.3.1.3. Inductores y sustratos.
Aunque la naturaleza del inductor real de la sntesis del complejo celulolitico no se
conoce con exactitud, se sabe que tanto la celulosa como la celobiosa y la lactosa actan
como inductores naturales eficaces de la misma. En el caso de la celulosa, puesto que sta
es insoluble, cabra pensar que el verdadero inductor debera ser algn compuesto soluble,
derivado de su metabolismo. Adems de la glucosa, la celobiosa es el producto principal
formado en la degradacin de la celulosa. La glucosa y otras fuentes de carbono fcilmente
metabolizables. actan como represores de la sntesis de endoglucanasas y celobiohidrolasas
hasta tal punto que, en el caso de T.reesei, aunque ste crece muy bien en medios glucosados, no sintetiza enzimas celulolticos, hasta que no ha desaparecido completamente la
glucosa de los mismos. La celobiosa, sin embargo, se ha mostrado en diversas experimentos

realizados como un eficaz inductor de la sntesis de celulasas. Utilizando celobiosa como

inductor y nica fuente de carbono, se han conseguido producciones de enzimas tan altas
como las obtenidas con celulosa <Enari, 1983>, siempre que la concentracin de celobiosa en
el medio se mantenga baja. Para algunos hongos como T.reesei, se ha demostrado la existencia de una sntesis basal de celulasas independiente de la fuente de carbono que sera
responsable de una degradacin preliminar de celulosa a celobiosa que actuara como inductor del complejo.
La lactosa, aunque no se conoce su mecanismo de induccin, se sabe que acta corno
un inductor de la sntesis del complejo celuloltico a bajas concentraciones <Gong y Tsao.
1979>. A diferencia de lo que ocurre en el caso de la celobiosa, parece que altas concentraciones de este disacrido no inhiben el proceso de sntesis. Algunos mutantes de T.reesei son

capaces de sintetizar activamente celulasas cuando crecen sobre lactosa como inductor y
nica fuente de carbono <Dury y col., 1984>. En este caso, la glucosa y la galactosa actan

como catabolitos reguladores de la produccin de enzimas.

36

Asimismo, se ha observado el efecto inhibitorio de bajas concentraciones de sefarosa,

disacrido que se encuentra presente en algunas preparaciones industriales de glucosa que

estimulan la sntesis de enzimas celuloliticas. No se sabe con exactitud si la sefarosa es un
inductor natural en cultivos de T.reesei sobre celulosa, aunque el hecho de que este microorganismo posea actividades de transglicosilacin, necesarias para la sntesis de sefarosa,
apoya esta posibilidad. Al igual que en el caso de celobiosa, la induccin por sefarosa es
dependiente de la concentracin, producindose una inhibicin de la sntesis de enzimas
cuando la proporcin del disacrido en el medio es elevada (Nisizawa y col., 1971; Sternberg
y Mandels, 1979; Loewenberg, 1984; Mishra y Gopalkrishnam, 1984; Kawamori y col.,
1986>.
Con respecto a la 0-glucosidasa y como ya se coment anteriormente, esta enzima es
producida por todos los organismos celulolticos pero tambin por algunos que carecen de
celobiohidrolasas. Parece ser que existe una 0-glucosidasa constitutiva, intracelular muy
resistente a represin catablica, mientras que la frglucosidasa extracelular es reprimida
por glucosa e inducida por muchos 0-glucsidos como metil-0-D-glucsido, salicina y celobiosa. La celobiosa no acta como inductor de esta enzima.

37

1.3.2. Pretratamientos de los materiales lignacelulsicos.

Uno de los factores que contribuyen ms decisivamente a limitar el rendimiento de

un proceso de hidrlisis enzimtica de celulosa es la propia estructura de este compuesto. La

asociacin de la celulosa con lignina, que constituye una autntica barrera fsica a la penetracin de las enzimas celulolticas, unida a la cristalinidad de las molculas de celulosa,
dificultan en tal grado la accin de las enzimas que se hace necesario alterar previamente
mediante tratamientos diversos las caractersticas de dicha estructura.
Hay otros factores, tales como el grado de polimerizacin (DP> y de sustitucin de
las cadenas celulsicas, contenido en humedad y madurez de la fibra y la asociacin con
otras sustancias que tambin modifican la susceptibilidad de un sustrato celulsico a la
accin enzimtca. Como objetivos fundamentales de los pretratamientos de materiales

lignocelulsicos destinados a modificar sus caractersticas para favorecer el rendimiento de

la hidrlisis posterior, podran enumerarse los siguientes:

# reducir la cristalinidad de la celulosa.

1! disociar el complejo lignina-celulosa.
# aumentar el rea superficial de la fibra de celulosa.
# disminuir en la medida de lo posible la presencia de aquellas sustancias que dificulten
dicho proceso.

Un pretratarniento eficaz debera, adems, reunir otras caractersticas tales como:

bajo consumo energtico. bajos costes de inversin y mantenimiento, utilizacin de reactivos
baratos y fcilmente recuperables, y posibilidad de aplicacin a diversos sustratos. Existen
numerosos pretratamientos de materiales lignocelulsicos descritos en la bibliografa especializada <Fan y col.. 1982; Gharpuray y col., 1983; Ohose y col., 1983; Puri y Mamers,
1983; Martin y col.,1985; Vallander y Eriksson, 1985> y algunos de ellos son muy eficaces

con respecto al incremento del rendimiento de hidrlisis enzimtica. Sin embargo, no todos
son aplicables a escala industrial debido a los altos costes o las dificultades tcnicas que
conlenvan. En la tabla X, se relacionan distintos mtodos de pretratamiento utilizados para

aumentar la digestibilidad de los materiales lignocelulsicos.

Por su naturaleza, los pretratamiento se clasifican en tres grupos generales: qumicos, fsicos y biolgicos. La evaluacin de la efectividad de los mismos se hace en base al

rendimiento de hidrlisis posterior del material pretratado. en funcin del cual se determinan experimentalmente Jas condiciones ptimas de operacin en cada caso. A continuacin.
se describen brevemente dentro de los tres grupos citados algunos de los pretratamientos

ms estudiados.

-28-

FSICOS

QIJIMICOS

BIOLOGICOS

Molienda

Alcalis

Hongos

molino de bolas
molino de doble
rodillo
molino de martillos
molino coloidal

Hidrxido sodico
amoniaco
sulfito amnico
cidos

Vapor a alta presin

Extrusin
Expansin
Pi rl isis
Radiacin de alta energa

ac. sulfrico
ac. clorhdrico.
ac. fosfrico
Gases

dixido de cloro
dixido de nitrgeno
dixido de azufre
Agentes oxidantes
perxido de hidrgeno

ozono
Disolventes de celulosa
Cadoxen
CMCS
Organosolventes
extraccin:
etanol: agua
benceno:etanol
etilenglicol
butanol agua

Agentes de svelling

TABLA X: Mtodos utilizados

lignocelulosicos.

para el pretratamiento

39---

de materiales

1.3.2.1.

Pretratamientos tsicas.

Los pretratamientos fsicos se suelen dividir en dos categoras: mecnicos y no

mecnicos. En los primeros, se utilizan las fuerzas de impacto y cizalladura que conducen a
materiales de baja cristalinidad, mayor superficie especifica y densidad aparente ms alta.
Como consecuencia, se facilita la hidrlisis posterior, se disminuye el volumen del reactor y
se abarata el transporte de materiales. Entre estos pretratamientos cabe mencionar diferentes tipos de moliendas (molino de bolas, martillos, cuchillas, rodillo> as como procesos de
molienda e hidrlisis simultnea (Furcht y Sille, 1990>. Los pretratamientos de carcter
fsico no mecnico someten al residuo celulsico a la accin de agentes externos que provocan alteraciones diversas del material de partida. Entre estos, se encuentran los tratamientos con radiacin, la utilizacin de vapor a altas presiones y la pirlisis a temperaturas

intermedias.

Molienda y trituracin.

En general, los pretratamientos por molienda <que pueden efectuarse tanto por va
seca como por va hmeda> tienen el inconveniente de su alto consumo energtico. Aunqur
es necesario triturar el material lignocelulsico previamente hasta un cierto tamao para
facilitar su manejo posterior, el planteamiento de una operacin de molienda intensivo corno
pretratamento principal de un sustrato se considera poco recomendable para la economa

del proceso.

Radiacin de alta energa.

En cuanto al pretratamiento por irradiacin, de eficiencia comprobada en algunos

casos <Kurnakura y Kaetsu, 1982; Kumakura y col., 1982; Kumakura y Kaetsu, 1983;
Kumakura y Kaetsu, 1984; Khan y col., 1986>, adems de su alto coste, es tcnicamente
difcil de llevar a la prctica debido a que la baja densidad de los materiales lignocelulsicos
y las altas dosis requeridas obligaran al diseo de instalaciones demasiado complejas.
Puesto que en este trabajo se estudia el efecto de la radiacin gamma sobre el rendimiento
de hidrlisis enzimtica se discutirn, en posteriores apartados, aspectos concretos de este

pretratamiento.

Explosin por vapor.

El pretratamiento con vapor a alta presin (steam-explosion> combina los efectos,

sobre el material lignocelulsico, de altas presiones y temperaturas junto con la descompresin brusca posterior <Jusarek. 1979; Saddler y col.. 1982: Marchessault y col.. 1983; PuIs y
col.. 1983. Schultz y col., 1983>. Este pretratamiento que se basa en el proceso Mansonite,

40--

de aplicacin muy extendida en la industria papelera, tambin puede realizarse en presencia

de determinados agentes qumicos, cidos y bases. El resultado final es la obtencin de un
producto fibroso cuya fraccin celulsica es mucho ms accesible al ataque enzimtico. La
hemicelulosa que se despolimeriza en mayor o menor medida dependiendo de las condiciones
del pretratamiento es fcilmente recuperable por simples lavados, y la lignina, prcticamente inalterada, puede ser extrada y utilizada con fines diversos.
Para la aplicacin de este pretratamiento se han desarrollado algunos procesos comerciales en continuo y discontinuo cuyo objetivo es aumentar la digestibilidad de residuos
lignocelulsicos para su utilizacin como alimento de ganado o incrementar su rendimiento
en procesos de hidrlisis. Los aspectos concretos del tratamiento con vapor a altas presiones
se discutirn ms adelante junto, con los resultados obtenidos en este trabajo, para el caso
concreto de su aplicacin a la hidrlisis enzimtica de O.uervosum.

1.3.2.2. Pretratamientos qumicos.

El objetivo fundamental de estos pretratamientos es.en general, solubilizar la frac-

cin de lignina y modificar la estructura de las cadenas celulsicas de manera que sean
fcilmente atacables por las enzimas. Existen procesos de deslignificacin de fibras empleados tradicionalmente en la industria papelera, que a pesar de su gran eficacia para eliminar

lignina no son de gran utilidad como pretratamiento por estar diseados para respetar al
mximo la estructura de la celulosa. Entre los pretratamientos qumicos ms estudiados se

encuentran los tratamientos con lcalis, cidos. organosolventes y agentes oxidantes.

An para los ms eficaces pretratamientos qumicos, hay que reconocer la existencia
de inconvenientes que plantean serios problemas a la hora de ponerlos en prctica a gran
escala. Entre ellos, la necesidad de disponer de equipos fabricados con materiales especiales
resistentes a la corrosin, la exigencia de efectuar lavados sucesivos del sustrato pretratado
y la produccin de residuos qumicos contaminantes que hay que procesar y eliminar de
alguna manera.
Los mecanismos de accin de los agentes qumicos sobre el material lignocelulsico
son de varios tipos. Algunos actan solubilizando determinadas fracciones, tal como es el

caso de los tratamientos con solventes orgnicos <etanol. butanol. etilenglicol, etc) que
extraen la fraccin de lignina y que han sido fundamentalmente utilizados en los procesos de
elaboracin de pulpa de papel, o la solubilizacin de hemicelulosa con bajas concentraciones
de cido habitualmente empleado como fase previa a la hidrlisis cida de celulosa. La
mayor parte de los pretratamientos qumicos empleados persiguen sin embargo la ruptura
de los enlaces de hidrgeno en las regiones cristalinas de la fibra con objeto de abrir la
estructura y permitir el paso de los agentes hidroliticos. En este grupo hay que incluir la

utilizacin de cidos (H2S04. H3P04>. sales (ZnCI2>, lcalis (NaOH. NH3. Ca<OH>2 etc.>.

41--

De todos estos pretratarnientos, uno de los que han proporcionado mejores resultados es el tratamiento con NaOH tradicionalmente empleado para aumentar la digestibilidad

de la paja para alimentacin animal. El tratamiento con NH~ aunque menos efectivo que el
anterior tambin es interesante, sobre todo en el caso de residuos para alimento de ganado
puesto que produce un aumento del contenido en N2 orgnico del sustrato como consecuencia de la formacin de acetato amnico.
El resto de los pretratamientos qumicos o bien producen resultados menos satisfactorios o son excesivamente caros por la tecnologa o los reactivos que hay que emplear <por

ejemplo solventes rganicos> o incluso plantean problemas de toxicidad, como ocurre con el
cadoxen <solucin alcalina de etilendiamina> que acta como disolvente de la celulosa y que
produce un aumento del rendimiento de hidrlisis muy significativo.
Puesto que las condiciones del tratamiento y los resultados dependn en gran medida del tipo de sustrato utilizado, en este trabajo se han estudiado algunos de los pretratamientos qumicos anteriormente mencionados con objeto de comparar el efecto de todos
ellos sobre un mismo material. Los resultados obtenidos en cada caso se recogen en el
apartado correspondiente de esta memoria.

1.3.2.3.

Pretratamientos biolgicos.

Estos pretratamientos consisten en someter a la biomasa lignocelulsica a la accin

de microorganismos degradadores de lignina y hemcelulosa con lo que se destruyen as las
estructuras que protegen a la celulosa y se la hace ms accesible al ataque hidroltico. Un
problema que presentan un gran nmero de los mencionados microorganismos es que poseen tambin actividad celuloltica, consumiendo la celulosa preferentemente a la lignina.
Son numerosos los trabajos que tratan sobre el tema de la biodegradacin de la lignina <Kirk
y col.. 1986; Kadam y Drew, 1986; Sanglard y col.. 1986; Botany y col., 1987> y son
interesantes las investigaciones que en este campo se estn realizando para conseguir el

denominado biopulping, nuevo proceso de fabricacin de papel en el que la celulosa es

liberada de la lignina por medio de microorganismos ligninolticos y no mediante procesos
qumicos tradicionales.

1.3.3. Procesos de hidrlisis enzimtica.

De acuerdo con el esquema general de un proceso de hidrlisis enzimtica, el sustrato una vez sometido al pretratamiento, seleccionado de acuerdo con sus caractersticas
especificas, es hidrolizado, mediante la accin de las enzimas celuloliticas, hasta glucosa.
Las condiciones del proceso, temperatura. tiempo de hidrlisis, concentracin de enzimas y

42

relacin slido-lquido dependen del sustrato elegido y de las caractersticas y actividad

hidrolitica del complejo utilizado y deben por tanto ser determinadas experimentalmente
para cada caso concreto.
Estos parmetros unidos a la finalidad del proceso de hidrlisis de que se trate
determinan el modo de operacin ms adecuado en cada caso. Se han descrito numerosos
sistemas para llevar a cabo los procesos de hidrlisis enzimtica: continuos, discontinuos,
con enzimas inmovilizadas, con reciclado de enzimas, con fermentacin simultnea, biorreactores de membrana, etc., cada uno de los cuales presenta ventajas e inconvenientes que se
discutirn mas adelante junto con la descripcin de dichos esquemas operativos. Las dificultades para realizar a gran escala estos procesos no son slo de orden tcnico sino econmico,
ya que los productos resultantes deben competir, entre otros, con los derivados de la industria petroqumica cuyos precios son en la actualidad, inferiores a los que alcanzaron durante
la crisis energtica y que generaron unas perspectivas para la transformacin de celulosa
muy optimistas. Con el conflicto poltico del Golfo Prsico, se ha vuelto a considerar la
necesidad de una mayor dedicacin de recursos en la bsqueda de soluciones alternativas al

petrleo.
Los factores que influyen en mayor medida en el coste de la hidrlisis con enzimas

son la baja actividad especfica de las mismas y la fuerte inhibicin que experimentan por
acumulacin de los productos finales, fundamentalmente celobiosa y glucosa. Es por esto.
por lo que las variaciones ms importantes, diseadas sobre el esquema bsico del proceso,

han tenido como objetivo la reduccin o eliminacin de estos factores negativos. En esencia,
se ha tratado de recuperar y reutilizar las enzimas en operaciones sucesivas y eliminar el

efecto de los productos de hidrlisis separndolos del medio o transformndolos mediante

fermentaciones simultneas, acopladas o empleo de cocultivos.

1.3.3.1. Recuperacin e inmovilizacin de enzimas.

La inmovilizacin de enzimas, que es una tcnica ampliamente utilizada en los modernos procesos biotecnolgicos, presenta, en el caso concreto de las celulasas, muchos
inconvenientes debido a la insolubilidad del sustrato que dificulta enormemente la interaccin de ste con los enzimas inmovilizadas. A pesar de esto, se han descrito algunos trabajos
experimentales de inmovilizacin de celulasas con buen resultado en cuanto a retencin de
la actividad y reutilizacin de los lechos enzimticos <Woodward y col., 1982; Fadda y col.,
1984: Lobarzewski y Paszczynski, 1985; Wongkhalaung y col., 1985: Fujikawa y col., 1988:
Lee y Woodward, 1983> y utilizando como soportes para la inmovilizacin: sefarosa, dextranos activados, esferas de vidrio, etc. Esta tcnica no ha pasado, sin embargo, de la etapa de
laboratorio y aunque no parece muy viable para el caso de celulasas no se descarta la
posibilidad de su utilizacin para trasformacin de materiales lignocelulsicos sobre todo en

el caso de la 0-glucosidasa en cuyo caso no presenta la limitacin de la insolubilidad del

sustrato.

43-

Otra forma de disminuir el gasto de enzimas sera la de recuperar stas de los

hidrolizados mediante ultrafiltracin o adsorcin sobre sustratos frescos. El incoveniente de

estas tcnicas es que gran parte de las enzimas utilizadas, sobre todo exo y endoglucanasas,
permanecen adsorbidas al sustrato residual con lo que el complejo recuperado va desequilibrndose con respecto a su composicin original (Peitersen, 1975; Lee y col., 1982; Ooshima
y col., 1990> complicando el diseo de un proceso de este tipo.

1.3.3.2. Separacin de productas de hidrlisis.

La separacin de los productos de hidrlisis tiene por objetivo, como hemos dicho
anteriormente, eliminar o reducir la inhibicin que sobre la accin enzimtica ejercen dichos
productos, fundamentalmente glucosa y celobiosa y, que puede en timo termino detener el
proceso de hidrlisis.
ActuaJmente se estn estudiando dtversos sistemas que permitiran retirar estos

productos a medida que se generan. Entre ellos, estn los reactores de membrana de
ultrafiltracin. que son reactores convencionales equipados con una membrana de poro
adecuado para que las enzimas puedan ser retenidas mientras que el hidrolizado es retirado

y sustituido por medio fresco <Obose y Kostick, 1970: Grianfreda y Greco, 1980; Alifan y
col., 1983: Ohson y col., 1984>. Este es. en realidad, un sistema de ultrafiltracin que tiene
el inconveniente de producir medios con muy baja concentracin de azcares y por tanto un
incremento econmico y energtico del proceso global al tener que ser concentrados para
posteriores operaciones.
Otros sistemas que permiten el reciclado de las enzimas y la separacin de los
productos de hidrlisis son los sistemas acuosos de doble fase (Tjerneld y col., 1985a: 1985b:
1991>. Las dos fases de estos sistemas se forman con polmeros solubles como dextranos y
polietilenglicol que son biocompatibles por su alto contenido en agua. Los azcares formados

durante la etapa de hidrlisis se distribuyen en una de las fases, de donde pueden ser
separados mediante un sistema de ultrafiltracin o ser fermentados directamente, mientras
que las enzimas y el sustrato se distribuyen en la otra. Segn una comparacin recogida en
la bibliografa (Tjerneld y col., 1985b> el grado de utilizacin de enzimas (expresado como

actividad enzimtica, en unidades de papel de filtro consumidas por gramo de azcares

reductores formados> es de 35 para un proceso discontinuo clsico, 9,6 para un sistema de
ultrafiltracin y 16,6, para un sistema acuoso de dos fases, aunque este ltimo permite
obtener soluciones de azcares ms concentradas <5-7%> que Las obtenidas en reactores de

ultrafiltracin (1%>.

-44-

1.3.3.3. Procesos de sacarificacin y fermentacin simultnea y

acoplada.
La acumulacin de glucosa y otros azcares en el medio de hidrlisis tambin puede
evitarse utilizando procesos de sacarificacin y fermentacin simultnea (SES> en los cuales
los azcares, producidos por la accin de las celulasas sobre el material celulsico,
son,simultneamente, transformados en etanol mediante levaduras o bacterias, fundamentalmente Saccharomyces o Zymomonas (Viikari y col., 1981; Ghosh y col., 1982; Asenjo y
Jew, 1983; Deshpande y col., 1983; Kosaric y col., 1983; Ohose y col., 1984; Spangler y
Emert, 1986; Wright y col., 1987; Spindler y col., 1989; Szczodrak, 1989>. Empleando
levaduras como Cndida vickerhamrni, que no slo transforma en etanol la glucosa sino que
tambin es capaz de utilizar celobiosa y celodextrinas, se podra, incluso, reducir la limitacin del rendimiento final de transformacin originado por la baja actividad que, en general,
presenta la 0-glucosidasa de la mayora de los complejos celulolticos (Freer y Wing, 1985>.
El principal inconveniente de este tipo de procesos radica en las diferentes condiciones, sobre todo de temperatura, que requieren las dos fases que lo constituyen. Habra que
establecer soluciones de compromiso para las distintas variables de operacin, as, la temperatura podra mantenerse alrededor de unos 40W, que es un valor intermedio entre la
temperatura ptima para la actuacin de celulasas <40-50W) y la correspondiente a las
levaduras <30-350C>. Este problema se podra, tambin, solventar con la utilizacin de microorganismos fermentativos termotolerantes, que aportaran la ventaja, al trabajar a altas
temperaturas. de facilitar el proceso de destilacin del etanol y disminuir su coste. Con el

proceso SFS se elimina, adems, la necesidad de utilizar reactores separados, reducindose

por tanto el coste de instalacin y operacin (Blanco y col.. 1982>.
Entre los procesos de SFS descritos, cabe destacar el proceso de la Gulf Oil
Corporation realizado con celulasas de Trichoderma reesei QM 9414 y la levadura
Saccharomyces oerevisiae skl utilizando solka-floc BW200 (Kosaric y col., 1983>. Asimismo
Szczodrak (1988) ha estudiado el proceso de SFS utilizando celulasas de T.reesei junto con
Ktuyveroniyces fragilis sobre paja de trigo sometido a diferentes pretratamientos, consiguiendo productividades muy superiores a las obtenidas al realizar ambos procesos por
separado. Sin embargo el proceso de SFS ms importante en la actualidad es el patrocinado

por el Departamento de Energa de EE.UU. (DOE> y realizado en el Solar Energy Research

Institute <SERI> de Colorado <Wyman, 1990>.
Este proceso SF5 est integrado en un gran proyecto de produccin de etanol a

partir de cultivos energticos <herbceos y leosos> cuyo objetivo es la obtencin de etanol a

un precio competitivo con el de la gasolina para utilizarlo como combustible en automocin
en EE.UU.
Este proyecto comenz en 1980 y sus objetivos principales son obtener unas materias primas muy baratas (altas productividades de los cultivos energticos>, mejorar el

proceso de hidrlisis y fermentacin <enzimas y levaduras) y aprovechar ntegramente los

45

productos mayoritarios de la biomasa (hemicelulosa, celulosa y lignina>. En este proceso se

utiliza un pretratamiento con cido sulfrico diluido, aunque tambin se estudia el tratamiento con. organosoiventes. El complejo enzimtico lo obtiene la empresa Genencor del
T.reesei. pero continan trabajando en produccin de enzimas procedentes de hongos <con
fermentadores de lecho fluidizado) y de bacterias productoras de celulasas termoresistentes
(Acidotermnus cettulolyticusj.

La fermentacin se realiza con la intervencin del S.cerevisiae (fermenta la glucosa>

y del Brettanomycs clausenii que fermenta la colobiosa producida en la hidrlisis de la
celulosa, solucionando, de esta forma, los problemas de inhibicin por producto final de las
enzimas endo y exoglucanasas.
El problema de la fermentacin de la xilosa derivada de la fraccin de hemicelulosa
lo estn resolviendo en un proceso simultneo, utilizando la enzima isomerasa inmovilizada
<cataliza la conversin de xilosa a xilulosa>. obtenida por manipulacin gentica del E.coli y
levaduras.
El aprovechamiento de la lignina lo estn estudiando a travs de procesos termoqmmicos para la produccin de metil-aril-teres <MAE), compuestos que incrementan el octanajo de las gasolinas sin incrementar la presin de vapor de las mezclas.
El esquema del proceso de produccin de etanol a partir de biomasa lignocelulsica
propuesto por el SERI est representado en la figura 12.

Fruto del esfuerzo realizado por el UGE en estos diez aos (1980-1990> es el hecho
de que el precio del etanol estimado se ha reducido desde 3.60 $/galn en 1980 a 1,85
$/galn en 1989. Sin embargo, el objetivo del Programa es una reduccin de costes hasta 0,6
$/galn <aproximadamente 20 pts/l a valor actual del $= 100 pts) basados fundamentalmente en mejoras tecnolgicas de las distintas etapas del proceso que incluyen en todos los
casos los avances cientficos que se prevn pueden realizarse a corto y medio plazo <Wyman,
1990>.
La sacarificacin y fermentacin simultnea tambin se puede llevar a cabo utilizando microorganismos con capacidad para realizar ambas funciones. En este sentido, adems
de los intentos de expresar los genes de celulasas en levaduras, tambin se llevan a cabo

estudios genticos con microorganismos que, aunque con bajos rendimientos, pueden transformar celulosa en etanol directamente. Este es el caso de Clostridiun th.ermocetlnn que es
un organismo altamente celuloltico que fermenta celulosa y los productos de degradacin,
fundamentalmente glucosa y celobiosa, produciendo etanol, C02 y cidos orgnicos. El
gnero Moni/ja tambin puede utilizarse en estos procesos ya que adems de celulosa puede
utilizar hemicelulosa y sustancias pcticas como fuente de carbono <Gong y col.. 1981>. La

46

Lignocelulosa

Mosto

Xilosa

1
Lgnna

de xilosa

Etanol
Recuperacn
de lignina 4

Metl-aril-ter

Figura 12. Proceso de produccin de etanol a partir de bomasa lignocelulsica (Wrgth

1987)

47

principal limitacin de este tipo de microorganismos es que debido a la heterogeneidad de su

metabolismo producen un rendimiento bajo de transformacin y en el caso de C/ostridiun
existe el problema adicional de la inhibicin de su metabolismo por la acumulacin de etanol
incluso a bajas concentraciones.
Los principales procesos que emplean microorganismos con capacidad de sacarificacin y fermentacin son: MIT, GE/CITA y PEN/Arkansas.

1.3.3.4. Utilizacin de cocultivos.

La obtencin de etanol a partir de materiales celulsicos ha sido, asimismo, abordada
utilizando cocultivos de organismos con capacidad celuloltica y fermentativa, evitando de
esta forma la fase de produccin y obtencin de enzimas. Este tipo de procesos se ha
estudiado ampliamente con bacterias termoflicas del gnero Ciostridium como Cl. Mermoce/muz, Cl. thermosaccharolyticumn y CI.thermohydrosulfuricum. El primero de ellos es un
organismo altamente celulolitico que fermenta la celulosa y sus productos de degradacin.
fundamentalmente celobiosa y glucosa, produciendo etanol, 002 y cidos orgnicos. Puesto

que esta bacteria es capaz de degradar hemicelulosas pero no de fermentar las pentosas
producidas, su cultivo con cualquiera de las otras dos especies aumenta significativamente el
rendimiento en etanol, ya que estas ltimas son capaces de utilizar tanto las pentosas como
la glucosa y la celobiosa producidas por la primera (Gomez, 1982; Ng y Zeikus, 1982>.
Tambin se han obtenido buenos resultados utilizando cocultivos de CI.thermocellunz con
bacterias productoras de etanol como Zymononas mobilis <Kosaric y col., 1983>.
Como inconvenientes principales de los cocultivos hay que sealar la dificultad de
controlar y mantener un proceso en el que deben coexistir poblaciones microbianas diferentes y cuyas exigencias pueden ser en algunos casos difciles de hacer compatibles.
De lo anteriormente expuesto, se puede concluir que no hay un proceso de eficacia

demostrada para llevar a cabo la etapa de hidrlisis, pero s hay diferentes opciones sobre
las que se puede trabajar en cada caso concreto (tipo de sustrato, tipo de enzima, productos
que se quieren obtener, etc>, para conseguir buenos resultados. La puesta en prctica de
estos procesos depende no slo de la resolucin de las cuestiones tcnicas que se plantean
sino tambin de factores econmicos tales como competencia de los productos obtenidos a
partir de la celulosa con los obtenidos por otras vas, precio del petrleo. y por tanto de los
productos derivados de la petroqumica, etc, que son variables y por tanto difciles de

evaluar.
No obstante, y por los datos econmicos y tcnicos recogidos en la bibliografa y
parcialmente expuestos anteriormente, parece recomendable profundizar en el estudio del
proceso de SF5. as como en la determinacin del pretratamiento ms adecuado para la
biomasa seleccionada segn los criterios expuestos. El hecho de que organismos tan impor-

48

tantes como el OQE y el SERI apoyen y estudien ese proceso como medio para producir

etanol y solventar as sus problemas de obtencin de combustibles lquidos, nos anim a

emprender esta tesis con la que modestamente podemos contribuir en nuestro pas a obtener energa (en forma de combustible lquido> y materias primas que ayuden al ahorro de
petrleo.

49

2.

OBJETO E INTERES DEL TEMA

2. OBJETO E INTERES DEL TEMA.

En el presente trabajo se estudia la hidrlisis enzimtica de la celulosa de
Onopordunt nervosiun boiss utilizndo un complejo enzimtico obtenido a partir de
Trichodernzo reesel QM9414.

La disminucin de las reservas de combustibles fsiles y el aumento del precio de los

mismos ha concentrado durante los ltimos aos mucha atencin en la investigacin y
desarrollo de nuevas fuentes de energa y materias primas. La celulosa, por su abundancia
y su capacidad de ser renovada continuamente en la naturaleza, ha sido, de entre dichas
fuentes, una de las ms estudiadas. Para su utilizacin, pueden aplicarse diversos procesos
de transformacin en funcin de la finalidad concreta que se persiga. Entre estos procesos,
uno de los ms prometedores es la hidrlisis mediante enzimas, para su conversion en
glucosa, que puede ser empleada directamente para alimentacin humana y animal o como
sustrato de transformaciones para obtener SCP, combustibles o compuestos qumicos
diversos.
En este contexto y teniendo en cuenta las perspectivas que presenta O. netosum
(cardo silvestre> para su introduccin en algunas zonas de Espaa como cultivo alternativo
productor de lignocelulosa, se ha considerado el inters de realizar un estudio detallado de la
transformacin por hidrlisis enzimtica de la biomasa de dicha especie.
Los objetivos parciales que se han abordado en el desarrollo de este trabajo para la
consecucin del objetivo final del mismo, han sido los siguientes:
1. Obtencin de un complejo celuloltico a partir de Trichodermna reesez
QM94 14. Este apartado ha incluido el estudio de las condiciones de crecimiento del microoorganismo y de la produccin de enzimas, as como la caracterizacin de la actividad enzimtica de la preparacin obtenida y de las
condiciones ptimas de hidrlisis para dicha preparacin.
2. Evaluacin de la efectividad de distintos pretratamientos sobre el rendimiento de la hidrlisis de k biomasa de O. n.eLosun. Este estudio ha incluido
el seguimiento de las alteraciones experimentadas por los otros compuestos
mayoritarios de la biomasa. hemicelulosa y lignina con objeto de dar una
vision global del efecto del pretratamiento sobre dicho material, y

3. Seguimiento del proceso de hidrlisis de O. n.ervosum pretratado de acuerdo

con las condiciones ptimas seleccionadas en el apartado anterior y utilizando
el complejo enzimtico producido en la primera fase del trabajo.

50--

3.

MATERIAL Y METODOS

3. MATERiAL Y METODOS.
3.1.

PRODUOCION DE CELULASAS.

3.1.1. Cepas productoras de celulasas.

El organismo ideal para la obtencin de celulasas es aqul que siendo estable, produce altas concentraciones del complejo enzimtico completo, con un bajo requerimiento en
nutrientes solubles, en un corto tiempo, sin ser adems suceptible a ningn tipo de represin catablica. Los que ms se ajustan a este modelo ideal de productor son los mutantes
de T. iongibrachiarwn. Para el desarrollo del trabajo de investigacin correspondiente a esta
memoria, se ha utilizado el mutante QM 9414. El complejo enzimtico producido es completo (endoglucanasas, celobiohidrolasa y ~.glucosdasa>, extracelular y con actividad suficiente
como para abordar la hidrlisis de la celulosa.
La cepa QM 9414 es lo suficientemente estable, como para permitir su manejo en
medios slido o lquido mediante las tcnicas de resiembra e inoculacin habituales.
3.1.2. Cepa productora.
Para la obtencin de las celulasas se utiliz la cepa QM9414 del mutante hiperproductor Trichoderma longibrachiatmn <CECT 2414). procedente de la Coleccin Americana
de Cultivos Tipo <ATCC> va Coleccin Espaola.
3.1.3. Medios necesarios para el mantenimiento, caracterizacin, cre-

cimiento y produccin.
Para desarrollar las diferentes etapas que integran el proceso de produccin de
celulasas a partir de microorganismos fue necesario utilizar distintos medios slidos o lquidos para mantener las cepas, comprobar su estabilidad, o para abordar la fase de produccin
masiva de enzimas. Dichos medios, son los que se describen a continuacion.
3.1.3.1. Medias slidos de crecimiento.
La preparacin de un inculo destinado a produccin de enzimas utilizando estos
mutantes, requiere disponer de suspensiones de esporas procedentes de cultivos jvenes,

<7-14 das> sobre medios slidos. Para el crecimiento y conservacin de las mismas se han
utilizado los medios comerciales convencionales de agar-patata o de agar-malta. Cuando se
observ un mal crecimiento sobre medios sintticos, se pas a utilizar sustratos naturales
como patata cocida. En el anexo 1 se encuentra recogido la composicin de dicho medio.

51

3.1.3.2. Medios lquidos para la preparacin de inculo y para la produccin en

fermentador.
Para la preparacin de inculos y medios nutritivos de crecimiento en matraz y
fermentador se utiliz un medio lquido salino, fuertemente tamponado, al que se aadi el
sustrato hidrocarbonado que actuara como inductor en la sntesis de celulasas. La composicin del medio fue variable segn la concentracin de sustrato. En el anexo 1 se muestra la
composicin de los diferentes medios empleados.
3.1.3.3. Preparacin del mcula.
Para la preparacin del inculo se parti de una suspensin de esporas obtenidas a
partir de cultivos en medio slido de 7-14 das de edad. Las suspensiones de esporas
contenian 2,5-3,0 106 esporas/m, aadindose 1 ml de la suspensin por cada 100 ml de
medio salino del inculo.
El pH inicial del inculo se ajust a 5,5-6. Se mantuvo a 28W y una agitacin que
garantizaba una buena oxigenacin del medio, sin alterar el micelio ni los agregados de
micelo-celulosa que se producen.
3.1.4. Condiciones tsico-qumicas necesarias para la puesta en mar-

cha de la produccin en fermentador.

El inculo bien crecido se aadi al medio de produccin del fermentador. que contena como nica fuente hidrocarbonada celulosa. El fermentador utilizado para la produccin
de celulasas fue un fermentador Biotec de 2-9 litros de capacidad. en el que se pueden
prefijar las condiciones de temperatura <28-30W) y agitacin <200 rpmi. El pl-! del medio del
fermentador se ajust entre 5-5,5 prefijndose el nivel mnimo de pH a alcanzar en 3.5. La
adicin de base o cido <NH4OH 2N o cido fosfrico 0.5N) era automtica, mediante bomba
peristltica y en las cantidades requeridas por la marcha del proceso. La temperatura se fij
durante el proceso en 28-30W. La adicin de antiespumante. tambin automtica, estaba
controlada por una sonda de contacto. Un problema que se plante frecuentemente fue la
formacin de espumas. La espuma que apareci generalmente alrededor de las 60 horas era
muy consistente y difcil de eliminar una vez formada, an incluso mediante el empleo de
antiespumante. Slo corrigiendo la aireacin y la agitacin se logr minimizar en parte el
problema. Parece que el alto contenido en protenas del medio es la causa del aumento

gradual de espumas a partir de cierto momento del proceso. La concentracin de sustrato

utilizado <Solka Flock HW 200) fue del 1 y 2 % (/V>.

3.2. ESTUDIO DEL COMPLEJO CELULOLITICO

3.2.1. Precipitacin y concentracin del complejo enzimtico.
Una vez finalizado el proceso de produccin en fermentador, se procedi a la separacin a partir del medio lquido de la fraccin que contena las enzimas. Para ello, se yaci el

52--

fermentador y se pas el medio de cultivo por unos filtros de luz de malla de 0,1 mm de
dimetro. Con esta primera filtracin se lograba separar la fraccin de celulosa y micelio del
medio lquido. Se realiz posteriormente otra filtracin, con el fin de eliminar los slidos en
suspensin restantes. Finalmente el complejo enzimtico fue concentrado, a partir del lquido obtenido por filtracin del medio de cultivo del hongo, utilizando un equipo tangencial
<PELLICON, Millipore> que permite concentrar hasta 9 veces, molculas disueltas cuyo
peso molecular sea superior a 10.000, entre las que se encuentran los componentes del
complejo celulolitico. Sobre este concentrado se realizaron las determinaciones finales del
proceso. Para la conservacin de las enzimas obtenidas, el concentrado obtenido fue liofilizado y conservado en nevera hasta su utilizacin.

La determinacin de las actividades y cinticas del complejo enzimtico as como los

estudios de hidrlisis se llevaron a cabo en un principio disolviendo el liofilizado en tampn
citrato 0,OSM, PH 4,8. Sin embargo, los anlisis posteriores del liofilizado por 1-IPLC presentaron poblemas derivados de la interaccin entre dicho tampn y los componentes de las
columnas de separacin. Por este motivo, se procedi a una seleccin entre distintos tampones de diferente molardad, con objeto de encontrar uno en el que la actividad del complejo
no resultara afectada y que no presentara los inconvenientes citados anteriormente. Entre
los tampones ensayados: citrato, fosfato y acetato con concentraciones niolares que variaron

desde 0.025 M hasta 0.15 M, se eligi el acetato 0,1 M que cumpla los requisitos indicados
y que sustituy desde ese momento al tampn citrato 0.05M en todos os ensayos de
hidrlisis.

3.2.2. Medida de la actividad enzmtica.

Puesto que el complejo enzimtico est constituido por diversas enzimas es necesario emplear diferentes ensayos para determinar las diferentes actividades enzimticas. Las
tres pruebas ms utilizadas para establecer la capacidad de un complejo celuloltico de
hidrolizar celulosa son: la actividad sobre papel de filtro, la actividad sobre carboxi-metilcelulosa (CMC> y la actividad de 0-glucosidasa. A continuacin, se recoge la metodologa

detallada para
elaboradas por
sido utilizados
entre distintos

la realizacin de cada una de estas pruebas, de acuerdo con las normas

la IUPAC en 1984 con objeto de unificar los distintos mtodos que haban
hasta esa fecha y que dificultaban por tanto la comparacin de resultados
grupos de trabajo (Ghose, 1987>.

3.2.2.1. Determinacin de la actividad sobre papel de filtro.

Reactivos
-

Tira de papel de filtro Whatman n01 (1 x 6 cm ).

Tampn citrato 0,05M. pH 4,8.
DNS.
Solucin de glucosa en tampn citrato (10 mg/m>.

Procedimiento

53

2.

3.

1.Deben hacerse al menos dos diluciones en tampn citrato de la solucin de enzima

cuya actividad se quiere medir. Una de ellas debe liberar en el medio de reaccin
algo menos de 2 mg y la otra algo ms de 2 mg de azcares reductores expresados
como glucosa. Aunque las diluciones que liberan esta cantidad de reductores deben
ser estudiadas para cada caso particular, se puede deducir de nuestras experiencias
con distintas soluciones de celulasas, que stas corresponden, generalmente, a
concentraciones de protenas solubles (calculadas segn el mtodo de Lowry> comprendidas entre 0,1 mg/ml y 1 mg 1 ml.
Los patrones de glucosa se preparan a partir de una solucin de glucosa, en
tampn citrato 0.05M. pU 4,8 de 10 mg/mi de concentracin. Las diluciones,
realizadas con el mismo tampn citrato, tienen una concentracin final de 3,3; 2,5;
1,65 y 1,0 mg en 0,5 ml respectivamente.
La reaccin enzimtica se lleva a cabo en tubos de ensayo de unos 25 mi de
capacidad. En la siguiente tabla, se detallan los volmenes de reactivos que se
incorporan en las distintas muestras.

MUESTRA

PATRONES

BLANCO

PROBLEMA

GLUCOSA

ENZIMA

1 ml

1 ml

Tampn citrato

1 ml

Disolucin enzimaj
(2 diluciones)

Glucosa
Tira de

4.

papel

O,Sml

CERO

1,5 ml

0,Sml

0,5 ml*

~
-

de la dilucin de glucosa correspondiente.

Las muestras problemas se atemperan a 50W antes de aadir la tira de papel de

filtro. Es importante que el papel quede sumergido, en su mayor parte. en la

mezcla de reaccin. La incubacin de las muestras se realiza durante 60 minutos a

50W en un bao de agitacin.
5.

Una vez transcurrido el tiempo de incubacin se aade 3 ml del reactivo 3,5dinitrosaliclico (Anexo 1> a todos los tubos. incluyendo muestras problemas. patrones de glucosa, blanco de enzima y cero. Despus de agitar se introducen durante
cinco minutos en un bao con agua hirviendo y se transfieren posteriormente a un
bao de agua fra. Se aaden 20 ml de agua destilada a cada tubo y se agitan
invirtindolos varias veces hasta que la mezcla sea uniforme. Luego se deja reposar
unos 20 minutos para que la pulpa de papel se deposite en el fondo de los tubos y
se lee la densidad ptica del sobrenadante a 540 nm. frente al blanco de enzima.

54--

Clculo dc la actividad.
Definicin de la unidad de papel de filtro (UPF>.
La UPF est basada en la Unidad Internacional (UI>, que corresponde a una conversin de sustrato de 1 pmol en 1 minuto. En el caso de actividad enzimtica sobre papel de
filtro, la UPF se define como la formacin de 1 pmol/min. de azcares reductores medidos
como poder reductor de glucosa, en las condiciones de ensayo descritas previamente.
Debido a la ausencia de linealidad entre la dilucin de enzima y los azcares reductores liberados durante el ensayo, la actividad enzimtica sobre papel de filtro debe medirse a
una concentracin de enzima que libere en el medio de reaccin una cantidad absoluta de 2
mg de azcares reductores, expresados como glucosa, que es el punto en donde la relacin
entre ambas variables se hace razonablemente lineal. Haciendo las transformaciones correspondientes se comprueba que 2 mg de glucosa en las condiciones de ensayo descritas
corresponde a 0,37 pmoles de glucosa liberados por minuto y por ml de la dilucin enzimtica ensayada o lo que es lo mismo 0,37 UI por ml de dilucion.
Clculo de las UPF de la disolucin enzirntica.
1.
2.

3.

4.

Se ajustan los valores de absorbancia obtenidos para los distintos patrones de

glucosa a una recta.
Se calculan sobre la ecuacin de esa recta los valores de glucosa que corresponderan a las absorbancias obtenidas para las muestras poblema (despus de deducir el
valor del blanco de enzima correspondiente).
Se representan en papel semilogaritmico los valores de glucosa obtenidos frente a
las concentraciones <inversas de las diluciones> de solucin de enzima correspondiente, y se estima el valor de la concentracin que liberara exactamente 2 mg de
azcares reductores.
Se calcula la actividad <UPF>

0,37
UPF=

1
unidades ml

C
C= concentracin de enzima que liberara 2,0 mg de glucosa.

Cuando se trate de disoluciones de baja actividad enzimtica. puede ser que incluso la
muestra no diluida libere en el ensayo menos de los 2 mg. de azcares reductores. En este
caso, el clculo de actividad se realiza a partir de la cantidad de glucosa liberada empleando
la siguiente expresion:

55

UPF/ml de solucin de enzima=mg.de glucosa liberados x 0,185*

*1 mg. de glucosa liberada equivale a 0,185 111/m:

1,0

lmg de glucosa #

pmol.min

1
.ml

1
=

0,185 UI.ml

O, 18x0, 5x60
3.2.2.2. Determinacin de la actividad sobre OMO.
Reactivos:
-

Carboximetilcelulosa (1%>. La carboximetilcelulosa <viscosidad media. D.S.=0.5> se

disuelve en agua caliente y luego se aade tampn citrato O,5M pH4.8 en una
proporcin tal que la concentracin final de citrato sea 0.05M.

Tampn citrato O.05M. pH 4,8.

DNS.
Solucin de glucosa en tampn citrato (10 mg/m).

Procedimiento:
1.

Deben hacerse al. menos dos diluciones en tampn citrato de la disolucin de

enzima cuya actividad se quiere medir. Una de ellas debe liberar en el medio de
reaccin algo menos de 0,5 mg y la otra algo ms de 0.5 mg de azcares reductores
expresados como glucosa.

2.

Los patrones de glucosa se preparan a partir de una disolucin de glucosa. en

tampn citrato 0.05M, pI-! 4,8 a una concentracin de 5 mg/ml. Las diluciones,
realizadas con el mismo tampn citrato, tienen una concentracin final de 1,0; 0,7;
0,5 y 0,25 mg en 0,5 ml respectivamente.

3.

La reaccin enzimtica se lleva a cabo en tubos de ensayo de unos 25 ml de

capacidad. En la siguiente tabla, se detallan los volmenes de reactivos que se
incorporan en las distintas muestras.
Las muestras problemas se incuban a 500C durante 30 minutos en un bao de

4.

agitacin. Una vez transcurrido el tiempo de incubacin se aade 3 ml del reactivo

3,5-dinitrosaliclico <ver anexo 1) a todos los tubos, incluyendo muestras problemas,

patrones de glucosa, blanco de enzima y cero. Se agita y se introducen durante

cinco minutos en un bao con agua hirviendo y se transfieren posteriormente a un

bao de agua fra. Se aade 20 ml de agua destilada a cada tubo y se agita
invirtindolos varias veces hasta que la mezcla sea uniforme y se lee la densidad
ptica de las muestras a 540 nm. frente a la muestra cero.

56

MUESTRA

PATRONES

PROBLEMAS GLUCOSA

CMC (1%)

0,5 ml
0,5 ml

Glucosa
*

CERO

ENZIMA

0,5 ml

Tampn citrato
Disolucin enzima
(2 diluciones)

BLANCO

0,5 ml

1 ml

0,5 ml

0,5 ml*

de la dilucin de glucosa correspondiente.

Clculo de la actividad.
Teniendo en cuenta que la relacin entre concentracin de enzima y azcares reduc-

tores liberados se hace aproximadamente lineal cuando, la cantidad de azcares reductores

liberados como glucosa oscila alrededor de 0,5 mg <en las condiciones de ensayo descritas
previamente>, la actividad sobre CMC debe medirse utilizando diluciones de enzima que

produzcan algo ms y algo menos de este valor para as deducir la concentracin de enzima
que liberara exactamente 0,5 mg de glucosa.
De acuerdo con el valor de Unidad Internacional, definido en el apartado correspondiente a la actividad sobre papel de filtro, se deduce que 0,5 mg de glucosa corresponden a
0.185 pmoles de glucosa por minuto y por ml de la dilucin enzimtica ensayada, es decir.
0.185 UI/m.

Clculo de la actividad sobre CMC en la disolucin de enzima.

1.
2.

Se ajustan los valores de absorbancia obtenidos para los distintos patrones de

glucosa a una recta.
Se calculan sobre la ecuacin de esa recta los valores de glucosa que corresponden a las absorbancias obtenidas para las muestras poblema (despus de deducir
el valor del blanco de enzima correspondiente>.

3.

Se representan en papel semilogaritmico los valores de glucosa obtenidos frente

a las concentraciones <inversas de las diluciones> de solucin de enzima correspondiente, y se estima el valor de la concentracin que liberara exactamente 0.5
mg de azcares reductores.

5-

4.

Se calcuta la actividad CMC:

CMC=

0,185

IJIm

C
C= concentracin de enzima que liberara 0,5 mg de glucosa.
3.2.2.3. Determinacin de la actividad de ~-glucosidasa (Bailey et al.1981>.

Reactivos:
-

4-nitrofenil-0.D-glucopiransido <Merck Rfa 6753) lmM en tampn citrato 0,05 M

pI] 4,8.

Solucin de 4-nitrofenol <10 Mg/m> en tampn citrato 0,05 M pH 4,8

Carbonato sdico 1M

Procedimiento
1.

A partir de una disolucin de 4-nitrofenol en tampn citrato (10 pg/ml>, se preparan

las disoluciones que se utilizan como patrones con las siguientes concentraciones:
10; 7,5; 5; 2,5 y 1,25 ng/ml.
2.

La reaccin enzimtica que consiste en la liberacin de 4-nitrofenol a partir de

4-nitrofenil-0-D-glucopiransido se lleva a cabo en bao de agitacin a 50W durante 10 minutos. Las muestras se preparan como se detalla en la siguiente tabla.

MUESTRA
PROBLEMA

4nitrofenil~--0
glucopiransido 1 mM

1,8 ml

Solucin enzima

0,2 ml

4nitrofenol

PATRONES

CERO

1,8 ml

2 ml*

Tampn citrato

0,2 ml

0,5 14 pH 4,8

*de la dilucin de 4nitrofenol correspondiente.

3.

Transcurridos los 10 minutos, la reaccin se detiene aadiendo a cada muestra 1

ml de Na2CO3 1 M. La lectura de la absorbancia se realiza a 400 nm frente a la
muestra cero.

58

Clculo de la actividad.
La actividad enzimtica de frglucosidasa se suele expresar en nKat. El nKat se
define como la cantidad de enzima que libera 1 nmol/s de 4-nitrofenol en la mezcla reaccionante en las condiciones descritas <lnkat 0,06 U!>.
3.2.3. Determinacin de protenas solubles.
El mtodo empleado para la determinacin de protenas fue el de Lowry y col.
<1950>, que tiene como fundamento la aparicin de color, resultado de la reaccin de Biuret

de las protenas con el in cobre en medio alcalino y de la reduccin del fosfomolbdicofosfotngstico por la tirosina y el triptfano presentes en las protenas totales.
Procedimiento:
Se utiliza un volumen de muestra de 1 m, en una concentracin presumible de
protenas comprendida en la curva patrn (preparada con disoluciones de seroalbmina
entre 50 y 200 pg/ml>. Se aaden 5 ml de la disolucin C (ver Anexo 1>. se agita y se dejan
en reposo 10 minutos. Transcurrido este tiempo se aaden 0,5 ml de reactivo O (Anexo 1).
se agita inmediatamente, y se dejan las muestras 30 minutos en reposo para conseguir el
desarrollo (le color. La lectura de la absorbancia se realiza en espectrofotmetro a longitud
de onda de 757 nm frente a un blanco tratado de forma idntica a la muestra problema en
el que esta ltima es sustituida por agua destilada.

3.3. CARACTERIZACION DE LA MATERIA PRIMA Y DE LOS

PRODUCTOS DE HIDROLISIS.
En este apartado se indican los mtodos analticos utilizados para caracterizar la
materia prima tanto nativa como pretratada y los productos de hidrlisis de la biomasa
lignocelulsica:
3.3.1. Materia prima.
Como materia prima de partida en este trabajo se ha utilizado parte area desecada
<6-10% humedad> del cardo Onopordum neuosum boiss procedente de una plantacin experimental situada en los Campos de Prcticas de la Escuela Tcnica Superior de Ingenieros

Agrnomos de Madrid.
La fotografa de la figura 13, muestra algunos ejemplares de la citada especie en los
que se puede observar el gran desarrollo que alcanzan las plantas, algunas veces de altura
superior a los 3.5 metros.

59

3.3.2. Caracterizacin de la materia prima.

3.3.2.1. Determinacin de la humedad : segn norma Tappi, T-llm-59.
3.3.2.2. Determinacin de la solubilidad en NaOH 1%:norma Tappi T-4m-59.
3.3.2.3. Determinacin de la solubilidad en agua(fra y caliente):norma Tappi T-lm-59.
3.3.2.4. Extracto en ter : norma Tappi T-5m-59.
3.3.2.5. Extracto en alcohol-benceno: norma Tappi T-6m-59.
3.3.2.6. Anlisis de componentes. Hidrlisis total con cido sulfrico.
Existen diversos mtodos para el estudio de la composicin en celulosa, hemicelulosa
y lignina de biomasa lignocelulsica. Despus de algunos estudios previos realizados sobre
Onopordrtm nervosunt en los que se evaluaron tanto los resultados obtenidos como la complejidad de dichos mtodos se decidi emplear el mtodo descrito por PuIs <PuIs et al.,
1985).

Este mtodo que consiste en una hidrlisis total con H2S04. se lleva a cabo sobre el
sustrato seco <1000C> como se describe a continuacin <figura 14>.
Se pesan 200 mg. de producto y se aaden 2 ml. de H2S04 72% (IP> se homogeniza en mortero hasta conseguir una impregnacin total del material y se deja en estufa a
30W durante 1 hora, removiendo varias veces durante este tiempo. Despus se transfiere el
material cuantitativamente a un frasco sovirel de 100 ml y se aade H20 (56 m> para diluir
el H2504 hasta el 4%.
La segunda hidrlisis se realiza durante 1 hora a 120W. Despus se deja enfriar
despresurizando lentamente el autoclave para evitar sobreebullicin de hidrolizado. La
muestra se deja enfriar y se neutraliza a pH 5-6 con Ba<OH>2. Una vez neutralizada la
muestra se filtra por membrana Millipore de 0,45 ji. y se recoge el filtrado para anlisis
posterior.
Para la determinacin de los azcares reductores se sigui el mtodo propuesto por
Somogyi <1954> y modificado por Nelson (1944>. Mientras que para la determinacin de
glucosa se utiliz el mtodo enzimtico de la 6-hexoquinasa comercializado por Boehringer
<Anexo 1>.

61.

Sustrato (200 mg)

H2S04 12M (hasta

jn total).
(hasta 58 ml
totales)
Autoclave 1 hora, 1200C.

Dilucin (hasta lOOml

totales).
Filtracin
Azcares
Reductores

/
Residuo

Filtrado
Glucosa

Peso seco

Calcinacin

LIGNINA

CENIZAS

HEMICELIJLOSACELULOSA.

Figura 14. Procedimiento realizado para el estudio de la composicion

de la biomasa lignocelulsica.

3.3.2.6.1. Determinacin de lignina (lignina Klason).

La determinacin de lignina de la biomasa lignocelulsica <tanto nativa com tratada>

se ha efectuado sobre el residuo resultante de la hidrlisis total con cido sulfrico tal y
como se recoge en el esquema de la figura 14.
El residuo slido resultante de dicha hidrlisis es filtrado sobre filtro Millipore
0,45 ~u previamente pesado. El residuo slido se deja secar en estufa a 80W durante
horas. Transcurrido este tiempo se pesa hasta peso constante. Se calcina el residuo
mufla a 550W durante 3 horas (norma TAPPI, T-15m-58> calculndose el contenido
lignina por la diferencia de peso entre el residuo seco y el peso de cenizas resultante.

62

de
24
en
en

32.2.7. Determinacin de cenizas: norma TAPPI, T-15m-58.

3.3.2.8. Determinacin de nitrgeno total.
El contenido en nitrgeno se determin por el mtodo Kjeldahl (Coombs et al.,
1985>, emplendose para la digestin de la materia orgnica cido sulfrico concentrado, as
como una mezcla digestora que acta como catalizador y cuyo contenido es el siguiente:
Sulfato potsico
Sulfato de cobre
Sulfato ferroso

87 g.
4,35 g.
8,65 g.

De esta mezcla, una vez homogeneizada, se utiliza 1 g. para cada determinacin.

Despus de realizada la digestin de 500 mg de materia seca se destila el amonaco, previo
desplazamiento de ste con NaOH al 40%. El destilado se recoge sobre cido brico al 4%
que contiene unas gotas de indicador Shiro-Tashro, y se valora despus el amonaco con
H2504 O,O1N.
El tanto por ciento de nitrgeno en la muestra se calcula utilizando la siguiente
expresin:

14 x N

x / x F

10 x P

donde:
y = % de nitrgeno en la muestra.
N, F, y = normalidad, factor y volumen de H2504 utilizado en la valoracin.
P = peso de la muestra expresado en gramos.
3.4. PRETRATAMIENTOS.
Se ha realizado un estudio exhaustivo de distintos pretrata- mientos fsicos, qumicos y biolgicos utilizando como referencia aquellos que resultaron ms eficaces al ser
aplicados a sustratos lignocelulsicos de caractersticas similares a las de Onopordun

u ervosun.
3.4.1. Molienda.
Para cualquier manipulacin o tratamiento posterior, la biomasa vegetal debe ser
previamente reducida a un tamao de partcula adecuado. La evaluacin del efecto de los
distintos grados de molienda se ha llevado a cabo sobre la biomasa desecada previamente en
estufa a 60W <6 % de humedad>, utilizando un molino de cuchillas tipo Restsch, con

63

tamices de los siguientes tamaos de luz de malla: 0,25, 0,5, 0,75, 1 y 2 mm. A partir de los
resultados obtenidos y que se exponen en el apartado correspondiente, se decidi utilizar el
tamiz de 2 mm para todos los estudios posteriores que se describen en este trabajo.
3.4.2. Pretratamientos alcalinos.
3.4.2.1- Pretratamiento con hidrxido sdico.
Los pretratamientos con NaOH se llevaron a cabo en bao de silicona a 250, 1000,
1200 y 15000, utilizando disoluciones de NaOH al 1 y 2 % <1V> y una relacin slido-lquido
del 5%. Los tiempos de reaccin estudiados variaron desde O a 90 minutos.
3.4.2.2. Tratamiento con hidrxido clcico.
Este pretratamiento se realiz utilizando disoluciones de Ca<OH>2 al 0,2 y 1,8%, tres
temperaturas diferentes,
250 y 1000C y tiempos de tratamiento de 24 y 48 horas para
los realizados a 4 y 2500, y 10 y 30 nnutos para el efectuado a 10000. La relacin
slido-lquido para dicho pretratamiento fue del 5%.
40,

3.4.3. Pretratamiento oxidante.

3.4.3.1. Pretratamiento con perxido de hidrgeno.
A un gramo de sustrato lignocelulsico se le aadieron 50 ml de una solucin de
1-1202 al 1 %. El pl-1 de la suspensin resultante se ajust a 11,5 con NaOH SN y se
mantuvo con agitacin durante 24 horas a temperatura ambiente.
3.4.3.2. Pretratamiento con hipaclorito sdico.
El tratamiento con hipoclorito sdico se efectu de manera que la relacin gramos de
cloro por gramo de sustrato a pretratar fuera de 0,7 0,9, y la relacin slido-lquido final
del 10%. El pH de la mezcla de reaccin fue ajustado a 7 con cido actico glacial y el
tratamiento se efectu a temperatura ambiente durante 15 horas.
3.4.4.

Pretratamientos cidos.

El l)retratamiento en medio cido se ha llevado a cabo utilizando cidos clorhdrico,

sulfrico y actico. La relacin slido-lquido para estos tratamientos fue del 5% y en todos
los casos las condiciones ensayadas fueron las siguientes:
3.4.4.1. Pretratamiento con cido clorhdrico.
Temperatura:

250.

700 y 10000.

Concentracin de cido: 0.5%, 1% y 5%.

Tiempo: 1.3. y 5 horas

64--

3.4.4.2.

Pretratamiento con cido sulfrico.

Temperatura: 100 0C
Concentracin de cido: 0,2%, 0,5%, 1% y 2%.
Tiempo:1, 3 y 5 horas.

3.4.4.3. Pretratamiento con cido actico.

Temperatura: 700 y 100W
Concentracin de cido: 1 y 5%
Tiempo: 1, 3 y 5 horas.

3.4.5. Pretratamiento con solventes orgnicos

Se ha estudiado el efecto del pretratamiento de la biomasa lignocelulsica con etanol,
butanol y butilamina. Los primeros se llevaron a cabo en presencia de distintos catalizadores
descritos en la bibliografa por su efectividad en el tratamiento de sustratos similares al O.
nervosllfll.

El pretratamiento con n-butilamina se llev a cabo utilizando las condiciones descritas en la bibliografa para la deslignificacin de paja de arroz. El sustrato fue tratado con
una solucin de n-butilamina al 1% a temperatura de 120W durante 2 horas utilizando
relaciones slido-lquido del 25 y 10%.
En la tabla siguiente se recogen las condiciones en las que sc llevaron a cabo los
pretratamientos con etanol y butanol.

65

SOLVENTE

TEMPERATURA

TIEMPO SOLIDOLIOUIDO(%)

Etanol:Agua (1:1)

120%
1600C
175%

Butanol:Agua (1:1)

120%

lhora

20

Etanol:NaOH iN (1:1)

1200C

ihora

20

1600C

ihora

20

120W

ihora

20

160%

ihora

20

1200C

ihora

20

160%

ihora

20

120%
160%
120W

lhora
lhora
ihora

20
20
20

1600C

ihora

20

Butanol:NaOH lN (1:1)
Etanol:H2504 O,1N (1:1)

Butanol:H2504 0,lN (1:1)

Etanol:Fenol

Butanol:Fenol

(1:1)

(1:1)

ihora
3Omin.
30min.

20
20
20

Una vez efectuados los pretratamientos qumicos en las condiciones antes descritas,
la suspensin de biomasa resultante fue filtrada a travs de papel de filtro y lavada hasta
eliminacin de los restos del agente qumico utilizado en cada caso. Sobre el residuo slido
recogido y secado en estufa a 600C se realizaron todos los estudios posteriores de composicin y rendimiento de hidrlisis enzimtica.
3.4.6. Pretratamiento de irradiacin.
Se llev a cabo en la unidad de irradiacin NAYADE del CIEMAT que consiste en
una fuente de tipo piscina de 7.700 Ci de 60Co distribuidos en doce elementos activos. Las
muestras fueron irradiadas a las siguientes dosis: 20, 50 y 100 Mrad. El flujo con el que se
realiz la irradiacin fue de 2,41 Mrad/hora. La dosimetra de las fuentes se realiz mediante el mtodo dosimtrico qumico Frcke.

66

Los recipientes que contenan las muestras a irradiar, fueron introducidos en contenedores hermticos de acero inoxidable, que fueron ajustados posteriomente en el dispositivo de irradiacin. La geometra de las fuentes de 60Co en dicho dispositivo fue mantenida
constante durante todas las experiencias para garantizar la homogeneidad en la distribucin
de la dosis:.
Las muestra fueron irradiadas directamente o suspendidas en agua o medio cido
(HCI, H2SO
4~ y GH~-COOH al 1 %). En estos dos ltimos casos la proporcin slido-lquido
fue del 5%.
Como en el caso de los tratamientos
qumicos
descritos,
el sustrato
pretratado
0C en estufa.
Sobre antes
el slido
resultante
se llevaron
a cabo
fue
filtrado,
lavado
y
secado
a
60
los estudios de composicin y rendimiento de hidrlisis enzimtica.
Sobre los residuos slidos obtenidos en el tratamiento de irradiacin en seco y agua
se estudi el efecto de un pretratamiento posterior en medio cido (sulfrico, clorhdrico o
actico>. Las condiciones de este segundo tratamiento, que fueron elegidas despes de un
rastreo previo realizado con bajas concentraciones de cido, se detallan a continuacin:

cido

HC o 112504
CH3-COOB

Concentracin
(%)

1%

Temperatura
(0C)

100

1%

70

Tiempo

(horas)

5
3

La relacin slido-lquido a la que fueron efectuadas estos pretratamientos fue del 5%.
3.4.7. Pretratamiento de explosin por vapor.
Este pretratamiento se llev a cabo en una unidad piloto, diseada para este fin, por
la empresa INTECSA y construida en las instalaciones del CTEMAT. El diagrama de flujo
de la instalacin mencionada se recoge en la figura 15.
Dicho sistema incluye un generador de vapor con el que se alimenta el reactor de
explosin en el que se introduce el material lignocelulsico. Gracias a la sbita apertura de
la vlvula de descarga del reactor, se expansiona el material bruscamente y se descarga en
un cicln donde finalmente es recogido para su tratamiento posterior.

67

u
u

u
(Ji

>1-fr

Figura 15. Escuema del diaarama de ooeracin de la olanta piloto de tratamiento de material lignocelulsico.

-68

El reactor de explosin es la cmara donde la biomasa es comprimida y sbitamente

despresurizada. La capacidad del cuerpo del reactor es de 2 litros, y est provisto de
vlvulas de carga y descarga de biomasa de 3 pulgadas. La presin mxima de trabajo con
vapor saturado es de 42 bares absolutos. El material es de acero inoxidable AISI 316 y
posee adems elementos de control y seguridad (2 termmetros, un manmetro y una
vvula de seguridad>.
La mezcla de vapor y material lignocelulsico expulsado en cada disparo entra al
cicln de descarga horizontal y tangencialmente. El cicln est construido en acero inoxidable AISI 316, posee una vlvula de descarga de tipo tajadera de 3 pulgadas.
Las condiciones de tiempo y temperatura en las que fueron realizados los pretratamientos fueron las siguientes:
Temperaturas: 19000, 21000 y 23000.
Tiempos: 30 segundos, 1, 2, 4 y 8 minutos.
Se realiz adems un pretratatamiento combinado con cido. La impregnacin de la
biomasa del cardo se realiz con cido sulfrico 0,4 y 1% <relacin slido-lquido 1:4> a 2500
durante 24 horas. Las condiciones de tiempo y temperatura utilizadas para el pretratamiento de explosin por vapor en condiciones cidas fueron:
Temperaturas: 170v y 19O~ 0.
Tiempos : 2, 4 y 8 minutos.

3.4.8. Pretratamiento biolgico.

El pretratamiento biolgico del sustrato lignocelulsico se llev a cabo utilizando la
cepa de Phanerochaete c/n-ysosporium (CECT 7754>, el sustrato utilizado para este estudio
fue Onopordum nervosum nativo o pretratado por los tres mtodos qumicos cuyas condiciones se recogen a continuacin:
cido:

5 gramos de sustrato tratado con 100 ml de una solucin de H2504 al

1%, durante 3 horas a una temperatura de 10000.

alcalino:

5 gramos de sustrato tratados con 100 ml de una solucin de NaOH al

1% durante 10 minutos y a una temperatura de 10000.

oxidante:

10 gramos de sustrato tratado con 100 ml de una solucin de H202 al

1% y con NaOH iN hasta pH 11,5, durante 24 horas a temperatura
ambiente.

El sustrato nativo o bien el residuo resultante del pretratamiento fue esterilizado en

autoclave e inoculado con una suspensin de esporas de 12.8 x i.06 esporas/g.material. El
hongo fue incubado a 3800 durante 4 semanas. Las muestras fueron retiradas a los 7, 14.
21 y 28 das despus de la inoculacin y el residuo obtenido lavado y secado en estufa a

69

10500 hasta peso constante. Sobre el residuo seco final se realizaron las siguientes determinaciones: anlisis de la composicin, evaluacin de la susceptibilidad del sustrato a la hidrlisis enzimtica con celulasas obtenidas de 7. reesei QM9414.

ara todos los sustratos tratados se procedi al lavado con agua hasta pH neutro,
secado en estufa a 6000, determinndose el peso del residuo seco as como su composicin
en celulosa y lignina.

3.5. HIDROLISIS ENZIMATICA DE BIOMASA UGNOCELULOSICA.

3.5.1. Ensayos de hidrlisis enzimtica de la biomasa pretratada.
Una vez realizado el pretratamiento, el residuo pretratado fue sometido a hidrlisis
enzimtica utilizando celulasas procedentes de Triehodernia ;-eesei QM9414. Las pruebas de

hidrlisis enzimtica se efectuaron en tubos de ensayo en un bao termostatizado con

sistema de agitacin. Las condiciones en las que se realizaron las pruebas de hidrlisis
fueron las siguientes:
-

actividad enzimtica: 20 UIPF/g. sustrato.

medio: tampn acetato 0.1M. pH 4.8.

tiempo de hidrlisis: 48 horas.

temperatura: 5000.

Finalizado el perodo de hidrlisis, las muestras fueron filtradas para separar el

residuo insoluble del hidrolizado. La determinacin del rendimiento de la hidrlisis se llev
a cabo sobre el hidrolizado valorndose el contenido de azcares reductores por el mtodo de
Somogyi-Nelson y de glucosa por el mtodo enzimtico comercial de Boehringer-Manheim
(Anexo 1>.

70

4. RESULTADOS Y DISCUSION

4. RESULTADOS Y DISCUSION.
Los resultados, que sern expuestos y discutidos a continuacin, estn agrupados en
tres apartados que se corresponden con las diferentes etapas del desarrollo experimental del
trabajo realizado:
1- Produccin y caracterizacin de enzimas celuloliticas.
2-Evaluacin de la eficacia de diferentes pretratamientos sobre el rendimiento de hidrlisis
enzimtica del Onopordum nervosm.
3-Estudio del proceso de hidrlisis de Onopordum nervosunt en condiciones ptimas.
Estos tres apartados se relacionan, asimismo, con las diferentes fases que constituyen un proceso completo de transformacin por hidrlisis enzimtica: obtencin de enzimas,
pretratamiento de la materia prima e hidrlisis enzimtica del sustrato pretratado.
4.1. Produccin y caracterizacin de celulasas
4.1.1. Estudios de produccin enzimtica.
Como ya se ha comentado en el apartado correspondiente del captulo de
Introduccin, Triehodernia iongibrachiaturu QM9414 rene una serie de caractersticas que
le hacen adecuado para su utilizacin como productor de celulasas. Por un lado, es capaz de
producir enzimas con actividad suficiente para degradar in vitro la celulosa insoluble a
azcares y adems, presenta una estabilidad que permite su manejo en medios slidos o
lquidos mediante las tcnicas de resiembra e inoculacin habituales. Por estos motivos, esta
cepa fue elegida como productora de las enzimas que habran de ser utilizadas a lo largo del
presente trabajo.
De acuerdo con los resultados obtenidos en las primeras pruebas de produccin de
enzimas, realizadas en matraces con agitacin continua, en bao termostatizado, y con el fin
de controlar eficientemente las condiciones de cultivo y las cinticas de produccin de
enzimas, se decidi llevar a cabo los experimentos definitivos de produccin en fermentador
de 10 litros de volumen til. De esta manera, se pretenda adems, obtener cantidad de
enzima suficiente para ser utilizada en los distintos ensayos de hidrlisis, previstos en el
planteamiento del trabajo.

71.

En la figura 16 se muestran las cinticas de produccin de celulasas por

T.tongibrachiatun QM9414 sobre un 1% <p/v) de Solka Floc HW200. Al tratarse de un
proceso sin control automtico del pH, se observa una disminucin del pH a partir del
primer da hasta un valor de alrededor de 3, que se mantiene ms o menos constante a lo
largo del proceso. Este hecho hace que las protenas presentes en los medios de produccin
estn sometidas al efecto de un bajo pH durante muchas horas, lo que da lugar a que se
provoque tina desnaturalizacin parcial de las mismas, que se acenta con el paso del
tiempo. Es por ello, por lo que se produce una disminucin progresiva de las actividades
enzimticas valoradas a pesar de que se siguen secretando protenas al medio (Blanco,
1990).
La disminucin del pH puede estar motivada por la actividad metablica del hongo,
que, al mismo tiempo que degrada el sustrato hidrocarbonado aadido al medio, consume el
nitrgeno y protenas del mismo, rompiendo el tampn y consecuentemente bajando el pH.
Debido a los efectos negativos que ejercen los bajos niveles de pH en el medio sobre
la actividad enzimtica se decidi, cuando se llev a cabo el proceso de produccin sobre
Solka Floc al 2%. controlar el pH de forma que nunca bajase de 4. En estas condiciones las
actividades enzimticas medidas en los medios de produccin evolucionaron con la misma
tendencia que el contenido en protenas en el medio <figura 17>.
En la tabla XI se recogen las caractersticas de las fermentaciones llevadas a cabo y
de los rendimientos tanto de protenas obtenidas como de las actividades enzimticas finales
secretadas al medio.
Los resultados, representados en las figuras 16 y 17 muestran que un aumento de
concentracin de celulosa en los medios de produccin supone un alargamiento del tiempo
del proceso. Sin embargo, las actividades enzimticas valoradas por unidad de peso de
protenas secretadas al final del proceso aumentan un 50% en el caso de la 0-glucosidasa y
casi un 60% en el caso de la actividad medida sobre papel de filtro, mientras que la
actividad sobre CMC disminuy.
Dado que el elevado coste de la produccin de enzimas es uno de los principales
inconvenientes a la hora de plantear un proceso de transformacin mediante hidrlisis
enzimtica, es necesario, desde un punto de vista econmico, desarrollar procesos de produccin basados en la utilizacin de fuentes de celulosa baratas. Por este motivo, se ha evaluado
aqu la posibilidad de utilizar O.nervosu.m como sustrato para la produccin de celulasas.
Los estudios se han abordado utilizando tanto sustrato nativo como sometido a dos
pretratamientos diferentes:
1.Acido sulfrico al 5% <y/vi, durante 3 horas a 10000.
2.Agua oxigenada al 1% (y/vi a pH 11,5 durante 24 horas a 2500 con agitacin.

72-

Tipo de
sustrato

Solka Floc HW200

Concentracin
de sustrato

1 %

Volumen de produccin
en fermentador

9 litros

[Duracin del
so de produccin

2 %

168 h.

Total precipitado
con acetona

Protenas

Solka Floc HW200

11,8 g.

9 litros
268 h.

13,1 g.

9,69 g

9,65 g

Actividad fr-glucosi--j
dasa (UI/mg.protena)

0,18 Hl/mg

0,27 01/mg.

Actividad sobre PF
(01/mg, protena)

0,39 01/mg

0,62 Hl/mg

Actividad endogluca
nasa (01/mg protena>

16,55 01/mg

9,14 01/mg

valoradas en el precipitado por el mtodo de Lovry.

TABLA

XI. Caractersticas

de

la produccin de

73

enzimas en fermentador.

pH

Co
E

.14

-4

-13

CC

cg

Co

-4

o
a.

a:
U)

o 1

z
u
u

.12

-11

z
e
4-

.5

U)

oe-)

c
U)

09

10 ~
e-)
e
9

-4
ci

0,8

15~
7

0,7
e-o
a

.3

0,6

-6

D
0.5

o 04
o
u 0,3

-2

4
-3

05

02
0)

10

11

TIEMPO (das)

Figura 16.

Cintica de produccin de celulasas por 7. Longibrac/iatunt QM9414 sobre

1% de Soika Flor l-{W200. Volumen total 9 litros. Evolucin de f e pE-{. 1 o 1
actividad sobre PF. 1 ~-> actividad 0-Glucosidasa. <*) actividad endoglucanasa.
1 protenas extracelulares a lo largo de 7 das.

74--

II
CC

4-

CC
Cf)
a:

Co
-e

CC
a

4-

C~)
D

~x)

o-

a:

-o

z
4

10
9>

0,9
4

~
o
44-

e-)
e

1,5

0.7
0,6
z.

Q5

04

.3

0,3
e-:

-4

0,5-

-e

02

.2

~1

01-.

1
1

10

TIEMPO

Figura 1<7.

11

(das)

Cintica de produccin de celulasas por T. Longibrachiatuin QM9414 sobre 2%

de Solka Flor HW200. Volumen total 9 litros. Evolucin de 4 e pH. o
actividad sobre FE. ( g-) actividad e-Glucosidasa. 1 e) actividad endoglucanasa.

e) protenas extracelulares a lo largo de 11 das.

75

Cuando se utiliz como sustrato biomasa lignocelulsica, los mejores resultados en

cuanto a crecimiento y produccin de enzimas se obtuvieron para el caso de pretratamiento
cido.
En la figura 18 se presentan los perfiles de produccin utilizando dicho sustrato en
concentracin del 2%. Dado que el contenido en celulosa de esta biomasa pretratada es de
aproximadamente el 40%, los resultados de este proceso de produccin habra que compararlos con aqullos obtenidos sobre sustratos de referencia puros en concentracin del 1%
aproximadamente (tabla XII>. Como se observa en dicha tabla, los rendimientos en protenas extracelulares y actividades enzimticas obtenidos no son desalentadores aunque la
duracin del proceso es mayor, debido a la dificultad que encuentra el micelio para crecer
sobre este tipo de sustrato.

11
pH Tiempo 1 Protenas
SUSTRATO % ini (horas) (mg/mi)

Actividades (UT/mg)
~Glucosidasa
PP

cial.
41

jsolka

Bloc

1 5.2

O.nervosum 2 5.4

TABLA XII.

168

1,44

0,18

0,39

288

2,54

0,06

0,40

del tipo de sustrato en la produccin de celula-sas por Tilongibrachiatun DM9414.

Influencia

En este punto, es interesante hacer referencia a los problemas tcnicos, que surgieron durante la produccin de enzimas, y originados por la utilizacin en los medios de
cultivo de sustratos insolubles. La aparicin de espumas en los medios de produccin fue
uno de los mayores inconvenientes encontrados. Asimismo, la manipulacin de los cultivos,
toma de muestra, filtracin final de los mismos, etc., se dificult extraordinariamente debido
a la naturaleza filamentosa de los hongos empleados y a la baja densidad de los sustratos
lignocelulsicos.

76

ej

-4

PI;

-7

CC

4-4
E

o-

Cf)
c

0025E

o
e
a
4-

-6

ci

cg
e

11

-4

fiu

o-4

0,9

u
e

06

1 5

0,7

06
05-

-4

-1

Al

04

03
0502

01

~1 ~

b
TIEMPO

Figura 18.

1b

ii

(<las)

Cintica de produccin de celulasas por T. Longibracliarumn QM9414 sobre 2%

de O. neruosum sometido a pretratamiento cido. Volumen total 2.5 litros.
Evolucin de < e ) pH. { o ) actividad sobre PF. (
actividad ~-Glucosidasa.
(*1 protenas extracelulares a lo largo de 12 das.

77

En funcin de los resultados obtenidos y expuestos anteriormente, se concluy que el

proceso llevado a cabo con Solka Floc al 2% era el ms eficaz de los ensayados para
produccin de celulasas por T.longibrachiatum. Se eligi, por tanto, la fermentacin en
estas condiciones para la obtencin del complejo que se utilizara a lo largo del desarrollo del
trabajo correspondiente a esta memoria.
A continuacin, se recogen las caractersticas de la preparacin enzimtica empleada, obtenida por ultrafiltracin, precipitacin y liofilizacin del medio de cultivo de
T.tongibrachiatnm QM9414 producido en fermentador de 9 litros. Se utiliz medio salino de
Mandels con 2% de Solka Floc, 0,1% peptona y 0,1% Tween <temperatura 2800 y agitacin
300-400 rpm>.

protenas (%)
95
Absorbancia a 280 nm. 1,4
(0,1% p/v)
UI/mg (PF)
0,63
UI/mg (pNPG)
0,37
UI/mg(CMC)
17

78--

4.1.2. Caracterizacin del complejo enzimtica.

El rendimiento de un proceso de hidrlisis enzimtica viene determinado por una
serie de factores que ataen a la naturaleza del sustrato, a las caractersticas de la preparacin enzimtica empleada y a las condiciones en que se desarrolla el proceso de hidrlisis
elegido. En este apartado, se recoge el estudio efectuado sobre la influencia de diversos
factores en la eficacia con la que la preparacin enzimtica obtenida y cuyas caractersticas
se recogen. en el apartado anterior, hidroliza sustratos celulsicos de diferente origen, con
objeto de fijar las condiciones ptimas del proceso utilizando dichas enzimas.
4.1.2.1. Influencia del pH y la temperatura.
Puesto que el valor del pH del medio y la temperatura influyen decisivamente en el
comportamiento de las enzimas, fueron stas las primeras condiciones que se ensayaron
dentro de un rango elegido de acuerdo con los resultados publicados anteriormente.
Las condiciones ptimas para la actividad del complejo enzimtico de fl-ichoderma
Longibrachiatum QM9414 se estudiaron utilizando como sustrato para la hidrlisis Solka
Floc HW-200 por ser ste un sustrato celulsico puro. Para el estudio de la influencia del pH
se probaron valores comprendidos entre 3,8 y 6,3 y para el caso de la temperatura entre 300
y 5500 La hidrlisis se llev a cabo durante un perodo de tiempo de 4 horas para evitar
problemas de inhibicin que podran originarse como consecuencia de la acumulacin de los
productos de hidrlisis durante perodos largos. Para la realizacin de estas experiencias se
utiliz una actividad enzimtica por gramo de sustrato de 18 UIPE y una relacin slidolquido en el medio de reaccin <tampn citrato O.05M> del 5% (plv>. La tasa de hidrlisis se
evalu a partir de los azcares reductores y la glucosa solubilizados en el hidrolizado
resultante.
En las figuras 19 y 20 se muestran los resultados obtenidos con los diferentes pH y
temperaturas ensayadas. Se observan en ambos casos que los pH superiores a 5 producen
una clara disminucin de la liberacin de azcares reductores y de glucosa. Puesto que la
produccin de azcares informa de la actividad del conjunto de enzimas del complejo mientras que la glucosa lo hace ms especficamente de la actividad de la ~-glucosidasa, parece
ser que esta ltima enzima es la ms sensible a los valores altos de pH ya que la relacin
entre la glucosa y los azcares reductores totales producidos <figura 21> disminuye conside-

79--

12
.9
E

CC
E

Co

5
pH

Figura 19:

Efecto del pH en la hidrlisis enzimtica del Solka Flor HW 200 a distintas

temperaturas. expresado como azcares reductores liberados: ( 1 30W. <x 1
3500
< o 1 40W. 0> 45W. < A) 50W y ( ml 550C.

Tiempo de hidrlisis : 4 horas.

Relacin slido-liquido lp/vI : 5%.

-.80

e
rJ2
o
ti

6
pH

Figura 20:

Efecto del pH en la hidrlisis enzimtica del Solka Floc HW 200 a distintas

temperaturas. expresado como glucosa liberada: < 30W. <-x 1 3500 < o 1
4000. (D 1 4500. ( A > 5000 y U 55W.
Tiempo de hidrlisis : 4 horas.
Relacin slido-liquido <p/vi 5.

-81

o
Eti

0.7
0.6

cn

Of
e

0.4

o
ti
ti

0.3
0.2

0.1
3

Figura 21:

pH

Efecto del pH en la hidrlisis enzimtica del Solka Flor HW 200 a distintas

temperaturas, expresado como relacin entre glucosa y azcares reductores
liberados: < e 1 3O~C. < ti 35W. < o 1 40W. <0 45~C.
1 50W y lU 55W.
Tiempo de hidrlisis : 4 horas.
Relacin slido-lquido <pIvi 5%.

82

rablemente a medida que aumenta el pH del medio. De estos resultados se puede concluir
que el valor de pH para el ptimo funcionamiento del complejo enzimtico est comprendido
entre 4,3 y 4,8. Puesto que el rango de pH ptimo es relativamente estrecho, la hidrlisis
debera llevarse a cabo en medio tamponado, dado que segn han descrito algunos autores el
pH tiende a disminuir por efecto de la accin hidroltica de las enzimas <Linko, 1977>.
Con respecto a la temperatura se observa una mayor produccin de reductores y
glucosa cuando se eleva la misma alcanzndose los valores maximos entre 500 y
0
(Figuras 19 y 20>.
550

Paralelamente a la determinacin de los azcares reductores y de la glucosa solubilzados en el hidrolizado resultante, se evalu la cantidad de protenas solubles presentes en
el medio despus de 4 horas de hidrlisis. En la figura 22 estn representados los valores de
protenas expresados como porcentaje del contenido inicial de protenas en el medio de
hidrlisis. Se observa que la mxima recuperacin se produce a 5000 y pH 4,8; en este caso,
el 60% de la concentracin inicial fue recuperado, mientras que en las condiciones ms
desfavorables para la recuperacin de protenas, pH 3,8 y 30~C, solamente el 25% de la
concentracion inicial se encontraba en solucin. Este mismo fenmeno ha sido observado
por otros autores (Ryu y col.. 1984>.
Puesto que las condiciones ptimas de trabajo respecto a pH y temperatura coincid-

an con el mayor porcentaje de liberacin de protenas, se decidi efectuar en los ensayos

sucesivos la hidrlisis del material celulsico en tampn citrato 0.05M a pH 4,8 y a 5000.

4.1.2.2. Influencia de la concentracin de sustrato y de enzima.

El estudio de la relacin slido-lquido y de la actividad enzimtica por unidad de
peso de sustrato. en el proceso de hidrlisis enzimtica, es de gran importancia a la hora de
fijar las condiciones ptimas del proceso. El conocimiento de las eficacias de hidrlisis en
funcin de estas dos variables permitirn, por un lado, ajustar la cantidad de sustrato por
volumen de mezcla al mnimo posible dentro del rango ptimo con objeto de obtener jarabes
con alta concentracin de azcares, as como aquilatar el consumo de enzimas que como ya
hemos comentado, supone uno de los factores que ms encarece el proceso de hidrlisis.
Para llevar a cabo este estudio, se ha utilizado, como sustrato de la hidrlisis enzimtica, biomasa lignocelulsica de O.nervosum, con objeto de evaluar los rangos ptimos de
estos parmetros para el sustrato que ser la materia prima a lo largo del trabajo aqu
dasarrollado. No obstante, los resultados obtenidos se compararon con los correspondientes
al caso ideal de un sustrato celulsico puro como el Solka Floc. Debido a la baja susceptibilidad de la estructura lignocelulsica del O.neruosum a la accin enzimtica, los ensayos que
se recogen en este apartado. se llevaron a cabo tambin sobre Ouzervosum sometido a

83

60

50
40
u,
1:)

30

~1

o
CO
u,

20

1-4

10

o
a.

1.
3

6
pH

Figura 22:

pH

Efecto del pH en la hidrlisis enzimtica del Solka Floc HW200 a distintas

temperaturas en la recuperacin de enzimas (expresado como porcentaje del
valor inicial de protenas en el medio de hidrlisis>: 1 1 3000. Ix 1 35C. <O)
400C, (~ 1 4500. 1 A 1 50W y U> 550C.
Tiempo de hidrlisis 4 horas.
Relacin slido-lquido lp/vI 5%.

-84-

diferentes pretratamientos. Puesto que este estudio se llev a cabo con anterioridad a la
evaluacin de pretratamientos realizados en este trabajo y recogidos en la segunda parte de
la memoria, los aqu empleados fueron seleccionados tomando como referencia algunos
trabajos publicados sobre pretratamientos de sustratos lignocelulsicos, de composicin similar a la del O.nervosurn. Estos pretratamientos, pretratamiento oxidante con agua oxigenada al 1% <y/y> en medio alcalino y pretratamiento alcalino con NaOH al 1% (p/v>, se
describen en el apartado correspondiente del captulo de Materiales y Mtodos.
Tras algunos ensayos previos, se seleccionaron como valores de concentracin de
slidos 5% y 10%. Debido a la baja densidad de los sustratos lignocelulsicos, valores ms
altos originaran problemas tcnicos en la obtencin de una buena mezcla que dificultaran la
transferencia de las celulasas desde la fase lquida a la fase slida. El rango de concentracin
de enzimas ensayado vari entre el 2% y el 8%, expresados como mg de protena utilizada
por cada 100 mg de sustrato <la actividad enzimtica sobre papel de filtro y de frglucosidasa
por mg de protena fue 0,63 UI y 0,3 UI respectivamente>.
En las figuras 23. 24, 25 y 26 se representan los resultados obtenidos, expresados
como mg de azcares reductores solubilizados durante 48 horas de hidrlisis, con las diferentes proporciones de enzima, para los cuatro sustratos empleados.
En las figuras 27 y 28 se representan los valores obtenidos, a las 48 horas de
hidrlisis, de azcares reductores por unidad de actividad PF utilizado frente al valor de
actividad enzimatica empleada.
Comparando las distintas grficas, se puede observar que cuando la concentracin de
sustrato en el medio de reaccin se aumenta desde el 5% hasta el 10%, conservando la
misma relacin enzima-sustrato, el rendimiento de la hidrlisis, expresado como produccin
de azcares reductores por unidad de peso de sustrato. se mantiene ms o menos constante
en todos los casos. Esto supone la posibilidad de obtener, utilizando la concentracin del
10%, un hidrolizado con doble concentracin de azcares reductores sin perder eficiencia en
el rendimiento de hidrlisis.
La influencia de la concentracin de enzima en el rendimiento del proceso de hidrlisis queda reflejado en las figuras 23, 24, 25. 26, 27 y 28. En las dos ltimas se recogen los
valores de azcares reductores producidos despus de 48 horas de hidrlisis por gramo de
celulosa en funcin de la proporcin de protena.
En el caso de los sustratos no tratados <Solka Floc y O.nerosunz> se observa que
para los valores ms altos de actividad enzimtica empleada se obtiene alrededor de un 60%
de hidrlisis de la celulosa, expresada como azcares reductores producidos por gramo de
celulosa inicial (figura 27). La saturacin del proceso hidrolitico puede ser debida a la propia
estructura del sustrato cuyas zonas cristalinas son difcilmente atacables, en su estado
nativo, por las enzimas, o a la acumulacin de elevadas cantidades de glucosa y otros
azcares que actuaran inhibiendo la actividad de los distintos componentes del complejo.

--85

o
4-,
os

4-,
09
2
09

70

o-o
E

o
o

-4
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62

50

E
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40

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30
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0

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40
0

2%

4%

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o
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UD

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62

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20

Co
cg

lo

(-5
O
U)

20

40

TIEMPO
0

05%

Figura 23:

1%

2%

4%

(horas>

8%

Efecto de la proporcin de enzima <expresada como gramos de protena por

100 g. de sustrato> en la produccin de azcares reductores durante la hidrlisis enzimtica de Solka Floc HW-200.
Relacin slido-lquido: 5% (A) y 10% <B>.

-86

a
(0
09
09
62
E

20
19
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17

-4

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62
E

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Co

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o
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543

~~~~-14

---o

a.

-o

___

z_
--

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o 4

o
0,5%

Figura 24:

U
20
1%

T
40
0

2%

5<

TIEMPO (horas)
8%

Efecto de la proporcin de enzima <expresada como gramos de protena por

100 g. de sustrato> en la produccin de azcares reductores durante la hidrlisis enzimtica de O.nervosum nativo.
Relacin slido-lquido: 5% <A) y 10% (13>.

87---

o
4-)

4-,

09
-9
09

50

60
E
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60
E
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a.
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(horas)

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6
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E

40

-4

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ES
jo
cg
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a.

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O

20

CD

rl]

a.
[/2
LI]

--e------

----e-

lo

-e---

a.

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O
U)

-m

o
0

rn

135 %

Figura 25:

20
4

1%

40
0

2%

4%

TIEMPO
5<

(horas)

8%

Efecto de la proporcin de enzima <expresada como gramos de protena por

100 g. de sustrato> en la produccin de azcares reductores durante la hidrlisis enzimtica de O.nervosunz pretratado con H202 en medio bsico.
Relacin slido-liquido: 5% (A) y 10% <13>.

88

4-)

os

a
[fi
-9
09

60

ES
o

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20

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0

20

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1%

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4%

TIEMPO
5<

(horas)

6%

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----

20
C

0.5%

Figura 26:

1%

40
<3

2%

4%

TIEMPO
5<

(horas)

6%

Efecto de la proporcin de enzima <expresada como gramos de protena por

100 g. de sustrato> en la produccin de azcares reductores durante la hidrlisis enzimtica de Qn eruosum pretratado con NaOH.
Relacin slido-liquido: 5% (A> y 10% <B>.

89

loo

loo
90

90

RO

80

70

70
5.

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40

40

30

30

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u

30

Lo

20

lo

o
a
o

o
10.5 21

4?

IJ1W/g

Figura 27.

celulosa

rendimiento de la hidrlisis (mg. azcares reductores/lOO mg celulosa> <4 en

funcin de la relacin enzima-sustrato <UIPF/g.celulosa inicial>.
Tiempo de hidrlisis: 48 horas.
Relacin slido-lquido: (e> 5% y (xl 10%.
Sustrato: (A> Solka Floc I-IW-200 y <E> O. nervosum nativo
Eficacia del complejo celulolitico (mg. azcares reductores/UIEFI 1

100

loo

go

90
80

80
o-

70

70

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60

80

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50

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40

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30

20

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30

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1 00

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90

90
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70

70

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60

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50

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10

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30

30

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20

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lo

y-

It
E

7,3

14,8

29.2

56,6

117,2

(TOE!

Figura 28.

celulosa

Eficacia del complejo celulolitico (mg. azcares reductores/UIPE)

<

y ren-

dimiento de la hidrlisis (mg. azcares reductores/lOO mg celulosa) (1 en

funcin de la relacin enzima-sustrato <UIPF/g.celulosa inicial>.
Tiempo de hidrlisis: 48 horas.
Relacin slido-lquido: (.1 5% x (xl 10%.
Sustrato: <A) O. nervosum pretratado con H202 en medio bsico y (BI O.
nertosuru

pretratado con NaOH.

-9

Cori los sustratos

rendimientos cercanos al
de celulosa inicial>, con
modificar la estructura

pretratados <figura 28) se consigue para las actividades ms altas

100% <expresados como azcares reductores producidos por gramo
lo cual se demuestra la capacidad de los pretratamientos para
de los sustratos hacindolos ms accesibles a las enzimas

hidrolticas.

En general, se observa que alrededor del 70% del mximo de hidrlisis conseguida se
obtiene para valores entre 2% y 4% de enzima, siendo necesario aumentar de 2 a 4 veces la
concentracin de enzima para conseguir el 30% restante. Estos datos han servido como
base a la hora de fijar las actividades enzimticas por gramo de sustrato <20 UIPF/g.
sustrato> en los estudios comparativos posteriores de la eficacia de pretratamiento sobre el
rendimiento de la hidrlisis.
Estos resultados deben tenerse en cuenta a la hora de disear procesos de hidrlisis
y decidir si resulta ms interesante, desde el punto de vista tcnico y econmico, utilizar
mayor actividad de enzimas para obtener valores ms altos de hidrlisis y por tanto, hidrolizados ms concentrados con vistas a fermentaciones posteriores, o el elevado coste de las
enzimas aconseja su utilizacin en menor proporcin a pesar de que el rendimiento final
disminuya.

El pretratamiento de la materia lignocelulsica previo a la hidrlisis con enzimas

tiene una influencia decisiva en el rendimiento de la misma. Puesto que los pretratamientos
utilizados en este caso fueron, seleccionados en base a datos de bibliografa sin que se
realizaran estudios de optimizacin de los mismos para la biomasa de O.nervosu,n, es de
gran interes la evaluacin de la efectividad de diversos pretratamientos en funcin de su
incidencia en el rendimiento de la hidrlisis enzimtica y en el coste global del proceso de
transformacin. Por este motivo, en la segunda parte correspondiente a esta memoria se ha
hecho especial hincapi en el estudio del efecto de diferentes pretratamientos para la biomasa de Onopordum neruosum en el rendimiento de la hidrlisis.

4.1.2.3. Estabilidad del complejo enzimtico.

Dado que la temperatura ptima de accin de las enzimas celulolticas es elevada y
que el proceso de hidrlisis debe llevarse a cabo durante un perodo largo de tiempo, es
importante conocer la estabilidad de la actividad enzimtica de la preparacin, a la temperatura seleccionada como ptima. por si fuera necesario contrarrestar las posibles prdidas de
actividad durante dicho proceso con adiciones sucesivas de enzima.
En nuestro caso, la estabilidad de la actividad del complejo ha sido evaluada en
solucin, en condiciones similares a las del proceso de hidrlisis, y a la temperatura de 5000
seleccionada previamente como ptima. Los ensayos de termoestabilidad han sido llevados a
cabo durante 96 horas, con el fin de cubrir sobradamente la duracin tpica de un proceso de
hidrlisis enzimtica <24-48 horas>.

92

En la figura 29, en la que se representan los valores de la actividad sobre papel de

filtro y de la frglucosidasa en las condiciones descritas, se observa que sta ltima se
mantiene ms o menos constante durante este perodo y que la actividad sobre papel de
filtro disminuye a partir de las 48 horas en aproximadamente un 25% del valor inicial.
En la bibliografa, se describen diferentes grados de desactivacin trmica para
preparaciones celuloliticas procedentes de diferentes microorganismos. As, por ejemplo, la
~-glucosidasa producida por Coriolus versieoior, cuyo pH y temperatura ptima de actuacin son 4.3 y 4500 respectivamente, cuando se incuba a 4500 pierde el 50% de la actividad
inicial al cabo de 20 horas y el 55% despus de 45 horas de incubacin. <Evans, 1985).
Rodrguez y col. <1988> describen para las enzimas celulolticas producidas por bacterias del gnero Cellulomonas, cuando se incuban en las condiciones ptimas de pH y temperatura, una prdida del 77% de la actividad sobre papel de filtro y del 90% de la actividad
~-glucosidasa al cabo de 24 horas de incubacin.
Segn Saddler y col, quienes han estudiado la estabilidad trmica de las actividades
endoglucanasa. frglucosidasa y sobre papel de filtro de Trichoderma harzianus <1985>, la
vida media para las actividades de dichas enzimas es de alrededor de 15 horas en el caso de
la actividad PF y mucho menor para el caso de la actividad ~-glucosidasa. Utilizando el
mismo microorganismo. Macris y Galiotou-Panayoton <1986> encontraron valores de vida
media para la actividad Wglucosidasa de 1,1 das a 5000.
Por el contrario, la Wglucosidasa de Aspergil/us nige;- presenta bastante estabilidad
cuando se mantiene a 5000 y pH 5 durante prolongados tiempos de incubacin. En estas
condiciones, ms del 85% de la actividad se retiene despus de 48 horas y el 22% despus
de 120 horas <Dekker, 1986>.
La ~.glucosidasa de Alternada alternata presenta tambin elevada termoestabilidad
(vida media de 3,5 das, 1,8 horas y 10 minutos a 60v, 650 y 7000 respectivamente>
(Macris, 1984>.
En nuestro caso, los resultados obtenidos muestran una buena estabilidad enzimtica bajo las condiciones de hidrlisis, particularmente la ~-glucosidasa. la cual permanece
prcticamente constante despus de 96 horas de incubacin.

44.2.4. Estudios de inhibicin por glucosa, celobiosa y etanol.

Se ha estudiado el comportamiento del complejo enzimtico en la hidrlisis del
Onopordurn nenosu.m en funcin de la concentracin en el medio de productos finales de

hidrlisis como celobiosa y glucosa, as como de etanol, en previsin del comportamiento de

las enzimas celulolticas en un proceso simultneo de sacarificacin y fermentacin. Los

93

100-7
8060H

4Q

E-

u
<

2024

48

TIEMPO

Figura 29:

96

72
(horas)

Variacin de las actividades enzimticas: 1 o 1 ~-glucosidasa

y 1 e 1 sobre papel
de filtro, en funcin del tiempo de incubacin, a 500C. del complejo enzimtico
producido por Trichoderma longibrachiatum Q M94 14.

94

resultados obtenidos (figura 30) muestran un aumento de la inhibicin a medida que aumenta la concentracin de estos productos en el medio, as por ejemplo, con una concentracin
de 5 mg/ml de glucosa la inhibicin alcanz el 10% mientras que a partir de 10 mg/ml sta
fue superior al 60%. En el caso de la adicin de celobiosa, los resultados ponen de manifiesto la disminucin en la produccin de este disacrido probablemente debido a la inhibicin
de la OBH. En cuanto a la inhibicin por etanol de la produccin de glucosa se observa que
es proporcionalmente mucho menor que la producida por una cantidad de glucosa equivalente (cantidad de glucosa que producira por fermentacin esa concentracin de etanol> lo cual
favorecera los procesos de fermentacin simultneos a la hidrlisis, en la que la glucosa
puede ser retirada del medio por accin de los microorganismos fermentativos y transformada a etanol.
Para estudiar ms detalladamente el efecto de la acumulacin de los productos de
hidrlisis y la posibilidad de aumentar el rendimiento de la misma aumentando la concentracin de enzimas o procediendo a retirar los productos del medio se realizaron sobre Solka
Floc, O.nervosum nativo y pretratado una serie de ensayos que se recogen a continuacin.
El objeto de este estudio ha sido evaluar la capacidad mxima de hidrlisis del

complejo enzimtico obtenido de T.longibraeh.iatnm en ausencia de fenmenos de inhibicin

y utilizando concentraciones elevadas de enzima. Los tres tipos de ensayos se realizaron de
acuerdo a las siguientes estrategias:
1.
II.
HL.

Hidrlisis con una nica dosis de enzima <20 UIPF/g sustrato>, sin retirada
de productos de hidrlisis.
Hidrlisis con tres dosis de enzima <20U1/g sustrato x 3>, aadidas cada 24
horas previa separacin de productos de hidrlisis.
Hidrlisis con tres dosis de enzima <20U1/g sustrato x 3>. aadidas cada 24
horas sin retirada de productos de hidrlisis.

Las diferentes estrategias para estudiar el comportamiento hidroltico del complejo

enzimtico se recogen en la figura 31.

Los resultados obtenidos se recogen en las figuras 32 y 33.

De estos resultados se desprenden las siguientes consideraciones:
- En el caso de sustrato nativo no hay diferencias considerables debido a que el factor
limitante de la hidrlisis es la propia estructura del sustrato.

Para el resto de los sustratos estudiados el ensayo de tipo II es el que produce

mejores resultados debido a la eliminacin del medio de reaccin de los productos de hidrlisis que actan como inhibidores del proceso.

95

2
2
s

4.5

-I

1.5

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6
GLUCOSA

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GLUCOSA

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42

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5

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CELORIOSA

CV

10

42

LI

<.~/s~L

GLUCOSA

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fi
ETANOL

CV

Figura 30

OLI<COSA

fi

[0

<mg/~s4>

Efecto de la adicin de : (A) glucosa. <8> celobiosa y <CI etanol, en la produccin de azcares por hidrlisis enzimtica del O. ,zeruosum.

96

RESIDUO

ENSAYO TIPO 1:

HIDROLISIS ENZIMATICA
SUSTRATO
HIDROLIZADO

72 h. 20 UIPF/g.
En este ensayo se
horas.

glucosa y reductores

realizaron anlisis de

ENSAYO TIPO II:

HIDROLIZADO

cada 24

HIDROLISIS ENZIMATICA

SUSTRATO

NS

24 h. 20 UIFP/g.

RESIDUO

HIDROLISIS ENZIMATICA
24 h. 20 UIFP/g.

HIDROLIZADO*

RESIDUO

HIDROLISIS ENZIMATICA

24 h 20 UIPF/g.

RESIDUO

HIDROLIZADO

ENSAYO TIPO III:

20U1/g.

SUSTRATO

20 UIPF/g.

20 IUPF/g.

24 horas
24 horas

--

RESIDUO
24 horas

HIDROLISIS ENZIMATICA

HIDROLIZADO
*

anlisis de glucosa y azcares reductores.

Figura

31:
Diferentes estrategias
para estudiar
hidroltico del complejo enzimtico.

97

el

comportamiento

A
o
-1-a

(0

a
09

-9
09
60
E
20

o
EH
60
E

o
O
ENSAYO

IT

Tiempo (horas)

13

20

(0

24

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ci,

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10

ES

12

o
o
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60
o

Tiempo (horas)

o
I~2

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09

-9
ci,

60

o
o
EH
6V

ES

2
1

o
20
VI

ENSAYO

<3

ENSAYO

III

Tiempo (horas)

Figura 32:

Produccin de glucosa por hidrlisis enzimtica.

Sustratos: <A> Solka Floc HW-200, (E> O.ne-uosun pretratado y <0>
O.nertosum sin tratar.

98

70

o
43

(0

ID

09

-9
09

40

60

30

ES
o
o

20

lo
60
ES
20
ENSAYO

40

60

<3

ENSAYO

III

Fempo (horas)

40

o
4-,
~6

3,

43
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25
20

6*2
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o
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EH

40

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20
CV

ENSAYO

40

ENSAYO

00

II

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III

Tiempo (horas)
46

o
43
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-9
09

9
6

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E,
o
o
EH
6*2
ES
20

40

ENSAYO

60

<3

ENSAYO

no
III

Tiempo (horas)

Figura

33.

Produccin
Solka

Floc

de

azcares

HW-200,

reductores
(B>

O.nervosum

99

por

hidrlisis

pretratado

enzimtica.
y

<0>

O.nervosun

Sustratos:
sin

<A>
tratar.

Se observa tambin que, en general, la diferencia entre el rendimiento global de

hidrlisis en el ensayo III 6 1 no es significativa a pesar de que en el primero de ellos Ja
cantidad de enzima es triple que en el segundo caso.
-

Se demuestra con esto que la concentracin de enzima utilizada (20U1/g sustrato)

no es un factor limitante en la reaccin enzimtica estudiada y, que es la inhibicin por
producto final la razn ms importante en el desarrollo eficaz de la reaccin hidroltica.
-

4.1.2.5. Estudios cinticos de la 8-glucosidasa del complejo

enzimtico.
Los ensayos realizados para la determinacin de los parmetros- cinticos de la
actividad 0glucosidasa se llevaron a cabo a 500C y pH 4.8 utilizando como sustratos:
celobiosa (sustrato natural) y p-nitrofenil- WD-glucopiransido. El rango de concentraciones
empleado fue de 0,5-5 mM y 0,05-0.5 mM respectivamente. Los estudios cinticos de la
actividad 0-glucosidasa con ambos sustratos muestran un comportamiento cintico de
Michaelis-Menten en ambos casos. En las figuras 34 y 35 se muestran las representaciones
de Lineweaver-Burk para cada uno de ellos. Asimismo, se ha estudiado el modelo de inhibicin de esta enzima por glucosa, que ha resultado ser de naturaleza competitiva. Esto
supone la posibilidad de reducir el efecto inhibitorio aumentando dentro de ciertos lmites la
concentracin de sustrato. Los valores de Ki, utilizando pNPG y celobiosa como sustrato,
fueron determinados a partir de las representaciones de Lineawever-Burk.
En la tabla XIII se recogen las constantes calculadas experimen- talmente. Estos
resultados son similares a los obtenidos por Evans (1985> para el caso de la 0-glucosidasa de
Corlo/ns versico/or. La baja Km aparente correspondiente a la frglucosidasa para el sustrato pNPG (Km = 0,095 mM> frente a la correspondiente para celobiosa (Km 2,62 mM>,
indica que la enzima presenta una mayor afinidad por el sustrato S-D-glucs ido sinttico que
por la celobiosa, su sustrato natural, esta preferencia por el aril- 0-glucsido ha sido tambin
observada para 0-glucosidasas obtenidas a partir de otras especies (Wase y col,, 1985).

loo--

E
o
E
E
w

Figura 34.

10

1/Ls]

15
mM<

20

Efecto de la concentracin de glucosa sobre la actividad de la frglucosidasa

utilizando pNPG como sustrato. Representacin de Lineweaver-Burk
e 1 sin glucosa. ( o 1 0.5 mM. ( A> 0.75 mM y (A 1 mM.

2 ~

a
E

0,5

Figura 35.

/Ls]

1,5

Efecto de la concentracin de glucosa sobre la actividad de la ~-gIucosidasa

utilizando celobiosa como sustrato. Representacin de Lineweaver-Eurk
1 sin glucosa. 1 o 1 mM. 1 A 2.5 mM y A 1 5 mM.

102

Celobiosa
pnitrofeni1WDglucopiransido~
Km (mM)

2,626

0,095

Vmax (nmol/ml/min)

0,247

0,0041

Ki (mM)

2,56

0,8

TABLA XIII: Parmetros

cinticos

de la

T. longibrachiatum 0M9414.

103--

fr-Glucosidasa de

4.2. Pretratamientos de la biomasa de Onooordum nervosum

Uno de os aspectos fundamentales a tener en cuenta para el diseo y desarrollo de
un proceso de hidrlisis enzimtica de celulosa es la aplicacin de un pretratamiento efectivo, cuya naturaleza depender, entre otros factores, del tipo de sustrato elegido. La presencia de lignina y hemicelulosa as como la existencia de zonas cristalinas en las fibras
celulsicas hacen imprescindible pretratar por mtodos fsicos, qumicos- o biolgicos los
sustratos celulsicos antes de efectuar su hidrlisis, con objeto de alterar su estructura y
facilitar el posterior ataque por las enzimas.
Por este motivo, uno de los principales objetivos en el desarrollo del trabajo recogido
en esta memoria ha sido la evaluacin de diferentes pretratamientos de la biomasa lignocelulsica de O. nertosiuin con objeto de seleccionar aquellos que ofrecieran mejores resultados
desde el punto de vista del aumento del rendimiento de la posterior sacarificacin de dicho
material.
En general y dada las caractersticas qumicas y estructurales de los materiales
lignocelulsicos. los requisitos que deben cumplir los tratamientos previos a un proceso de
hidrlisis enzimtica seran:
-

reduccin de la cristalinidad de la celulosa.

deslignificacin de la biomasa.
aumento de la densidad de la biomasa.
bajos costes econmicos.
bajos inputs energticos.
posibilidad de aprovechamiento de las fracciones de hemicelulosa y
lignina separadas de la celulosa.

En nuestro caso, el efecto de los pretratamientos sobre el material lignocelulsico se

ha evaluado a dos niveles diferentes. En primer lugar, sobre la prdida de material ocurrida
como consecuencia del tratamiento y sobre la composicin del residuo obtenido. En segundo
lugar, se ha estimado la modificacin experimentada en la fraccin celulsica. por el incremento de su susceptibilidad al ataque enzimtico.
La prdida de material se ha evaluado a partir del porcentaje de dicho materia][
remanente despus del tratamiento as como de la composicin del residuo en celulosa.,
lignina y cenizas.

-104--

El xito de un pretratamiento se podra valorar por la cantidad de enzima necesaria

para obtener un grado razonable de hidrlisis o comparando el valor de sacarificacin obtenido utilizando concentraciones de celulasas relativamente bajas (=1UIPF/ml> y bajas relaciones enzima-sustrato (=20 UIPF/g sustrato>. Este segundo sistema es el que se ha
utilizado en nuestro caso dado que estas condiciones proporcionan una medida ms sensible
del efecto de pequeos cambios en las condiciones del pretratamiento en la digestibilidad
enzimtica.
El rendimiento de hidrlisis se calcul a partir de los azcares reductores y glucosa
liberados en el medio de reaccin y se expres utilizando dos indicadores diferentes: eficiencia de sacarificacin y porcentaje de conversin de celulosa en glucosa.
La eficacia de sacarificacin hace referencia a la susceptibilidacf de un sustrato,
nativo o pretratado, a la hidrlisis por celulasas. Se calcul a partir de la glucosa liberada y
la glucosa potencialmente liberable mediante la expresin:

ES

Gp/Gr

Donde:
Gp es el porcentaje de glucosa liberada despus dc 48 horas de hidrlisis de un sustrato
(basado en el peso seco de este sustrato>
Gr es el rendimiento terico mximo de glucosa de ese sustrato. calculado por el mtodo
analtico de PuIs que se recoge en el apartado correspondiente del captufli de Materiales y
Mtodos.
El porcentaje de conversin de celulosa hace referencia no slo a la susceptibilidad
de hidrlisis de un material pretratado sino que incluye tambin el efecto de posibles prdidas de celulosa durante el pretratamiento. Para el clculo se utiliz la siguiente expresin:

CC= Gp.r/Gi

Donde:

105

Gp es el porcentaje de glucosa liberada despus de 48 horas de hidrlisis de un sustrato

(basado en el peso seco de ese sustrato>.
r es el porcentaje de sustrato inicial (como peso seco> recuperado despus del
pretratamiento
Gi es el rendimiento terico mximo de glucosa en el sustrato nativo, calculado por el
mtodo de PuIs.

-106--

4.2.1. Composicin de la materia prima.

Para la realizacin del anlisis de la composicin qumica, la biomasa de O. nervosum
secada a 600C fue previamente triturada en un molino con un paso de malla de 2 mm.
Los anlisis de la materia prima realizada segn los mtodos descritos en el apartado
3.32. figuran en la tabla XIV. Como queda reflejado en dicha tabla, la biomasa de
O.nervosnm est formada principalmente por celulosa, hemicelulosa y lignina, que en su
conjunto, constituye alrededor de un 65% del peso seco de su materia yun contenido en
cenizas prximo al 10%.
4.2.2. Pretratamientos ensayados.
4.2.2.1. Molienda.

Como pretratamiento previo a cualquier otro, se ha estudiado la influencia del grado

de molienda de la lignocelulosa del cardo nativo sobre el incremento de la accesibilidad de
las enzimas al sustrato.
Los resultados obtenidos en esta primera etapa indican que el grado de molienda, no
afecta en gran medida a la produccin de glucosa y inicares reductores en la hidrlisis
enzimtica <tabla XV>, al menos en el rango de tamao de partcula estudiado (0.25-2 mml.
Por ello, la biomasa de cardo utilizada para el estudio posterior de pretratamientos fue
molida y recogida a travs de un tamiz de malla de 2 mm.
Comportamiento similar ha sido observado por otros autores. ~VIcDona1dy col.
(1983>, estudiaron el efecto del tamao de partcula en la produccin de azcares reductores
por hidrlisis enzimtica a las 48 horas sobre zuros de maz, encontrando que sta es
independiente del tamao de partcula en el rango estudiado (45-300 pm>. Rivers y Ernert
(1988>, utilizando sustratos tales como bagazo de caa de azcar y paja de trigo, no encuentran que el tamao de partcula sea un factor principal en la hidrlisis enzimtica en el
rango estudiado (107-947 pm>.

107

COMPONENTE

Vm

Cv

Solubilidad en NaOH
1%

51,46

0,97

Solubilidad en agua
fra

17,36

3,29

Solubilidad en agua
caliente
Extracto

21,25

1,96

7,83

2,80

Proteinas

7,80

1,20

Celulosa

29,65

2,29

Azcares reductores

49,97

2,14

Xilosa

11,84

1,32

Arabinosa

2,36

1,50

Lignina <ason

20,36

2,45

Cenizas

10,42

1,25

alcohol;benceno (1:2>

TABLA XIV.Composicifl quimica de la biomasa del cardo O. neruos tun. Los valores estan
expresados en porcentaje respecto a peso de biomasa seca.
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TABLA XV. Influencia del grado de molienda en a produccin de glucosa y

azcares reductores por hidrlisis enzimtica.

1.09

4.2.2.2. Pretratamiento alcalino.

4.2.2.2.1. Pretratamiento con hidrxido sdico.
Hasta hace relativamente pocos aos, el tratamiento con sosa castica era aplicado

fundamentalmente para aumentar la digestibilidad de los materiales lignocelulsicos utiliza

dos para alimentacin de ganado. Diversos autores han estudiado el efecto del tratamiento
con hidrxido sdico sobre la composicin quimico-bromatolgica y la digestibilidad de sub
productos agrcolas y agroindustriales, con especial hincapi en las pajas de cereales, y la
mayora de estos estudios coinciden en afirmar que el efecto ms importante es el cambio en
la proporcin relativa de los componentes de la pared celular, reducindose, en general, la
fibra neutro detergente. Sin embargo dichos efectos dependen del tipo de tratamiento.,
concentracin de lcali, temperatura, tiempo de actuacin, lavado posterior (Rexen y col..,
1976: Gonzlez Santillana, 1978>. As, una paja embebida en NaOH al 5,8% durante 48
horas incrementa su digestibilidad in vitro desde un 38,7 hasta un 46,3% (Hadjipanayo
tou. 1984>. El tratamiento con NaOH al 1.35% del bagazo de caa de azcar durante 18
horas a temperatura ambiente produce un aumento de la digestibilidad in vitro de la
materia orgnica de 197 (g MO/Kg bagazo seco> a 601 <g MO/Kg bagazo seco> (Plaync.,
1.984>.
Es bien conocido el efecto de una solucin de hidrxido sdico (de aproximadamente
10%> sobre la celulosa nativa: se produce hinchamiento, que se traduce en aumento del rea
superficial interna, disminucin del grado de pobmerizacion. disminucin del ndice de cristalinidad, separacin de los elementos estructurales, lignina y carbohidrats, y formacin de
una celulosa que difiere considerablemente de la primitiva, la nueva celul6a se hidroliza un
40% ms rpidamente que la original (Millet y col., 1954>.
Los distintos sustratos responden de forma diferente al tratamiento con NaOH. No
existe uniformidad de respuesta para las distintas especies vegetales, si bien, parece que
est relacionada con su contenido en lignina. As, por ejemplo. Feist y col. (1970) observan
que la digestibilidad de las maderas blandas, maderas con alto contenido en lignina, aumenta solo ligeramente con el tratamiento con NaOH. mientras que la digestibilidad de algunas
maderas duras y otros materiales lignocelulsicos, con bajo contenido en lignina, aumentan
significativamente con un tratamiento con NaOH. Aunque el hidrxido sdico tiene un
efecto muy marcado sobre maderas duras y paja. tiene, sin embargo. poco efecto en la
digestibilidad del algodn, los resultados presentados por Moore y col. (1972> muestran que
el porcentaje de azcares reductores (expresados como glucosa) no varan tuando el algodn
sufre un tratamiento alcalino.

110

En el presente apartado, se ha estudiado el efecto del pretratamiento alcalino con

NaOH en el rendimiento de la hidrlisis enzimtica del O. nervosnm. Las variables estudiadas: temperatura, concentracion de lcali y tiempo de pretratamiento, fueron elegidas tratando de minimizar los costes asociados a la cantidad de lcali y consumo energtico
durante el pretratamiento.
Recuperacin de material inicial.

Dadas las caractersticas qumicas del pretratamiento y del sustrato se controlaron

las prdidas de material sufridas en esta etapa, identificndose en las tablas como porcentaje de recuperacin de material inicial (r).
En las tablas XVI, XVII, XVIII y XIX se muestran los valores de porcentaje de
recuperacin de material inicial para las distintas condiciones estudiadas: Como se puede
observar, la solubilidad del sustrato en soluciones alcalinas es mayor cuanto mayor es la
temperatura de tratamiento y tiempo de] mismo. El residuo final obtenido, disminuye notablemente cuando el tratamiento fue efectuado con concentraciones de NaOH del 2%. Es
evidente, adems, que la solubilizacin ocurre sobre todo durante los primeros minutos. A
1000C, por ejemplo, y para concentraciones de lcali del 1 y 2 % se producen el 73% y el
85% respectivamente de las prdidas mximas ocurridas en cada caso durante los 10
primeros minutos, A partir de este momento se produce una prdida gradual durante los
siguientes 30 minutos. Esta rpida solubilizacin inicial fue caracterstica para todos los
rangos de temperatura y concentracin de lcali estudiados.
Podemos tambin sealar, que cuando las condiciones en las que se realiz el pretratamiento fueron suaves, es decir aquellos pretratamientos realizados a temperatura ambiente durante 90 minutos y en ausencia de lcali, se produce una solubilizacin del 23,25%
aumentando sta al 32,9% cuando la temperatura de pretratamiento se elev a 1500C.
En las condiciones ms severas de pretratamiento (1500C, 2% N~OH y tiempo 90
minutos> se produce hasta el 61,16% de la solubilizacin del material lignocelulsico.
Comportamiento similar fue observado por McDonald y col. (1983) cuando realizaron
el tratamiento con NaOH sobre zuros de maz. En las condiciones estudiadas por estos
autores, rango de concentracin de NaOH 0-2%, temperatura <100-1500C> y tiempo de
pretratamiento (1-60 mm.), se observa tambin que el grado de solubilizacin depende de la
severidad del pretratamiento siendo los principales factores que influyen: tiempo, concentracin de lcali y temperatura. Durante los primeros 10 minutos se produce el 85% de la
solubilizacin. Los mismos autores, obtienen un rango de solubilizacin de 55-65% con
tratamiento con NaOH (1-2%> y temperatura (100~150oC>; en ausencia de lcali el rango de
solubilizacin fue de 18-28%.
Recuperacin de celulosa y la tigniua.

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4:
-4
ci
4

5-

Para este pretratamiento se realiz un rastreo previo de diferentes condiciones de

temperatura, concentracin y tiempo. De los 56 tipos de ensayos realizados, que se recogen
en las tablas XVI, XVII, XVIII y XIX, se seleccionaron 27 para la realizacin del estudio
ms detallado del patrn de solubilizacin durante el pretratamiento. En la tabla XX se
recogen los valores de composicin (glucosa, azcares reductores y lignina> expresados en
porcentaje con respecto a materia seca para cada uno de los residuos obtenidos despus de
los tratamientos alcalinos seleccionados. En la tabla XXI se muestran los porcentajes de
recuperacin de los diferentes componentes analizados sobre el residuo, as como los rendimientos de hidrlisis enzimtica evaluados como eficacia de sacarificacin (%>. El anlisis de
la varianza segn diseo factorial 3x2x3 se muestra en el anexo III.
Este tipo de pretratamiento solubiliza fundamentalmente lignina y hemcelulosa (estimada a partir de la disminucin de los azcares reductores>. La solubilizacin de lignina
llega en las condiciones ms drsticas al 61,58%.
La solubilizacin fundamentalmente de hemicelulosa y lignina por la accin del hidrxido sdico ha sido observada por numerosos autores. Probablemente, ello es debido a la
ruptura de las uniones ster entre la lignina y xilano (Rivers y Emert, 1988; Gharpuray y
col., 1983>.
Con respecto a la recuperacin de glucosa, sta disminuye significativamente al
aumentar la temperatura y concentracin de lcali, siendo esta disminucin bastante rpida
sobre todo en los primeros 30 minutos, y no encontrndose diferencias significativas a partir
de los 30 minutos (entre los 30 mm. y 90 mm.>. El anlisis de la varianza, segn diseo
factorial 3x2x3, indica que la interaccin temperatura-concentracin de NaOH y
temperatura-tiempo de pretratamiento resultan muy significativas (p<O.OOl> y la interaccin concentracin de lcali-tiempo de pretratamiento resulta significativa (p<O,O1>.
En las condiciones ms severas <1500C, 2% NaOH y 90 mm.> se recupera solamente
el 49,07% de la glucosa en el residuo.
Por otra parte, la fraccin de lignina es la ms solubilizada por efecto del tratamiento, aunque como hemos comentado, en condiciones extremas se puede llegar a solubilizar
cerca del 50% de la celulosa. Aunque la deslignificacin aumenta con la severidad del
pretratamiento, no se observan diferencias significativas en la recuperacin de lignina cuando la temperatura utilizada en la realizacin del pretratamiento se eleva por encima de 120
0C. adems, la deslignificacin mayoritaria se produce durante los primeros 10 minutos del
pretratamiento, no producindose una disminucin significativa a partir de los 30 mm.
(entre 30 y 90 minutos). La deslignificacin a 1000C es ms lenta. Podemos observar que el
efecto nico de la temperatura no produce deslignificacin. sta slo se produce cuando el
efecto temperatura se combina con el efecto de adicin de lcali, tal como se puede observar
a partir de los valores obtenidos para cada una de las condiciones de tempratura estudiadas
cuando no se aadi lcali.

116--

CONDICIONES

% REcUPERACION
DELMATERIAL
INICIAL

Ternp
(OC>

25

100

120

150

Conc.
()

t,ernpo
(mm.)

(r)*
Vm
Cv

GLUCOSA
(%)
Vm

Cv

AZUCARES
REDUCTORES
<O/o)
Vm

Cv

LIGNINA
Vm

Cv

76,75 (2,63)

33,19 (2,01)

48,53 (3,21)

20,70 (6,46)

7,00

37,69

54,64 <3,19)

15,89 (5,73)

90

71,00 (1,63)

32,66 <5,02>

50,35

(4,31)

19,48 <6,60)

90

65,00

29,49

(7,96)

41,39

(5,15)

19,89

(7,97)

300

66,25 (1,31>

29,94 (1,64>

45,92

(5,32)

20,85

(6,04)

10

65,06 (0,99)

42,41

49,15 (4,53)

18,33 (7,59)

30

63,15 (0,27>

31,68 (3,88>

46,21

22,08

90

53,50 (1,08)

37,57 (0,88)

50,95 (3,51>

2149 <5,34)

10

64,10

(0,18)

41,60 (2,31)

59,86

(1,20)

16,09 (4,41)

30

46,00 (3,77)

43,98 (0,84>

61,31

<0,88)

20,44 (7,27)

90

57,00

32,43

45,40 (5,88)

18,94 (7,96)

2
2
2
2
2
2
2
2

300

70,05

32,83 (0,85)

4,81

(4,96)

21,59

(4,44)

63,96 (0,07)

38,52 (2,90)

39,57

(7,12>

2168

(4,43)

10

62,43

34,51

4669 (3,92)

8,39

(10,3>

30

45,15 (1,66)

37,86 (4,30>

43,87

(3,83>

20,00 (8,10)

90

44,70 (0,52)

43,19

61,38 (3,24)

21,68 (4,45)

10

55,65 (1,62>

39,67 (6,26>

53,53

(4,39)

2027

30

4101

46,74 (3,32)

63,31

(0,75)

21,90 (4,52)

90

40,90

41,26 (2,57>

54,95

(2,23)

17,30 (2,00>

300

58,00

(9,95)

32,86 (602)

39,65 <7,29)

28,25 (2,84)

63,45 (4,64)

45,86 (5,21)

56,30 (2,36)

23,18 (3,99)

10

59,39

(2,70)

33,80 (2,51)

44,86

(1,13>

19,85

30

47,40

(2,19)

41,84 (4,41)

53,21

(0,55)

21,25 <3,79)

90

48,56

(1,53>

42,27

(3,87)

53,20

(2,21)

21,53 (1,39>

10

51,81

(1,83)

34,98 (7,54)

51,72

(7,52>

21,14 (3,59)

30

38,90 (4,75)

36,51

56,93

(2,92)

17,14 (3,46)

90

38,85 (4,03)

39,15 (372)

90

30

(14,1)

<2,90)

(0,31)

(1,01)

(3,85)

(10,9)

(7,33)

(2,05)

(6,20)

(4,41)

43,35 (653)

1,90

(6,21)

(1,82)

(4,12)

(5,80>

TABLA XX Porcentaje de recuperacin del material inicial (expresado como peso seco)
despus del pretratamiento (r> y composicin de los residuos slidos para las
disflntas condiciones de pretralamiento alcalino con hidrxido sdico ensayadas
Vm = valor medio Cv = coeficiente de variacin (QSY nr 4 nt 2
117

CON DICION

Temp
Conc
(oc)
(>

0
25
1

100

120

150

ES

tempo
(ruIn)

90
30

82,24 (1,26>
91,29 (1,01>

71,90 (3,91)
79,11 (3,19)

90

75,54 (3,61>

90

REcuPERACION

RECUPERACION

REcUPERAcION

GLUCOSA

A REDuCTORES

LIGNINA

~~>

ES
(%)

(%)

Vm

Cv

98,88 (4,44>
74,23 <5,73)

27,33
19,67

(5,49>
(2,43)

68,98 (2,69)

86,10 (5,60)

38,80 (1,12)

61,90 (7,96>

51,94 (5,15)

80,53

(7,97)

59,89 (2,02>

64,05
89,09
64,63
64,91
86,13
65,36
59,01

(0,83)
(2,88>
(4,14)
(1,04)
(2,48>
(4,60)
(338)

58,69 (4,02>

86,03 (5,20)

35,34 (6,62>

61,70

(3,58)

74,24 (6,80)

57;20

2
2
2
2
2

300
10
30
90
10
30
90

56,33 (4,69)

86,86 (6,42)

61,76 (3,07>

52,94 (4,59)

71,4

(6,29)

66,77 (4,14)

74,07 (128)

64,24 (4,42)

4767 (2,42)

5443

(2,89)

58,48 (4,57)

57,07

49,66 (8,87>

66,72 (7,62>

74,57 (3,36>

300

74,28

(0,85)

64,65 (4,96)

94,21

(4,44>

46,41

(1,69>

79,58 (2,85)

48,86 (7,07)

86,37 (4,36)

50,85

<3,88>

10

69,48 (4,54)

56,22

71,46 (9,65)

57,19

(4,36)

30

55,18 (2,69)

38,25 (5,41)

56,25

5806

(3,67)

90

62,37 (2,36)

52,97 (3,75>

60,36 (4,14>

29,80 (5,54>

10

71,26 (4,64>

57,56 (5,65)

70,29 (3,10)

55,06

(3,80)

30

61,92

(3,63>

50,12

(1,6>

55,96 (4,55)

33,08

(3,42)

90

54,51

(2,57>

43,39 (2,21)

44,09 (7,00)

56,43

(3,29)

300

60,81

(6,67>

44,16 (4,15)

103,9 (10,1)

68,59

(3,39)

93,83

(2,09)

68,93

(3,41>

91,49

(1,27>

51,30

(5,59>

10

64,01

(1,43)

51,42

(1,57)

73,41

(2,92)

78,08 (2,35)

30

64,02

(2,28>

48,69 (274)

62,75 (420)

1923

90

66,27

(2,53)

49,85 (1,07>

65,12 (2,18>

1,597 (421>

10

58,48 (5,72)

51,67 (5,71>

68,20

(2,39)

69,79 (3,11)

30

45,77 (1,54)

42,80 (7,65)

41,48 <1,61)

3,62 (10,79>

90

49,07

32,51

38,42

353 (10,04>

Vm

Cv

(2,43)

vm

Cv

(1,02)

(7,67>

Vm

Cv

<7,94)

(2,45>

(2,73)

(2,89)

(3,31)

Tabla XXI. Efecto del pretratamiento alcalino con hidrxido sdico en la recuperacin de
glucosa, azcares reductores y lignina Efecto en el rendimiento de la hitirlisis
enzimtica expresado como porcentaje de eficiencia de sacarificacin
Vm = valor medio. Cv = coeficiente de variacin (%) n = 4

1.18

Cuando comparamos los distintos pretratamientos llevados a cabo a altas temperaturas (1000, 1200 y 15000) se observa que la interaccin de los efectos combinados
temperatura-concentracin de lcali influyen de forma significativa (p=O,05)mientras que
las interacciones temperatura-tiempo de pretratamiento y concentracin de lcali-tiempo de
pretratamiento resultan muy significativas (p=0,001).
El comportamiento con respecto a la recuperacin en azcares reductores es similar
a aqul que se produce en la recuperacin de la glucosa.
En condiciones relativamente suaves, por ejemplo, a 1000C, 10 mm. y 1% NaOH, la
recuperacin de slidos fue del orden del 65 %, la eliminacin de lignina fue del orden del
25,76% y la prdida de celulosa del 10,91%.
Cuando se compararon nuestros datos con aqullos obtenidos por otros autores para
materiales lignocelulsicos de composicin similar al O. nervosum observamos ligeras dife-
rencias. As, por ejemplo, para el tratamiento con NaOH al 1% a 12000 durante 90 minutos
en el caso de la paja de trigo, Gharpuray y col. (1983) obtienen un 50% de solubilizacin por
efecto del tratamiento, y prdidas de celulosa. hemicelulosa y lignina del 40%, 60% y 85%
respectivamente. En estas mismas condiciones, con O. nervosum encontramos que se soln-
biliza el 55,3%. siendo las prdidas de celulosa y liguina del 37,6% y 39.64%
respectivamente.
Prdidas menores de celulosa fueron obtenidas con pretratamiento alcalino de zuros
de maz <McDonald y col., 1983). En el tratamiento alcalino con NaOH al 1%, a 15000
durante 15 minutos, se pierde el 15% de la celulosa, mientras que en el caso del O,
nervosum en las mismas condiciones de temperatura y concentracin de NaOH, pero con un
tiempo de pretratamiento de 10 mm., las prdidas de celulosa encontradas por nosotros:
fueron del 36%.
Rendimiento de la hidrlisis enzimtica.
Como se ha dicho anteriormente la eficacia de un pretratamiento viene dada por e]L
incremento en la hidrlisis enzimtica que experimenta un determinado sustrato celulsico,,
Para su determinacin se evalu la glucosa producida, a partir de la cual se calcularon las
eficiencias de sacarificacin y eficacia de conversin de celulosa en glucosa de acuerdo con
las definiciones antes sealadas.
Produccin de glucosa.

Los resultados correspondientes a la produccin de glucosa y azcares reductores

(expresados como mg/lOO mg sustrato> despus de una hidrlisis enzimtica durante 48
horas aparecen en las tablas XVI. XVII, XVIII y XIX. En el anexo III se muestra el nalisis
de varianza de los datos correspondientes al rendimiento de la hidrlisis enzimtica.

un--

En general, para todas las condiciones de pretratamiento realizadas se produce un

aumento en la produccin de glucosa por hidrlisis enzimtica. El estudio estadstico indica,
que los valores mximos de dicha produccin se encuentran a temperaturas de 1000C
producindose por encima de sta una disminucin significativa (p<0,OOl) en la produccin
de glucosa. Las diferentes concentraciones estudiadas no dan lugar a resultados significativamente diferentes, aunque la interaccin de los efectos temperatura-concentracin de lcali
resulta muy significativa (p=0,001). Tambin resultan muy significativas (p=O,001>las
interacciones concentracin de lcali-tiempo y temperatura-tiempo. El tiempo de pretratamiento tiene tambin un efecto significativo, los valores ms altos se obtienen cuando ste
fue menor, no encontrndose, sin embargo, disminucin significativa para tiempos largos
(30-90 minutos).
McDonald y col. (1983>. estudiaron el efecto del pretratamiento alcalino en la produc-

cin de azcares reductores por hidrlisis enzimtica de zuros de mazencontrando que

sta disminuye con el tiempo de pretratamiento, aumentando ligeramente al aumentar la
concentracin de NaOH <0-2%> a tiempos cortos, ello es debido probablemente a la solubilzacin de la hemcelulosa y celulosa con lo que se produce una disminucin en los azcares
potenciales del residuo.
Eficacia de sacarifico cin y conversiones de celulosa en glucosa.

Con respecto al rendimiento en la hidrlisis enzimtica, se observa que cuando el

pretratamiento se realiz a temperatura ambiente (25W> durante 90 mm., aqul aument al
aumentar la concentracin de lcali. As, cuando la concentracin de lcali utilizada fue del
2%, la eficacia de sacarificacin (ES%> y la conversin de celulosa (CC%> se multiplicaron
por un factor de 2,72 y 1.68 respectivamente con respecto a los valores correspondientes al
sustrato no tratado.
La conversin de celulosa en glucosa (%> a temperaturas elevadas (100,1200 y
150W) en general disminuye al aumentar la concentracin de lcali del 1 al 2 %. Cuando se

estudia la variable tiempo, se observa que su efecto tanto sobre la conversin de celulosa
como sobre la eficiencia de sacarificacin, va a depender de la temperatura del proceso. A
100W, las conversiones, en lneas generales, aumentan hasta los 60 mm., transcurridos los
cuales comienzan a disminuir. Sin embargo, para temperaturas ms elevadas <120 y 1500C>,
es a partir de los primeros 10 mm. cuando la conversin de celulosa comienza a disminuir,
concretamente a 150W y tiempos superiores a 10 mm. se produce una disminucin considerable de sta as como de la eficacia de sacarificacin. llegando incluso a obtenerse valores
muy por debajo de los obtenidos para el material sin tratar (1500C. 30-90 mini.
Los valores ms altos de hidrlisis a 48 horas fueron encontrados cuando el pretratamiento se realiz en condiciones suaves (1000,1200, 150W durante 10 mm. y concentracin de lcali del 1%). En estas condiciones y a 150W. los valoreg de eficiencia de
sacarificacin y conversin de celulosa alcanzaron el 78,08% y el 50.60% respectivamente.

120

De los resultados expuestos. se puede asegurar que con el pretratamiento alcalino, se

aumenta significativamente la digestibilidad enzimtica, pero desgraciadamente a costa de
importantes prdidas de materia seca y por tanto, de azcares potenciales durante el
pretratamiento.

En la tabla XXII se comparan los rendimientos de hidrlisis enzimtica de la biomasa de O. nervosum obtenidos con los pretratamientos ptimos en este trabajo con los citados
por otros autores para diferentes sustratos lignocelulsicos.
Debido a las diferentes condiciones de trabajo mostradas en dicha tabla es difcil
establecer, con los datos que se ofrecen en ella, comparaciones sobre la facilidad de hidrlisis
enzimtica de la celulosa de los distintos materiales citados. S se puede constatar, sin
embargo, la eficacia del pretratamiento, cuando se seleccionan adecuadamente las condiciones de operacin, para conseguir altos rendimientos de degradacin de la fraccin de celulosa en una gran variedad de sustratos lignocelulsicos.

121

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42.2.2.2.

Pretratamiento con

hidrxido clcico.

Aunque los datos publicados sobre la utilizacin de hidrxido clcico para mejorar la
digestibilidad de residuos agrcolas, en general, parecen indicar que este de tipo agente
qumico no es tan efectivo como la utilizacin del hidrxido sdico, se han obtenido algunos
resultados, como los publicados por Winughogo y col. (1984> sobre paja de arroz, que indican
que el tratamiento con este tipo de reactivo puede ser incluso ms efectivo que el tratamiento con hidrxido sdico, realizado en condiciones similares. Estos autores recomiendan la
utilizacin de una concntracin 1,8 veces superior a la utilizada de hidrxido sdico siendo
suficiente la impregnacin del material durante 24 horas. En estas condiciones y utilizando
20 g Ca(OH)2/l00 g de paja de arroz, la digestibilidad in vitro aument desde el 40% para
el sustrato sin tratar, hasta el 59% en el caso del sustrato tratado. Resultados similares se
obtuvieron cuando se valor la digestibilidad en rumiantes (Ibrahim y Pearce, 1984>. DeI
mismo modo, el tratamiento con altas concentraciones de Ca<OH>2 (300g/Kg sustrato> del
bagazo de caa de azcar supone un incremento de la digestibilidad de 197 a 724 (g MO
digeridaf Kg materia seca) <Playne, 1984>.
La utilizacin de Ca(OH)2 podra ser interesante para aumentar la digestibilidad de
sustratos lignocelulsicos. debido a su bajo coste. flatos recogidos en la bibliografa muestran que el hidrxido clcico supone, dependiendo del pas, solamente del 7 al 20% de][
precio del hidrxido sdico por tonelada (Playne, 1984>, Otras ventajas adicionales de la
utilizacin de hidrxido clcico con resiiecto a la sosa custica es su menor efecto corrosivo.,
facilidad de manejo y la posibilidad de la recuperacin de este tipo de reactivo una vez
efectuado el pretratamiento, aprovechando la baja solubilidad de este compuesto en agua.
El pretratamiento alcalino con hidrxido clcico sobre la biomasa del cardo
O.nevosum se estudi utilizando 2 concentraciones de lcali 0,2 y 1,8%; tres temperaturas
diferentes 4, 25 y 100~C y tiempos de pretratamiento de 24 y 48 horas para los realizados
a 4 y 25W y 10 y 30 minutos para el efectuado a 100W. Los resultados obtenidos se
muestran en la tabla XXIII.
Aunque la solubilizacin y la prdida de celulosa fueron menores para este pretratamiento que para el realizado con hidrxido sdico, la eficacia de la hidrlisis enzimtica fue
no solo menor que para el sustrato pretratado con sosa custica, sino que incluso, los valores
de hidrlisis enzimtica obtenidos fueron en todos los casos significativamente inferiores a
los del material no tratado indicando la ineficacia de este tratamiento sobre la biomasa del
O. neruosum en las condiciones estudiadas.

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42.2.3.1.

Pretratamiento con perxido de hidrgeno.

En la Naturaleza, la lignina es degradada por distintos microorganismos. Aunque el

mecanismo de la degradacin natural de la lignina es desconocido, se sabe, sin embargo, que
el perxido de hidrgeno juega un papel importante. Es bien conocido que el H202 es capaz
de reaccionar con la lignina, y de hecho esta propiedad se ha aplicado para el blanqueo de
pulpa de madera con alto contenido en lignina. Parece ser, que la especie capaz de oxidar la
lignina no es el H202, sino que se debe al radical hidroxilo (HO.) que se forma durante la
degradacin del 11202 con el anin perxido:

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La utilizacin de 11202 en medio alcalino ha sido aplicado como pretratamiento de biomasa

procedente de residuos agrcolas. As, Gould y Freer (1984) tratando paja de trigo y zuros de
maz con 11202 al 1%, pH 11,5 y temperatura ambiente durante 18-24 horas, se produce

aproximadamente el 50% de deslignificacin, eliminndose prcticamente toda la hemicelulosa y recuperndose en el residuo toda la celulosa. El residuo obtenido despus del pretratamiento puede hidrolizarse enzimticamente con una eficacia del 90% (basado en el
contenido de celulosa del material de partida>.
En este trabajo, se ha pretratado la biomasa de O.nervosum utilizando las condiciones ptimas descritas por Gould para paja de trigo (H202 al 1%, pH 11.5; 25W. 24 horas>.
Los resultados obtenidos en este caso fueron los siguientes:
Recuperacin de material inicial: 44,501,27
Composicin (Z):Clucosa: 39,95+0,39
Azcares Reductores: 66,002,04
Lignina: 15,050,38
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125

Cenizas: 3,1
Recuperacin <%):Glucosa: 57,40
Azcares Reductores: 56,69
Lignina: 41,72
Rendimiento de hidrlisis enzimatica:
mg Glucosa/lOO mg sustrato: 21,940,76
mg Azcares reductores/lOO mg sustrato: 34,070,67
Eficacia de sacarificacin (%): 54,91
Conversin de celulosa en glucosa (%): 31,17

Como se puede observar, la eficacia de sacarificacin se multiplica por un factor de

2.4 respecto al sustrato nativo y, se produce adems una elevada deslignificacin (58,3%>.
Sin embargo, y como consecuencia de las elevadas prdidas de celulosa 442,6%>, la eficaca
global del proceso disminuye considerablemente, expresada como porcentaje de conversin
de celulosa en glucosa.
En la tabla XXIV y con objeto de establecer una comparacin con los resultados
obtenidos por otros autores para diferentes sustratos lignocelulsicos pretratados con 11202
se recogen los valores de eficiencia de sacarificacin obtenidos para dichos sustratos as
como el correspondiente a O.nervosum. En ella, se puede observar la fuerte dependencia del
tipo de sustato lignocelulsico para unas condiciones similares de pretratamiento. La eficacia de sacarificacin obtenida sobre O. n<r,osunz es comparable a la obtenida por Oould
(1984) sobre kenaf y sobre roble.

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4.2.2.3.2. Pretratamienta can hipoclorito sdico.

El tratamiento con hipoclorito sdico est descrito en la bibliografa como muy efectivo para
producir deslignificacin en materiales lignocelulsicos tales como bagazo de caa de azcar
y tallo de algodn (Naim y col., 1986>. Este tratamiento se llev a cabo sobre O. nervosum
empleando una solucin de hipoclorito sdico de tal forma que la relacin gramos de cloro
por gramo de sustrato a pretratar fuera de 0,7 6 0,9.
En la tabla XXV, se recogen los resultados obtenidos de porcentaje de recuperacin de[
material inicial <r> de los residuos sometidos a las dos condiciones estudiadas de pretratamiento alcalino con hipoclorito sdico. En la misma tabla se recogen adems, las composiclones de los residuos obtenidos despus del pretratamiento. La prdida de material es en
ambos casos de un 30%. valor comparable a los obtenidos en bagazo de caa de azcar y
tallo de algodn <alrededor del 26% en ambos casos> por Naim y col. (1986> en condiciones
similares de tratamiento.
En la tabla XXVI, se recogen los datos de recuperacin de los componentes mayoritarios de
la biomasa expresados como recuperacin referidos a material inicial. Los resultados mues
tran un alto porcentaje de deslignificacin <31% cuando se utiliz 0.7 g C12/ g sustrato y
40% cuando se utiliz 0,9 g C12/ g sustrato>, sin embargo, no se consigue el efecto de
deslignificacin total obtenido en estas mismas condiciones para los sustratos lignocelulsicos anteriormente mencionados.
Los valores de produccin de glucosa y azcares reductores, expresados como mg/lOO mg
sustrato despus de 48 horas de hidrlisis, as como los valores de eficiencia de sacarificacin y conversin de celulosa se recogen en la tabla XXVII. Como se puede observar e.l
rendimiento de hidrlisis (expresado como produccin de glucosa en el medio de reaccin
despus de 48 horas> experimenta con este tipo de pretratamiento un incremento de 1,98 y
2,44 veces respecto al sustrato nativo para las relaciones g de C12 /g de sustrato de 0,7 y 0.9
respectivamente. Estos valores son similares a los obtenido por EI-l9iwany y col. (1986>
sobre cscara de arroz tratada con clorito sdico.
El incremento de la eficacia de sacarificacin. con respecto al sustrato no tratado. fue de
2.15 y 2.46 para las dos condiciones estudiadas. Los datos recogidos en la bibliografa con
respecto al incremento de este ndice por efecto del tratamiento con hipoclorito sdico
muestran valores diferentes, dependiendo del tipo de sustrato. As, por ejemplo, el bagazo
de caa de azcar experimenta un incremento de la eficacia de sacarificacin desde 1.5%

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para el sustrato nativo hasta 67% para el pretratado, mientras que, el tallo de algodn
aumenta desde 0,6% hasta el 29% en el caso del sustrato pretratado. Tales variaciones en
el comportamiento de los distintos sustratos podran relacionarse con las estructura fisicoqumica de los constituyentes celulsicos y con la especificidad enzimtica por el sustrato
(Naim y col., 1986)

132

4.2.1.4. Pretratamiento cido.

La utilizacin de cido sulfrico diluido (0,2-2%) a temperaturas moderadas <100140W> en el tratamiento prehidrolitico de la madera, fue propuesto por Schller en 1923
como modificacin de su sistema de percolacin a presin (Sehller, 1961). Posteriormente
tanto cidos minerales como orgnicos han sido empleados satisfactoriamente en los pretratamientos de diferentes sustratos lignocelulsicos. La accin principal de los cidos diluidos
a temperatura moderada sobre la lignocelulosa es la de solubilizar la fraccin de hemicelulosa permaneciendo prcticamente inalterado su contenido en lignina y celulosa. Estos pretratamientos son as aconsejables para los materiales con un gran contenido en hemicelulosas
y, son aplicadas como fase inicial o prehidrlisis de los procesos de hidrlisis de materiales
lignocelulsicos para obtener un mximo aprovechamiento de azcares.
La prehidrlisis de madera de lamo y paja de trigo con cido sulfrico a temperatura moderada <120-160W> y alta temperatura (180-2300C> se ha descrito como un pretratamiento eficaz para aumentar la digestibilidad de la celulosa por el complejo enzimtico
producido por mutantes del hongo T-iclodernia reesel <Grohmann y col., 1984; 1985; 1987;
1989; Grethlein y col., 1984; Torget y col., 1990).
En general, se ha descrito que este tipo de pretratamiento es eficaz para el caso de
maderas duras y no en el caso de maderas blandas (Grethlein y col., 1984>.
Segn Grethlein (1985) el pretratamiento con cido diluido crea poros en la madera,
los cuales son suficientemente grandes como para que puedan penetrar las molculas de
enzima y de esta forma acceder a la fibra de celulosa. Estos poros se producen probablemente por eliminacin de la hemicelulosa y condensacin con la lignina.
Wilke y col. <1981), recomiendan la utilizacin de 0,9% de H
2S04 para la eliminacin de las hemicelulosas de zuros de maz y para distintas pajas, previa a la hidrlisis
enzimtica. Cuando este tratamiento se lleva a cabo a 100W durante 5 horas y media, el
40-80% de los pentosanos se transforma en pentosas. La produccin de hexosas por hidrlisis enzimtica aumenta del 20 al 70% sobre la obtenida sin pretratamiento.
En nuestro caso el pretratamiento de O.neruosun en medio cido se ha llevado a
cabo utilizando cido clorhdrico, sulfrico y actico en distintas condiciones de concentracin y temperatura.

133

4.2.2.4.1. Pretratamienta con cida clorhdrica.

En la tablas XXVIII, XXIX y XXX se recogen los resultados obtenidos en cuanto a

recuperacin de material inicial (r) y rendimientos de la hidrlisis enzimtica para los distin
tos condiciones de tratamiento.
Para el tratamiento realizado a 25W el rango de recuperacin de slidos fue de
70-75,5%, mientras que para el realizado a 1000C, fue de 34,5-55,5%.
Con respecto a la produccin de glucosa (expresado como mg/lOO mg de sustrato),
no se producen aumentos significativos con respecto a la obtenida por hidrlisis enzimtica
del cardo nativo (alrededor de 8 mg/lOO mg sustrato) para los pretratamientos realizados a
25W. A medida que se aumenta la temperatura de pretratamiento, conceptracin de cido
utilizado y tiempo de tratamiento, la produccin de glucosa por hidrlisis enzimtica aumenta, llegndose en las condiciones ms favorables <1000C, 5% HCI y 5 h.) a multiplicarse PO!.
2,4 con respecto al sustrato nativo. Sin embargo, si se tienen en cuenta las prdidas de
material que se producen por el efecto del pretratamiento, se obtuvieron rendimientos
expresados como porcentaje de conversin de celulosa en glucosa similares al obtenido sin
tratar (25,8%>.
En las condiciones ms favorables de pretratamiento con cido clorhdrico en el
rango estudiado (1% HCl, 100 C y 5 horas> se obtuvo una recuperacin de slidos del 50%.
una produccin de glucosa por hidrlisis enzimtica de 17,37 mg/lOO mg sustrato y una
eficiencia de sacarificacin del 27.78%.
4.2.2.4.2. Pretratamienta can cido sulfrica.
En la tabla XXXI se recogen los resultados obtenidos para el tratamiento con cido
sulfrico en las diferentes condiciones estudiadas. El rango de recuperacin de material
inicial (r) obtenido fue de 45,4-71,4%.
Con respecto a la produccin de azcares por hidrlisis enzimtica a bajas concentraciones de 112504 (0,2 y 0,5%) no se obtuvo aumento significativo, mientras que a concentraciones de cido ms elevadas 1 y 5% la produccin aument obtenindose un incremento del
80% con respecto al sustrato nativo. En el caso de la utilizacin de cido sulfrico, el efecto
sobre la conversin de celulosa en glucosa es ms evidente, obtenindose en todos los casos
valores de conversin menores que el correspondiente al sustrato sin tratar debido a las
prdidas de material que se producen por efecto del pretratamento.
4.2.2.4.3. Pretratamiento can cido actica.
En la tabla XXXII, se recogen los valores obtenidos para cada una de las condiciones
estudiadas. La recuperacin de material inicial es mayor que en el caso del cido clorhdrico
y sulfrico, el rango obtenido fue de 62-77%. La produccin de glucosa, en general, es menor

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que en los casos anteriores, sin embargo se obtienen mayores conversiones de celulosa en
glucosa (%) debido a la menor prdida de material por efecto del tratamiento, especialmente
en el caso del tratamiento a 70W.
En las condiciones ms favorables (70W, 1% y 3 horas), la recuperacin de slidos
fue del 74,0%, la produccin de glucosa de 15,9 mg /100 mg sustrato, obtenindose una
eficiencia de sacarificacin del 38.06% que corresponde a un incremento del 48% con respecto al sustrato sin tratar.
De los resultados obtenidos puede concluirse que al menos en el intervalo de condi
clones estudiadas para los tres tipos de cidos utilizados, no se favorece la eficacia global delL
proceso de hidrlisis enzimtica.

140

4.2.2.5. Pretratamiento con radiacin gamma.

Diversos autores han estudiado el efecto del tratamiento con radiacin y sobre la
digestibilidad de subproductos agrcolas y agroindustriales (Han y col., 1983a, Khan y col..,
1986; Kumakura y Kaetsu, 1978; Saeman y col., 1952>. La mayora de estos estudios
coinciden en afirmar que el efecto ms importante de la radiacin y a dosis elevadas, de][
orden de io~ rad (100 KGy>. es la disminucin del grado de polimerizacin de la ceiulosa y
una solubilizacin de una considerable proporcin de los materiales lignocelulsicos. La
irradiacin produce una despolimerizacin oxidativa de la celulosa tanto en presencia como
en ausencia de oxgeno (Phillips y Arthur, 1985>. Adems, las roturas originadas por e]L
efecto de la radiacin sobre las cadenas celulsicas, facilitan el anclaje y posterior actuacin
de las enzimas celulolticas. Sin embargo. el efecto final depende fundamentalmente delL
sustrato utilizado: as, por ejemplo, las experiencias de irradiacin llevadas a cabo sobre eL
bagazo de caa de azcar, muestran un aumento del rendimiento en azcares en la hidrlisis
enzimtica de dicho bagazo irradiado con dosis de 10 Mrad (100 KGy~ o superiores. COrL
dosis de 100 Mrad. el rendimiento se triplica con respecto al sustrato no irradiado (Han y
Ciegler, 1982>. Los trabajos realizados por Kumakura y Kaetsu (1982, 1983> demuestran la
eficacia del tratamiento por irradiacin en la mejora de la hidrlisis enzimtica de sustratos
tales como bagazo, paja de arroz, serrn de cedro y residuos de papel, encontrando el ptimo
de digestibilidad cuando se irradi a 5.108 rad, mientras que el ptimo de digestibilidad
encontrado para la paja de trigo es de 2,5.108 rad (Pritchard y col., 1962>. Fan y col. <1987)
estudiaron el efecto de la irradiacin sobre Solka Floc, encontrando que el principal efecto
era el aumento de la superficie especfica como consecuencia de una despolimerizacin de la
celulosa, que no iba acompaada de cambios en el indice de cristalinidad. Otros autores han
comprobado que la presencia de cloro al irradiar la paja de trigo acelera la degradacin de la
celulosa con la consiguiente reduccin de la dosis necesaria para conseguir los mismos
incrementos de digestibilidad <Kumakura y Kaetsu. 1979>. Los resultados no son, sin embargo, muy espectaculares y en cambio resultan poco prcticos para realizarlos a gran escala.
A pesar de los distintos resultados encontrados para los distintos materiales, se
puede generalizar diciendo que con radiacin gamma se necesitan dosis comprendidas entre
10 y 100 Mrad para obtener un aumento significativo del rendimiento en la hidrlisis del
material irradiado.

141

Uno de los principales problemas en la utilizacin de este tipo de pretratamiento es

su alto coste. Por este motivo, se ha concedido gran importancia al estudio de la posibilidad
de aprovechamiento de los residuos de Cesio-137 obtenidos en Centrales Nucleares, que
permitiran el abaratamiento de este proceso.
Estudios previos sobre el efecto de la preirradiacin sobre la hidrlisis cida realizados sobre Onopordum nervosum (Surez y col., 1983>, han mostrado un aumento en el
rendimiento de hidrlisis cida del sustrato irradiado. Por este motivo, se decidi estudiar el
efecto de la preirradiacin del cardo sobre la hidrlisis enzimtica de dicho sustrato. EJ
pretratamiento se llev a cabo sobre el material lignocelulsico suspendido en un medio
acuoso con objeto de comprobar si el efecto adicional de los radicales libres generados por
hidrlisis del agua permita obtener buenos resultados empleando dosis ms bajas. Con este
mismo objetivo se ha estudiado el efecto de la adicin de cido al medio de irradiacin, tal
como sugieren algunos autores para sustratos de composicin similar al Onopordum ne,-to
sum. Asimismo, se ha estudiado el efecto combinado de irradiacin y posterior tratamiento
con cidos diluidos.
Recuperacin de mate;-ial inicial.

El efecto sobre la solubilizacin fue evaluado por prdida de peso seco despus de
realizar el pretratamiento.
En la figura 36 se encuentran recogidos los valores de porcentaje de solubilizacin.
obtenidos para cada uno de los tratamientos de irradiacin realizados en los distintos medios:
(agua, cido sulfrico, cido actico y cido clorhdrico>. A la vista de los resultados obteni-
dos, podramos deducir el escaso efecto de la adicin de cido en el medio de irradiacin,,
como potenciador de la solubilizacin por efecto del tratamiento. Solamente a dosis bajas
<20 Mrad? y en el caso de adicin de cido sulfrico o clorhdrico se observa un incremente
de la solubilizacin.
Cuando se realiz un pretratamiento combinado (irradiacin previa y posterior trata
miento cido) tanto si la muestra fue preirradiada en seco o en agua, la solubilidad aument
con respecto al tratamiento de irradiacin en una nica fase, obtenindose los valores ms
elevados en el caso del tratamiento posterior con cido clorhdrico y sulfrico. En el caso de
tratamiento de radiacin en medio acuoso y posterior tratamiento cido, la solubilizacin
total producida se puede descomponer en dos factores, la solubilizacin correspondiente a la
primera fase y debida al efecto de la radiacin y. aqulla correspondiente a la segunda fase
debida a la accin de los distintos cidos. Teniendo en cuenta este hecho, se ha confeccionado con los datos obtenidos, la figura 37 en la que aparece la solubilizacin debida nicamente
a Ja segunda fase del tratamiento con cidos. Se puede observar que para cada tipo de cido
empleado sta es muy similar para las tres dosis de irradiacin aplicadas, lo cual indicara

142

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90

80

70

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100

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20

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biCi

Figura 36.

2504

CI-13--COOH

HO
2

Influencia de la dosis de irradiacin gamma en la solubilizacin del sustrato

O.nervosuni en diferentes medios.

-143

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501

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(Nicad)

0530005

-o

Figura 37.

Influencia de la dosis de irradiacin gamma en la solubilizacin del sustrato

O nervosum con diferentes cidos.

44

que el efecto del tratamiento cido no se potenciara por la dosis de irradiacin recibida. Sin
embargo, cuando la muestra se irradi previamente en aire, se observ un aumento de la
solubilizacin a medida que aumentaba la dosis de irradiacin.
Recuperacin de celulosa y lignina.

En la tabla XXXIII se recogen los valores de composicin de los residuos obtenidos

despus del pretratamiento de irradiacin en los distintos medios (agua y cido> y para las
distintas dosis de irradiacin ensayadas (20. 50 y 100 Mrad), mientras que en la tabla
XXXIV se recogen aquellos valores correspondientes al tratamiento combinado de irradiacin y posterior tratamiento cido (pretratamiento en dos fases).
La accin del pretratamiento sobre la celulosa y lignina se expresa como recuperacin de celulosa (considerando el 100% el contenido en celulosa del material inicial> y
porcentaje de recuperacin de lignina. En las tablas XXXV y XXXVI se recogen los valores
obtenidos en cuanto a recuperacin de glucosa, azcares reductores y lignina de los pretratamientos realizados en una nica fase y en dos fases respectivamente. En el anexo III, se
recogen los anlisis de varianza segn un diseo factorial 2x4 para comparar los datos de
porcentaje de recuperacin de glucosa, azcares reductores y lignina, en los distintos pretratamientos de irradiacin (pretratamiento en una fase), as como el anlisis de varianza segn
un diseo factorial 3x2x3 correspondiente al tratamiento combinado irradiacin y posterior
tratamiento cido (tratamiento en dos fases>.
Con el tratamiento de irradiacin, a medida que aumentamos la dosis de irradiacin,
la recuperacin de celulosa es menor. llegndose solamente al 45.22k 1 62 en las condiciones mas drsticas (tratamiento en medio acuoso a 100 Mrad y posterior tratamiento con
cido clorhdrico). En general, la recuperacin de celulosa es mayor cuando nicamente se
somete el sustrato a irradiacin, que cuando el sustrato irradiado es sometido posteriormente al efecto de los distintos cidos.
Cuando se comparan los valores obtenidos de recuperacin de celulosa para los
distintos medios en que se realiz la irradiacin (tabla XXXV) se observa una disminucin
muy significativa (p<O.O1) de dicho porcentaje de recuperacin a medida que aumenta la
dosis, dependiendo tanto de la dosis como del tipo de medio utilizado, aunque no se encuentran diferencias significativas entre el cido clorhdrico y sulfrico en cuyos casos las recuperaciones <expresadas en porcentaje> son significativamente ms elevadas que en el caso
del tratamiento en medio acuoso o en medio acidificado con cido actico, teniendo stas dos
ltimas un comportamiento similar.
Si se comparan los pretratamientos combinados de irradiacin y posterior tratamiento cido, pretratamiento en dos fases (tabla XXXVI>, se observa una influencia significativa
de los tres factores estudiados (dosis de irradiacin. medio en el que se realiz la irradiacin
previa (agua/aire) y tipo de cido utilizado en el pretratamiento combinado posterior, siendo
el efecto combinado dosis de irradiacin-medio y medio-tipo de cido, significativo <p<0.05>

145

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146

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CONDICIONES

COMPOSICION
RECUPERACION

% GLUCOSA
Vm
Cv

AZUCARES
REDUCTORES
Vm
Cv

44,50

49,11

(2,36)

58,80

(1,09)

31,89

(2,11)

36,19

44,19

(3,80)

52,42

81,33)

40,74

(2,30)

33,48

44,67

(3,58)

52,69

(1,06)

449,39

(2,33)

47,76

45,41

(3,97)

57,74

(1,98)

28,13

(1,78)

50*

37,70

47,06

(6,07)

54,55

(1,72)

23,06

(3,83)

100*

35,91

50,27

(2,74)

58,23

(1,24)

29,39

(2,59)

20

48,53

45,48 (5,86)

50,74 (1,36)

31,51

(3,44)

38,98

45,42 (5,79)

4823

(1,66)

31,49

(6,37)

36,18

44,50 (2,32)

49,07 (3,87)

34,76

(5,15)

51,88

52,39 (6,39)

58,04 (5,60)

25,88

(752)

50*

40,94

45,97 (648)

55,80 (2,06)

24,40

(2,31)

100*

39,18

43,24 (4,95>

49,93 (3,18>

30,64

<293)

20

67,38

29,80 (2,15)

51,57 (2,38)

20,54 (2,35)

50,09

35,73 (4,32)

49,77 (5,31)

28,79 (2,45)

49,14

34,44 (1,48>

53,41

(3,46)

29,19 (9,12)

72,23

35,28 (1,79)

56,56 (2,70)

21,59 (3,22)

50*

50,47

38,39 (1,53>

55,58 (4,54)

27,70 (1,53)

100*

68,71

32,48 (2,99)

51,06 (3,83)

18,89 (379)

Dosis
(Mrad)

Tratamiento
cido
posterior

20
50

Acdo

100
20*

50

Clorhdrico

Acido

100
20*

50

Sulfrico

cido

100
20*

Actico

DE MATERIAL
INICIAL
<r)

O/ LIGNINA
Vm

Gv

TABLA XXXIV. Porcentaje de recuperacin de material inicial (expresado como peso seco)
despus del pretratamiento (r) y composicin de los residuos slidos obtenidos
para las distintas condiciones de pretratamiento combinado de irradiacin y
posterior tratamiento cido~
las muestras fueron irradiadas previamente en seco.
Vm = valor medio
Cv o coeficiente de variacin (%)
no4
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CONDICIONES

Dosis
(Mrad>

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RECUPERACION
GLUCOSA

Pretatamiento
cido posterior

Vm

Cv

R
RECUPERACION
AZUCARES
REDUCTORES
Vm
Cv

O/o
RECUPERACION
LIGNINA

Vm

Cv

20

65,82

(2,36)

52,19

(1.09)

88,74

(2.11)

50

48.16

(3,80)

38,21

(1,33)

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(2.30)

85,37

(2.33>

100

Acido

45,22

(3.58)

35.53

(1.07)

20*

Clorhdrico

65,31

(3,97>

55.55

(1,98>

50*

53.44

(6.07)

41,42

(1,72)

54,88

(3.83)

100*

54,97

(2,74)

42,12

(1,24)

66.63

(2,59)

20

66.49

(5.86)

49,59

(1,36)

96,55

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50

53,33

(5,79>

37,87

(1.66>

77,49

(6,37)

84,83

(1,78)

100

Acido

48.47

(2,33)

35,76

(3.87)

79.40

(5,15)

20*

Sulfrico

81,86

(6,39>

60,64

(5,60>

84,76

(7,52)

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56,69

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46.01

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63.06

(2,31>

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50,63

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(3,18>

75,78

(2.92)

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(2,15)

69.99

(2.38)

87,37

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50

53,90

(4.32)

50,21

(5.31)

91.04

(2,4S)

100

Acido

50,85

(1,48)

52.86

(3,46>

90,55

(9,12)

20*

Actico

76.76

(1,79)

82.29

(2,70)

98,45

(3.22)-

50*

58,36

(1.53>

56.50

(4,54>

88.48

(1.53)

100*

67,21

(2.59)

70,67

(3,82)

81,94

(3.79)

TABLA XXXVI. Efecto del pretratamiento combinado irradiacin y posterior tratamiento

cido en la recuperacin de glucosa azcares reductores y lignina
las muestras fueron irradiadas previamente en seco.
Vm = valor medio
Cv coeficiente de variacin
n=4
*

149

y muy significativo el efecto dosis-medio <p=O,O1). A medida que aumenta la dosis, la

recuperacin de celulosa es menor aunque, en general, no se observan diferencias significa
tivas cuando el material fue irradiado a 50 y 100 Mrad. Tambin se observa que la recuperacin fue menor cuando el material fue irradiado previamente en medio acuoso. En general,
no se observan diferencias significativas entre el pretratamento posterior con cido actico
y cido sulfrico. En ambos casos las recuperaciones obtenidas fueron mayores que en el
tratamiento cido posterior con cido clorhdrico.
Con respecto a la deslignificacin, cuando el pretratamiento se realiz en una nica
fase, al comparar los distintos medios donde se llev a cabo la irradiacin no se observa
diferencias significativas con respecto a la dosis de irradiacin, es decir, la deslignificacin
es independiente de la dosis aplicada, al menos, en el rango de dosis estudiado (20 a 100
Mrad>. Slo es significativo la influencia del medio utilizado en la irradiaci4n y la interaccin
de los factores medio-dosis de irradiacin. No se produce deslignificacin significativa cuan
do la irradiacin se realiz en medio acuoso. En principio, podramos decir que la irradiacin
como nico efecto no produce deslignificacin, en el caso del Onopordwn n.eruosuin, es decir,
es el efecto del cido el que produce una ligera deslignificacin siendo mxima <media del
orden del 24%> cuando la irradiacin se realiz en medio con cido actico al 1%, no
encontrndose diferencias significativas cuando la irradiacin se realiz en cido sulfrico o
en cido clorhdrico.
Los resultados encontrados en la bibliografa con respecto al comportamiento de la
lignina cuando se irradian materiales de distinto contenido en la misma son muy dispares,
pasando del escaso efecto de deslignificacin encontrada a dosis de 100 Mrad por Bono y
col. <1985) hasta las prdidas significativas de lignina descritas por Han y Ciegler (1982i
sobre bagazo de caa de azcar.
Cuando se compara el efecto combinado irradiacin y posterior tratatamiento cido
<tratamiento en dos fases), no se observan diferencias significativas entre los pretratamientos realizados a 50 y 100 Mrad. La deslignificacin es. en general. mayor cuando el tratamiento previo de irradiacin se llev a cabo en seco. No se observan adems diferencias:
significativas entre el pretratamiento posterior con cido clorhdrico y cido sulfrico. La
deslignificacin producida es mayor con estos dos cidos que con cido actico.
Rendimiento en la hid-lisis enzimtica.
Produccin de glucosa.

En las tablas XXXVII y XXXVIII se encuentran recogidos los valores de glucosa y

azcares reductores producidos a partir de 100 mg de sustrato pretratado despus de 48
horas de hidrlisis enzimtica. Los resultados del anlisis estadstico correspondiente se
muestran en el anexo III. Teniendo en cuenta que para el sustrato nativo se obtienen
valores de produccin de glucosa del 6% (referidos a peso seco>, se observa que por efecto de

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21,68 (3,32>

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37,50 (4,86>

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22,25

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10

Acido

20*

Clorhdrico

100

Acido

20*

Sulfrico

(2,70)

20

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(2,26)

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27,99

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100*

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24,00 (4,67)

46,00

30,95

102,8

TABLA XXXVIII Efecto del tratamiento combinado irradiacin y posterior tratamiento cido en
el rendimiento de la hidrlisis enzimtica.
Vm = Valor medio
Cv = coeficiente de variacin (Va)
ns4
*Las

muestras fueron previamente irradiadas en seco.

152

los pretratamientos realizados se produce un incremento en la produccin de sta, llegndose a multiplicar por un factor de 4 en el caso de la irradiacin en seco a 50 Mrad y posterior
tratamiento con H2S04 (24,12 0,67>.Se observa tambin que la produccin de glucosa por
hidrlisis enzimtica es mayor cuando el pretratamiento con irradiacin es completado con
un tratamiento cido posterior, es decir cuando el pretratamiento se realiza en dos fases.
Este incremento en la produccin de glucosa por hidrlisis enzimtica del sustrato
pretratado, nos refleja un aumento de la accesibilidad de las enzimas a la celulosa de la fibra
por efecto del pretratamiento. Si se observan los valores de composicin de los residuos
(tablas XXXIII y XXXIV) encontramos que, en general, se obtiene una mayor produccin de
glucosa por hidrlisis enzimtica en aquellos sustratos enriquecidos en lignina con respecto
al material original. Es decir, se podria pensar, que despus de la radiolisis gamma, la
mayor accesibilidad a la celulosa no es debida a la deslignificacin sino probablemente a
cambios en el grado de polimerizacin y cristalinidad de la celulosa o a un efecto swelling
tal y como reportan algunos autores (Han y Ciegler, 1982; Han y col., 1983b; Kumakura y
col., 1982; Kumakura y Kaetsu, 1984) o a una posible modificacin en la relacin de los
distintos componentes de la fibra.
Existe un comportamiento diferente dependiendo de que se realice el pretratamiento. en una nica fase o en dos fases. As, por ejemplo, si comparamos nicamente el efecto
de la irradiacin (tratamiento en una fase>, la produccin aumenta con la dosis, pero a partir
de 50 Mrad no se observan diferencias significativas. Sin embargo, si se combina el pretratamiento con un tratamiento cido posterior (tratamiento en dos fases> se observa un mximo de produccin a 50 Mrad,
Eficiencia de sacarificacin y conversin de celulosa en glucosa.

Los resultados obtenidos en cuanto a eficiencia de sacarificacin (ES%) y conversin

de celulosa en glucosa (CC%> estn reflejados en la tabla XXXVII para los tratamientos de
radiacin realizados en una nica fase. En el anexo III se recogen los resultados del anlisis
estadstico correspondiente. Teniendo en cuenta que para el sustrato nativo, el rendimiento
de la eficiencia de sacarificacin (ES%) es del 22% podemos asegurar que la irradiacin
incrementa la accesibilidad del sustrato a las enzimas hidrolticas, obtenindose valores de
hasta 57,72 2,56 y 57,981,49 en los casos de irradiacin en medio acuoso con dosis de
50 y 100 Mrad respectivamente. Sin embargo, si el medio acuoso donde se irradia est
acidificado con cualquiera de los cidos estudiados <HCI, H2504 O CH3-COOH al 1%), se
produce una disminucin de la sacarificacin de forma significativa aunque entre los diferen
tes cidos no existen diferencias significativas. Este hecho no coincide con lo encontrado por
otros autores, segn los cuales, la adicin de cido sulfrico 0,1N incrementa la produccin
de azcares en la hidrlisis enzimtica de bagazo de caa de azcar (Han y Ciegler. 1982>.
Los estudios estadsticos realizados indican que la eficiencia de sacarificacin aumen
la dosis de irradiacin aplicada hasta 50 Mrad y por encima de esta dosis, para los:
valores estudiados, no existen diferencias significativas.
ta con

153

En las experiencias efectuadas por nosotros sobre cardo, se obtiene un aumento del
rendimiento de hidrlisis enzimtica con la dosis de irradiacin de 100 Mrad de 2,6 veces,
que es similar al obtenido por Kumakura y Kaetsu (1982) irradiando bagazo de caa de
azcar con la misma dosis. Estos autores obtienen para el tmismo sustrato irradiado tambin a 100 Mrad, un aumento del rendimiento de 4 veces cuando la hidrlisis se efectu
utilizando la va qumica (con HCI 0,85%). Para la hidrlisis cida del O. nervosum Surez y
col. (1983) han encontrado, en tallo de cardo, un aumento del rendimiento en azcares
reductores desde el 40% a dosis nula hasta 62% a 50 Mrad, y 65.5% a 100 Mrad. Para la
hoja de cardo, el rendimiento en azcares aument desde el 34% a dosis nula hasta el 44%
y 50% cuando la hoja se irradi a 10 y 50 Mrad respectivamente. Tambin parece ser, segn
Kawakishi y col. (1977>, que dosis por encima de 100 Mrad son desfavorables porque pueden
conducir a una descomposicin de oligosacridos y de la estructura de la glucosa.
Los valores obtenidos de eficiencia de sacarificacin (%> y conversin de celulosa en
glucosa (%) en el caso del tratamiento de radiacin realizado en dos fases <irradiacin previa
y posterior tratamiento cido) se recogen en la tabla XXXVIII mientras que en el anexo III
se recogen los estudios estadsticos correspondientes a estos datos. Los valores ms altos de
ambos indices se obtuvieron cuando las muestras fueron previamente irradiadas a 50 Mrad,
no encontrndose diferencias significativas entre el pretratamiento posterior con cido sulfrico y cido clorhdrico, y obtenindose en general mayores eficacias de sacarificacin en el
caso del tratamiento posterior con cido actico. Esto tendra la ventaja adicional de ahorre
de la fase de lavado posterior al tratamiento cido, puesto que la hidrlisis enzimtica se
suele llevar a cabo en tampn acetato pH 4,8.
La accion del cido, que favorece la produccin de glucosa en la hidrlisis, provoca.
tambin, una mayor prdida de celulosa en el pretratamiento, lo que repercute negativamen
te en el rendimiento global del proceso <conversin de celulosa en glucosa) obtenindose en
general incrementos no superiores al 30% del valor del porcentaje de conversin de celulosa
en glucosa obtenido para el cardo nativo.
Cuando se estudia la accin de los cidos en el pretratamiento posterior a la irradia
cin no se encuentra que influya de forma significativa la interaccin de los efectos combi
nados medio-tipo de cido.
La utilizacin de la radiacin y combinada con cidos esta descrita en la bibliografa
(Kumakura y Kaetsu, 1984> como pretratamiento favorable en el incremento de la hidrlisis
enzimtica de determinados sustratos lignocelulsicos. Los resultados obtenidos en nuestro
caso, ponen de manifiesto, sin embargo, que para la biomasa del O. nervosunt el tratamiento
posterior con cido solo potencia el efecto de la irradiacin en el caso de dosis bajas con 20
Mrad.
En general, se puede decir que aunque la irradiacin aumenta significativamente la
eficacia de sacarificacin (hasta 2.6 veces en el caso ms favorable), debido a una prdida
considerable de celulosa como consecuencia de la utilizacin de este tipo de pretratamiento.

154

el rendimiento final que se obtiene expresado como conversin de celulosa en glucosa es

poco satisfactorio.
Desde el punto de vista econmico, los pretratamientos con irradiacin del sustrato
aqu empleado no resultan aconsejables an en el caso de utilizacin de Cesio-137, obtenido
en Centrales Nucleares, como fuente de irradiacin.

155

4.2.2.6. Pretratamiento con solventes orgnicos.

La deslignificacin con organosolventes fue inicialmente estudiada por Kleinert y
Tayenthal (1932) como un nuevo mtodo para la produccin de pasta qumica para la
fabricacin de papel, con costes sustancialmente menores que los procesos convencionales.
Los estudios realizados en este sentido se han llevado a cabo tanto a nivel de laboratorio
como a escala piloto utilizando soluciones acuosas de etanol en presencia y en ausencia de
catalizadores.
Recientemente, la deslignfcacin con organosolventes ha cobrado un gran inters
como mtodo de pretratamento de materiales lignocelulsicos para la hidrlisis enzimtica,
debido a la capacidad de los solventes orgnicos de eliminar la fraccin de lignina o una
combinacin de la fraccin de lignina y hemicelulosa (Black y col., 1987; 1989; Chum y col.,
1985; 1988: Lee y col., 1987). En general. se ha observado mejor comportamiento con este
tipo de pretratamiento sobre biomasa procedente de maderas duras o residuos agrcolas que
sobre biomasa procedente de maderas blandas.
En estos pretratamientos. la deslignificacin va acompaada de solvolisis y disolucin de la fraccin de lignina y hemicelulosa. dependiendo de las condiciones del proceso
(sistema solvente utilizado, temperatura, diseo del reactor batch o continuo-, tipo de
material inicial) <Holtzapple y Humphrey, 1984). Las condiciones ptimas deben ensayarse
para cada tipo de material.
Los principales fenmenos qumicos asociados a los procesos con organosolventes
son <Sarkanen, 1980>:
-hidrlisis de los enlaces internos de la lignina (principalmente -0-4 ster y en
menor proporcin los enlaces 0-0-4) as como de los enlaces lignina-hemicelulosa (enlaces
ster y ster cido 4-0-metilglucurnico> unido al carbono a de las unidades de lignina.
-hidrlisis de los enlaces glucosdicos en la hemicelulosa y en menor proporcin de la
celulosa, dependiendo de las condiciones.
-degradacin catalizada en medio cido de los monosacridos a furfural y 5hidroximetilfurfural seguido de la reaccin de condensacin entre la lignina y sus aldehdos
reactivos.

156

El producto final de este tipo de deslignificacin produce:

-fibra celulsica que contiene la celulosa original y cantidades variables de lignina y
hemicelulosa,
-lignina que puede obtenerse despus de eliminar el organosolvente por destilacin.
-unidades monomricas de azcares procedentes de la fraccin de hemicelulosa disueltas en la fraccin acuosa.
As, la eliminacin de la fraccin de lignina y xilano, facilitara los procesos posteriores de hidrlisis o sacarificacin y fermentacin simultnea, puesto que se evitara la presencia de estos materiales inertes <en general suponen el 30-40% de la capacidad). Adems
mejorara la capacidad de reciclado de enzima, dado que se ha descrito que stas son
capaces de adsorberse en la lignina <Sutcliffe y Saddler, 1987>.
Por otra parte, la posibilidad de recuperacin de estos solventes, hace interesante la
aplicacin de este tipo de procesos como pretratamiento de la biomasa lignocelulsica. Es
conveniente resaltar los trabajos desarrollados por el SERI cuyos objetivos, en la actualidad.
son los estudios de pretratamientos con organosolventes como una opcin interesante para
el fraccionamiento de todos los componentes de la biomasa para su transformacin en
combustible lquido <Chum y col., 1990>.

4.2.2.6.1. Pretratamiento con etanol y butanol como organosolventes.

Se ha estudiado el efecto del pretratamiento de la biomasa lignocelulsica del O.
nervosum con dos tipos de solventes orgnicos, etanol y butanol. El pretratamiento se llev
a cabo adems en presencia de distintos catalizadores (cido, base y fenol) descritos en la
bibliografa por su efectividad en el tratamiento de sustratos similares al O. ne,-vosum.
Recuperacin de material inicial.

Los datos relativos al porcentaje de recuperacin de material inicial (r> de los distin
tos pretratamientos realizados con etanol y butanol se muestran en las tablas XXXIX y XL.
Para una misma temperatura y tipo de solvente orgnico utilizado se encontraron
mayores recuperaciones cuando se utiliz como catalizador fenol, mientras que stas fueron
menores cuando el catalizador utilizado fue hidrxido sdico.
Recuperacin de celulosa y lignina.

157

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Los resultados obtenidos de composicin en glucosa, azcares reductores y lignina

(expresados como porcentaje) de los residuos slidos resultantes del tratamiento con etanol
y butanol se muestran en las tablas XXXIX y XL. En las tablas XLI y XLII se recogen los
resultados del porcentaje de recuperacin de los distintos componentes analizados. Los
resultados del anlisis de varianza correspondiente a estos datos se muestran en el anexo
III.
En el tratamiento con etanol encontramos elevadas recuperaciones de celulosa (expresadas como porcentaje glucosa>, en muchos de los casos prximas a la recuperacin total.
A 1200C, la recuperacin de celulosa fue total tanto en presencia como en ausencia de
catalizador, excepto en el caso de la utilizacin de fenol como catalizador con el que se
producen ligeras prdidas de celulosa (recuperacin del 84,631,90%>.Sin embargo, este
tipo de pretratamiento afecta tanto a la fraccin de lignina como a la de hemicelulosa.
Aunque en ausencia de catalizador, a 1200C. se recupera prcticamente toda la hemicelulosa, en presencia de catalizador se producen ligeras prdidas, aumentando stas con la
temperatura de pretratamiento. El rango de deslignificacin vari entre 13,8 y 34,1; no se
observaron diferencias significativas entre los distintos catalizadores utilizados (p=O,Ol)ni
en la recuperacin de azcares reductores ni en la de lignina para una misma temperatura.
En ausencia de catalizador, se ve un marcado efecto de la temperatura. Mientras que
a 1200C la recuperacion de celulosa y hemicelulosa fue total, al elevar la temperatura
aumentan las prdidas de los distintos componentes, no encontrando diferencias sgnificaticvas entre el pretratamiento realizado a 160 y 1750C.
Con butanol como solvente, se observan tambin altas recuperaciones de celulosa, no
encontrando diferencias significativas entre las distintas condiciones estudiadas. Por e][
contrario, en la recuperacin de azcares reductores se observa un marcado efecto de la
temperatura. Con respecto a la recuperacin de lignina, sta fue menor cuando el pretratamiento se llev a cabo en presencia de NaOI-I como catalizador, siendo en este caso el efecto
de la temperatura muy acusado.
En general. se producen mayores deslignificaciones con butanol. Este mismo fen
meno ha sido observado por otros autores <Ohose y col.. 1983> y puede ser debido a la mayor
polaridad de este disolvente con respecto al etanol.
Como ya hemos comentado, este tipo de pretratamiento se aplica principalmente por
su capacidad de disolver la lignina. Los datos obtenidos para el caso del O. nervosun,~
muestran que, efectivamente, el pretratamiento con solventes orgnicos deslignifica. aunque
este efecto no es tan grande como el producido sobre otros sustratos. En la tabla XLIII se
muestran los valores en cuanto a recuperacin de material inicial tras el pretratamiento, as
como el porcentaje de deslignificacin de diversos sustratos lignocelulsicos junto con los
obtenidos en el presente trabajo para la materia prima considerada. Aunque no se pueden

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evaluacin global si es posible. Los porcentajes de deslignificacin obtenidos en el presente
trabajo son comparables a los obtenidos en algunos casos.
Rendimiento de la hidrlisis enzimtica.
Produccin de glucosa.

En las tablas XLIV y XLV se muestran los valores del rendimiento en la hidrlisis
enzimtica expresados como mg de glucosa y azcares reductores producidos por 100 mg de
sustrato, porcentaje de eficiencia de sacarificacin y porcentaje de conversin de celulosa en
glucosa. Los anlisis de varianza correspondientes a estos datos se muestran en el anexo
III.
La produccin de glucosa (expresada como mglIOO mg de sustrato> aumenta con
este tipo de pretratamiento. En general. es mayor a medida que aumenta la temperatura de
pretratamiento, exceptuando el caso del pretratamiento con etanol y catalizador bsico en
que el efecto de la temperatura hace disminuir dicha produccin. Las condiciones ptimas se
encontraron para el caso de la utilizacin de etanol como disolvente, a 1750C y ausencia de
catalizador (29,020.82mg /100 mg> y, en el caso de utilizacin de butanol a 1600C y en
presencia de catalizador bsico (29.320,74mg/lOO mg sustrato>. En estas condiciones se
incrementa en un factor de 4,2 la produccin de glucosa por hidrlisis enzimtica respecto al
sustrato nativo.
Eficacia de sacari/icacin y conversin de celulosa en glucosa.
En todos los casos se obtuvo un aumento de la eficacia de sacarificacin y de la
conversin de celulosa en glucosa con respecto al sustrato nativo. Las condiciones en las que
se obtuvieron los valores ptimos de estos dos ndices coinciden con aqullas en las que la
produccin de glucosa fue mayor.
En la tabla XLVI se comparan los rendimientos de hidrlisis enzimtica de la biomasa de O. nervosum obtenida en las mejores condiciones de pretratamiento realizado en este
trabajo con los citados en la bibliografa para diferentes sustratos lignocelulsicos. En ella
puede observarse la fuerte dependencia del rendimiento con las distintas fuentes de material
lignocelulsico y condiciones de operacin.

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Dentro de los pretratamientos con solventes orgnicos, se ha estudiado, asimismo, e]L

pretratamiento con n-butilamina. La utilizacin de este tipo de solvente ha sido descrita
como muy efectiva para algunos sustratos lignocelulsicos. As por ejemplo, Tanaka y col.
(1985a) que aplicaron este tratamiento a la paja de trigo (1% de n-butilamina a 1200C~
obtuvieron prdidas de peso del material inicial de alrededor del 30%, una deslignificacin
del 60%. y un aumento de la solubilizacin enzimtica (en 48 horas de hidrlisis enzimticai
de 10% en el caso del sustrato nativo y de hasta el 78% en el sustrato pretratado.
Aunque. como ya se ha comentado en anteriores ocasiones, la utilizacin de pretrata
mientos qumicos presenta algunos inconvenientes, el tratamiento con n-butilamina, y dado
que este compuesto presenta un bajo punto de ebullicin ( 770C>. implicara la ventaja de la
posibilidad de recuperacin de este tipo de reactivo por destilacin y su reutilizacin posterior, con la consiguiente disminucin de los costes de este tratamiento. El principal efecto
de este tipo de pretratamiento qumico es la deslignificacin del material lignicelulsico y
segn algunos autores se produce. adems. un swelling de la celulosa, que afecta nicamente a la regin amorfa, a la hemicelulosa y lignina.
El pretratamiento del Qn ervosum con n-butilamina se llev a cabo utilizando las
condiciones descritas como ptimas en la biblografa para la deslignificacin de paja de arroz
<Tanaka y col., 1985b>.
En la tabla XLVII se recogen los resultados obtenidos en cuanto a recuperacin del
material inicial <expresado en porcentaje sobre peso seco) y la composicin de los residuos
slidos obtenidos despus del pretratamiento, en celulosa, hemicelulosa y lignina.
En la tabla XLVIII se recogen los valores de recuperacin de glucosa. azcares
reductores y lignina en los residuos slidos obtenidos tras el pretratamiento,
Aunque slo se han estudiado dos condiciones de pretratamiento, se observa una
elevada recuperacin del material inicial <alrededor del 80%). producindose adems una alta
recuperacin de celulosa <expresada como glucosa> y de la fraccin de lignina, y unas ligeras
prdidas de hemicelulosa (prdida mxima obtenida expresada como azcares reductores
alrededor del 15%).

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En la tabla XLIX se recogen los valores de rendimiento en la hidrlisis enzimtica.

A pesar de la baja o nula deslignificacin obtenida en los dos casos estudiados, se produce,
como consecuencia del pretratamiento, un aumento considerable de la produccin de glucosa
por hidrlisis enzimtica. sta (expresada como mg glucosa/ 100 mg sustrato> aument de
6,2 en el sustrato nativo hasta 19,6 en las mejores condiciones, lo que indica que mas
importante que la deslignificacin del material, es la modificacin de las relaciones entre los
distintos componentes de la fibra y por lo tanto, de su estructura, La eficacia de sacarificacin alcanz valores del 63,7% para el tratamiento efectuado con una relacin slido/lquido
del 25%, y del 43,47% para el 10% de relacin slido-lquido. Estos valores suponen un
incremento del 255 % y del 174% respectivamente con respecto al sustrato nativo. En este
ltimo caso la eficacia de sacarificacin obtenida fue del 66,3%, la prdida de celulosa nula,
mientras que la deslignificacin fue del 18%.
Para las mismas condiciones de pretratamiento, con un sustrato similar al
O.nervosum, Cynara cardunculus (datos no publicados) se obtuvieron en nuestro laboratorio
valores de eficacia de sacarificacin del 20% y 48% (para las condiciones de relacin slidoliquido del 10% y 25% respectivamente>. En este ltimo caso el incremento del rendimiento
de hidrlisis con respecto al sustrato nativo (eficacia de sacarificacin del 20%> fue similar al
producido sobre la biomasa del O.neruosum.

171

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4.2.21. Pretratamiento de explosin por vapor.

El pretratamiento de explosin por vapor, patentado en 1926 por Manson para la
produccin de tableros de madera. combina el efecto autohidroltico con una desorganizacin
mecnica de la fibra lignocelulsica por efecto de la descompresin brusca a que es sometido
el material. El proceso se lleva a cabo inyectando vapor a presin en un recipiente donde se
introduce el sustrato a tratar. El vapor penetra en la estructura lignocelulsica del material
que, despus de un tiempo de reaccin determinado, es expulsado hacia un cicln a presin
atmosfrica.
Existen distintos procesos desarrollados tanto a escala piloto como a escala de
produccin. Los diferentes procesos difieren en los sistemas de alimentacin, modo de
operacin <continuo o discontinuo> y condiciones de operacin <temperatura y tiempo de
residencia>.
La planta piloto en la que se han llevado a cabo las pruebas de explosin por vapor
se muestra en la figura 38. En el esquema de la figura 15 se muestra el diagrama de
operacin de la planta piloto de tratamiento. La unidad de explosin de vapor est constitu
da por 3 unidades: reactor de explosin por vapor, acumulador de vapor y cicln de descar-
ga, cuyas caractersticas se describen en el anexo II.
El efecto de este pretratatamiento es la liberacin de cidos orgnicos, fundamental-mente cido actico a partir de los restos acetilados de las hemicelulosas. Como consecuencia, se produce una autohidrlisis cida que afecta a los enlaces glicosidicos de las
hemicelulosas y a los enlaces a-ter de la lignina, en mayor o mnor medida dependiendo de
la severidad de las condiciones empleadas <PuIs y col., 1983). Cuando las condiciones son
muy severas las pentosas se transforman en furfural y las hexosas en 5-hidroximetilfurfural,
los cuales pueden generar productos de condensacin <PuIs y col.. 1985). Aunque, la prehidrlisis de las hemicelulosas es la reaccin principal, tambin se producen cambios en la
lignina, que se hace fcilmente extraible en medio alcalino o con solventes orgnicos.

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El resultado final de este tipo de pretratamiento es la alteracin del empaquetamienmicrofibrilar dentro de la pared celular y la rotura de la fibra que provoca un aumento de

la accesibilidad a la celulosa de las enzimas hidrolticas. Este efecto de incremento de la

eficacia de hidrlisis enzimtica se produce tanto para el caso de biomasa procedente de
maderas duras como para el caso de biomasa de residuos agrcolas. Las condiciones ptimas
de temperatura y tiempo de reacccin varan dependiendo del tipo de material.

1173

As, por ejemplo, los resultados de los informes publicados por Iotech Corporation
sobre explosin por vapor de biomasa procedente de maderas duras-. indican encuentra que
las condiciones ptimas tanto para la recuperacin de xilosa como de glucosa son de 500-550
psig, con un tiempo de reaccin de 40-50 s y un contenido inicial de humedad en la biomasa
del 35%. En estas condiciones, se obtuvo una produccin mxima de glucosa equivalente al
90% del contenido terico para los distintos sustratos ensayados, despus de 24 horas de
hidrlisis, utilizando una combinacin de enzimas, Novo Celluclast bOL (procedente de 7.
reesei) y 250L (enzima procedente de Aniger>, con una actividad enzimtica de 9UJPF/g y
una concentracin de sustrato del 5% en el medio de hidrlisis.
Jurasek <1979), utilizando este tipo de pretratamiento sobre madera de lamo y
estudiando un rango de condiciones entre 600 y 700 psig y tiempos de residencia de 20 a 80
s encontr que en las condiciones ptimas (24000) se obtena una produccidn de glucosa del
40 % cuando la hidrlisis se llevaba a cabo a 3000 durante 24 horas con Maxazyme CL
2000 (enzima procedente de 7. reesei) con una concentracion de 30 UI/g sustrato. La
produccin de glucosa en el sustrato nativo fue del 5%.
Dekker y Wallis (1983) obtuvieron una conversin de glucosa del 50% cuando se
hidrolizaba bagazo de caa de azcar (condiciones ptimas de pretratamiento 225 psig.
durante 1-20 minI utilizando enzimas procedentes de lreesei RutCSO y QM94 14, en una
concentracinde 20 UI/g sustrato. La hidrlisis fue llevada a cabo a 5oUc durante 24 horas.

una relacin slido:lquido del 10% (p/v>. La conversin aumentaba hasta el 80% cuando se
aada celobiosa procedente de A. nger.
Puri y Mamers <1983> trabajaron con tres sustratos distintos: paja de trigo, bagazo y
madera de eucalipto.
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(procedente de T.reseei>. Los mismos autores tambin estudiaron el efectode la inyeccin de
C02 durante el pretratamiento, encontrando un aumento de la autohidrlisis. probablemente, debido a la formacin de cido carbnico a altas temperaturas por reaccin del 002 con
el vapor condensado.
lizo y col. <1988) obtuvieron despus del pretrataniiento <7Kg/cm2 y 80 minutos> de
bagazo, un 59% de conversin de glucosa despus de 48 horas de hidrlisis utilizando
celulasas procedentes de Penicillium un iculosum. La hidrlisis fue llevada a cabo utilizando
una relacin slido:lquido del 2.5% y una carga de enzima de 50 UI/g sustrato.
Grous y col. (1986> obtuvieron conversiones superiores al 90 % sobre madera de
lamo tratado por explosin de vapor en las siguientes condiciones. 250 psig durante 20
mm, 350 psig durante 5 mm y 20 mm y 450 psig durante 2. 5 y 20 mm. realizando la

175

hidrlisis enzimtica con enzimas procedentes de T.reseei (16,2 (11(g) y A.niger (76 111(g)
durante 24 horas a 500C. En el caso del sustrato nativo la conversin obtenida fue del
15,2%.
McDonald y col. (1979) utilizando enzimas comerciales Onozuca RiO y Onozuca SS
(enzimas procedentes de T.reesei), llevaron a cabo la hidrlisis enzimtica sobre madera de
lamo durante 24 horas, con na relacin slido:lquido del 2% y una concentracin de
enzima de 0,25 g de enzima/g de sustrato. La conversin obtenida (porcentaje de glucosa
producida) fue del 39% cuando el sustrato se trat en las condiciones ptimas (7,5 mm,
1900C). En este caso, las bajas conversiones obtenidas pueden ser debidas a que la hidrlisis
se realiz a 220C.
De los estudios anteriores, se puede deducir, que existe un rango considerable de
condiciones ptimas de pretratamiento (temperatura, tiempo), dependiend del tipo de material y deben ser determinadas para cada material con el fin de obtener una elevada
recuperacin de carbohidratos y una degradacin ptima de la fibra.
Recuperacin de material inicial.

Para el caso del Onopordum nervosum y como puede observarse en la tabla L. en las
condiciones ensayadas se llegan a alcanzar recuperaciones del material por encima del 88%.
Sin embargo, por razones de diseo de la planta, el material que se obtiene despus del

pretratamiento va acompaado de un volumen considerable de lquido procedente de la

condensacin de vapor (en una proporcin que oscila entre 2 y 4 litros de agua por cada 200
g de material tratado>. Por este motivo, se ha considerado como recuperacin efectiva de
slidos el peso seco del material obtenido despus de la filtracin del lodo resultante, que
como puede observarse en dicha tabla es para el caso ms favorable del 77.05%. En la
misma tabla se recogen los valores de la composicin de los residuos obtenidos para distintas condiciones de tratamiento de explosin por vapor. Se observa que la&prdidas de peso
ocasionadas por efecto del pretratamiento son mayores para las condiciones ms drsticas
(temperaturas ms elevadas y tiempos de residencia largos>. Adems, la fiayor parte de la
prdida total de peso se produce durante los primeros segundos de pretratamiento.
Recuperacin de celulosa y lignina.

En la tabla LI se muestran los valores de recuperacin de celulosa, azcares reducto-res y lignina expresados en porcentaje para las distintas condiciones de tratamiento de
explosin por vapor ensayadas. El anlisis de la varianza segn diseo factorial 2x5 y 3x4
se muestran en el anexo 11.
Es de destacar las elevadas prdidas de azcares reductores-. siendo mucho menores
las prdidas correspondientes a la glucosa, lo que muestra una solubilzacin preferente de
las hemicelulosas del sustrato. Las dos variables estudiadas: temperatura y tiempo de residencia influyen en la recuperacin de glucosa, de forma que. a medida que aumenta la

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temperatura, la recuperacin es menor. Cuando se considera el factor tiempo, se observa

que la recuperacin disminuye con el tiempo, pero a partir de 1 minuto y dentro del rango
estudiado, la recuperacin es de orden similar, Con respecto a la recuperacin de azcares
reductores, se observa que es en la fraccin de hemicelulosa donde se producen mayores
solubilizaciones, La solubilizacin se produce fundamentalmente durante el primer minuto,
siendo constantes estas prdidas a partir de los minutos siguientes.
Por otra parte, la fraccin en la que se producen menores solubilizaciones es la de
lignina. Los resultados obtenidos muestran que, en general, la recuperacin de lignina
aumenta al aumentar la temperatura del pretratamiento, alcanzando valores por encima del
100% cuando el pretratamiento se realiz a 2300C durante 1-4 mm. Los valores que aqu se
muestran corresponden a lignina Klason (lignina cido insoluble> encontrndose en algunos
casos valores superiores al contenido de lignina Klason real. Este hecho, ujuede ser debido a
la formacin de complejos de condensacin de lignina y polisacridos, que se cuantificaran
como lignina cido insoluble puesto que el contenido en este componente ha sido calculado
por el mtodo de hidrlisis total con cido sulfrico, Este fenmeno ha sido observado por

numerosos autores fBrownel] y Saddler, 1984; Brownell y col., 1984 y 1986>.

Rendimiento de la hidrlisis enamntatca.
Produccin de glucosa.

En la tabla LII se muestran los datos referentes a la produccin de glucosa y

azcares reductores (expresados en porcentaje) despus de 48 horas de hidrlisis enzimtica
a 50W. En el anexo III se muestran los anlisis correspondientes a estos datos segn
diseo factorial 2x5 y 3x4.
Para todos los rangos de temperatura y tiempo de residencia se alcanzan valores
muy por encima de los obtenidos. Si tenemos en cuenta que con el control (cardo sin
pretratar), los valores encontrados son del orden del 7,5%, se observa que el incremento
obtenido oscila entre 2 y 4,8 veces.

En general, la produccin de glucosa y azcares reductores aumenta a medida que

aumenta la temperatura y para cada una de ellas con el tiempo de residencia del material.
Los valores ms altos se obtuvieron para el pretratamiento a 230W durante 4 minutos
<36,131.22mg glucosalloo mg sustrato).
Eficacia de sacar/icacin y conversiones de celulosa en glucosa.

Los estudios de hidrlisis enzimtica recogidos en la tabla LII, muestran claramente

el efecto del tratamiento de explosin por vapor en la eficiencia con que las enzimas actuan
sobre la celulosa del cardo. As por ejemplo, mientras que los valores de eficacia de sacarificacin (relacin entre la glucosa liberada y glucosa potencialmente liberable-en un sustratol
estn alrededor del 25% para el caso del material sin tratar, en el caso del tratamiento a

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2300C durante 1 y 2 mm, la eficacia de sacarificacin es superior al 97%. De los estudios

estadsticos realizados (anexo III), se deduce que tanto la temperatura como el tiempo de
reaccin, tienen un efecto positivo sobre la eficacia de sacarificacin, siendo el efecto producido por la primera de ellas mucho ms marcado que el debido al tiempo de reaccin. En
cuanto a la conversin de celulosa, se observa el mismo patrn de comportamiento que en el
caso de la eficacia de sacarificacin, aunque las diferencias encontradas se acortan al quedar
compensado el incremento del rendimiento de hidrlisis con las prdidas de celulosa. Esto
ltimo indica que a pesar de la alta prdida de celulosa, para este pretratamiento (alrededor
del 21%) la celulosa remanente est suficientemente alterada como para que el rendimiento

de hidrlisis compense dichas prdidas. Los valores ms altos de conversin de celulosa se

han encontrado para las condiciones de pretratamiento a 210W durante 8 minutos y 230W
durante 4 minutos (69,32% y 68,84% respectivamente).
Aunque desde el punto de vista de economa global del proceso hay que buscar

condiciones en las que la degradacin de la celulosa sea mnima, uno de los objetivos
fundamentales del pretratamiento debe ser aumentar al mximo la eficiencia de sacarificacin de la celulosa ya que sto conducira a la obtencin de jugos azucarados de mayor

concentracin en azcares y ms adecuados para ser sometidos a fermentaciones

posteriores.
La principal ventaja del pretratamiento de explosin por vapor es la posibilidad de
minimizar la descomposicin de azcares durante el mismo acotando estrictamente las

condiciones de pretratamiento as como, la obtencin de altas concentraciones de azcares

utilizando moderadas concentraciones de enzima.
Asimismo, la presencia de lignina, cuyas prdidas son escasas o nulas durante el

tratamiento de O.nervosum en las distintas condiciones ensayadas. no parece, a la vista de

los resultados constituir en el material pretratado una barrera para el acceso de las enzimas

a la fraccin celulsica.
Tambin es interesante resaltar que las conversiones de celulosa son relativamente

altas incluso cuando se realiz la hidrlisis enzimtica despus de haber secado el residuo
obtenido tras el pretratamiento. Sin embargo, otros autores <Grous y col.. 1986) han observado que la produccin de glucosa cuando la biomasa se seca previamente a la hidrlisis es
mucho menor que cuando la biomasa permanece hmeda. La explicacin de este fenmeno

segn estos autores es que, posiblemente, se pueda producir un colapso en la estructura

porosa creada durante el pretratamiento. En cualquier caso, para el trabajo aqu recogido se
ha optado por el secado previo del residuo con el fin de poder realizar una mejor comparacin con los otros tipos de pretratamientos.

~181

4.2.23.1. Pretratamienta de explosin por vapor en media cido.

De acuerdo con los resultados obtenidos por algunos autores, la aplicacin del tratamiento de explosin con vapor en condiciones cidas mejora la solubilizacin de la hemicelulosa, reduciendo la temperatura y tiempo ptimos de reaccin y disminuyendo
consecuentemente la de gradacin de las pentosas. As, por ejemplo, segn Morjanoff y
Gray (1987> el tiempo ptimo de pretratamiento sobre bagazo de caa a 220W disminuye
de 3 minutos a 30 segundos cuando ste se realiza en condiciones cidas (1% H2504). La
produccin de glucosa por hidrlisis enzimtica del mismo aumentaba desde 48 gibO g
bagazo, cuando el tratamiento se realizaba en ausencia de cido sulfrico, hasta 57,7 g/100

g sustrato cuando se realizaba en presencia de cido.

Pourquie y Vandecasteele <1990) obtienen un incremento del rendimiento de la hidr-

lisis enzimtica de paja de trigo desde 5,8%, en el caso del sustrato nativo, a 3 1,3% en el
caso del sustrato sometido a pretratamiento de explosin de vapor <21 atm., 3 mm.) y 62%
en el caso de realizar este ltimo pretratainiento en condiciones cidas H2S04 0,08N; 18

atm.. 12 mm.). Los mismos autores observaron este mismo efecto de incremento del rendimiento de la hidrlisis no slo para la paja de trigo sino tambin para biomasas procedentes
de distintas especies (residuos agrcolas y forestaies) aunque en el caso concreto de biomasa
procedente de maderas blandas stas fueron menos susceptibles a este tipo de
pretratamiento.
Los resultados obtenidos por Aguilera y San Martin (1985> muestran que la digestibilidad enzimtica de la biomasa procedente de pino (madera blanda) aumenta entre 4 y 6
veces con respecto al sustrato nativo, cuando se realiza el pretratamiento- de explosin por
vapor en ausencia de cido, y alrededor de 10 veces cuando el sustrato se impregna previamente con cido sulfrico.
A la vista de lo expuesto, se ha estudiado este tipo de pretratamiento para la
biomasa del cardo O. nervosum realizando la impregnacin del material con cido sulfrico

al 0.4% y 1%.
Recuperacin del material inicial,

En la tabla LIII se recogen los resultados obtenidos de recuperacin de material

inicial expresado como porcentaje en peso seco) as como los valores de composicin en
glucosa. azcares reductores y lignina de los residuos slidos obtenidos despus del
pretratamiento.

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En el rango de condiciones estudiadas la mxima recuperacin se obtuvo cuando el

pretratamiento se realiz a 170W durante 2 mm. e impregnando el material con H2504 al

0,4%.

Adems, tal y como cabra esperar, la recuperaciones fueron menores que en el caso

del pretratamiento de explosin de vapor en ausencia de cido si se comparan los valores

obtenidos para una condicin dada.

Recuperacin de celulosa y lignina.
En la tabla LIV se recogen los valores de recuperacin de celulosa (expresado como

glucosa), azcares reductores y lignina, expresados en porcentaje para cada una de las
condiciones de pretratamiento realizadas. El anlisis de la varianza se muestra en el anexo
III.
Con este tipo de pretratamiento, se producen, al igual que en el caso de ausencia de
cido, altas prdidas de azcares reductores, siendo stas menores para el caso concreto de
la glucosa. Con respecto a esta ltima fraccin es de destacar que la variable tiempo, al

menos en el rango estudiado, no parece que tenga una influencia significativa, mientras que
en el caso de los azcares reductores totales s la tiene. En ambos casos, el aumento de
temperatura y concentracin de cido utilizado en la impregnacin no producen disminuciones significativas de la recuperacin. La fraccin de lignina, sin embargo. tiene un patrn de
solubilizacin diferente: slamente el aumento de la concentracin de cido sulfrico hace
disminuir la recuperacin de lignina, mientras que ni la temperatura ni el tiempo de pretratandento parece que ejerzan una gran influencia (no se han encontrado diferencias significativas p=O.O1i. Otro punto interesante es la pequea deslignificacin que se produce con este
tipo de pretratamiento. sta fue menor del 10% en todos los casos estudiados.
Rendimiento de la hidrlisis enzimtica.
Produccin de glucosa.
En la tabla LV se muestran los valores de produccin de glucosa yazcares reductores (expresados como porcentaje) despus de 48 horas de hidrlisis enzimtica. En el anexo
III se muestran los anlisis de varianza correspondientes a estos datos.

Con este tipo de pretratamiento se obtuvo en todos los casos un incremento con
respecto al sustrato nativo en la produccin de glucosa que vari desde 1,7 en las condicio-nes menos favorables hasta 2,9 en aqullas ms favorables.
Eficacia de sacarifico cin y con versin de celulosa en glucosa.

Aunque con la impregnacin cida cabra esperar que se incrementase el efecto de la

explosin por vapor en la hidrlisis enzimtica, los resultados muestran <como se observa en
la tabla LV) que se produce una considerable disminucin en la eficacia d&sacarificacin y

en la conversin de celulosa con respecto al sustrato no impregnado. Puesto que el trata-

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-1.86

miento de explosin por vapor en condiciones cidas no produce prdidas aditivas de glucosa

con respecto al sustrato sin impregnar, sto puede sugerir la posibilidad de formacin de
algn inhibidor de la actividad enzimtica durante el pretratamiento en dichas condiciones.

-187

4.2.2.8. Pretratamiento biolgico.

Adems de por mtodos fsicos o qumicos, como los descritos en apartados anterieres, existe la posibilidad de pretratar los materiales lignocelulsicos por mtodos biolgicos,
empleando microorganismos capaces de crecer sobre dichos materiales, provocando transformaciones en su estructura que faciliten el posterior ataque por las enzimas celulolticas.
Es evidente que un pretratamiento de este tipo tiene como exigencia que los microorganismos responsables de dicha transformacin respeten al mximo el contenido en celulosa de la
materia prima. Los microorganismos capaces de desarrollarse utilizando selectivamente la
lignina como fuente de energa son, en principio, los ms adecuados para este tipo de
pretratamiento ya que podra obtenerse como consecuencia del mismo un material deslignificado, rico en la fraccin holocelulsica y por tanto de alto valor para su posterior sacarificacin por hidrlisis enzimtica.
Aunque este tipo de pretratamiento tiene algunas desventajas. como son los largos
tiempos requeridos para el mismo, presenta las ventajas con respecto a los pretratamientos
qumicos y fsicos derivadas de: la menor complejidad. menor consumo de agua, menor
gasto energtico. facilidad de manipulacin del material fermentado y una menor inversin
inicial de capital.
Debido al carcter aromtico y a la naturaleza de los enlaces intermonomricos, la
lignina es uno de los materiales de origen biolgico ms resistente a la degradacin. En
consecuencia, existen relativamente pocos grupos de organismos con capacidad para degradarla o alterarla significativamente. Los nicos organismos que en la Naturaleza producen
una importante degradacin de materiales con alto contenido en lignina son ciertos basidiomicetos. Dentro de los basiodiomicetos. se encuentran el grupo denominado en su conjunto
hongos de pudricin o podedrumbre blanca, que se caracterizan por la alteracin y
degradacin de la lignina hasta C02 y agua, conjuntamente a la utilizacin de los restantes
componentes mayoritarios del material. Los basidiomicetos de este grupo son los degradadores de lignina ms eficaces que se conocen. Dentro de este grupo se encuentra el hongo
Ph.aneroc/zaete chrysosporinm con el que se han llevado a cabo la mayor parte de los
estudios sobre aspectos qumicos y enzimticos de la degradacin de lignina <Buswell y
Odier, 1987; Kirk y Farrel, 1987; Troller y col., 1988: Waldner y col.; 1988, Kantelinen y
col., 1988).
Dado que se ha descrito que P.chrysosporiun es capaz de degradar lignina de maderas procedentes de gimnospermas y angiospermas as como tambin la lignina procedente
de residuos agrcolas (Hatakka. 1983: Agosin y Odier. 1985; Bono y col., 1985; RoIz y col.,
1988) se ha querido estudiar la posibilidad de utilizar este hongo como pretratamiento
biolgico previo a la hidrlisis enzimtica de Oneriosum.

188

Parece ser que el proceso de degradacin de la lignina ocurre tras el inicio del
metabolismo secundario durante el cual el hongo puede sintetizar un sistema de enzimas
ligninolticas. El principal inconveniente con estos microorganismos es que utilizan, como
cosustrato, la celulosa y hemicelulosa, por lo que los estudios realizados en este campo van
dirigidos a encontrar mutantes y condiciones de cultivo que favorezcan la degradacin de la
lignina sin que la celulosa sea consumida en gran medida (Kirk y col., 1986). Con vistas a la
aplicacin de procesos de deslignificacin es deseable que las actividades ligninolticas, celulolticas y hemicelulolticas sean de tal intensidad que se produzca una importante degradacin de la lignina sin que la celulosa se llegue a degradar significativamente. En la iniciacin
o supresin del metabolismo secundario y por tanto de la degradacin de la lignina, juega un
papel importante la disponibilidad de nitrgeno en el medio, de forma que la degradacin de
la lignina slo se produce en medios inicialmente pobres en nitrgeno o cuando ste se ha
agotado (Fenn y Kirk. 1981; Fenn y col., 1981; Jeffries y col.. 1981).
El estudio del pretratamiento biolgico de O.nervosum previo a la hidrlisis con
enzimas se ha llevado a cabo inoculando una suspensin de esporas de 1. chrysosporium. El
sustrato al que se aadi como nica fuente de nitrgeno una solucin de nitrato amonico al
25% hasta una relacin de 113. El sustrato utilizado fue cardo tanto nativo como sometido
a diferentes pretratamientos qumicos <el procedimiento utilizado para la realizacin de este
tipo de pretratamiento se recoge en el apartado correspondiente del captulo de Materiales
y Mtodos).
Recuperacin de material inicial.

En la figura 39 se encuentran recogidos los datos correspondientes a la prdida de

peso en funcin del tiempo de fermentacin con P.ch/ysosporium, sobre cada uno de los
sustratos estudiados (cardo nativo o sometido a diferentes pretratamientos qumicos>.
En el anexo III se muestran los anlisis de varianza utilizados paia comprobar los
datos de porcentaje de insolubilizacin a lo largo de la fermentacin.
Se observa claramente un marcado efecto en lo que respecta al tipo de sustrato sobre
el que se realiz la fermentacin con P.chrysosporium. Cuando la fermentacin se realiz
sobre sustrato nativo, las prdidas de peso fueron mayores que para el resto de sustratos
sometidos a los diferentes pretratamientos qumicos. En el primer caso, las prdidas de peso
durante la primera semana fueron relativamente altas, aumentando solo ligeramente a
partir de sta. Cuando el sustrato sobre el que se realiz la fermentacin fue tratado con un
agente oxidante no se observ prdida significativa de peso durante las primeras cuatro
semanas <p<O,O5>.
El crecimiento del hongo evaluado tanto por el aumento del contenido en nitrgeno
total (figura 40> como por las prdidas de peso seco del sustrato se produce fundamentalmente sobre cardo nativo. Asimismo, se aprecia la incapacidad del hongo para crecer sobre

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nitrgeno total de O.nervosum nativo o sometido a diferentes
pretratamientos.

1141.

el sustrato sometido a pretratamiento oxidante

Recuperacin de celulosa y lignina.

En las tablas LVI, LVII, LVIII y LIX se muestran los valores obtenidos en cuanto a
la composicin en glucosa, azcares reductores y lignina (expresados en porcentaje sobre
peso seco) de los residuos obtenidos despus de la fermentacin por P.chrysosporium sobre
cada uno de los sustratos utilizados.
En el anexo III se muestran los anlisis de varanza elaborados para comparar los
datos de recuperacin de celulosa, azcares reductores y lignina a lo largo de la fermentacin con P.clrysosporiznn sobre cada uno de los sustratos utilizados.
La influencia del tiempo de fermentacin con P.chrysosporium en la composicin de
holocelulosa (referida a la composicin inicial del sustrato> se muestra en las figuras 41 y 42
en las que se representan los valores de glucosa y azcares reductores expresados como
porcentajes del contenido inicial de los mismos.
Se obtuvieron mayores prdidas de celulosa cuando la fermentacin se realiz sobre
cardo nativo> Durante la primera semana se recuper slamente el 48.061.67 % de la
celulosa (expresado en % de glucosa> y, despus de un tiempo de fermentacin de 4 semanas, la recuperacin de celulosa fue solamente del 21,690,74%. lo que indica que el hongo
utiliza fundamentalmente celulosa para su crecimiento.
Cuando el tratamiento se realiz sobre material pretratado en medio bsico, se
obtuvieron prdidas de hasta el 65,950,45% durante las cuatro semanas de cremiento del
hongo. estas prdidas fueron menores cuando el crecimiento se realiz sobre sustrato pretratado en medio cido (35,761,84%).
Cuando se utiliz sustrato pretratado con agente oxidante no se encontraron prdidas significativas, lo cual est de acuerdo con la baja capacidad de crecimiento del hongo
sobre este tipo de sustrato.
En la figura 43 se muestra la influencia del tiempo de fermentacin en la composi-cin de lignina referida a la composicin inicial del sustrato. Se observa cmo el crecimiento
del hongo va acompaada de una tasa de deslignificacin variable segn los casos. As, por
ejemplo, cuando el hongo crece sobre cardo nativo se produce una deslignificacin progresva durante las cuatro semanas de crecimiento, alcanzndose una deslignificacin del 73,42:
0,75% despus de cuatro semanas de crecimiento. En el caso de utilizacin de un sustrato tratado en medio cido, la deslignificacin se produce a partir de la segunda semana de

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de azcares reductores referida a la composicin inicial del sustrato
O.nervosun nativo o sometido a diferentes pretratamientos.

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Nativo

Influencia del tiempo de fermentacin con P.clzrysosporium en la recuperacin

de lignina referida a la composicin inicial del sustrato O.nervosum nativo o
sometido a diferentes pretratamientos.

199

crecimiento, no siendo sta significativa durante las dos semanas siguientes despus de 4
semanas de crecimiento la deslignificacin fue solamente del 9,731,81 %>. Tambin, en el
caso del crecimiento del hongo sobre sustrato tratado en medio bsico, es a partir de la
segunda semana cuando se empieza a producir deslignificacin, alcanzando el 44,141,41%
despus de cuatro semanas de crecimiento.
Cuando el sustrato utilizado fue pretratado con agentes oxidantes no se produjo
deslignificacin significativa durante las cuatro semanas de crecimiento (p=O,05).
Rendimiento de la hidrlisis enzinitica.
Produccin de glucosa.

En las tablas LX y LXI se recogen los valores obtenidos de produccin de glucosa y

azcares reductores respectivamente, despus de la hidrlisis enzimtica de los residuos
obtenidos, a lo largo de la fermentacin sobre cardo nativo o sometido a los diferentes
pretratamientos qumicos. Los rendimientos obtenidos en la hidrlisis enzimtica muestran
tal y como cabria esperar, de acuerdo con el patrn de utilizacin de los distintas fracciones
de material lignocelulsico durante el crecimiento del hongo, la ineficacia de este tratamiento como fase previa a un proceso de hidrlisis enzimtica.
En el anexo III se muestran los anlisis de varianza correspondientes a estos ensayos. Salvo en el caso de la utilizacin del sustrato pretratado con agente oxidante, sobre el
que se produce poco o ningn crecimiento del hongo, en el resto de los casos, la produccin
de glucosa fue menor que cuando el sustrato original no fue sometido a pretratamiento
biolgico. La elevada utilizacin de las fracciones ms fcilmente solubilizables de componente holocelulsico previamente a la aparicin de la actividad deslignificadora, convierte el
material pretratado por este mtodo, contrariamente al objetivo perseguido con su aplicacin, en un sustrato empobrecido en el componente celulsico y constituido a su vez por
celulosa ms difcilmente hidrolizable por el sistema enzimtico. La parcial deslignificacin
observada no parece contrarrestar estos efectos negativos originados como consecuencia de!
crecimiento del hongo.
E/icaria de sacarificacin y con versin de ce/ii/oso en gil/cosa.

En las tablas LXII y LXIII se recogen los valores de eficacia de sacarificacin y

conversin de celulosa en glucosa repectivamente para cada una de las condiciones estudia-das. En el anexo III se muestran los anlisis de varianza de estos ndices.
Tal como cabra esperar a la vista de los bajos valores obtenidos en cuanto a la
produccin de glucosa, la eficacia de sacarificacin disminuye con este tipo de pretratamien-to. En el caso del sustrato sometido a pretratamiento con sosa se llegan a valores de eficacia
de sacarificacin de 2,9 veces menores que los correspondientes al sustrato nativo.

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204

En cuanto a los valores de conversin de celulosa en glucosa, que son ms representativos del rendimiento global del proceso, ya que contempla no slo la eficiencia del ataque
enzimtico sino tambin las prdidas de material ocurridas durante el pretratamiento, se
observa que la disminucin con el tiempo es ms drstica.
A la vista de estos resultados, se puede concluir que la utilizacin de un pretratamiento biolgico de material lignocelulsico encaminado a aumentar el rendimiento de una
hidrlisis enzimtica posterior, requiere la seleccin cuidadosa de microorganismos y condiciones de fermentacin que permitan una utilizacin selectiva de la fraccin de lignina
respetando al mximo el contenido en celulosa de las fibras, sustratos potenciales de la
accin hidroltica de las enzimas.

205

4.2.2.9. Estudio comparativo de la eficacia de los distintas

pretratamientos.
En este apartado y para facilitar la comparacin entre los distintos pretratamientos
aplicados a la biomasa del cardo O. nervosum se recogen los resultados de recuperacin de
material y rendimiento de hidrlisis para las condiciones ptimas dentro de cada uno de los
pretratamientos. En la tabla LXIV se recogen las condiciones de operacin de los pretratamientos seleccionados.
En la figura 44 se recogen los datos de recuperacin de material inicial, as como los
de recuperacin de los distintos componentes analizados (glucosa, azcares reductores y
lignina) en los residuos slidos obtenidos despus del pretratamiento.
Los datos sobre rendimientos de hidrlisis se presentan expresados tanto en funcin
del peso seco del sustrato pretratado (figura 45> como del contenido en celulosa de dicho
sustrato (figura 46>. En la figura 46 se representan asimismo los valores de conversin de
celulosa en glucosa para los distintos pretratamientos.
Como queda reflejado en la figura 44, tanto con los pretratamientos de tipo fsico
(radiacin gamma y explosin por vapor) como con el pretratamiento en medio acuoso a
1500C no se produce deslignificacin apreciable del sustrato, adems los residuos slidos
pretratados por estos mtodos son los que presentan una mayor relacin lignina/celulosa.
Con los pretratamientos de tipo qumico se producen ligeras deslignificaciones que variaron
entre el 15 y 30% salvo en el caso del pretratamiento oxidante en el que se produjeron las
mayores deslignificaciones (alrededor del 60%>. siendo el residuo correspondiente a este
ltimo tratamiento el que presenta la relacin lignina/celulosa menor.
En algunos pretratamientos qumicos (alcalino a 1000C y etanol> y en el tratamiento
de explosin con vapor en condiciones cidas, se produjeron elevadas recuperaciones de la
fraccin de celulosa, siendo total en el caso del tratamiento con etanol. En el resto de los
pretratamientos las prdidas de celulosa variaron entre 25 y 40%.
En todos los casos, se produjo una marcada prdida de hemicelulosa (valorada indirectamente a partir de los azcares reductores), siendo sta bastante evidente en los tratamientos alcalinos, con agua a 1500C y de explosin por vapor. Los residuos
correspondientes a estos tipos de pretratamiento presentaban los valores de relacin
glucosa/azcares reductores ms elevados, mientras que los ms bajos corresponden a los
pretratamientos oxidante y de irradiacin.

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recuperacin de glucosa, azcares reductores y lignina.

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hidrlisis enzimtica.

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Influencia del tipo de pretratamiento de la biomasa de O. nervosum en la

eficacia de sacarificacin (ES) y conversin de celulosa en glucosa (CC) por
hidrlisis enzimtica.

210

Con respecto al rendimiento de hidrlisis enzimtica expresado como liberacin de

glucosa en el medio de hidrlisis ensayado (figura 45>, las mximas producciones se obtuvieron para el pretratamiento de explosin por vapor, siendo stas casi 5 veces mayores a la
correspondiente al sustrato nativo.
En cuanto a los ndices eficiencia de sacarificacin y conversin de celulosa en
glucosa (figura 46), el pretratamiento de explosin con vapor es el que presenta los valores
ms elevados, seguido por los pretratamientos con lcali y etanol. En estos dos ltimos
casos, los valores de conversin de celulosa en glucosa se aproximan a los de eficacia de
sacarificacin debido a que las prdidas de celulosa fueron muy pequeas. Los residuos
obtenidos despus del tratamiento de explosin por vapor presentaban elevada proporcin
de lignina y pequea proporcin de hemicelulosa.

211

4.3. Seguimiento del proceso cJe hidrlisis de O.nervosum

pretratado.
Se ha estudiado la relacin entre el porcentaje de hidrlisis, tiempo de reaccin y
dosis de enzima. Para ello se ha utilizado el O.nervosum pretratado de acuerdo a las condiciones ptimas seleccionadas en el apartado anterior. Estas fueron:
Pretratamiento:explosin de vapor.
Temperatura: 2100C.
Tiempo: 1 minuto.
El seguimiento del proceso de hidrlisis se realiz durante un periodo de tiempo
entre 1 y 94 horas, utilizando una concentracin de sustrato de 50 g/l (C
0) y aadiendo dosis
variables de enzima (5-40 UI/g sustrato).
La concentracin de glucosa y celobiosa en el hidrolizado se determin por HPLC.
La concentracin de celulosa hidrolizada Y (g/l) se calcul de acuerdo a la siguiente
expresin:
Y

[gluJ 0.9+ [cel] 0,95.

donde [glul y celJ son la concentracin de glucosa y celobiosa en el hidrolizado expresado en

g/l.
El rendimiento de la hidrlisis se expres como la relacin entre la celulosa hidrolizada y la concentracin inicial de sustrato expresado como porcentaje (100Y/Co).
En la figura 47 se muestran las cinticas de hidrlisis del O. neruosnn pretratado
para distintas relaciones enzima-sustrato. Se observa un comportamiento bifsico caracterizado por una etapa inicial de hidrlisis rpida hasta aproximadamente 10-12 horas, seguida
de una etapa ms lenta. El rendimiento de hidrlisis aument despus de 94 horas de
hidrlisis desde el 15.3% (5UIPF/g sustrato> hasta el 36,6% (40 UI/g sustrato).
En la figura 48 se muestra el efecto de la dosis de enzima en el rendimiento de
hidrlisis (100Y/C0) despus de 24 y 48 horas. Se observa que alrededor del 70% del
mximo rendimiento obtenido se consigue para valores de actividad enzimtica de 1OUIPF/
g, siendo necesario aumentar la concentracin de enzima 3-4 veces para conseguir el 30%

212

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de enzima.

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Figura 48. Efecto de la dosis de enzima en el rendimiento de la hidrlisis del O.nervosuvn

pretratado despus de 24 y 48 horas.

114

restante. Esto debe tenerse en cuenta a la hora de aplicar procesos de hidrlisis y decidir si.
desde el punto de vista tcnico y econmico resulta ms interesante utilizar mayor actividad
de enzima o, el elevado coste de las enzimas aconseja su utilizacin en menor proporcin, a
pesar de que el rendimiento final del proceso disminuya.

215

5. CONCLUSIONES

5. CONCLUSIONES.
De los resultados obtenidos y discutidos en el apartado anterior se pueden extraer
las siguientes conclusiones:
1.- La produccin de enzimas celulolticas utilizando cultivos de Triehoderma longibrachiatum QM9414 ha mostrado los mejores rendimientos cuando se utiliz como fuente
carbonada un sustrato celulsico puro. Empleando biomasa de Onopordunt nervosum como
sustrato hidrocarbonado para la produccin de enzimas, se observaron los mejores resultados cuando dicho sustrato fue sometido a pretratamiento cido. La presencia de sustratos
lignocelulsicos en el medio influye negativamente tanto en la duracin del proceso como en
la manipulacin de los cultivos debido a la mayor dificultad de crecimiento sobre dichos
materiales y a la baja densidad de los mismos.
2.- Las condiciones ptimas de actividad del complejo enzimtico obtenido se encontraron para rangos de pH y temperatura comprendidos entre 4,3-4,8 y 50-550C respectivamente. La preparacin enzimtica utilizada present una elevada estabilidad en las
condiciones de hidrlisis seleccionadas (pH 4,8 , temperatura 500C y tiempo de reaccin 48
horas>. La frglucosidasa, en particular, conserv el 90% de su actividad despus de 72 horas
en dichas condiciones. Los estudios cinticos de la actividad ~-glucosidasa utilizando como
sustrato celobiosa y p-nitrofenil- frD-glucopiransido muestran un comportamiento cintico
de Michaelis-Menten. El modelo de inhibicin de esta enzima por glucosa, ha resultado ser
de naturaleza competitiva.
3.- Onopordum nervosum, especie seleccionada para este trabajo como material lignocelulsico de inters debido a sus caractersticas de crecimiento, productividad y composicin, presenta en su forma nativa, bajos rendimientos de hidrlisis enzimtica. Empleando
las enzimas celulolticas de T. tongibrachiatum se obtuvieron porcentajes de hidrlisis de su
fraccin celulsica inferiores al 23%. Estos resultados indican la necesidad de someter esta
biomasa a pretratamientos previos al proceso de hidrlisis con objeto de favorecer la accin
hidroltica as como aumentar la concentracin de celulosa en el material pretratado a fin de
obtener hidrolizados de ms elevada concentracin.
4.- La mayora de los pretratamientos qumicos y fsicos utilizados incrementan
considerablemente el rendimiento de transformacin por hidrlisis enzimtica. El tratamiento biolgico con Phanerochaete chrysosporium, debido a la elevada utilizacin de la fraccin
celulsica por parte del hongo, as como el pretratamiento alcalino con hidrxido clcico han
presentado efectos negativos sobre dicho sustrato.

2 16

Entre los pretratamientos de tipo qumico (alcalinos, cidos, oxidantes y orgnicos)

los que han producido mejores resultados han sido los pretratamientos alcalinos con hidrxido sdico y los pretratamientos con solventes orgnicos.
5.- El pretratamiento alcalino con hidrxido sdico aumenta considerablemente la
digestibilidad enzimtica, pero a costa de importantes prdidas de materia seca, siendo
caracterstica en este tipo de pretratamiento una rpida solubilizacin durante los primeros
10 minutos de reaccin en el rango de temperaturas y tiempos estudiados. Los mejores
resultados se lograron en condiciones de tratamiento relativamente suaves (1000C, 1%
NaOH, 10 minutos). En estas condiciones, se produjo una deslignificacin del 26% y una
prdida de celulosa del 11%. El rendimiento de azcares por hidrlisis enzimtica aument
desde 68 gramos de glucosa por kilogramo de sustrato nativo hasta 158 gramos de glucosa
por kilogramo de sustrato nativo.
6.- En general, con el pretratamiento con solventes orgnicos se obtuvieron reducidas prdidas de celulosa, produciendose adems ligeras deslignificaciones (rango de deslignificacin obtenido 14-34%) siendo mayores stas cuando se utiliz butanol como solvente. En
las condiciones ptimas de pretratamiento se increment la produccin de glucosa por
hidrlisis enzimtica en un factor de 2,8 respecto al sustrato nativo.
7.- El estudio de la eficacia del pretratamiento de irradiacin sobre el rendimiento de
la hidrlisis enzimtica muestra que aunque ste puede aumentar hasta 2,6 veces, las
prdidas cosiderables que experimenta la fraccin de celulosa se traducen en un rendimiento
final del proceso poco satsfactiorio. El tratamiento cido posterior a la irradiacin potencia
slo en algunos casos el efecto positivo de la misma, sobre todo a dosis de 20 Mrad. En
generat a dosis mayores no se incrementa la accin de k irradiacin.
8.- La tcnica de explosin por vapor ha mostrado ser el pretratamiento ms eficaz
para la biomasa lignocelulsica de O. nervosnm. La presencia de lignina, cuyas prdidas son
escasas o nulas durante el pretratamiento de dicho sustrato, no parece a la vista de los
resultados, constituir en el material pretratado una barrera para el acceso de las enzimas a
la fraccin celulsica. No se observa incremento de la eficacia de sacarificacin ni de la
conversin de celulosa en glucosa cuando se realiza el tratamiento de explosin de vapor
sobre biomasa previamente impregnada con cido sulfrico, no existiendo adems prdidas
adicionales de celulosa en dichas condiciones.
9.- El mximo rendimiento de transformacin por hidrlisis enzimtica ha sido obtenido cuando la biomasa lignocelulsica fue pretratada por explosin con vapor a 1300C
durante 1-2 minutos. En estas condiciones, se hidroliza ms del 90% de la glucosa potencial
contenida en el material pretratado. Este rendimiento equivale a una produccin de 204
gramos de glucosa por kilogramo de biomasa seca inicial que comparado con la obtenida

217

para el sustrato nativo, supone un valor final de transformacin en glucosa tres veces
superiores. Aunque los rendimientos globales podran mejorarse considerablemente si se
redujeran las prdidas de glucosa durante el pretratamiento, las caractersticas especficas
de la planta de explosin por vapor utilizada no han permitido realizar una seleccin ms
precisa de las condiciones (temperatura, tiempo de reaccin> del pretratamiento.

218

6. RIRLIOGRAFIA

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ANEXO

MEDIOS DE CULTIVO
Medio de patata-glucosa
Composicin:
Trozos de patata pelada
Glucosa
Peptona
Agar
120
pH antes de esterilizar

300 g
20 g
1 g
15g
1000 ml
6

Preparacin:
Los trozos de patata se hierven en aproximadamente 500 ml de H20 durante 1
hora. A continuacin se filtra a travs de gasa y se enrasa a 1 litro con agua destilada.,
Posteriormente se aade el agar y la glucosa, ajustandose el pH a 6 antes de esterilizar.,
Medios !quidos dc produccin de ce!u!asas.
Composicion:
COMPONENTES
(g/l)
(NH4) 2S04
KH2PO4
MgSO4. 7H20
CaCl2. 2H20
NH 2 COlME2
Peptona
Tween8O (mi)

SUST RATO HIDROCARBONADO (g/l)

10
20
1,4
3,9
2,0
2,0
0,15
0,15
0,34
0,34
0,3
0,3
1,0
1,6
0,2
0,2

Preparacin:
A este medio, ya preparado, se le aadi una solucin de metales traza preparada
aparte, en una cantidad de 1 ml. por litro de medio. El medio debe esterilizarse previamente. La solucin de metales traza tiene la siguiente composicin:
Elementos traza
C1H
FeSO4. 7H20
MnSO4H2O

5 ml.
2.5 g
1,6 g

233

ZnSO4.7H20
CoC12
1120 c.s.p.

1,76 g
2 g
1000 ml.

La disolucin de metales trazas, una vez preparada y steril, se mantiene estable en

nevera durante aproximadamente tres meses.
El pH del medio se ajust despus de esterilizar a 5-5,5 mediante la adicin de
NaOH 2N o CIH 0,5 N.

REACTIVO 3,5-DINITROSALICILICO.
Composicin:
-cido 3,5-dinitrosaliclico al 1% (plv>.
-hidrxido sdico al 1% (p/v).
-sulfito sdico al 0,05% (pv).
-sales de Roche/le <tartrato sdico-potsico) al 20% (p/v>.
-fenol destilado al 0,2% <p/v).

REACTIVO PROTEINAS.
Composicion:
A)
B>
C)
O)

Solucin
Solucin
Solucin
Reactivo

de Na2COS a] 2% lp/ii en NaOH 0.1 N.

de CaSO4 al 0,5% (p/v> en tartrato potsico al 1% (pfv).
alcalina de cobre que se obtiene mezclando 50 ml de A y 1 ml de C.
de Folin diluido 1/1 con agua destilada.

DETERIMINACION DE AZUCARES REDUCTORES.

Reactivo alcalino de Somogyi.

Composicion:
Solucin 1
-tartrato sdico potsico 12 g.
-carbonato disdico anhidro 24 g.
-carbonato monosdico 16 g
-sulfato sdico 114 g.
-agua destilada 500 ml.
Solucin II
-sulfato de cobre CuSO4.7H20 4 g.
-sulfito disdico 36 g.
-agua destilada 200 ml.

234

Preparacin:
El reactivo cprico se prepara en el momento de su utilizacin mezclando 4 volmenes de la solucin 1 y un volmen de la solucin II.

Reactivo de Nelson
Composicin:
Solucin 5:
-(NH4)eMo7O24.4H20 25 g.
-H2504 concentrado 21 ml.
-agua destilada 400 ml.
Solucin II:
-Na2HAsO4.7H20 3 g.
-agua destilada 25 ml.
Preparacin:
El reactivo arsenomolbdico se prepara mezclando las soluciones 1 y II en frasco
topacio y se deja en oscuridad a 3700 durante 24 horas.
Procedimiento:
Se toma 1 ml muestra convenientemente diluida para que la concentracin de azcares se encuentre del margen adecuado, se aade 1 ml de reactivo de Somogyi. La mezcla se
calienta en bao de agua a ebullicin durante 30 minutos. A continuacin se enfran los
tubos y se aade 1 ml de reactivo arsenomolbdico. Cuando acaba la reaccin se enrasa a 25
ml con agua desionizada y finalmente se determina la DO a 540 nm, frente a un blanco
preparado de forma idntica a la muestra problema en el que sta ltima es sustituida por
1 ml de agua desionizada, como patrn se utiliz una disolucin de glucosa de 100 pg/ml.
En general, aunque los residuos agrcolas contienen distintos azcares-. cuyas cantidades varian de unos a otros, vamos a referir los datos de azcares reductores a glucosa,
independientemente de las diferencias en el poder reductor de unos azcares a otros.

DETERMINACIN DE GLUCOSA.
Para la determinacin de glucosa se ha utilizado el mtodo enzimtico <de la 6
hexoquinasa> comercializado por Boeliringer. La glucosa se determina a un pH 7,6, con las
enzimas hexoquinasa (HK> y glucosa- 6-fosfato deshidrogenasa (G-6-PDH>. La glucosa se
fosforila con adenosin-5-trifosfato (ATP).

235

11K

Glucosa

ATP

-3G-6-P

AIF.

La glucosa-6-fosfato formada es posteriormente oxidada por la nicotinamida-adenindinucletido fosfato (NADP> en presencia de glucosa-6-fosfato- deshidrogenasa (G6P-DH) a
glucosa-6-fosfato formandose NAOPH reducido.

G6--P

06PDH
NADPH
-*gluconato6fosfato+NADPH+H+

La cantidad de NADPH formada durante la reaccin es proporciona] a la cantidad de

glucosa formada. El NADPH se determina por su absorcin en espectrofotmetro a 340 nm.

DETERMINACION DE GLUCOSA Y CELOB(OSA POR I-IPLC

La separacin y cuantificacin de glucosa y celobiosa se ha llevado a cabo con un
cromatgrafo de lquidos ffewlett-J-acfcard 108113 con detector de ndice de refraccin

79877A.
Columna: Amin ex HPX-87P <300x7,8 mm).
Temperatura de columna: 850C.
Eluyente: agua reactiva.
Flujo del eluyente: 0,6 m/mm.

236

ANEXO II

DESCRIPCION DE LA PLANTA PILOTO.

La planta piloto en la que se han llevado a cabo las pruebas de explosin por vapor
est contituida por 3 unidades: reactor de explosin por vapor, acumulador y cicln de
descarga, cuyas caractersticas se describen a continuacin.
Reactor de explosin por vapor.
Es la cmara donde la biomasa lignocelulsica es comprimida y despresurizada
sbitamente.
Consiste en una tubera de 3 de diametro nominal de acero inoxidable 316, monta
do verticalmente y limitado por 2 vlvulas de paso reducido de 3 de diametro en acero
inoxidable 316.
La vlvula situada en el extremo superior se abre manualmente y a su travs se
efecta la carga de la biomasa lignocelulsica en el reactor.
La vlvula del extremo inferior de la cmara se abre mediante un dispositivo de
disparador y muelle con el fin de lograr una apertura en menos de 1 segundo. De esta
manera, la mezcla de vapor y biomasa se descarga violentamente pasando a travs de la
tubera que conduce al cicln.
La cmara del reactor, vlvulas y tubera de descarga estan aisladas con lana mine-~
ral, de 70 mm de espesor, con el fin de disminuir al mximo razonable la condensacin del
vapor en el proceso de compresin-expansin.
La cmara del reactor est provista de la siguiente instrumentacin y elementos de
seguridad:
a)

Dos termmetros, uno en la parte superior de la cmara, cerca de la vlvula de

carga y otro en la parte inferior, cerca de la vlvula de descarga, de modo que
pueda comprobarse la temperatura
del vapor y de la biomasa
independientemente.

b)

Vlvula de seguridad tarada a la presin mxima del acumulador de vapor.

c>

Un manmetro.

d>

Conexin de ventilacin para despresurizacin despus de los precalentamientos con el fin de permitir, a continuacin, la apertura de la vlvula de carga.

Existen, adems, dos entradas de vapor, una en la parte superior de la cmara y otra
en la inferior.

237

Cic!n de descargo
La mezcla de vapor y material lignocelulsico expulsado en cada disparo entra en el
cicln de descarga horizontal y tangencialmente. El cicln esta construido en acero inoxidable 316 y tiene una parte cilindrica de 16 de diamtro y una parte troncocnica que
partiendo de la cilindrica, hacia abajo y con angulo de 600 acaba en el cuello de una brida
DN-80 y DN 16, sobre la que se monta una vlvula de tipo tajadera por la que se extrae el
material expansionado en el reactor.
El borde superior de la parte cilindrica del cicln acaba en una brida de 16 provista
de orejetas y pasadores que sujetan las 16 pernas de ojo que fijan la brida ciega, que hace de
tapadera de cicln.
El cicln incorpora un termmetro y un manmetro
Acu,nrdador de vapor.
El acumulador ha de suministrar vapor al reactor de explosin por vapor. Consiste
en un recipiente a presin provisto de 3 resistencias elctricas de 9 Kw de potencia cada
una.
El recipiente tiene un diametro de 1000 mm y una altura, entre lineas de tangencia
de 930 mm. Est construido con acero a] carbono y posee las siguientes conexiones, instrumentos y elementos de seguridad.
-

conexion de 1 de diametro para el indicador de nivel

drenaje de 3 /4 diametro
valvula de seguridad de 2 x3 de diametro
manmetro
termometro
presostatos de control de las resistencias elctricas.

En la salida de vapor adems de una placa de orificio limitadora de caudal, se

dispone de una derivacin de venteo a la atmosfera, cerrada por dos valvulas, con el fin de
permitir la salida de aire en los llenados iniciales y en la puesta en temperatura de servicio.
Los presostatos que actan sobre las resistencias estn tarados a presiones escalona-das y actuar uno sobre cada resistencia apagndola o encendindola segn se alcance o no
el nivel de consigna.

238

ANEXO III
Justificacin estadstica

REFERENCIA EN EL TEflO:

Tabla XXI.

Ensayo: Tratamiento alcalino con hidrxido sdico. Recuperacin glucosa (Z).

Fuente de
variacin
Total

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

71

8233,844

Temperatura

2260,188

1130,094

244,958

Concentracin

538,875

538,875

116,806

3042,375

1521,188

329,731

2
4

668,563
1036,031

334,281
259,008

72,458
56,142

214,969

107,484

23,298

223,719

55,930

12,123

54

249,125

4,613

Tiempo
Temperatura
conce~tracin
temperatura
tiempo
Concentracin
-x
tiempo
Tem~5~ turax
conDe araclon
lempo
Error

TEST DE SCHEFPE. COMPARACION HULTIPLE.

COMPARACION

G.L.

G.L.

numerador

denominador

100W

120%

54

14,629

107,009

10000

15000

54

21,699

235, 4 33

12000

15000

54

7,070

24, 993

2%

54

10,807

116,800

10 mm

30 aUn

54

22,140

10 mm

90 mm

54

22,338

30 mm

90 aUn

54

0,198

1%

P=0,10
P ~ 0,05
P ~ 0,01
****P =0,001
NS no significativo
*

**
***

-239

245, 082
249, 490

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla XXI.

Pretratamiento alcalino con hidrxido

Ensayo:

sdico. Recuperacin lignina

(%).

Fuente de
variacin
Total

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

71

11080,530

Temperatura

2100,344

1050,172

82,176

Concentracin

2900,031

2900,031

226,928

2120,969

1060,484

82,983

2
4

446,313
1390,406

347,602

27,200

472,281

236,141

18,4~*

960,094

240,023

18,782

54

690,094

Tiempo
Temperatura
concentracin
temperatura
tiempo
Concentracin
tiempo
Ten1~5? turax
conDe racion
iempo
Error

TEST DE SCBEFEE. COMPARACION IiULTIPLE.

COMPARACION

G.L.

numerador

denominador

120%
150%

2
2

54
54

10,301
11,760

150%

54

1,459

1%

2%

54

15,064

226,929

10 aUn

30 aUn

54

9,700

47,044

10 mm

90 mm

54

12,192

74,326

30 mm

90 mm

54

2,492

3,106

100%
0C
100
120%

P=0,10
1 =0,05
P =0,01

NS

no significativo

*
**

G.L.

240

53,052
69,147
1,065 NS

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla XXI.

Ensayo:

Tratamiento

alcalino

con

hidrxido sdico. Eficiencia

de sacan-

ficacin (%).

Fuente de
variacin
Total

Crgdos
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

71

40238,810

Temperatura

11303,360

5651,680

1909,867

Concentracin

269,688

269,688

91,135

7435,032

3717,516

1256,256

2
4

278,938
17660,830

139,469
4415407

47,131
1492,6~*

1976,203

988,102

333,908

1154,969

288,742

97,574

54

159,797

2,959

Tiempo
Temperatura
concentracin
temperatura
tenpo
Concentracin
tiempo
Tern~e~~ turanc
con~e aracion
iempo
Error

TEST DE SOHEFEE. COMPARACION NIJLTIPLE.

COMPARACION

G.L.

1000C

120%

numerador
2

100%

150%

54

61,485

1890,225

120%

150%

54

36,171

654,169

2%

54

9,547

91,140

1%

denominador
54

25,314

320,409

10 mm

30 mm

54

44,361

983,949

10 aUn

90 mm

54

42,391

898,494

30 aUn

90 mm

54

1,970

P<010
P =0,05
P =0,01

NS

no significativo

*
**

G.L.

241

1,94l~

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tablas XVI, XVII, XVIII y XIX.

Ensayo: Tratamiento alcalino con hidrxido sdico. Produccin de glucosa por
hidrlisis enzimtica (mg/lOO mg sustrato

Fuente de
variacin
Total

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

71

5071,910

Temperatura

1871,359

935,680

1301,684

Concentracin

4,230

4,230

5,885

Tiempo

297,357

463,679

645,053

Temperatura
concentracin
tempe~atura
tiempo
Concentracin
.2<
tiempo
TemDera tura-x
concevtracion

94,475

47,237

1715,852

428,963

86,355

43,178

333,456

83,366

38,816

0,719

Error

54

115,976

TEST DE SCEEFFE. COMPARACION MUI.TIPLE.

G.L.
numerador
2

COMPARACION

denominador
54

1000C

120W

15,567

100%

150W

54

49,864

120%

150W

54

34,297

1%

2%

54

2,424

5,87t

12l,lt
1243,214

10 aUn

30 mm

54

30,596

468,0~**

10 aUn

90 mm

54

31,592

499,OS~

30 mm

90 aUn

54

P=0,10
=0,05
P =0,01

NS

no significativo

*
**

G.L.

-242

0,996

0,49W

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla XVI, XVII, XVIII y XIX.

Ensaya: Tratamiento alcalino con hidrxido sdico. Convesion de celulosa en

glucosa (%).

Fuente de
variacin
Total

Grados
libertad
-

71

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

18354,010

Temperatura

6967,875

3483,938

2062,964

Concentracin

277,523

277,523

164,332

6258,688

3129,344

1852,996

2
4

190,508
3821,188

95,254
955,297

56,403

464,063

232,031

137,394

282,969

Tiempo
Temperatura
concentracin
temperatura
tiempo
Concentracin
-x
tiempo
Temneratura.x
contentraclon
x tiempo
Error

54

u-.-

91,195

7
70,742

41,888

1,689

TEST DE SCHEFFE. COMPARACION NULTIPLE.

COMPARACION
100%

1200C

denominador

1%

2%

10 aUn

30 aUn

54

52,682

1387,691

10 mm

90 mm

54

52,760

1391,790

30 mm

90 mm

54

0,078

P =0,10
P ~ 0,05
P =0,01

NS

no significativo

*
**

G.L.
numerador
2

243

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla XXXV.

Ensayo:

Pretratamiento

Fuente de
variacin

de irradiacin.

Grados
libertad

Recuperacin de glucosa (Z).

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

Total

47

3725,266

Dosis

1715,828

857,914

97,213

Medio

286,469

95,490

10,820

1405,266

234,211

26,539

317,703

8,825

Dosis X Medio
Error

36

TEST DE SCHEFFE. COMPARACION Y4ULTIPLE.

COMPARACION

C.L.
numerador

G.L.
denominador

20 Mrad

50 Mrad

36

2,076

20 Mrad

100 Mrad

36

12,979

84,227

50 Mrad

100 Mrad

36

10,903

59,436
*

H2504

CH3COOH

1120

CH3COOH

P<010
P <005
1 =0,01

NS

no significativo

*
**

36

-244--

5,650

10,642

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla XXI.

Ensayo:

Tratamiento

alcalino

con

hidrxido

sdico.

Recuperacin

azcares

reductores (%).

Fuente de
variacin
Total

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

71

5870,907

Temperatura

1813,813

906,906

182,959

Concentracin

31,406

31,406

6,336

2014,719

1007,359

203,224

367,219

183,609

37,041

303313

75,828

15,298

705,781

352,891

71,192

366,984

91,746

18,509

54

267,672

4,957

Tiempo
Temperatura
concentracin
temperatura
tiempo
Concentracin
.2<
tiempo
Temer tura..x
con~e aracion
x
lempo
Error

**

TEST DE SCREFFE. COMPARACION MULTIPLE.

COMPARACION

GL
numerador

G.L.
denominador

100%
1000C

120%
150%

2
2

54
54

13,048
18,638

85,121
173,686

120%

150%

54

5,590

15,626

1%

2%

54

2,516

6,332

10 mm

30 aUn

54

16,080

129,290

10 mm

90 mm

54

18,571

172,444

30 mm

90 mm

54

2,491

P=0,10
P =0,05
P ~ 0,01
****P =0,001
NS no significativo
*
**
***

245

**

3
3,102

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla XXXVI.

Ensayo:

Pretratamiento

combinado irradiacin

y posterior tratamiento cido.

Recuperacin glucosa (%).

Fuente de
variacin

Grgdos
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

4120,922

2060,461

323,415

1168,031

183,337

7205,422

Medio

1168,031

Acido

423,203

125,422

461,547

Dosis
x
med o
Dosis
cido
Me io
x
cido
Dosis
2<
medio x cido
Error

j4j44*
2

180,281

90,141

381,984

95,496

54

344,031

6,371

14,989

TEST DE SCREFFE. COMPABACTON MULTIPLE.

COMPARACION

numerador

denominador

20 Mitad

50 l4rad

20 Mitad

100 Mitad

50 Mitad

100 Mitad

Aire

54

13,540

183,329

Agua
HCl

S04112

54

5,616

15,767

ECl

CH3COOH

54

7,923

31,386

S04H2

CH3C00E

54

2,307

2,662

P=0,10
E <005
P =0,01

NS

no significativo

*
**

246

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla XXXV:

Ensayo: Pretratamiento de irradiacin. Recuperacin de azcares reductores (%).

Fuente de
variacin

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

Total

47

572,891

Dosis

80,477

40,238

32,38~***

Medio

50,680

16,893

j359~

397,008

66,168

53,258

44,727

1,242

Dosis X Medio
Error

36

TEST DE SCIIEPFE. COMPARACION MULTIPLE.

20 Mrad

100 Mrad

36

8,004

32,03~

HCl

112S04

36

6,269

13,098

HCl

C113C0011

36

3,805

4,82~

HCl

1120

112504

C113COOH

112504

1120

CH3COOH

1120

36

1,221

*
**

E =0,10
E =0,05

P =0,01

NS

no significativo

247

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla XXXVI

Ensaya:

Pretratamiento combinado irradiacin y posterior tratamiento cido.

Recuperacin

de azcares

reductores

(%).

Medio

1164,750

1164,75

405,661

Acido

5922,688

2961,344

1031,382

Dosis
medio
Dosis
cido

42,563

21,281

398,734

99,684

34,718

181,906

90,953

31,6~*

160,547

40,137

13,979

54

155,047

2,871

Medio
x
cido
Dosis
2<
medio x cido
Error

**
7,412

TEST DE SCBEFFE. COMPARACION MUIJTIPLE.

COMPARACION

G.L.
numerador

denominador

20 Mrad

50 Mrad

54

34,076

580,586

20 Hrad

100 Mrad

54

31,990

5l1,6~**

50 Mrad

100 Mrad

Aire

54

20,141

405,663

Ecl
ECl

504112
C113C0011

2
2

54
54

1,451
40,039

S04H2

C113COOH

54

38,587

Agua

E =0,10
P =0,05
~ =0,01

NS

no significativo

*
**

248

1,0~
801$4$

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla XXXV.

Ensayo:

Pretratamiento

Fuente de
variacin

de irradiacin.

Recuperacin

de lignina

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

4407,188

1469,063

1467,125

244,521

36

1780,344

49,454

(%>.

Cuadrado
medio

Total

Dosis
Medio
Dosis X Medio
Error

29,70***
4,944

TEST DE SCHEFFE- COMPARACION MULTIPLE.

COMPARACION

G.L.

G.L.

numerador

denominador

20 Mrad

50 Mrad

36

0,106

20 Mrad

100 Mrad

36

0,168

50 Mrad

100 Mrad

36

0,062

ECl

H2S04

36

1,174

IKI

CH3COOH

36

3,723

4,620

36

5,630

10,564

ECL

H20

112504

C113COOH

36

4,896

7,992

112S04

1120

36

4,456

6,619

01300011

1120

36

9,353

29,157

P=0,10
P =0,05
P =0,01

NS

no significativo

*
**

249

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla XXXVI

Ensayo:

Pretratamiento

combinado irradiacin

y posterior

tratamiento

cido.

Recuperacin lignina (%).

Fuente de
variacin

Grados
lib~Ftad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

Total

71

9824,469

Dosis

2031,625

1015,813

82,896

Medio

1831,281

1831,281

149,443

Acido

1742,719

871,359

71,108

Dosis
medo

852,406

426,203

34,781

610,469

152,617

12,454

1230,719

615,359

50,217

863,531

215,883

54

661,719

12,254

Dosis
cfdo

**

Medio
cfdo
Dosis
2<
medio x cido
Error

17,617

TEST DE SCHEFFE. COMPARACION MULTIPLE.

COMPARACION

G.L.
numerador

G.L.
denominador

20 PIrad

50 PIrad

54

11,987

71,841

20 PIrad

100 PIrad

54

10,066

50,663

50 Mrad

100 PIrad

54

1,921

Aire

54

12,225

149,44~

Agua

1,84~

1101

504112

54

0,580

0,l6~

1101

011300011

54

10,606

56,242

S04H2

CH3COOH

54

10,026

50,25~~

P =0,10
E =0,05
P =0,01

NS

no significativo

*
**

250

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla XXXVII.

Ensayo:

Pretratamiento de irradiacin. Produccin de glucosa por hidrlisis

(mg 1100 ng sustrato).

enzimtica

Fuente de
variacin

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

Total

47

298,188

Dosis

73,639

36,819

79,0~*

Medio

124,455

41,485

89,042

83,322

13,877

29,807

36

16,722

0,466

Dosis X Medio
Error

TEST DE SCHEFFE. COMPARACION NIJITIPLE.

G.L.
numerador

COMPARACION
20 Mrad

50 PIrad

20 PIrad
50 PIrad

G.L.
denominador

36

11,649

67,852

100 PIrad

36

9,919

49,195

100 PIrad

36

1,730

HCl

H2S04

36

2,377

RO].

011300011

36

3,690

1101

1120

36

11,938
-I

6,068

12,273

9,561

30,469

112S04

C113COOH

36

H2S04

1120

36

C113COOH

1120

36

*
**
***

~
NS

P =0,10
I=0,05

=0,01
=0,001

no significativo

251

15,628

4,539
47,507

81,41t**

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla XXXVIII.

Ensayo:
Pretratamiento combinado irradiacin y posterior tratamiento
Produccin de glucosa por hidrlisis
enzimtica (mg/lOO mg sustrato).

Fuente de
variacin

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

cido.

Total

71

766,201

Dosis

81,615

40,808

31,307

PIedio

45,744

45,744

35,094

Acido

275,816

137,908

105,802

64,422

32,211

Do~is
medio
Dosis
cko
Medio
x
cido
Dosis
2<
medio x cido
Error

24,712

116,596

29,149

41,797

20,898

69,824

17,456

54

70,387

1,303

22,363
16, 03V
13,392

TEST DE SCREFFE. COMPARACION >WLTIPLE.

COMPARACION

C.L.

G.L.

numerador

denominador

20 PIrad

50 PIrad

54

6,620

21,909

20 PIrad

100 PIrad

54

0,445

50 PIrad

100 PIrad

54

7,065

24,954

Agua

Aire

54

5,924

35;09V**

009~s

flCl

504112

54

3,836

1101

0113C0OH

54

14,070

98,979

504112

0H3C00H

54

10,234

52,368

*
**
***

E =0,10
E =0,05
E =0,01

NS

no significativo

252

735*

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla XXXVII.

Ensayo: Pretratamiento de irradiacin. Eficacia de sacarificacin (%).

Fuente de
variacin

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

74,440

Total

47

3316,383

Dosis

618,625

309,313

Medio

1595,703

531,901

952,469

158,745

36

149,586

4,155

Dosis X PIedio

Error

128,01
38,204

TEST DE SCUEFFE. COMPARACION HULTIPLE.

COMPARACION

G.L.
numerador

50 tIrad

36

20 PIrad

100 PIrad

36

SO PIrad

100 PIrad

H2504

ECl

1120

______________

9,588

45,965

11,329

64,178

36

1,741

1,516

36

0,127

36

2,183

36

16,645

CH3COOH

ECl

denominador

20 Mrad

Ecl

G.L.

92,352-

112504

C113COOI-l

36

2,056

112504

1120

36

16,518

90,946

C113-C0011

1120

36

14, 462

69, 716

E =0,10
P =0,05
P =0,01

NS

no significativo

*
**

253

NS

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla XXXVIII.

Ensayo: Pretratamiento combinado irradiacin y posterior tratamiento cido.

Eficiencia de sacarificacin <%).
Fuente de
variacin

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

Total

71

2392,047

Dosis

350,547

175,273

25,295

Medio

49,891

49,891

7,200

Acido

195,328

97,664

14,095

319,141

159,570

23,029

531,734

132,934

19,18~**

244,422

122,211

17,63~**

326,813

81,703

374,172

6,929

m
medio x cido

Error

11,791

TEST DE SCHEPFE. CONPARACION MULTIPLE.

COMPABACION

numerador
2

50 PIrad

20 PIrad

100 PIrad

54

1,422

50 PIrad

100 PIrad

54

5,324

14,174

Agua

Aire

54

2,683

7,199

2,163

2,338 NS

S04H2

1101

011300011

1
1

504112

CH3COOH

**

NS

20 PIrad

1101

G.L.
denominador
6,747

54

54

3,118

4,862

54

5,281

13, 944

P =0,10
P =0,05
~ =0,01

=0,001

no significativo

254

22,758****

**

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla XXXVII.

Ensayo: Pretratamiento de irradiacin. Conversin de celulosa en glucosa (Z).

Fuente de
-variacin

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

Total

47

1107,332

Dosis

168,932

84,466

Medio

507,125

169,042

101,604

371,381

61,897

37,203

59,895

1,664

Dosis X Medio
Error

36

5O,76V**

TESE DE SCBEFFE. COMPABACION HULTIPLE.

COMPARACION

G.L.
numerador

20 Mrad

50 Mrad

20 Mrad

100 Nrad

50 PIrad

100 PIrad

ECl

013-00011

1101
112504

011300011

112504
011300011

1120

**
***

E =0,10
E ~ 0,05
E =0,01

NS

no significativo

denominador
36

8,093

36

9,245

36

4,133

5,639

36

0,941

0,08~3~

36

15,309

78,126

36

3,622

4,374

36

11,196

41,786

36

14,819

73,199

255

42,73V<**

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla XXXVIII.

Ensayo: Eretratamiento combinado irradiacin y posterior tratamiento cido.

Conversin de celulosa en glucosa (Z).
Fuente de
variacin

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

Total

71

1507,188

Dosis

407,895

203,947

84,541

Medio

281,602

281,602

116,731

Acido

181,742

90,871

37,668

Dosis
medio
Dosis
cido

77,824

38,912

**
16,130

272,535

68,134

28,243

Medio
cido
Dosis
2<
medio 2< cido

21,578

10,789

4
4,472

133,742

33,436

13,860

54

130,270

2,412

Error

TEST DE SCHEEFE. COMPARACION NULTIPLE.

COMPARACION
20 PIrad

50 Mrad

GL.
numerador
2

GL.
denominador
54

F
-

7,142

25,502

20 PIrad

100 PIrad

54

12,981

50 PIrad

100 PIrad

2
1

54
54

5,840
10,804

Agua

Aire

84,258
17,051

116,729

HCl

504112

54

0,258

HCl

0H3COOH

54

7,643

29,204

504112

CH3-COOH

54

7,384

27,263

**

~
~
NS

E =0,10
P =0,05
P =0,01

=0,001

no significativo
256

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla XXXIX.

Ensayo: Pretratamiento con etanol. Composicin en glucosa (%)

Fuente de
variacin
Tratamientos

Grados
libertad

24

Ensaya: Pretratamiento

con etanol.

Tratamientos
Error

Cuadrado
medio

Error

Fuente de
variacin

Suma de
cuadrados

Composicin en azcares reductores (%).

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

561,172

80,167

24

109,086

4,545

Ensayo: Pretratamiento con etanol- Composicin en lignina (%).

Fuente de
variacin
Tratamientos
Error

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

424,634

60,662

24

36,771

1,532

1 =0,10
E =0,05
E =0,01
****P =0,001
*
**
***

NS

no significativo

257

Cuadrado
medio

F
39,594

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla XL.

Ensayo:

Pretratamiento

Fuente de

variacin
Tratamientos
Error

Ensayo:

Pretratamiento

Fuente de
variacin
Tratamientos

Ensayo: Pretratamiento

Fuente de
variacin
Tratamientos

Error

*
**

con

butanol.

~
NS

no significativo

en

Grados
libertad

cuadrados

980,762

196,153

18

17,577

0,977

con butanol.

Suma de

en azcares

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

348,576

69,715

18

94,025

5,244

con butanol.

Grados
libertad

glucosa

Cuadrado
medio

Composicin

F
200,8~**

reductores

l3,34~

composicin en lignina (%).

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

382,325

76,465

18

10,326

0,574

P=o,10

E =0,05
P =0,01

Composicin

258

133498

(%).

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla

XLI.

Ensayo: Pretratamiento con etanol. Recuperacin de glucosa (%)

Fuente de
variacin
Tratamientos
Error

Ensayo:

Pretratamiento

Fuente de
variacin
Tratamientos

Error

Ensayo:

Pretratamiento

Fuente de
variacin
Tratamientos

Error

*
**

E =0,10
E <005

P =0,01

NS

no significativo

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

1093,807

156,258

24

145,006

6,042

con etanol.

Gr3dos
libertad

Recuperacin

Suma de
cuadrados

de azcares

4346,815

620,974

24

187,873

7,828

Recuperacin

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

de lignina

Cuadrado
medio

1422,705

203,244

24

449,826

18,743

259

25,86~**

reductores.

Cuadrado
medio

con etanol.

F
79,324***

(%).

F
10,844

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla XLII.

Ensayo: Pretratamiento con butanol. Recuperacin de glucosa (%).

Fuente de
variacin

Gr9dos
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

1137,326

227,465

Error

18

80,455

4,470

Ensayo: Pretratamiento

con butanol.

Tratamientos

Fuente de
variacin

Tratamientos
Error

Ensayo:

Pretratamiento

Fuente de
variacin
Tratamientos

Error

*
**

Recuperacin de azcares

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

3822,018

764,404

18

179,904

9,995

con butanol.

P =0,01

NS

no significativo

50,890

reductores

Cuadrado
medio

76,481

Recuperacin de lignina (U.

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

4809,834

961,967

18

190,745

10,597

E =0,10
P =0,05

260

Cuadrado
medio

F
90,7~**

(%).

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla XLIV.

Ensayo:

Pretratamiento

con

etanol.

Produccin

de

glucosa

(mg/lOO

mg

sustrato) por hidrlisis enzimtica.

Fuente de
variacin
Tratamientos
Error

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

1409,374

201,339

24

13,449

0,560

Ensayo: Pretratamiento
con etanol. Produccin de azcares reductores (mg/lOO
mg sustrato) por hidrlisis enzimtica.

Fuente de
variacin

Tratamientos
Error

Ensayo:

Pretratamiento

Fuente de
variacin
Tratamientos
Error

Ensayo:

Pretratamiento

Fuente de
variacin

Tratamientos
Error

*
**
***

P ~ 0,10
E =0,05
E =0,01

NS

no significativo.

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

2881,458

411,637

24

20,601

0,858

con etanol.

Grados
libertad

479,SM**

Eficacia de sacarificacin (%).

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

4614,864

659,266

164,662

24

96,090

4,004

con etanol.

Grados
libertad

Conversin de celulosa en glucosa (%).

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

4090,927

584,418

24

81,417

3,392

261

REFERENCIA EN EL TEXTO: TABLA XLV.

Ensayo:

Pretratamiento

con

butanol.

Produccin

de

glucosa

(mg/lOO

mg

sustrato) por hidrlisis enzimtica.

Fuente de
variacin
Tratamientos

Gr3dos
libertad

Suma de
cuadrados

1232,686

246,537

7,541

0,419

Ensayo:
Pretratamiento
con butanol.
Produccin
enzimtica.
<mg/lOO mg sustrato) por hidrlisis

Grados
libertad

Fuente de
variacin

Tratamientos
Error

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

de

F
588,4~**

azcares

reductores

Cuadrado
medio

F
769,349

2393,897

478,779

18

11,202

0,622

Ensayo: Pretratamiento con butanol. Eficiencia de sacarificacin (%).

Fuente de
variacin
Tratamientos

Gr3dos
libertad

Error

Ensayo:

Pretratamiento

E =0,10
P =0,05
P =0,01

NS

no significativo

2742,622

548,524

18

54,296

3,016

Grados

Tratamientos

*
**

Cuadrado
medio

con butanol.

Fuente de
variacin

Error

Suma de
cuadrados

Conversin de celulosa

libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

2778,854

555,771

18

68,880

3,827

262

F
181,843

en glucosa

(%).

F
145,21y

REFERENCIA EN El. TEXTO: Tabla LI.

Ensayo: Pretratamiento de explosin por vapor. Recuperacin de

Fuente de
variacin
Total

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

39

1057,125

Temperatura

357,484

357,494

Tiempo

187,750

46,938

TemperaturaxTiempo

269,172

67,293

30

242,719

8,091

Error

glucosa (%).

5,801

TEST DE SCHEFFE. COMPARACION HUIJTIPLE.

GOMPARACION

G.L.
numerador

C.L.
denominador

210%

230%

30

6,647

44,185

30 s

1 aUn

30

3,445

2,968

30 s

2 mm

30

3,572

3,190

30 s
30 s

4 mm
8 mm

4
4

30

2,496

30

3,160
0,646

1 mm

2 aUn

30

0,127

1 mm

4 mm

30

0,286

1 aUn

8 mm

30

2,799

2 mm

4 mm

30

0,412

2 mm

8 mm

30

2,926

4 mm

8min

30

2,514

**
**
2

*
**
***

P ~ 0,10

E =0,05
E =0,01

****P =0,001
NS no significativo

263

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla LI.

Ensayo: Eretratamiento de explosin por vapor. Recuperacin de glucosa (U.

Fuente de
variacin
Total

Gr~os
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

47

1038,563

249,031

124,516

19,774

Tiempo

233,750

77,917

12,374

TemperaturaxTiempo

329,094

54,849

8,711

36

226,688

6,297

Temperatura

Error

TEST DE SCHEFFE. COMPARACION HULTIPLE.

COPIPARACION

G.L.
numerador

G.L.
denominador

1900C

21000

36

2,935

4,307

190%

2300C

36

3,350

5,610

21000

2300C

36

6,285

19,748

30 s

1 mm

36

4,477

6,682

30 s

2 aUn

36

4,109

5,627

30 s

4 mm

36

5,739

10,978

1 mm

2 ndn

36

0,368

1 aUn

4 aUn

36

1,262

2 mm

4 mm

36

1,630

**

0,886NS

P<0l0
P ~ 0,05
E =0,01
****P =0,001
NS no significativo
*
**
***

264

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla LI.

Ensayo:
Pretratamiento
reductores (%).

Fuente de
variacin
Total

de

explosin

Grados
libertad

por

vapor.

Suma de
cuadrados

Recuperacin

azcares

Cuadrado
medio

39

1359,484

410,695

410,695

72,111

Tiempo

649,953

162,488

28,530

TemperaturaxTiempo

127,977

31,994

5,618

30

170,859

5,695

Temperatura

Error

TEST DE SCHEFFE. COMPARACION MTJLTIPLE.

COMPARACION

G.L.
numerador

210%
30 s

2300C

1 mm

30s

2min

30s

4min

30s

Smin

1 mm

2 mm

imin

4min

imin

Emin

2 mm

4 mm

2 an
4 mm

denominador
30

8,863

19,640

9,867

30

0,020

30

0,424

8 mm

30

2,561

8 mm

30

2,137

E =0,10

E <005
P =0,01
****P =0,001
NS no significativo
**

265-

O,045~

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla LI.

Ensayo:
Pretratamiento
reductores (%).

de

explosin

por

vapor.

Recuperacin

azcares

TEST DE SOIXEFFE. COMPABACION 4IJLTIPLE.

COMPARACION

G.L.

G.L.

numerador

denominador

190W

210%

36

8,056

32,499

19000

23000
2300C

2
2

36
36

16,564
8,508

137,176
36,190

1 mm

36

5,234

9,132

30 s

2 mm

36

8,208

22,455

30 s

4 mm

36

7,891

20,758

1 mm

2 an

36

2,974

2,974

1 mm
2 mm

4 mm
4 aUn

3
3

36
36

2,657
0,316

2,354

21000
30 s

**
2

o,s
3Ns

*
**

~
~
NS

P<010

E <005
E = 0,01
= 0,001
no significativo

266

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla LI.

Ensayo:

Pretratamiento de explosin por vapor. Recuperacin de lignina

Fuente de
variacin
Total

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

(U.

39

6027,875

Temperatura

1022,844

1022,844

49,438

Tiempo

2932,375

733,094

35,433

TemperaturaxTiempo

1451,969

362,992

17,54~***

Error

30

602,688

20,690

TEST DE SCHEFFE. CO14PARACION HULTIPLE.

COMPARACION

G.L.
numerador

G.L.
denominador

2100C
30 s

2300C

30

7,031

49,442

1 aUn

30

7,649

14,627-,

30 s

2 aUn

30

9,211

21,209

30 s

4 mm

30

8,033

16,133

30 s

8 mm

30

1,492

1 mm

2 aUn

30

1,561

1 mm

4 mm

30

0,384

1 mm

8 mm

30

6,,157

9,477

2 mm

4 mm

30

1,177

0,347

2 mm

8 mm

30

7,718

14,893

4 mm

8 an

30

6,541

10,696

E=0,10
E = 0,05
~
P = 0,01
****E = 0,001
NS no significativo
*
**

267

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla LI.

Ensayo: pretratamiento de explosin por vapor. Recuperacin de lignina

Fuente de
variacin

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

Temperatura

3743,156

1871,578

Tiempo

5108,188

1702,729

90,728

TemperaturaxTiempo

2257,688

376,281

20,050

675,625

18,767

Error

36

TEST DE SCHEFFE. COMPARACION NIJLTIPLE.

COPIPARACION

*
**

1900C

2100C

numerador
2

190W

2300C

210%

2300C

30 s

C.L.
denominador
36

4,119

8,485

36

13,759

94,649

36

9,639

46,457

1 ruin

36

15,468

79,754

30 s

2 mm

36

12,607

52,975

30 s

4 mm

36

10,278

35,212

1 mm

2 mm

36

2,862

2,729

1 aUn

4 mm

36

5,190

8,979

2 mm

4 mm

36

2,329

P
E

P
~
NS

G.L.

= 0,10
= 0,05
= 0,01
= 0,001

no significativo

2 68

**

(%).

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla LII.

Ensayo: Pretratamiento de explosin de vapor. Produccin

hidrlisis enzimatica (mg glucosa/lOO mg sustrato).

de glucosa

Fuente de

Grados

Suma de

Cuadrado

variacin

libertad

cuadrados

medio

Total
Temperatura

TemperaturaxTiempo

39

732,828

148,723

148,723

152,069

373,246

93,312

95,411

181,520

45,380

46,401

30

29,340

0,978

TESE DE SCHEPFE. COMPARACION MIJLTIPLE.

COMPARACION

G-L.
numerador

21000

2300C

30s

imn

30s

Zmin

denominador

7 2,966
69,763
6,448

5,521
8,703

*
**

***

~
NS

2min

Smin

4 mm

8 mm

30

1 ~ 0,10
E = 0,05
E ~ 0,01
= 0,001
no significativo

269

0,379

O,O3(~

por

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla LII.

Ensayo: Pretratamiento de explosin por vapor. Produccin de glucosa (mg/lOO

mg sustrato) por hidrlisis enzimtica.

Fuente de
variacin
Total
Temperatura

TemperaturaxTiempo

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

47

1703,711

1094,699

547,356

473,739

297,219

99,073

85,749

270,199

45,033

38,97~*

Error

1,155

TESE DE SCREPFE. CONPARACION MULTIPLE.

COPIPARACION

G.L.
numerador

denominador

19000
19000

2100C
230~C

123,598

473,668

2100C

23000

113,056

30 s

1 aUn

36

3,671

4,492

30 s

2 aUn

36

8,559

24,418

30 s

4 ruin

36

15,137

76,378

1 ruin

2 ruin

36

4,888

7,965

1 ruin

4 mm

2min

4min

36
36

11,466
6,578

*
**
***

p<010

P ~ 0,05
E = 0,01
****P = 0,001
NS no significativo

270

43,826
14,424**

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla LII.

Pretratamiento de explosin por vapor. Eficiencia de sacarificacin

Ensayo:

Fuente de
variacin
Total

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

39

5436,407

1781,719

1781,719

Tiempo

1950,781

487,695

54,352

TemperaturaxTiempo

1434,719

358,680

39,974

30

269,188

8,973

Temperatura

Error

198,56***

TEST DE SCHEFFE- COIIPARACION NULTIPLE.

COPIPARACION

G.t.

C.L.

numerador

denominador

210%

230%

30

14,091

198,563

30 s

1 mm

30

11,671

34,053

30 s

2 ruin

30

10,099

25,046

30 a

4 jin

30

13,383

44,779

30 a

8 mm

30

7,932

15,729

1 ruin

2 ruin

30

1,662

1 mm

4 ruin

30

1,713

1 mm

8 ruin

30

3,739

3,495

2 ruin
2 ruin

4 ruin
8 mm

4
4

30
30

3,374
2,077

2,846

4 ruin

8 mm

30

5,452

7,430

**
2

**

P = 0,10
E = 0,05

P = 0,01

NS

no significativo

271

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla LII.

Ensaya:

Pretratamiento de explosin por vapor. Eficiencia de sacarificacin

(%).

Fuente de
variacin
Total

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

47

11273,160

Temperatura

7158,000

3579,000

352,033

Tiempo

2261,531

753,844

74,149

TemperaturaxTiempo

1487,625

247,938

24,384***

36

366,000

10,167

Error

TEST DE SCHEFFE. COMPARACION MULTIPLE.

COMPARACION

G.L.

G.L.

numerador

denominador

19000

21000

36

10,819

58,524

190%

230%

21000

2
2

36
36

26,392
15,573

348,265

2300C

121,259

20, 688
27,04 1
72, 999
15,964
11,181

E = 0,10

~
***

1 =0,05
E ~ 0,01

NS

no significativo

272

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla LII.

Ensayo: Pretratamiento de explosin por vapor. Conversin de celulosa <U-

Fuente de
variacin
Total
Temperatura

Gr3dos

Suma de
cuadrados

libertad

Cuadrado
medio

47

4452,938

3173,250

1586,625

403,620

659,734

219,911

55,943

79,740
3,931

20,28~***
-

TEST DE SCIIEFFE. COMPARACION HULTIPLE.

COMPARACION

~
~
NS

denominador
16,022

128,356

36

4,967

8,222

2 ruin

36

6,115

12,466

4 ruin

36

12,844

54,985

1 mm

2 mm

36

1,149

1 mm

4 mm

36

7,877

20,682

2 mm

4 mm

36

6,728

15,089

190%

210

2100C

230%

30 s

1 ruin

30 s
30 s

1900C

*
**

numerador
2

36

0C

2300C

E =0,10
E = 0,05
E = 0,01
= 0,001
no significativo

273

O,440~

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla LII.

Ensayo: Pretratamiento de explosin por vapor.

glucosa (%).

Fuente de
variacin
Total

Grados
libertad

(Conversin de celulosa en

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

39

Temperatura

253,938

253,938

80,099

Tiempo

559,969

139,992

44,154***

TemperaturaxTiempo

732,203

183,051

57,739

30

95,109

3,170

Error

TEST DE SCHEFFE. COMPARACION HIILTIPLE.

COMPARACION

G.L.
numerador

G.L.
denominador

21000

230%

30

8,949

80,091

30 a

1 ruin

30

9,399

22,085

30s

Zmin

30

7,194

12,940

30 a

4 ruin

30

12,489

38,995

30 a

8 ruin

30

9,416

22,164

1 mm

2 ruin

30

2,204

1 ruin

4 ruin

30

3,090

2,388

1 mm

a ruin

30

0,017

0,OOO~

2 ruin

4 ruin

30

5,295

7,009

2 ruin

8 ruin

30

2,221

1,233

4min

Sruin

30

3,074

2, 36~~

E =0,10
1 =0,05
~
P =0,01
****P =0,001
NS no significativo
*
**

274

w~* c

NS

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla LIV.

Ensayo: Pretratamiento de explosin por vapor

de glucosa (Z)-

Fuente de
variacin

Gr3dos
libertad

Suma de
cuadrados

en medio cido. Recuperacin

Cuadrado
medio

Tratamientos

10

1264,207

126,421

Error

33

469,855

14,238

Ensayo: Pretratamiento de explosin por vapor

de azcares reductores (%).

Fuente de
variacin

Gr3gos
libertad

Suma de
cuadrados

en medio cido. Recuperacin

Cuadrado
medio

F
17,998

Tratamientos

10

1293,557

129,356

Error

33

237,178

7,187

Ensayo: Pretratamiento de explosin por vapor

de lignina (%).

en medio cido. Recuperacin

Fuente de

Grados

Suma de

Cuadrado

variacin

libertad

cuadrados

medio

Tratamientos

10

1046,619

104,662

Error

33

7 59,313

23, 021

E =0,10
E =0,05
E ~ 0,01
****P =0,001
NS no significativo
*

**

275

8,879

F
4,546

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla LV.

Ensayo: Pretratamiento de explosin de vapor en medio cido. Produccin de

glucosa (mg/lOO mg sustrato) por hidrlisis enzimtica-

Fuente de
variacin

Grgdos
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

Tratamientos

10

266,520

26,651

Error

33

26,320

0,789

F
33,41***

Ensayo: Pretratamiento de explosin por vapor en medio cido. Produccin de

azcares reductores (mg/lOO mg sustrato) por hidrlisis enzimtica.

Fuente de
variacin

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

Tratamientos

10

1611,244

161,124

Error

33

188,771

5,720

Ensayo: Pretratamiento de explosin por

sacarificacin (%).

Fuente de
variacin

Grados
libertad

Cuadrado
medio

F
23,861

1171,248

117,125

Error

33

161,986

4,909

Ensayo: Pretratamiento de explosin de vapor en

celulosa en glucosa (%).

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Tratamientos

10

299,903

Error

33

19, 466

Conversin de

medio cido.

Cuadrado

medio

29,990

50,841

0,590
-J

E =0,10
1 ~ 0,05
~
~ =0,01
****P =0,001
NS no significativo

Eficacia de

Suma de
cuadrados

10

variacin

28,16~***

vapor en medio cido.

Tratamientos

Fuente de

*
**

276

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tablas LVI, LVII, LVIII y LIX.

Ensayo: Variacin de la recuperacin de material inicial (%) a lo largo de

la
fermentacin
con
P.chrysosporinm
sobre
O.nervosum sometido
a
pretratamiento alcalino.

Ensaya: Variacin de la recuperacin de material inicial (Z) a lo largo de

la fermentacin con P~chrysasparium sobre O.nervosum sometido a tratamiento
oxidante.
Fuente de
variacin

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

Tratamientos

2,730

0,910

Error

0,371

0,093

**
9,811

Ensayo: Variacin de la recuperacin de material inicial (%) a lo largo de

la
fermentacin
con
Ltchrysosporium
sobre
Onervosum sometido
a
pretratamiento cido.

Fuente de
variacin
Tratamientos

Error

Grados
e
libertad
3
4

Suma de
cuadrados
301,080

Cuadrado
medio
100,369

16, 123

4,03 1

24,899

Ensayo: Variacin de la recuperacin de material inicial (%) a lo largo de

la fermentacin con ltchrysosporium sobre O.nervosum nativo.

Fuente de
variacin

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

F
**

Tratamientos

704,318

234,773

Error

93,789

23,447

E =0,10
F =0,05
E =0,01
=0,001

NS

no significativo

*
**

277

10,013

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tablas LVI, LVII, LVIII y LIX.

Ensayo: Variacin del porcentaje glucosa en la composicin a lo largo de la

fermentacin con P.chrysosporium sobre O~nervosum sometido a pretratamiento
alcalino.

Fuente de
variacin

Grados
libertad

Tratamientos
Error

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

503,910

125,977

15

15,858

1,057

F
119,164

Ensayo: Variacin del porcentaje glucosa en la composicin a lo largo de la

fermentacin con P.chrysosporium sobre 0.nervosum sometido a pretratamiento
oxidante.

Grados
libertad
4

Fuente de
variacin
Tratamientos
Error

15

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

5,371

1,343

19,086

1,272

F
1,055 NS

Ensayo: Variacin del porcentaje glucosa en la composicin a lo largo de la

fermentacin con Pchrysosporium sobre O.nervosum sometido a pretratamiento
cido.

Fuente de
variacin
Tratamientos
Error

Grados
libertad

cuadrados

Suma de

217,936

15

34, 900

Cuadrado
medio

54,484

F
23,417

2,327

Ensayo: Variacin del porcentaje glucosa en la composicin a lo largo de la

fermentacin con Pchrysosporium sobre 0. nervosum nativo.

Fuente de

Grados

Suma de

Cuadrado

variacin

libertad

cuadrados

medio

Tratamientos
Error

P=0,10
E = 0,05
E = 0,01
****P = 0,001
*
**
***

NS

756,735

189,184

15

9,521

0,635

no significativo
278

298,052

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tablas LVI, LVII, LVIII y LIX.

Variacin del porcentaje de azcares reductores en la composicin a

lo largo de la fermentacin con P.chrysosporium sobre O.nervosum sometido a
pretratamiento alcalino.

Ensayo:

Fuente de
variacin

Grados
libertad

Tratamientos
Error

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

1668,906

417,226

15

59,055

3,937

E
105,97~***

Ensayo: Variacin del porcentaje de azcares reductores en la composicin a

lo largo de la fermentacin con P.chrysosporium sobre O.nervosum sometido a
pretratamiento oxidante.

Fuente de
variacin

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

1401,605

350,401

15

189,481

12,632

Tratamientos
Error

E
27,739

Ensayo: Variacin del porcentaje de azcares reductores en la composicin a

lo largo de la fermentacin con P.chrysosporium sobre O.nervasum sometido a
pretratamiento cido.

Fuente de
variacin

Gr8dos
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

197,121

49,280

226,699

15,113

E
3

Tratamientos

Error

Ensayo:

15

Variacin del porcentaje de azcares reductores en la composicin a

lo largo de la fermentacin

Fuente de
variacin
Tratamientos
Error

*
**
-

con Pchrysosporium

Gr3dos
libertad

Cuadrado
medio

2245,140

561,285

214,43V**

15

39,263

2,618

P =0,10
E =0,05

E < 0 01
0,001
no

sobre O. nervosnm nativo.

Suma de
cuadrados

****p ~
NS

3,261

significativo
;179

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tablas LVI, LVII, LVIII y LIX.

Ensayo: Variacin del porcentaje de lignina en la composicin a lo largo de

la
fermentacin
con
Pchrysosporium
sobre
Onervosum sometido
a
pretratamiento alcalino.

Fuente de
variacin
Tratamientos
Error

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

27,880

6,970

15

20,541

1,369

F
5,090

Ensayo: Variacin del porcentaje de lignina en la composicin a lo largo de

la
fermentacin
con
Kchrysosporiuni
sobre
O.nervosum sometido
a
pretratamiento oxidante.

Ensayo: Variacin del porcentaje de lignina en la composicin a lo largo de

la
fermentacin
con
P.chrysosporium
sobre
Onervosum sometido
a
pretratamiento cido.

Fuente de
variacin
Tratamientos
Error

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

79,191

19,798

15

14,176

0,945

F
20,949

Ensayo: Variacin del porcentajede lignina en la composicin a lo largo de

la fermentacin con P..chrysosporium sobre O.nervosum nativo.

Fuente de
variacin

Tratamientos
Error

E =0,10

**

P =0,01

NS

no significativo

Grggos
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

634,866

158,717

15

24,040

1,603

=0,05

280

99,033

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla LX.

Ensayo: Variacin de la produccin de glucosa por hidrlisis enzimtica (mg

glucosa/lOO mg sustrato) a lo largo de la fermentacin con P.chrysosporium
sobre 0.nervosum sometido a pretratamiento alcalino.

Fuente de
variacin
Tratamientos
Error

Gr3dos
libertad

Suma de
cuadrados

1040,632

260,158

15

8,554

0,570

Cuadrado
medio
456,224

Ensayo: Variacin de la produccin de glucosa por hidrlisis enzimtica (mg!

100 mg sustrato) a lo largo de la fermentacin con P.chnjsosporium sobre
O.nervosum sometido a pretratamiento oxidante.
Fuente de
variacin
Tratamientos
Error
Ensayo:

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

50,570

12,,642

15

4,764

0,318

Variacin de la produccin de glucosa

glucosa!

Cuadrado
medio

por hidrlisis

F
39,80~

enzimtica

(mg

100 mg sustrato) a lo largo de la fermentacin con P-chrysosporium

sobre O.nervosum sometido a pretratamiento

cido.

Ensayo: Variacin de la produccin de glucosa por hidrlisis enzimtica (mg

glucosa! 100 mg sustrato) a lo largo de la fermentacin con Pchrysosporium
sobre O. nervoswn nativo.
Fuente de
variacin
Tratamientos
Error

**

~
~
NS

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

64,926

16,2322

15

0,568

0,038

:=0,10
E <005
P = 0,01
P

=0,001
no significativo
281

Cuadrado
medio
428,312

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla LXI.

Ensayo: Variacin de la produccin de azcares reductores por hidrlisis

enzimtica (mg glucosalloo mg sustrato)
a lo largo de la fermentacin con
P.chrysosporium sobre O.nervosum sometido a pretratamiento alcalino.

Ensayo: Variacin de la produccin de azcares reductores por hidrlisis

enzimtica
(mg/lOO mg sustrato) a lo largo de la fermentacin con
F. chrysosporium sobre Onervosum sometido a pretratamiento oxidante.

Fuente de
variacin

Tratamientos
Error

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

98,723

24,681

15

19,340

1,289

F
19,142

Ensayo: Variacin de la produccin de azcares reductores por hidrlisis

enzimtica (mg glucosa! 100 mg sustrato) a lo largo de la fermentacin con
Pchrysosporium

sobre 0.nervosum sometido a pretratamiento

Fuente de
variacin
Tratamientos
Error

Grados

Suma

de

Cuadrado

libertad

cuadrados

medio

168,198

42,050

15

3,150

0,210

cido.

200,264

Ensayo: Variacin de la produccin

de azcares reductores por hidrlisis
enzimtica (mg glucosa! 100 mg sustrato) a lo largo de la fermentacin con
P.chrysosporium sobre O. nervosum nativo.
Puente de
variacin
Tratamientos
Error

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

156,750

39,188

15

1,148

0,077

E =0,10
P =0,05
~
P =0,01
****P =0,001
NS
no significativo
*
**

282

E
512,214***

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla LXII.

Ensayo: Eficacia de sacarificacin (Z ES) a lo largo de la fermentacin con

Pchrysosporium sobre O.nervosum sometido a pretratamiento alcalino.

Fuente de
variacin
Tratamientos
Error

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

4759,520

1189,880

15

40,262

2,684

F
443,302

Ensayo: Eficacia de sacarificacin (% Es> a lo largo de la fermentacin con

Pchrysosporium sobre Onervosum sometido a pretratamiento cido.

Fuente de
variacin
Tratamientos
Error

Gr3dos
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

473,107

118,277

15

5,539

0,369

320,289

Ensayo: Eficacia de sacarificacin (% ES) a lo largo de la fermentacin con

P.chrysosporium sobre Onervosum sometido a pretratamiento oxidante.

Fuente de
variacin

Tratamientos
Error

Grados
libertad

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

184,836

46,209

15

33,219

2,215

20,866

Ensayo: Eficacia de sacarificacin (Z ES> a lo largo de la fermentacin con

P.chrysosporium sobre O. nervosum nativo.

Fuente de
variacin

Tratamientos
Error

Cr8dos
libertad

Suma de
cuadrados

160,713

40,178

15

9,080

0,605

=0,10

**

E =0,05

***

Cuadrado
medio

=0,01

****P ~ 0,001
NS
no significativo
283

66,375

REFERENCIA EN EL TEXTO: Tabla LXIII.

Ensayo:

Conversin

fermentacin
alcalino.

de

celulosa

en

glucosa

(%

CC)

lo

largo

de la

con P.chrysosporium sobre 0.nervosum sometido a pretratamiento

Fuente de
variacin

Grados
libertad

Tratamientos
Error

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

7290,828

1822,707

15

27,481

1,832

994,402

Ensayo: Conversin de celulosa en glucosa (% CC) a lo largo de la

fermentacin con P.chrysosporium sobre O.nervasum sometido a pretratamiento
cido.

Grados
libertad

Fuente de
variacin
Tratamientos
Error

Ensayo:

Conversin

fermentacin

de

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

4373,412

1093,353

15

37,510

2,501

celulosa

con P.chrysosporium

en

glucosa

(%

CC)

F
43?,22t

lo

largo

de la

sobre O.nervosum sometido a pretratamiento

oxidante.
Fuente de

Grados

Suma de

Cuadrado

variacin

libertad

cuadrados

medio

Tratamientos
Error

Ensayo:

Conversin

fermentacin

497,416

124,354

15

2,295

0,153

celulosa

con P.chrysosporium

Fuente de
variacin
Tratamientos
Error

*
**

de

Grados
libertad

en

glucosa

Suma de
cuadrados

Cuadrado
medio

866,568

216,642

15

4,283

0,286

E =0,01
****p < 0 001
significativo

CC)

E =0,10
E ~ 0,05

no

(%

8l2,61~

lo

largo

de la

sobre 0.nervosum nativo.

***

NS

284

F
758,73***

ANEXO IV

INDICE DE

FIGURAS

pgna

Comparacin de la composicin de maderas duras y maderas blandas

Representacin de la estructura primaria de la celulosa

Estructura de la celulosa

II

a-Estructura del O-acetil-4-O-metilglucuronoxilano.Hemicelulosas de

tejidos dc angiospermas
b-Estructura del O-acetil-4-O-galactoglucomananoHemicelulosas de

12

tejidos

de gimnospermas

Estructura de la lignina

13

Esquema de la arquitectura de la pared celular caracterstica de las

fibras vegetales

15

Distribucin aproximada de los constituyentes qumicos en las distintas

capas de la pared celular

16

Organizacin de la celulosa de la fibra

17

Procesos

de transformacin de materiales lignocelulsicos

21

10

Esquema de las etapas secuenciales en la hidrlisis enzimtica de la

celulosa

28

Ii

Genealoga de los niutantes biperproductores de celulasas

34

12

Procesos de produccin de etanol a partir de biomasa lignocelulsica

47

13

Onopord orn neruosu-m FSoiss

60

14

Procedimiento -e-alizado l)ara e estudio de la composicin de la biomasa

1 ignoce1 uls

62

15

Esquema del diagrama de operacin de la planta piloto de tratamiento

68

de material lignocelulsico
16

Cintica de produccin de celulasas por T. longbrachiatum QM9414

sobre 1% dc Solka [loe 11W200. Volumen total 9 litrosEvolucin de
() 1)1 [(0>actividad sobre papel de ltro,k) actividad ~3-glucosidasa, (*)
actividad endoglucanasa, (*1 protenas extracelulares a lo largo de? das

74

17

Cintica de produccin (le celulasas por 71 longibrachiahim QM9414

sobre 2% de SoIRa bloc II W200 Volumen total 9 litrosEvolucin (le
(e) ph (O) actividad sobre papel de filtro,(4) actividad 3-glucosidasa,
(-~) actividad endog lucanasa, (.) protenas extracelulares a lo largo de 11
das

75

18

Cintica de produccin de celulasas por T. longibrachiaturn QM9414

sobre 2% de O. neruosum sometido a pretratamiento cido Volumen
total 2,5 litrosEvolucin de 1.) pillO) actividad sobre papel de filtro,
(<1 actividad [3-gucosidasa, (*) protenas extracelulares a lo largo de 12
das

77

285

pqna
19

Efecto del ph en la hidrlisis enzuntica del Solha Floc 1W200 a

distintas temperaturas, expresado como azcares reductores liberados:
() 300C, (2<) 35<C, (O~ 400C, UD) 45oC,(A) 50C y U)55oC

80

Tiempo de hidrlisis : 4horas

Relacin slido-liquido (p/v): 5%
20

Efecto del pH en la hidrlisis enzimtca del Solka Floc I[W200 a

distintas temperaturas, expresado como glucosa liberada: (@)SOoC,
(x)350C, (O) 4OoC, (U 450C,(A) 500C y (U) 55oC

81

Tiempo dc hidrlisis : 4horas

Relacin slido-lquido (plv): 5%

21

Efecto del pH en la hidrlisis enzimtica del Solka bloc HW200 a

82

distintas temperaturas, expresado como relacin entre glucosa y

azcares reductores liberados: (.) 3OoC, (x) 350C, (O~ 400C, (U) 450C,(A)

500C y (U) 55t

Tiempo de hidrlisis: 4horas
Relacin slido-lquido (p/v): 5%
22

Efecto del pH en la hidrlisis enzimtica del Solka Floc HW200 a

84

distintas temperaturas en la recuperacin de enzimas, expresado corno

porcentaje del valor inicial de protenas en el medio de hidrlisis: (e)
30C, (x) 35oC, ~O)4OoC, (U) 4SoC,(A) SOoC y (U) 55~C
Tiempo de hidrlisis : 4horas

Relacin slido-lquido (p/v): 5%

23

Efecto de la proporcin de enzima (expresada como gramos de protenas

por 10<) g de sustrato) en la produccin de azcares reductores durante la
hidrlisis enzimtica de Soll=aFloc 2HW200
Relacin slido-liquido (p/v) :5% (A) y 10% (lB

86

24

Efecto de la proporcin de enzima (expresada como gramos de protenas

por 100 g de sustrato) en la produccin de azcares reductores durante la
hidrlisis enzimtica de O. neruosum nativo
Relacin slido-liquido (pH) : 5% (A) y [0% (8)

8?

25

Efecto de la proporcin de enzima (expresada corno gramos de protenas

por lOO g de sustrato) en la produccin de azcares reductores durante la
hidrlisis enzimtica (le O. nervosurn
pretratado con [1202en medio
has ico
Relacin slidoliquido (plv) 5% (A) Y 10% (8)

88

26

Efecto de la proporcin de enzima (expresada como gramos de protenas

por 10<) g de sustrato) en la produccin de azcares reductores durante la
hidrlisis enzimtica de O. neruosum pretratado con NaOH
Relacin slido-liquido (p/v) :5% (A) y lOO/o (11)

89

2?

Eficacia del complejo celuloltico (mg azcares reductores/U[Pl~) ( ~ Y

rendimiento de la hidrlisis (mg azcares reductores/lOO mg celulosa)
en funcin de la relacin E/S (UIPF/g celulosa inicial)
Iiempo de hidrlisis :48 horas
Sustrato: (A) Solka Eloc 1W 200 y (8) Onervosurn nativo

90

286

pg n a
28

Eficacia del complejo celuloltico (mg azcares reductores/UIPE) ~ ) Y

rendimiento de la hidrlisis (mg azcares reductores/lOO mg celulosa)
en funcin de la relacin E/S(UIPF/g celulosa inicial)
Tiempo de hidrlisis : 48 horas
Sustrato: (A) O. nervosum pretratado con 11202 y (11) Onervosum
pretratado con NaOli

91

29

Variacin de las actividades en-zmticas: (O) f-Glucosidasa y (e) sobre

94

papel de filtro, en funcin del tiempo de incubacin a SOoC, del complejo

enzi:ntico producido por Trchoderrna longibrachiatum QM9414
30
31

Efecto de la adicin de : (A) glucosa, (B) celobiosa y (C) etanol, en la

produccin de azcares por hidrlisis enzimtica del O.nervosum

96

l)iferentes estrategias para estudiar el comportamiento hidroltico del

97

complejo enzirntico
32

Produccin de glucosa por hidrhsis enzimtica. Sustratos: (A) Solka

98

Floc HW200, (13)0. neruosum pretratado y (C) 0neruosum sin tratar

33

Produccin de azcares reductores por hidrlisis enzimtica. Sustratos:

(A) Solka [loc
l1W200, (13)0. nervosum pretratado r (C) Oneruosurn. sin

99

tratar

34

E fecto de la concentracin de gticosa sobre la actv idad fI-Ql ucosidasa

utilizando pN PG como sustrato Representacion de 1 4inewacver- Bu rL

101

(e)
35

sii

glucosa, (0)0,5 mM, (4> 0,75 mM y (A) 1 mM

Efecto de la concentracin (le glucosa sobre la actividad f3-Glucosidasa

utiliza irlo celo 5i osa t mo sus>, rato Re pre senLic i n de 1 i newae xcr 1 u rIt
) sin glucosa, (0) 1 mM, (A) 2,5 mM y (A) 5 tuN)

102

Influencia de la dosis de irradiacin gamma en la solubilizacin dei

143

36

sustrato Onervosum en diferentes medios

37

Influencia de la dosis dc irradiacin gamma en la solubilizacin del

sustrato Oncruosum con diferentes cidos.

144

38

Planta piloto de tratamiento de materiales lignocelulosicos

174

39

In A nc nc ia del tiempo dc fer mentacion con 1. chrysosporurn. en la

p d ida dc peso seco dc 0. nertajsutn. nativo o so metido a d ifetentes
p retrata mi ciito s

190

40

1 o A ucocia del tiempo de Yermen taciyi con P. chrysosporiurn en el

contenido de nitrgeno total de O. arreos um nativo o sometido a
diferentes pretratam cotos.

191

41

Influencia (le tiempo de fermentacin con 1. chryso.spori um en la

recuperacin dc celulosa referida a la composicin inicial de sustrato
O. ??E?(&<)SUt? OUL i VG (1 sometitlr> it ti i fereotes p-etata nico tos

197

42

Influencia del tiempo de fermentacin con 1< chrysosporiurn en la

recuperacin dc azcares reductores referida a la composicin inicial de
sustrato Oneruosurn nativo o sometido a diferentes pretratamientos.

198

43

nA ucocia del tiempo (le fermentacin con P. chrysospori taj en la

recuperacion tic lignina referida a lii composicion inicial dc sustrato
O. ru-ruosurn. nativo o sometido a dlercotes pretratamien tos.

199

287

pgina
44

Efecto del tipo de pretratamiento de la biomasa de O. nervosum en el

porcentaje de recuperacin de material inicial (expresado como peso
seco) yen la recuperacin de glucosa, azcares reductores y lignina.

208

45

Efecto del tipo de pretratamiento de la biomasa de O. neruosum en la

produccin de glucosa y azcares reductores (mg/LOO mg sustrato
pretratado) por hidrlisis en-umtica.

209

46

Influencia del tipo de pretratamiento de la biomasa de O. nervosum en la

eficacia de sacarificacin (ES) y conversin de celulosa en glucosa (CC)
por hidrlisis enzimtica

210

47

Cintica de hidrlisis del O. nervosum pretratado con diferentes

concentraciones de enzima

213

48

Efecto de la dosis de enzima en el rendimiento de la hidrlisis del

Onervosum pretratado despus de 24 y 48 horas

214

288

pgina

INDICE DE TABLAS
Rendimientos y produccin en residuos agricolas de algunos cultivos

II

Composicin media de algunos residuos agrcolas lignocelulsicos

III

Datos de produccin de residuos forestales en Espaa

IV

Celobiohidrolasas de hongos

24

[3-Glucosidasas de hongos

25

VI

Endoglucanasas de hongos

26

VII

Microorganismos productores de celulasas

32

VIII

Mecanismos bioqumicos del control de la sntesis de celulasas de

Treese

33

IX

Actividades enzmticas obtenidas en cultivos de diferentes cepas de

microorganismos celulolticos

Mtodos utilizados para el pretratamiento de materiales lignocelulsicos

39

XI

Caractersticas de la produccin de enzimas

75

XII

Influencia del tipo de sustrato en la produccin de celulasas por

T/ongbrachiatum QM9414

76

XIII

Parmetros cinticos de la f-Glucosidasa de Tlongibruchatum

XIV

Composicin qumica de la biomasa del cardo O. nervosum

XV

Influencia del grado de molienda en la produccin de glucosa

reductores por hidrlisis en-zimtica

XVI

Efecto del pretratamento alcalino con hidrxido sdico a 250 C sobre:

porcentaje de recuperacin de material inicial (expresado como peso
seco) (r) ye! rendimiento en la hidrlisis en-zimtica

112

XVII

Efecto del pretratamiento alcalino con hidrxido sdico a 100 C sobrel

113

XVIII

porcentaje de recuperacin de material inicial (expresado como peso

seco) (r) y el rend i miento en la hidrlisis cot mtca
Efecto del pretratamiento alcalino con hidrxido sdico a 120 C sobre:
porcentaje de recuperacin ole material inicial (expresado como peso
seco) (r) y el rendimiento en la hidrlisis enzimtica

114

QM9414

35

103
108

v~t

-tOcares

109

XIX

Efecto del pretratamiento alcalino con hidrxido sdico a 150 C sobre:

porcentaje de recuperacin de material inicial (expresado como peso
seco) (r) yel rendimiento en la hidrlisis enzimtica

115

XX

Porcentaje de recuperacin del material inicial (expresado como peso

seco) (r) y ruin posiciun de los resid oes slidos obtenidos para las distintas
condiciones de pretratamiento alcalino con hidrxido sdico ensayadas

117

XXI

Electo del pretratamiento alcalino con hidrxido sdco en La

recuperacin de glucosa azcares reductores y lignina. Efecto en el
rendimiento de la hidrlisis en-ii mtica expresado como porcentaje (le
eficiencia de sacarificacin

118

289

pgina
XXII

Rendimiento de diversos pretratamientos alcalinos con hidrxido sdico

de diferentes sustratos lignocelulsicos

122

XXIII

Efecto del pretratamiento alcalino con hidrxido clcico en la

recuperacin de material inicial (expresado como peso seco) (r), glucosa,
azcares reductores y Iignina.y efecto sobre rendimiento de la hidrlisis
enzimtica.

124

XXIV

Efecto del pretratamiento oxidante en medio alcalino en la eficacia de

sacarificacin de distintos materiales lignocelulsicos

127

XXV

Porcentaje de recuperacin de material inicial (expresado como peso

seco) (r) y composicin de los residuos slidos obtenidos para las distintas
condiciones dc pretratamiento oxidante con hipoclorito sdico

129

XXVI

Efecto del pretratamiento oxidante con hipoclorito sdico en la

recuperacin de glucosa, azcares reductores y lignina.

130

XXVII

Efecto del pretratamiento oxidante con hipoclorito sdico en el

rendimiento de la hidrlisis enzimtica.

131

XXV[ll

Efecto del pretratamiento con cido clorhdrico a 250 C sobre: porcentaje

de recuperacin de material inicial (expresado como peso seco) (r) y el
rendimiento en la hidrlisis enzimtica

135

XXIX

Efecto del pretratainiento con cido clorhdrico a 70 C sobre: porcentaje

de recuperacin de material inicial (e xpresado como peso seco) (r) y el
rendimiento en la hidrlisis cnt i mtica

1 3G

XXX

Efecto del pretratamiento con cido clorhdrico a 100< sobre:

porcentaje de recuperacin de material inicial (expresado co mo peso
seco) (r) y el ren(limie nto en la hidrlisis enzimtica

137

XXXI

Efecto del pretratamiento con cido sulfrico a 100C sobre: porcentaje

de recuperacin de material inicial (expresado como peso seco) (r) y el
rendimiento en la hidrlisis enzimtica

138

XXXII

Efecto del pretratamiento cido cetico sobre: porcentaje de recuperacin

de material inicial (expresado como peso seco) (r) y el rendimiento en la
hidrlisis en-zimtica

139

XXXIII

Porcentaje de recuperacin de material inicial (expresado corno peso

seco) (r) y composicin de los residuos slidos obtenidos para las distintas
condiciones de pretratamiento con irradiacin ensayadas

146

XXXIV

Porcentaje de recuperacin de material inicial (expresado como peso

seco) (r) y composicin de los residuos slidos obtenidos para las distintas
condiciones de pretratamiento combinado de irradiacin y posterior
tratamiento cido.

147

XXXV

Efecto del pretratam iento con irradiacin en la recuperacin de glucosa,

azucares reductores y lignina.

148

XXXVI

Efecto del pretratamiento combinado irradiacin y posterior tratamiento

cido en la recuperacin de glucosa, azcares reductores y lignina.

149

XXXVI!

Efect. (le pretratamiento por irradiacin en el rendimiento de la

hidrlisis en-Li ntca.

151

290

pgina
XXXVIII

Efecto del pretratamiento combinado irradiacin y posterior tratamiento

cido en el rendimiento de la hidrlisis en-uimtica.

152

XXXIX

Porcentaje de recuperacin de material inicial (expresado como peso

seco) (r) y composicin de los residuos slidos obtenidos para las distintas
condiciones de pretratamiento con etanol

158

XL

Porcentaje de recuperacin de material inicial (expresado como peso

seco) (r) y composicin de los residuos slidos obtenidos para las distintas
condiciones de pretratamiento con butanol

159

XLI

Efecto del pretratamiento con etanol en la recuperacin de glucosa,

azcares reductores y lignina.

161

XI~11

Efecto del pretratamiento con butanol en la recuperacin de glucosa,

162

azcares reductores y lignina.

163

XL[II

Recuperacin de material inicial y deslignificacin (%) para distintos

sustratos lignocelulsicos

XLIV

Efecto del pretratamiento con etanol en el rendimiento de la hidrlisis

en u initica

165

XLV

Efecto del pretratamiento con butanol en el rendimiento de la hidrlisis

enzimtca.

166

XLVI

Rendimientos de hidrlisis de diversos pretratamientos con solventes

orgnicos de diferentes sustratos lignocelulosicos

167

XLVII

Porcentaje de recuperacin de material inicial (expresado como peso

seco) (r) y composicin (le los residuos slidos obtenidos para as distintas

169

condiciones <le pretratamiento con n-butilamni na

XLVIII

Efecto del pretrataniiento con n-butilamina en la recuperacin de

glucosa, azcares reductores y lignina.

170

XLIX

Efecto del pretratamiento con n-butilamina en el rendimiento de la

hidrlisis enzimtica.

172

Porcentaje de recuperacin de material inicial (expresado como peso

seco) (r) y composicin de los residuos slidos obtenidos para las distintas
condiciones de pretratamiento de explosin por vapor

177

1~l

Efecto del pretratamiento de explosin por vapor en la recuperacin de

glucosa, azcares reductores y lignina.

178

LII

Efecto del pretratamiento de explosin por vapor ene1 rendimiento de la

[80

LIII

Porcentaje de recuperacin de material inicial (expresado como peso

183

hidrlisis enzimtica.

seco) (r) y composicin de los residuos slidos obtenidos para las distintas
condiciones de pretratamiento cori explosion (le vapor en medio -cido

LIV

Efecto del pretratamiento con explosin de vapor en medio cido en la

185

recuperacin de glucosa, azcares reductores y lignina.

1Y

E fecto (le pretratam iento con explosin de vapor en medio cido en el

rendimiento dc la hidrlisis etiuimtica.

291.

186

pgina
LVI

Recuperacin de material inicial (expresado como porcentaje en peso

seco) (r) y composicin de los residuos resultantes de la fermentacin con

193

P. chrysosporium sobre O.nervosum nativo

LVII

Recuperacin de material inicial (expresado como porcentaje en peso

seco) (r) y composicin de los residuos resultantes de la fermentacin con
1. chrysosporum sobre Onervosum sometido a pretratamiento cido

194

LVIII

Recuperacin de material inicial (expresado como porcentaje en peso

seco) (r) y composicin de los residuos resultantes de la fermentacin con

195

P. chrysosporium sobre Onervosum sometido a pretratamiento alcalino

LIX

Recuperacin de material inicial (expresado como porcentaje en peso

seco) (r) y composicin de los residuos resultantes de la fermentacin con

196

1. chrysosporiu.m. sobre Onervosum sometido a pretratarniento oxidante

LX

Produccin de glucosa por hidrlisis enzmatica (mg/LOO mg sustrato) d&

los residuos resultantes de la fermentacin por?. chrysosporum sobre

201

O. neruosum nativo o sometido a diferentes pretratamentos

LXI

Produccin de azcares reductores por hidrlisis enzimtica (mg/LOO mg

sustrato) de los residuos resultantes de la fermentacin por F.
chryso.sporium sobre Onereosurn nativo o sometido a diferentes
pretratamientos

202

LXII

Valores de eficacia de sacarificacin (%) de los residuos resultantes de la

203

fermentacin por R c/rysosporum sol)re Oneruosum nativo o sometido

a diferentes pretratam ientns
LXIII

Valores de conversin de celulosa en glucosa (%) <le los residuos

resultantes de la fermentacin por?. chrysosporium sobre Onereosurn.
nativo o sometido a diferentes pretratamientos

204

LXJV

Condiciones de operacin de os pretratamientos seleccionados como

ms efectivos para la biomasa de Onervosum.

207

292-