Vous êtes sur la page 1sur 18

PLSMIDOS

Son pequeas molculas de ADN independientes, circulares, auto-replicantes que lleva slo unos
pocos genes, pesan de 1 Kb a 200 Kb y se pueden encontrar en las bacterias. Los plsmidos se

replican y se transmiten independientemente del cromosoma bacteriano. La replicacin y la


transcripcin de los plsmidos dependen de las protenas de su hospedero.

El nmero de plsmidos en una clula generalmente permanece constante de generacin en generacin.


Los plsmidos son molculas de carcter autnomo y existen en las clulas como genomas
extracromosmicos, aunque algunos plsmidos se pueden insertar en un cromosoma bacteriano, donde
se convierten en una parte permanente del genoma bacteriano.

Es aqu que ofrecen una gran

funcionalidad en la ciencia molecular.

Los plsmidos son fciles de manipular y aislar el uso de bacterias. Pueden ser integradas en los
genomas de mamferos, lo que confiere a las clulas de mamferos cualquier funcionalidad genticos que
llevan. Por lo tanto, esto le da la capacidad de introducir genes en un organismo dado mediante el uso de
bacterias para amplificar los genes hbridos que son creados in vitro. Esta molcula de plsmido pequeo
pero poderoso es la base de la tecnologa del ADN recombinante.

Hay dos categoras de plsmidos. Plsmidos estrictas replicar slo cuando el cromosoma se replica.
Esto es bueno si se est trabajando con una protena que es letal para la clula. Plsmidos tranquilo
replicar por s mismos. Esto le da una mayor proporcin de los plsmidos en el cromosoma.

Universidad Nacional Jos Faustino Snchez Carrin E.A.P. Medicina Humana

I.

TIPOS DE PLSMIDOS

Cada plsmido, dentro de la amplia diversidad de los que se conocen, se suele clasificar segn
el grupo de incompatibilidad al que pertenece (los grupos de incompatibilidad se suelen
denominar con las siglas Inc seguidas de una letra mayscula (por ejemplo IncP, IncFII, etc.).
Se dice que dos plsmidos son incompatibles cuando no pueden coexistir establemente en la
misma bacteria en ausencia de una presin selectiva permanente. Grupo de incompatibilidad
es el conjunto de plsmidos incompatibles entre s. La incompatibilidad depende del hecho de
que los distintos miembros de un mismo grupo poseen el mismo tipo de sistema de control del
nmero de copias y de reparto de dichas copias a las clulas hijas.
Existe una amplia variedad de plsmidos. Los plsmidos bacterianos son de muchos tipos
distintos, pero a grandes rasgos podemos clasificarlos atendiendo a diversos caracteres:
1. Segn que sean autotransmisibles por conjugacin o no:
a. Plsmidos conjugativos.
b. Plsmidos no-conjugativos. Dentro de esta categora se incluyen:
i.

Plsmidos no movilizables

ii.

Plsmidos movilizables por otros que s son conjugativos.

2. Segn su control de replicacin vegetativa:


a. Plsmidos de control estricto del nmero de copias: tienen bajo nmero de
copias por cromosoma en la misma clula. Suelen ser plsmidos de tamaos
medianos (unas 30 kb) a grandes (cientos de kb) P. ej., el factor F se mantiene
a 1-2 copias por cromosoma.
b. Plsmidos de control relajado: alto n de copias por cromosoma (ms de 10).
Suelen ser plsmidos pequeos (menos de 10 kb). Algunos de ellos tienen un
sistema de replicacin especial, y son amplificables cuando a las bacterias que
los poseen se les aade cloramfenicol: este antibitico detiene la sntesis de
protenas. Lo que afecta a la replicacin del cromosoma, ya que para que se
inicie cada ciclo de replicacin cromosmica se necesita un nuevo "pool" de
determinadas enzimas. Pero esto no afecta a la replicacin del plsmido, que
de esta manera se "amplifica" y aumenta an ms su proporcin respecto del
cromosoma.
3. Segn el tipo de fenotipos que codifican (y dejando aparte a los plsmidos
crpticos, de los que se desconoce su funcin fenotpica):
a. Plsmidos R, que codifican una o ms resistencias a drogas (antibiticos) y/o
resistencia a metales pesados.
b. Plsmidos

bacteriocinognicos,

que

codifican

alguna

bacteriocina

simultneamente confieren inmunidad frente a esa bacteriocina a la bacteria

Asignatura: Biologa

Docente: Segami Salazar Hugo


2

Universidad Nacional Jos Faustino Snchez Carrin E.A.P. Medicina Humana


que lo posee. Dentro de ellos, de los ms estudiados son los plsmidos Col,
que producen colicinas (bacteriocinas de E. coli).
c.

Plsmidos de virulencia, que codifican funciones relacionadas con la virulencia


en muchas bacterias patgenas. Por ejemplo:
i.

plsmido de la toxina tetnica en Clostridium tetani.

ii.

plsmido de la toxina del ntrax en Bacillus anthracis.

d. Plsmidos que codifican factores de colonizacin (para la invasin de los


tejidos de su hospedador).
e. Plsmidos de cepas de Pseudomonas, que confieren rutas metablicas
capaces de utilizar como fuentes de carbono y energa sustancias que otros
organismos no pueden catabolizar:

f.

i.

plsmidos OCT (degradacin del octano);

ii.

plsmidos TOL/XYL (degradacin del tolueno y xileno);

iii.

plsmidos NAF (degradacin del naftaleno), etc.

Plsmidos de cepas de Rhizobium responsables de funciones relacionadas


con el establecimiento de las simbiosis fijadoras de nitrgeno en los ndulos
radicales de las leguminosas (pSym y otros tipos).

g. Plsmidos Ti y Ri de Agrobacterium, responsables de la produccin de tumores


en numerosas plantas dicotiledneas.
h. Existen igualmente plsmidos que codifican ms de un tipo de fenotipos: p. ej.,
plsmidos que suministran resistencia a antibiticos y capacidad de virulencia.
4. Plsmidos segn el grupo de incompatibilidad. Recordar la definicin de
incompatibilidad entre plsmidos, y la base de este fenmeno: dos plsmidos son
incompatibles (no pueden permanecer establemente en la misma clula) porque
comparten un mismo sistema de replicacin y segregacin de las copias. Como se
sabe, los plsmidos se pueden clasificar segn su pertenencia a un mismo grupo de
incompatibilidad.
a. As p. ej., el plsmido F pertenece al llamado grupo IncFI;
b. Los plsmidos R1 y R100, de resistencia a antibiticos, pertenecen al grupo
IncFII.
Dos plsmidos conjugativos pertenecientes a grupos de incompatibilidad diferentes pueden
poseer regiones tra semejantes, y tipos de pelos sexuales parecidos. Esto es precisamente lo
que ocurre con el F comparado con el R1 o el R100.

Asignatura: Biologa

Docente: Segami Salazar Hugo


3

Universidad Nacional Jos Faustino Snchez Carrin E.A.P. Medicina Humana


II.

ESTRUCTURA DE LOS PLSMIDOS

Los plsmidos extrados de una bacteria se encuentran principalmente en forma


superenrollada. El ADN as enrollado adopta una configuracin ms compacta que
el ADN menos enrollado y migra entonces ms rpido que el otro durante una
electroforesis.

Las formas de ADN


Los plsmidos se encuentran principalmente en forma superenrollada en las bacterias.
Las formas de ADN pueden visualizarse en el microscopio electrnico como crculos
relajados o superenrollados.
Adems, pueden identificarse por electroforesis o por centrifugacin. En estos casos, la
estructura compactada del ADN superenrollado aumenta su migracin electrofortica y
su velocidad de sedimentacin, lo cual permite diferenciarlo del ADN circular relajado o
del ADN lineal.

Asignatura: Biologa

Docente: Segami Salazar Hugo


4

Universidad Nacional Jos Faustino Snchez Carrin E.A.P. Medicina Humana


Los tipos de plsmidos, clasificados de acuerdo al tipo de genes que transportan: F
("factor sexual") : en Escherichiacoli el plsmido F contiene 25 genes, algunos de los
cuales controlan la produccin de los pilis , "tubos" que se extienden desde la
+

superficie de las clulas bacterianas "machos"( F ), a la de las clulas bacterianas


-

hembras ( F ).

Se denomina episoma a un plsmido incorporado al cromosoma bacteriano. Los


plsmidos se replican en manera similar al cromosoma bacteriano. En Escherichia coli
se han reconocido muchos plsmidos, entre ellos el F ("factor sexual") y el R
(resistencia a los antibiticos).
El plsmido R confiere, a las clulas que lo poseen, resistencia a los antibiticos o
drogas. Un plsmido R puede llegar a tener hasta 10 genes que confieren resistencia y
pueden transferirse a otra bacteria de la misma especie, a virus e inclusive, a bacterias
de diferentes especies.

Asignatura: Biologa

Docente: Segami Salazar Hugo


5

Universidad Nacional Jos Faustino Snchez Carrin E.A.P. Medicina Humana


III.

FUNCIONES DE LOS PLSMIDOS

En funcin de que los plsmidos sean o no transmisibles de una bacteria a otra por medio de
contactos intercelulares, se pueden distinguir:
A. PlsmidosConjugativos (auto transmisible):Que son aquellos que se transfieren entre
cepas por medio de fenmenos de conjugacin. Algunos de estos plsmidos no slo se
transfieren entre cepas de la misma especie, sino que son capaces de hacerlo entre
especies y gneros muy diversos, recibiendo el muy apropiado nombre de plsmidos
promiscuos o de amplio espectro de hospedadores, permitiendo transferencia
horizontal de informacin gentica entre grupos bacterianos filogenticamente
alejados.
B. Plsmidos No Conjugativos: Carentes de esta propiedad de conjugacin. Dentro de
esta categora existe un subgrupo, el de los plsmidos movilizables: son aquel no auto
transmisible que pueden ser transferidos por la accin de un plsmido conjugativo
coexistente en la misma bacteria.
Existe una variedad de fenotipos y funciones determinados por plsmidos:

Resistencia a antibiticos (plsmidos R).

Resistencia a metales pesados (por ejemplo, resistencia a mercurio).

Plsmidos de virulencia: produccin de toxinas, factores de penetracin en tejidos,


adherencia a tejidos del hospedador, etc., en ciertas bacterias patgenas.

Produccin de bacteriocinas (protenas txicas producidas por bacterias que matan a


otras de la misma especie).

Produccin de siderforos (quelatos para secuestrar iones Fe ).

Utilizacin de determinados azcares.

Utilizacin de hidrocarburos, incluyendo algunos cclicos recalcitrantes (degradacin de

3+

tolueno, xileno, alcanfor, etc.) en Pseudomonas.

Induccin de tumores en plantas (plsmido Ti de Agrobacteriumtumefaciens).

Interacciones simbiticas y fijacin de nitrgeno en ciertos Rhizobium.

IV.

DESCRIPCIN DEL PLSMIDO F Y DE SUS FUNCIONES BSICAS


El factor responsable de la fertilidad de E. coli K12, o sea, el plsmido F, es un ejemplo
de plsmido conjugativo que tiene la capacidad de interaccionar con el cromosoma
bacteriano para integrarse en l (episoma). El factor F puede encontrarse en uno de
tres posibles estados:

Autnomo, en las clulas F ;

Integrado (como episoma), en las clulas Hfr;

Asignatura: Biologa

Docente: Segami Salazar Hugo


6

Universidad Nacional Jos Faustino Snchez Carrin E.A.P. Medicina Humana

Autnomo, pero con un trozo de cromosoma, en las cepas F'


En estos tres estados realiza el mismo tipo de funciones esenciales.
4.1.

Estructura fsica:

ADN circular de cadena doble, cerrado covalentemente (C.C.C.);

Superenrollado negativamente (requiere la accin de la girasa);


Tamao: 100 kilobases. El mapa fsico de F posee coordenadas en kb de 0 a 100
(obviamente el 0 y el 100 son el mismo punto), tomando como punto arbitrario de
referencia (0/100) el borde izquierdo de la secuencia de insercin IS3a.
4.2.

Organizacin gentica y funcional:

Se han identificado unos 60 genes en el plsmido F. Vamos a echar una ojeada al


mapa de F para describir los principales grupos de genes segn las funciones que
realizan:
1.

Porcin tra (genes que codifican funciones relacionadas con la transferencia

conjugativa). Existen unos 25 genes tra, repartidos en unas 33 kb (o sea, casi la tercera
parte de F est dedicado a genes de conjugacin). La mayor parte de esos genes
estn formando parte de un gran opern traYZ (unos 20 genes).
2.

Regiones para la replicacin vegetativa del plsmido F: la zona RepFIA es la

ms importante, y posee genes relacionados con la replicacin vegetativa, con la


incompatibilidad de F respecto de otros plsmidos (Inc) de tipo similar, y con el reparto
de las copias replicadas de F a las clulas hijas.

V.

DESCRIPCIN DEL PLSMIDO R Y SUS FUNCIONES BSICAS

EL PLSMIDO R: La resistencia a los antibiticos ha sido encontrada en grmenes patgenos


causantes de enfermedades tales como: tifoidea, meningitis, gonorrea y otras. Actan
proporcionando la informacin necesaria para destruir el antibitico o para circunvalar el
bloqueo que produce el antibitico en la va metablica bacteriana.
En el caso de una infeccin viral, el uso indebido o innecesario de antibiticos matar a la
poblacin bacteriana normal, quedando (o seleccionando) las que tengan el factor R; stas
pueden reproducirse an en presencia del antibitico. La prxima vez que tenga una infeccin
bacteriana, las bacterias con factores R estarn listas para transferir su factor a la nueva
bacteria invasoras, que se harn resistentes a los antibiticos.

Asignatura: Biologa

Docente: Segami Salazar Hugo


7

Universidad Nacional Jos Faustino Snchez Carrin E.A.P. Medicina Humana


VI.

MECANISMO DE TRANSMISIN DE GENES

Las bacterias tienen tres mecanismos para el intercambio y la incorporacin del material
gentico. Son transformacin (la admisin de ADN extracelular), transduccin (los fagos
transfieren genes bacterianos a partir de una clula hospedadora a otra) y conjugacin
(transferencia genmica directa entre las clulas bacterianas temporalmente unidas).
1. TRANSFORMACIN
Transformar una bacteria una levadura, consiste en introducirle una molcula de ADN
extranjero, introducir un plsmido en una bacteria es transformar una bacteria, o sea una
transformacin. Para las clulas eucariotas (no las levaduras), no se dice transformar sino
transfectar (transformar una clula eucariota quiere decir hacerla eterna o hacerla cancerosa).
Existen varios mtodos para introducir un plsmido en una clula. Cada uno es en s una
receta y cada uno tiene una propia.
TRANSFORMACIN CON CACL2 + CHOQUE TRMICO:
Consiste en aadir plsmidos a las bacterias tratadas con CaCl 2 y de someterlas a un breve
choque trmico (42C). La utilizacin de otras sales de CaCl2 y la adicin de iones metlicos
aumenta la eficiencia de la transformacin. Para plsmidos de 3 kb, una transformacin eficaz
produce alrededor de 10+8 colonias/mg de ADN plasmdico superenrollado.
Otros mtodos de transformacin: Utilizando por ejemplo liposomas y son ms costosos. La
eficiencia de la transformacin es inversamente proporcional a la talla del plsmido. Para
identificar las bacterias transformadas, se utilizan marcadores de seleccin proporcionados por
plsmidos. Los marcadores de seleccin ms utilizados son los genes de resistencia a
antibiticos, como la ampicilina, la tetraciclina, el cloramfenicol y la kanamicina. Como regla, las
bacterias transformadas se cultivan en presencia del antibitico para evitar que la bacteria
pierda el plsmido que se le ha introducido.
2. TRANSDUCCIN
Es la transferencia de material gentico entre bacterias, usando como vehculo un bacterifago.
No todos los ciclos virales son iguales, pudiendo destacar dos ciclos principales, el lisognico y
el ltico. Si la respuesta es ltica, el virus se va replicando, formando una serie de nuevos fagos
a la vez, que usan a la bacteria como elemento parasitado, hasta que son capaces de parasitar
ya por ellos mismos. La segunda respuesta que podemos encontrar es la lisognica, en la que
el genoma del fago se integra en el de la bacteria, de forma que puede permanecer en este
estado estacionario bastante tiempo hasta que se produzca el ciclo ltico.
Este proceso es similar a la integracin o desintegracin del factor F, aunque la diferencia es
que en la transduccin, la integracin del profago siempre es en el mismo punto del

Asignatura: Biologa

Docente: Segami Salazar Hugo


8

Universidad Nacional Jos Faustino Snchez Carrin E.A.P. Medicina Humana


cromosoma bacteriano, mientras que el factor F poda integrarse en ms de un punto
determinado.
Podemos encontrar transduccin especializada y generalizada, estando relacionadas con el
ciclo que acabamos de ver.

3. CONJUGACIN
Tenemos una cepa receptora junto con material gentico que aporta otra clula, de forma que
a partir de ah, puede producirse la conjugacin, que es la transferencia de material; aunque
para que sea viable, debe darse la recombinacin gracias al proceso del entrecruzamiento. El
intercambio gentico no tiene lugar entre dos genomas completos como ocurre en eucariota,
sino que, tiene lugar entre un genoma completo (F-) que se denomina endogenote, y otro
incompleto, del donante, denominado exogenote. Obtendremos un merocigoto (diploide
parcial). La gentica bacteriana es la gentica de la merocigosis.
Para que la recombinacin d algn cromosoma viable (que podr ser circular), debe
producirse un nmero par de entrecruzamientos, puesto que si no, no obtendremos ningn
producto viable, sino un cromosoma largo lineal y extrao, parcialmente diploide. Si se da este
nmero par de entrecruzamientos, obtendremos dos productos, uno que se perder durante el
crecimiento celular y otro que ser viable.
Produccin del proceso: podemos usar los datos de la conjugacin interrumpida para realizar
un mapa con frecuencias de recombinacin, usando la conjugacin, primero tenemos que
asegurarnos de que los marcadores han pasado al cromosoma receptor, teniendo en cuenta
que gracias al gradiente de transferencia natural, pasan con mayor frecuencia y facilidad,
aquellos marcadores que se encuentran ms cerca del punto de entrada. Esto es debido a que
el apareamiento entre las bacterias suele interrumpirse espontneamente, de forma que la
transferencia de los marcadores suele ocurrir en el orden en que estos estn presentes en el
DNA a partir del punto de inicio de la transferencia del mismo factor F. Nosotros seleccionamos
para un determinado marcador, teniendo que controlar qu marcadores pasan, pudiendo
estimar que se produce un punto de entrecruzamiento hacia el ltimo marcador. Podemos

Asignatura: Biologa

Docente: Segami Salazar Hugo


9

Universidad Nacional Jos Faustino Snchez Carrin E.A.P. Medicina Humana


deducir el orden de los genes que entran gracias a las frecuencias relativas de recombinantes
en cruzamientos recprocos entre los genotipos parentales.
Podemos encontrar procesos relacionados con la conjugacin, tales como la sexduccin, en el
que se usan elementos F para crear diploides parciales. El F es un caso de factor F
modificado, encontrndose en algunas cepas Hfr. Podemos obtener estirpes F con fragmentos
muy grandes del cromosoma bacteriano. Los factores F son ms fciles de recombinar porque
poseen ms puntos para recombinar.
FISIOLOGA Y BIOLOGA MOLECULAR DE LA CONJUGACIN

Podemos distinguir en la conjugacin dos grandes fases:


Contactos entre clulas F+ (o, en su caso, Hfr) y F--;
Transferencia del ADN.
+

CONTACTOS ENTRE CLULAS F Y F

--

Las clulas F (o las Hfr) forman de 1 a 10 pelos sexuales (repasar aqu lo que se dijo
oportunamente en el cap. 11 sobre este tipo de pelos, que son distintos de las fimbrias
de tipo adhesivo). El pelo interacciona especficamente, a travs de su punta, con un
--

receptor de la clula F (concretamente, parece ser que se trata de la protena OmpA, de


la membrana externa).
En los cruces se ha visto que ms que parejas de cruce existen agregados de cruce,
donde varias clulas de ambos tipos (hasta unas 20) se encuentran relacionadas por
contactos directos. Las cosas ocurren de la siguiente manera:
+

Una clula F contacta por medio de la punta de su pelo F con el receptor de superficie
--

de una F El pelo F se va despolimerizando desde su base, lo cual provoca la apariencia


--

de que se va retrayendo. En ese movimiento de retraccin, la clula F se va acercando


+

a la F . Cuando el pelo se termina de desintegrar, las clulas se ponen en contacto


directo pared-pared. Se forma un puente conjugativo que pone en contacto los
citoplasmas de ambas clulas Las parejas o agregados de cruce se estabilizan por la
--

accin de los genes traN y traG del plsmido F, y de ompA de la clula F . La protena
producida por traD (localizada en ambas membranas, citoplsmica y externa) parece que
facilita el transporte del ADN a la clula receptora. Tras cierto tiempo de conjugacin, el
agregado se desagrega de forma activa.
Un fenmeno interesante, que tiene que ver con las interacciones entre superficies
celulares: se trata de la exclusin superficial, y consiste en un sistema por el que se evita
+

que las clulas de tipo F puedan actuar como receptoras frente a otras F . Se sabe que
la accin de dos genes del plsmido F realiza esta funcin:

Asignatura: Biologa

Docente: Segami Salazar Hugo


10

Universidad Nacional Jos Faustino Snchez Carrin E.A.P. Medicina Humana


traT: su producto se sita en la membrana externa, impidiendo la formacin de
+

contactos con pelos sexuales de otra clula F .


traS: su producto, situado en la membrana citoplsmica, evita la entrada de ADN
+

--

Otro fenmeno que se puede observar en los cruces F x F es la zigosis letal. Ocurre
+

--

cuando la proporcin de clulas F es muy superior a la de F (p. ej., de 10:1).


En este caso, las clulas receptoras pueden morir, debido a que estn siendo
modificadas en muchos puntos de su superficie por numerosos contactos con clulas
+

F.
TRANSFERENCIA Y PROCESAMIENTO DEL ADN CONJUGATIVO
+

--

La transferencia de ADN desde una clula F a una F es un proceso especial de replicacin


asimtrica por crculo rodante.

Una de las dos cadenas parentales del plsmido F pasa a la clula receptora,
replicndose en ella;

La otra cadena parental se queda en el donador, sirviendo a su vez como molde para
la sntesis de una nueva cadena complementaria. Esto explica porqu las clulas F

siguen siendo F tras la conjugacin.


Por lo tanto, la transferencia de ADN no implica que la doble hlice de F desaparezca del
donador para aparecer en el receptor, sino que al
final, ambos miembros de la pareja poseen un
plsmido F completo.
Resumiendo

el

modelo,

la

transferencia

conjugativa del plsmido F ocurre de la siguiente


manera:

En

la

clula

F,

una

endonucleasa

especfica codificada por uno de los genes


tra reconoce y corta en una de las
cadenas

de

la

secuencia

oriT

del

plsmido.

La cadena as cortada sej ve desplazada


por una helicasa codifica por otro gen tra
del plmido.

Los

productos

de

otros

genes

tra

transfieren la cadena cortada al receptor.


Al parecer, los extremos de esa cadena
permanecen "anclados" a otra protena Tra
(es decir, durante el proceso nunca

Asignatura: Biologa

Docente: Segami Salazar Hugo


11

Universidad Nacional Jos Faustino Snchez Carrin E.A.P. Medicina Humana


quedan extremos libres como tales).
Transferencia de ADN por conjugacin entre plsmidos.

PLSMIDOS RECOMBINADOS:
Los plsmidos son excelentes vectores de clonaje. Puede ser "cortado" con una dos enzimas
de restriccin puede incorporrsele un fragmento de ADN que ha sido previamente cortado
usando mas mismas enzimas de restriccin.
Los plsmidos as modificados se los denomina plsmidos recombinados. En ste estado, se
los introduce entonces en una bacteria donde sern replicados.
EMARCADOR DE SELECCIN:
Es crucial el poder distinguir entre las colonias que contienen los plsmidos recombinados de
aquellas que contiene ya sea plsmidos no recombinados o que no contienen ningn plsmido.
Varios mtodos existen para realizar sta distincin y se basan en el uso de un marcador de
seleccin. En el ejemplo de abajo por ejemplo, el marcador de seleccin es la ampicilina.

A.

EL INSERTO DE UN SEGMENTO DE ADN EXTRANJERO EN UN PLSMIDO.

Asignatura: Biologa

Docente: Segami Salazar Hugo


12

Universidad Nacional Jos Faustino Snchez Carrin E.A.P. Medicina Humana


B.

TRANSFORMACIN DE BACTERIAS POR EL PLSMIDO.

C.

SELECCIN DE BACTERIAS TRANSFORMADAS.


CUALIDADES DE UN VECTOR DE CLONADO
Los plsmidos deben ser pequeos y de replicacin con control relajado. La mayora de los
plsmidos en uso contienen un replicn derivado del plsmido pMB1, inicialmente aislado de
una muestra clnica. En condiciones normales de cultivo, se encuentra un mnimo de 15 a 20
copias de plsmido que contienen el replicn en cada clula bacteriana.
Deben contener marcadores genticos particulares, como gens de resistencia a antibiticos
el gen que codifica la -galactosidasa. Deben contener uno ms sitios de restriccin nicos
en una regin que no sea esencial para la replicacin del plsmido.

Si es posible, debe tener sitios de restriccin nicos en los gens codantes de marcadores
selectivos. Esos marcadores son inactivados cuando en ellos se inserta un fragmento de ADN
extranjero.
VII.

REPLICACIN DE LOS PLSMIDOS

Como dijimos, los plsmidos son replicones, es decir, unidades de replicacin autnoma, pero
ello no significa que codifiquen toda la maquinaria para su propia replicacin. De hecho, la
mayora de los plsmidos slo codifican unas pocas protenas para este fin, y aprovechan la
maquinaria de replicacin de la bacteria husped (ADN polimerasas, ligasas, primasas, etc.),

Asignatura: Biologa

Docente: Segami Salazar Hugo


13

Universidad Nacional Jos Faustino Snchez Carrin E.A.P. Medicina Humana


que acta sobre unas secuencias del plsmido denominadas secuencias oriV, donde tiene
lugar el inicio de esa replicacin. Cada tipo de plsmido se replica por uno de dos principales
tipos de mecanismos:

Modelo de replicacin en (theta): comienza por la separacin de las dos cadenas


en el sitio oriV, creando una estructura que se parece a la letra griega (theta). En
algunos plsmidos, la replicacin es unidireccional (slo hay una horquilla de
replicacin, que avanza a lo largo de la molcula, hasta que vuelve al sitio oriV, en el
que las dos molculas hijas se separan). Otros plsmidos se replican en por un
modelo bidireccional (dos horquillas de replicacin de sentidos opuestos, que se
encuentran cerca de la mitad de la molcula). La replicacin en es frecuente en
plsmidos de bacterias Gram-negativas.

Modelo de replicacin en s (sigma), o modelo del crculo rodante: una de las dos
cadenas es rota a nivel de oriV, de modo que el extremo 3 suministra el cebador para
la replicacin de la cadena adelantada. La cadena desplazada (cadena menos)
funciona como cadena retrasada (lagging) y debe ser replicada a partir de sitios de
cebado especiales. Este tipo de replicacin es frecuente en plsmidos de bacterias
Gram-positivas.
REGULACIN DEL NMERO DE COPIAS

La regulacin del nmero medio de copias de cada plsmido en cada bacteria es una
propiedad caracterstica dependiente de cmo se controla el inicio de replicacin, siendo
diferentes los mecanismos en los plsmidos de alto nmero de copias (con control relajado) y
en los plsmidos de bajo nmero de copias (de control estricto).

En general, los plsmidos de control relajado tienen mecanismos que inhiben el inicio
de replicacin slo cuando el nmero de copias ha llegado a un cierto nivel.

En cambio, los plsmidos de control estricto tienen mecanismos que logran que slo se
repliquen una vez o un pequeo nmero de veces en cada ciclo celular.
REPARTO DE LAS COPIAS A LAS CLULAS HIJAS

Muchos plsmidos poseen sistemas de reparto (= particin), que tienden a asegurar que una
vez que el plsmido ha sido replicado, cada una de las clulas hijas va a recibir al menos una
copia. A falta de un tal sistema, y si el reparto fuera aleatorio, de vez en cuando, las propias
fluctuaciones de la segregacin aleatoria haran que parte de la progenie no recibiera una
copia, con lo que quedara curada de ese plsmido.
El reparto de las copias a las clulas hijas se suele deber a las llamadas funciones par, que
estn cerca de los genes rep y de la zona ori. Se trata de cortas secuencias de ADN que de

Asignatura: Biologa

Docente: Segami Salazar Hugo


14

Universidad Nacional Jos Faustino Snchez Carrin E.A.P. Medicina Humana


alguna manera an no aclarada, debe unirse a alguna zona de la membrana de la bacteria que
se duplica durante la divisin celular, de modo que cada copia, unida a una de esas zonas, se
segrega a una clula hija.
VIII.

PLSMIDOS Y MAMFEROS

1. PLSMIDOS DE EXPRESIN EN MAMFEROS


Se pueden utilizar plsmidos para la expresin de clones de ADNc en mamferos. El ADNc se
inserta en el sitio de clonaje. El plsmido se multiplica en la E.coli utilizando para la seleccin
un gen de resistencia a la ampicilina. El plsmido as preparado se inserta en las clulas de
mamferos utilizando los mtodos de asemblaje ya descritos como cuando se usa la E.coli.

Promotor, intrones y cola poly (A):


La figura aqu muestra uno de sos plsmidos. La mayora de los gens de mamferos son
monocistrnicos. En la prctica eso significa que cada gen tiene su propio inductor/promotor y
su cola poly(A). La adicin de un intrn (una chimera de un intrn de la -globina y de IgG) a lo
largo del sitio de clonaje facilita la transcripcin.
Los promotores que se utilizan son de origen viral (cytomegalovirus y Simian virus 40 SV40),
que son promotores fuertes. Cada gen termina por una cola poly(A).
Dos genes de seleccin:
El gen de resistencia a la ampicilina sirve para la propagacin del vector en las bacterias. El
gen de resistencia a la neomicina sirve para seleccionar las clulas de mamferos
transfectadas. Las clulas de mamferos son insensibles a la neomicina. En contra, el
aminoglycsido G418 es txico para los procariotas y los eucariotas. Las clulas eucariotas
transfectadas con el pCIno sin embargo resisten al G418.

Asignatura: Biologa

Docente: Segami Salazar Hugo


15

Universidad Nacional Jos Faustino Snchez Carrin E.A.P. Medicina Humana


Transfecciones transitorias y estables:
Se denomina transfeccin transitoria aquella en la que el plsmido no ha sido integrado a uno
de los cromosomas eucariticos. Se habla de transfeccin estable cuando el plsmido se ha
integrado a uno ms cromosomas eucariotas. La transfeccin se puede realizar utilizando los
mtodos procariotas.
Los transfectantes son seleccionados aadiendo G418 al medio de cultivo. Para obtener
transfectantes estables, se cultiva simplemente las clulas varias semanas en presencia de
G418. Es necesario sin embargo verificar de vez en cuando que las clulas no han eliminado el
inserto que slo conservan el gen de resistencia.
Cotransfeccin:
La Cotransfeccin es la transfeccin simultnea de varios plsmidos. Mediante la
cotransfeccin se puede verificar si la transfeccin se ha realizado correctamente. Para lograrlo
se cotransfecta un plsmido cuya presencia es verificada por una reaccin rpida y simple que
indica que el plsmido de inters ha sido bien transfectado. Se puede tambin cotransfectar
plsmidos complementarios: la protena codificada por una condicin de expresin que es
dependiente de otra.
IX.

ENFERMEDADES RELACIONADAS A LOS PLSMIDOS

BASES GENTICAS DE LA RESISTENCIA BACTERIANA


Debido a que muchos plsmidos R son trasnsmitibles, incluso intergenticamente, su
presencia en una enterobacteria intestinal representa su potencial transmisin a una
cepa patgena que entre en contacto con la cepa resistente. Es por eso que los
plsmidos R representan un grave peligro para la salud humana y animal.

ENZIMAS
La bacteria produce enzimas que
escinden y destruyen los antibiticos.

Asignatura: Biologa

Docente: Segami Salazar Hugo


16

Universidad Nacional Jos Faustino Snchez Carrin E.A.P. Medicina Humana

PARED DE LA CLULA
La pared de la bacteria aumenta de
espesor e impide por efecto rebote
la penetracin del frmaco en el
interior de la clula.

TRANSFERENCIA GENTICA DE PLSMIDOS


La bacteria desarrolla capacidad para
mutar. Las mutaciones confieren al
germen resistencia a los antibiticos y esta
caracterstica se transfiere a otros
microorganismos a travs de segmentos
de DNA llamados plsmidos.

La resistencia a los antibiticos ha sido encontrada en grmenes patgenos causantes


de enfermedades tales como: tifoidea, meningitis, gonorrea, Leiomiomatosis, Nefritis
Hereditaria, Dermatofibrosarcoma, Enfermedad de von Willebrand, entre otras.

Uretritis: La uretritis puede ser causada por bacterias o virus. Las mismas bacterias que
causan las infecciones urinarias (E. coli) y algunas enfermedades de transmisin
sexual (clamidia, gonorrea) pueden llevar a que se presente uretritis. Las causas
virales de la uretritis incluyen el virus del herpes simple y el citomegalovirus.

Epidermlisis Ampollosa Distrfica : Es un grupo de trastornos hereditarios en los que


se desarrollan ampollas en la piel como respuesta a una lesin menor.

Asignatura: Biologa

Docente: Segami Salazar Hugo


17

Universidad Nacional Jos Faustino Snchez Carrin E.A.P. Medicina Humana


X. CONCLUSIONES

1. En general, los plsmidos no son esenciales para la supervivencia de bacterias, sino


que pueden sin embargo codificar una variedad amplia de determinantes genticos,
que permiten que sus anfitriones bacterianos sobrevivan mejor en un ambiente
adverso o compitan mejor con otros microorganismos que ocupan el mismo lugar
ecolgico.

2. La importancia mdica de los plsmidos que codifican para la resistencia antibitica,


tan bien como rasgos especficos de la virulencia se ha documentado y demostr bien
el papel importante juego gentico bacteriano de estos elementos en naturaleza.

3. El anlisis molecular y gentico de plsmidos bacterianos condujo a los conceptos


bsicos tales como "el operon" y "el replicon"

4. En microorganismos patgenos, los plsmidos que contribuyen directamente a la


autognesis microbiano en plantas y animales.

5. Una de las caractersticas que guardan plsmidos en la vanguardia de la microbiologa


es su capacidad de llevar y de transmitir los genes que codifican resistencia a los
compuestos antimicrobianos. La resistencia a los antibiticos ha sido encontrada en
grmenes patgenos causantes de enfermedades tales como: tifoidea, meningitis,
gonorrea y otras. Actan proporcionando la informacin necesaria para destruir el
antibitico o para circunvalar el bloqueo que produce el antibitico en la va metablica
bacteriana.

Asignatura: Biologa

Docente: Segami Salazar Hugo


18