Reviso em Biologia

Molecular
Profa Cristiane Frota

Expresso gentica
em procariotos
Transcrio

Hibridizao

Hibridizao
Hibridizao DNA/RNA-Aps desnaturao da molcula de DNA uma das
fitas pode hibridizar com a molcula complementar de RNA. A existncia de
complemetaridade RNA/DNA uma forte indicao de que o DNA molde
para a sntese de molculas de RNA.

Tipos de RNA

Complexo macromolecular ribonucleiproteina

Tipos de RNA

Os trs tipos de RNA, rRNA, tRNA e mRNA: processo de sntese protica.

Os mRNA contem a mensagem que ser traduzida em protena, e a
seqncia de bases no mRNA determina a seqncia dos aminocidos no
polipeptdio.
Os tRNA carregam os aminocidos especficos para cada cdon.
O local de sntese protica o ribossomo, um complexo ribonucleoprotico
onde rRNAs associam-se protenas especficas.
O valor S indica a velocidade de sedimentao de uma molcula numa
ultracentrfuga.
6

Sntese de RNA
(+)
(-)

Fita codificadora, fita molde e RNA.

O sentido da transcrio est indicado pela flecha

Unidade de Transcrio
RNA polimerase

A unidade de transcrio uma seqncia de DNA

transcrita pela RNA polimerase, com incio no ponto
+1 e trmino no sinal de terminao jusante.
8

Fita molde de DNA

Transcrio utilizando fitas diferentes como molde.

No segmento A, a fita "superior" ser utilizada como molde e a molcula de RNA
produzida ter a mesma seqncia do segmento correspondente da fita "inferior".
No segmento B, a fita "inferior" ser utilizada como molde e a molcula de RNA
produzida ter a mesma seqncia do segmento correspondente da "superior".
9

Orientao da Transcrio

Hbrido DNA/RNA na transcrio

2-10bp

O DNA se desenrola localmente.

O transcrito produzido tem uma seqncia idntica da fita codificadora do
DNA, apenas com substituio de T por U.
Uma curta molcula hbrida DNA/RNA formada no local da bolha de
transcrio.
11

Sntese de RNAm

Adio de
ribonucleotidio

Reao catalisada por ons Mg+2 e Zn+2

12

RNApolimerase

Estrutura da RNApolimerase

RNA polimerase
5

s
Em

E. coli a RNA polimerase uma protena multimrica constituda de cadeias

polipeptdicas diferentes: b(beta), b'(beta linha), 2a(alfa) e s(sigma).
RNA polimerase holoenzima: complexo bb'a 2 s
A determinao do stio correto de iniciao da transcrio depende das subunidades
sigma.
O processo de alongamento da cadeia de ribonucleotdios depende do stio cataltico
existente na subunidade b.
15

RNA polimerase
Subunidades da RNA polimerase de E. coli
Subunidade

Gene

Massa (d)

Quantidade

Funes possveis

rpoA

~40.000

montagem

rpoB

~150.000

ligao dos nucleotdios

rpoC

~160.000

ligao ao molde

rpoD

32-92.000

ligao ao promotor

16

Subunidade s

Desliza ao longo
do DNA procura
do promotor

17

Fatores sigma s

18

Promotor de transcrio
Promotores:
Subunidades s reconhecem seqncias especificas nos
promotores dos genes

Caractersticas
Enzima RNA polimerase liga ao promotor
Regies de consenso 10 e 35 em relao
ao local de polimerizao
Regio 10 TATAAT: Pribnow box
19

Promotor de transcrio
Pribnow
box

20

Sequencias Consenso

Processo de Transcrio
1.
2.
3.
4.

Reconhecimento do promotor
Iniciao da cadeia
Alongamento da cadeia
Terminao da cadeia

22

Reconhecimento do promotor
Seqncias -35 e -10 de alguns promotores de E. coli
gene

seqncia -35

distncia

seqncia -10

distncia

+1

trp

TTGACA

N17

TATGTT

N5

tRNAtyr

TTTACA

N16

TATGAT

N7

lac

TTTACA

N18

TATGTT

N6

recA

TTGATA

N16

TATAAT

N8

araB, A, D

CTGACG

N18

TACTGT

N6

bioB

TTGTAA

N17

TAGGTT

N8

rrnA1

TTGACT

N16

TATTAT

N6

Consenso s70

TTGACA

TATAAT

Consenso s54

CTGGNA

TTGCA

Consenso s28

CTAAA

CCGATAT

Consenso s32

TxtCcCcTTGAA

N13-15

CCCCATtTA

Promotores fortes
Promotores fracos
23

Iniciao da transcrio

Complexo de iniciao

Bolha de transcrio
saida de s

alongamento

Iniciao da transcrio: o fator s reconhece a seqncia do

promotor e a subunidade b adiciona os primeiros ribonucleotdios
sem necessidade de um primer
24

Alongamento da Transcrio

*50 nucleotideos/seg

Alongamento do transcrito: liberao do fator sigma e interao com

NusA
Ocorre o deslizamento da central enzimtica sobre a fita de DNA,
at encontrar o sinal de terminao da transcrio
25

Alongamento da Transcrio

*50 nucleotideos/seg

Os processos de transcrio e traduo podem estar

acoplados e a extremidade 5 livre de uma molecula de
mRNA podera ser imediatamente iniciada em traduo
26

Ciclo da Transcrio

Transcrio

28

Terminao
Rho-independente
Rho-dependente

29

Terminao
Rho-independente

rica em G+C ou A+U

regio palindrmica

Estrutura em grampo desencadeia:

Parada da RNA polimerase
Destruio parcial do hbrido RNA-DNA, proporcionando instabilidade da regio ligada
Dissociao do RNA nascente da enzima RNA polimerase
Restabelecimento da regio dupla-fita do DNA
Liberao da RNA polimerase da fita molde do DNA

30

Terminao
Rho-dependente

31

EXPRESSO GNICA EM
PROCARIOTOS

32

Expresso de genes pode ser:

Constitutiva
Genes sempre expresso

Induzida
Expresso em resposta ao sinal ambiental

Reprimida
Represso em resposta ao sinal ambiental

33

Expresso Gentica visa controlar:

A transcrio
Grupos de genes com funo correlata
Controle coordenado de genes com funo
correlata
RNAm Polignico

34

A expresso gnica pode ser

regulada a cada passo

35

Genes Induzidos Modelo

Operon
Definio: Genes cuja expresso induzida
pela presena de alguma substncia
Lactose induz expresso de genes lac
Um antibiotico induz a expresso de genes de
resistncia

Vias Catablicas

36

Operon

Mltiplos genes
regulados por um
nico promotor
Gene regulador
constitutivo
Stio de ligao na
regio do promotor
do operon para a
proteina de
regulao

37

Organizao dos genes em operon

operon

Organizao de um operon hipottico em E. coli.

Os genes E, D, C, B e A codificam protenas cuja expresso controlada
por um mesmo promotor, montante.
Quando a protena repressora liga-se ao operador, no ocorre
transcrio deste conjunto de genes.
O segmento que compreende os genes mais a regio promotor/operador
denominado operon.
38

Proteinas Reguladoras da
Transcrio

Mecanismos de Regulao da Traduo

Repressor combina-se ao operador

competio

Repressor inibe o sitio de ligao do ativador

41

Operon Lactose
Genes estruturais
lac z, lac y, & lac a
Promotor
mRNA polignico

Gene regulador
Repressor

Operador
Operon
Indutor - lactose

Regulatory
Gene

Operon
p

DNA
m-RNA

Protein
-Galactosidase
Transacetylase
Permease

42

Operon Lactose
Absence of lactose

Indutor - lactose

Ausncia

Active
No lac mRNA

Represso ativa
sem expresso

Presena
Inativao do
repressor
Expresso

Presence of lactose
i

Inactive

-Galactosidase

Permease Transacetylase

43

44

45

46

O repressor pode controlar mais que uma proteina

Alolactose

lac operon
o ativador altera a forma do inibidor
o repressor no mais combina-se ao operador

47

Genes Repressveis Modelo Operon

Definio: Genes cuja expresso reprimida
pela presena de alguma substncia (corepressor)
Triptofano reprime os genes trp

Vias de biossntese
Co-repressor tipicamente um produto final de
uma via metablica
48

Repressor Triptofano

Modelo Repressor

Mecanismo do Triptofano

Operon Triptofano
Genes Estruturais
trp E, trpD, trpC
trpB & trpA
Promotor comum
Gene Regulador
Apo-Repressor

Regulatory
Gene

Operon
P

Inativo

Operador
Lider
Operon
Co-repressor
Triptofano

Inactive repressor
(apo-repressor)

5 Proteins

52

Operon Triptofano
Absence of Tryptophan

Co-repressor -triptofano

Ausncia de triptofano
Expresso de genes

Presena de triptofano

Inactive repressor
(apo-repressor)

5 Proteins

Ativa o repressor
Ausncia de expresso

Presence of Tryptophan

Controle Negativo

No trp mRNA
Inactive repressor
(apo-repressor)

Trp
(co-repressor)

53

Regulao da transcrio
Inibidores
Gene repressor

Gene controlado
Proteina ativa
Expresso negativa

Gene ativador

Gene controlado
Proteina ativa
Expresso

54

Traduo em bactrias
Aminoacil-tRNA sintetases

Interao do tRNA com a enzima aminoacil tRNA sintetase

As enzimas aminoacil tRNA sintetases so responsveis pela ligao correta de

cada aminocido a seu tRNA correspondente.
Em E. coli existe uma amino acil tRNA sintetase, pelo menos, para cada um dos
20 tipos de aminocidos (p. ex., arginil t-RNA sintetase - ArgRS, leucil t-RNA
sintetase - LeuRS, etc).
55

Traduo em bactrias
cdigo gentico - cdons

Molecula RNAtransportador

Estrutura RNAt ao codon

Aminocido ao tRNA especfico

Para carregar um tRNA especfico com o aminocido correto so necessrias duas
reaes consecutivas, catalisadas pela mesma aminoacil t-RNA sintetase, utilizando-se
energia de hidrlise de uma molcula de ATP:
ativao do aminocido ao reagir com ATP, gerando aminoacil adenilato (aminoacil-AMP)
+ PPi
ligao do aminoacil-AMP ao tRNA, gerando aminoacil-tRNA + AMP.

59

Aminocido ao tRNA especfico

60

Ativao do RNAt

Incorporao do aa ao RNAt

Ribossomos

Subunid. grande, 50S

Massa: 1590 kDa
RNAs: 23S e 5S
Protenas: 31

Subunid. pequena, 30S

Massa: 930 kDa
RNA: 16S
Protenas: 21

Ribossomo, 70s
Massa: 2520 kDa
RNAs: 23S, 16S, 5S
Protenas: 52

A subunidade pequena combina-se com a subunidade grande formando o ribossomo

completo (70S)

63

Estgios da traduo
1. Iniciao
2. Alongamento

3. Terminao

64

Iniciao
Implica na ativao do aminocido iniciador.
O aminocido iniciador a metionina
codon AUG

Estruturas da Metionina e N-formil metionina. Em vermelho, o grupo formil,

Formando o complexo de iniciao de traduo combinado ao ribossomo.

65

Complexo de iniciao da traduo

IF3

IF1

IF2

Iniciao da sntese protica em E. coli.

66

Ligao do
RNAt ao
ribossomo

Alongamento da cadeia de aminocidos

Ciclo de alongamento nos ribossomos de E. coli

EF-Tu, EF-Ts e EF-G: fator de alongamento

EF-Tu: GTPase, energia liberada permite o pareamento do
cdon ao anticdon
EF-Ts: substitui GDP por GTP (restaurando)
EF-G: libera o tRNA descarregado

68

Traduo do
RNAm

Terminao da cadeia de aminocidos

Release factors (RF)

RF3-GTP +RF1 combinam-se

no sitio A

Liberao
do peptidio

Transferncia de peptidil-tRNA
para a agua

Terminao da traduo em E. coli

RF1 reconhece os cdons de terminao UAA e UAG. RF2
reconhece UAA e UGA.

70

Polissomos

1 ribossomo:80 nucleotideos

Sntese protica em um polissomo

O RNAm ocupado por vrios ribossomos. Cada um sintetiza uma
cadeia polipeptdica completa, conforme vai deslizando sobre a molcula
de mRNA.
71

Chaperones moleculares

Permitem que os polipeptdios recm-sintetizados adquiram

sua estrutura final ativa.
72