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Exprience # 6

Sparation dun mlange par chromatographie sur colonne :


Les pigments de plantes vertes
1. But
Le but de lexprience consiste sparer diffrents composs que lon retrouve dans les
vgtaux par chromatographie sur colo nne. La sparation est caractrise par la va riation
de l indice de rfraction et les composs spars sont tudis par diffrents moyens
physiques. Nous pourrons ainsi en identifier quelques-uns.

2. Thorie
La chromatographie est une technique utilise pour sparer les constituants dun mlange
et pour purifier des substances. Bien que cette technique ait t dveloppe lorigine
pour sparer des substances colores (do le nom, Chroma (grec signifie couleur)), la
chromatographie est de nos jours utilise pour sparer tous les types de substances, y
compris celles qui sont incolores. Il faut donc employer une technique de rvlation
efficace pour observer les composs (UV, indice de rfraction, ractif complmentaire,
masse aprs vaporation de lluant).
Le principe de base de la technique de chromatographie rside dans la diffrence
daffinit dun solut envers une phase stationnaire (ladsorbant) et une phase mobile
(lluant). videmment, ces phases ne doivent pas ragir chimiquement lune avec
lautre. Au contact de ces deux phases, un solut sera spar des autres soluts selon sa
plus ou moins grande affinit pour ces phases.
Comme nous lavons dj vu dans le cadre du cours lments de chimie organique, il
existe plusieurs mthode de chromatographie. Celle qui nous intressera ici sera la
chromatographie sur colonne. Le principe gnral est similaire celui de la CCM la
diffrence prs que lon peut sparer une plus grande quantit dun compos. Le temps
requis est toutefois relativeme nt long pour effectuer une sparation adquate.
La chromatographie sur colonne permet de sparer pratique ment tous les mlanges
possibles. Il suffit de trouver les bonnes conditions (phase mobile et phase stationnaire).
Il nexiste pas de rgles dfinies pour trouver ces conditions. La mthode est donc une
mthode passablement empirique dessais et erreurs.
Dans un premier temps, il faut trouver un solvant qui parvient dissoudre tous les
constituants du mlange dans le cas ou ce dernier est ltat solide. La quantit de
solvant requise doit-tre minimale. Ce solvant pourra souvent tre utilis comme luant
(phase mobile). Si le solvant de dilution nest pas le mme que la phase mobile, il devra
avoir un faible pouvoir dlution. Le mlange pourra tre dpos la surface dune
colonne de ladsorbant que lon a choisi. Les adsorbants les plus communs sont le gel de
silice et lalumine. Ces deux adsorbants sont considrs polaires (SiO2 et Al2 O3 ).
Denys Grandbois, professeur
Collge Shawinigan, dpt. Chimie

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Lorsque lon travaille en phase normale, l adsorbant est polaire. Lluant est donc choisi
en fonction de la polarit des espces spares. Il sera ncessaire de trouver un luant
polaire pour pouvoir luer une espce polaire. En phase inverse, la phase stationnaire est
non polaire (un substrat non-pola ire est fix la surface de billes de verre de trs petit
diamtre). Le pouvoir dlution des diffrents solvants est donc invers. Les critres qui
permettent de choisir lluant sont:
Tableau # 1 Attractivit pour une phase stationnaire polaire

Fortement retenus
Acides carboxyliques et amines
Alcools
Aldhydes, ctones et esters
thers
Hydrocarbures aromatiques et halognures aromatiques
Alcnes et alcynes
Halognures et hydrocarbures saturs
Peu retenus

Tableau # 2 Pouvoir dlution de solvants sur un adsorbant polaire

Pouvoir lev (luant polaire)


Acides organiques (solution aqueuse)
Eau
Mthanol > thanol > propanol
Actone
Actate dthyle
ther
Dichloromthane
Tolune
Cyclohexane
Hexane
ther de ptrole
Pouvoir faible (luant peu polaire)

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Le montage utilis est illustr la figure 1.

Figure 1. Montage pour effectuer la chromatographie sur colonne


La technique sera applique pour sparer un mlange de composs retrouvs dans les
vgtaux. Comme nous ne sommes pas assurs de la coloration de ces derniers, nous en
profiterons pour caractriser la chromatographie en bauchant un chromatogramme qui
reprsentera lvolution de l indice de rfraction diffrents volumes dlution. Nous
baucherons aussi le chromatogramme en suivant lvolution de la masse spare. Pour
parvenir nos fins, nous sparerons le volume lu en plusieurs fractions. Une partie sera
utilise pour mesurer lindice de rfraction (avec la plus petite quantit possible) et le
reste sera vapor et pes.
Les composs que nous devrions retrouver sont : La chlorophylle a, la chlorophylle b, les
carotnes, la phophytine (complexe similaire aux chlorophylles avec le cuivre au lieu du
magnsium) et le xanthophylle. Il sera trs intressant de trouver les proprits de ces
composs avant dentreprendre le laboratoire.

Denys Grandbois, professeur


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3. Mode opratoire
3.1 Extraction des pigments
1. Pesez environ 10 g du vgtal analys et transfrez le tout dans un mortier.
2. Ajoutez 8 mL dactone et broyez en mlangeant le tout avec un pilon.
3. Ajoutez 4 mL dhexane et broyez encore.
4. Filtrez le tout sous vide. Rincez avec un peu dactone suivie deau distille.
5. Transfrez le filtrat dans une petite ampoule dcanter. Si les feuilles de la plante
sont encore colores, rptez les tapes 2 4 avec des quantits moindres des
solva nts. Combinez les filtrats. On peut ngliger le reste de couleur sur les feuilles de
la plante si le travail effectu nest pas quantitatif
6. Ajoutez 10 mL deau distille et agitez trs doucement. Dcantez et conservez la
phase colore (dans lhexane).
7. Lavez encore cette phase colore avec de leau distille. Si vous nobservez pas deux
phases, cest que vous avez conserv la mauvaise phase ltape prcdente J.
8. Asschez la phase organique avec un agent desschant appropri.
9. Transfrez la phase assche dans un petit erlenmeyer et concentrez le mlange sur
un plaque chauffante sous une hotte. Attention de ne pas surchauffer. Nous voulons
viter la dcomposition thermique de notre extrait.
3.2 Sparation par chromatographie
1. Procurez-vous au moins 10 prouvettes propres et identiques. Graduez- la 2 mL.
Rptez la graduation sur chaque prouvette.
2. Effectuez un montage tel quillustr la figure 1 en prvoyant que le volume
dlution sera collect dans des prouvettes (ajustez votre hauteur et prvoyez de
lespace pour changer rgulirement dprouvette). Insrez un morceau de laine de
verre au fond de la colonne et versez environ 1 cm de sable au-dessus. La surface de
sable doit tre horizontale.
3. Pesez environ entre 10 et 15 gramme dalumine dans un bcher de 100 mL (aucune
prcision requise, le seul but est de remplir la colonne sur une hauteur de prs de 15
cm et dviter de gaspiller une grande quantit de lagent adsorbant). Ajoutez
graduellement de lluant en agitant constamment. Le but est de produire une
suspension aussi homogne que possible de la phase stationnaire dans la phase mobile
(7 parties dhexane pour 3 parties dactone).
4. En agitant constamment, versez la suspension dans la colonne (la valve est ferme
ce moment). Si une grande quantit na pu tre transfre, ajoutez encore un peu
dluant au bcher et ajoutez le tout. Le remplissage de la colonne doit se faire aussi
rapidement que possible pour viter de devoir rajouter de l luant. videmment, la
suspension doit tre aussi homogne que possible avant de commencer emplir la
colonne une belle bouette . Il nest pas trs grave de renverser un peu du mlange
htrogne si la colonne dborde (vous devrez nettoyer J).
5. Lorsque ladsorbant sest dpos, tapotez la colonne avec un crayon et ajoutez une
couche de sable de 1 cm au haut de la colonne. Commencez laisser couler
lluant dans un contenant quelconque. Ayez toujours de lluant porte de main
afin de vous assurer que la colonne ne soit jamais expose lair. Il est IMPRATIF
que la colonne soit homogne et quelle ne craque pas en aucun point. Essayez de

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remarquer la vitesse de coule (dlution) et de lajuster un dbit qui nest pas trop
rapide.
6. Lorsque le niveau dluant est prs de la surface de ladsorbant et du lit de sable,
fermez la valve et ajoutez votre solution extraite en 3.1 laide dune pipette pasteur
long bec (notez la quantit approximative ajoute, 1 cm (de colonne) = 1 cm). Le
but est dviter dclabousser les parois de la colonne.
7. Ajoutez votre premire prouvette (num rote #1) au bas de la colonne. Ouvrez la
valve nouveau et laissez pntrer votre chantillon. Vous pouvez rincer les parois
doucement avec lluant que vous laissez couler sur la paroi de la colonne. Noubliez
pas que la surface de la colonne ne doit JAMAIS tre expose lair.
8. Lorsque tout lchantillon est pntr dans la colonne (ou quil en reste trs peu la
surface), continuez ajouter lluant. Il est alors convenable dlever le niveau de
lluant plusieurs centimtres au dessus du lit de sable afin dviter doublier
dajouter constamment lluant.
9. Observez si possible la colonne laide dune lampe UV tout au long de la
progression de llution. (Nous voulons voir si certains composs seraient visible
avec la lumire ultraviolette et non lil nu).
10. Lorsque la marque (2 mL) est atteinte dans la premire prouvette, remplacez- la par
la seconde. Soyez assur de ne jamais manquer dluant en tte de colonne. Ds que
vous aurez le temps, allez mesurer labsorbance la ou aux longueur(s) donde
choisies. Observez encore la colonne avec la lampe UV si le temps vous le permet.
11. Lorsque la marque de lprouvette # est atteinte, rempla cez par lprouvette 3, 4,
5 Notez encore lindice de rfraction pour chaque portion de 2 mL. Observez la
lampe UV Mesurez labsorbance
12. Lorsque lexprience est termine, vaporez le solvant des prouvettes qui
contiennent une grande quantit dextraits. Utilisez une plaque chauffante et un bain
marie sous une hotte et soyez prudents.
13. Si possible dterminez le point de fusion des diffrents composs isols.
14. Si le temps le permet (dpendamment de votre sens de lorganisation), reproduisez
lexprience sur une couche mince en utilisant votre extrait initial et sur des points
spars, vos composs isols.

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4. Cahier de laboratoire
1. Titre de lexprience
2. But
3. Rsum des manipulations sous la forme dun organigramme
- Ajoutez le shma du montage ainsi que les tableaux qui vous aideraient
trouver le bon luant et la bonne phase stationnaire.
4. Donnes et observations

5. Rapport de laboratoire
1. Page titre
2. Donnes et observations (4,0 pts)
- Rsumez ltape dextraction en ajoutant et en expliquant vos
observations.
- Rsumez les proprits des substances que vous prvoyez retrouver
dans le mlange.
- Notez toutes vos donnes et observations (Notamment la couleur des
fractions, labsorbance la choisie en fonction du volume dlution
total, le point de fusion de chaque fraction, la chromatographie sur
couche mince).
3. Rsultats et commentaires (6,0 pts)
*** La qualit est value***
- Ralisez un chromatogramme en portant labsorbance mesure en
fonction du volume total dlution (trouvez un titre plus convenable).
Identifiez aussi la couleur et la nature (quel compos) de chaque
fraction sur le graphique.
- Identifiez chaque composant en spcifiant son volume dlution.
Expliquez votre raisonnement immdiatement aprs lidentification du
compos.
- Classez les composs identifis en ordre de polarit croissante et
expliquez votre raisonnement en vous appuyant sur les polarits des
phases mobile et stationnaire ainsi que sur la structure molculaire.
- Commentez vos rsultats (chromatogramme, qualit de sparation,
dtection)
- Proposez quelques composs qui seraient rests dans la phase aqueuse
lors de lextraction. Justifiez.

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