Relatrio de Bioqumica

Pratica II: Cintica Enzimtica

Discentes:
Andr Yabuuti RA. 121040429
Guilherme A. Tassi Ricardo RA. 121040259
Vitor Kenji Suda RA. 121041761

Docente:
Prof. Dr. Eduardo Alves de Almeida

1. RESULTADOS E DISCUSSO
1.1 Obteno da reta de calibrao atravs da glicose
Com os resultados obtidos atravs da leitura da absorbncia no espectrofotmetro, foi
montada a seguinte tabela:
Tabela 1 Resultados da absorbncia nos tubos para a reta de calibrao utilizando a glicose

Tubos
Branco
1
2
3
4
5

[Glicose] (M)
0
200
400
600
800
1000

Absorbncia em 540 nm
0
0,273
0,566
0,784
1,073
1,342

Para o clculo de transformao da concentrao da glicose para micro moles, foi

utilizada a seguinte equao, onde C1 a concentrao da soluo de glicose final V1 o
volume total da soluo, C2 concentrao da soluo de glicose inicial e V 2 o volume de
glicose:
C1 * V1 = C2 * V2

(1)

Utilizando a equao 1, observa-se os resultados obtidos na tabela 1 na concentrao

de glicose:
Tubo 1: C1 x 10 mL = 0,01 M x 0,2 mL C1 = 2 x 10-4 M C1 = 200 M
Tubo 2: C1 x 10 mL = 0,01 M x 0,4 mL C1 = 4 x 10-4 M C1 = 400 M
Tubo 3: C1 x 10 mL = 0,01 M x 0,6 mL C1 = 6 x 10-4 M C1 = 600 M
Tubo 4: C1 x 10 mL = 0,01 M x 0,8 mL C1 = 8 x 10-4 M C1 = 800 M
Tubo 5: C1 x 10 mL = 0,01 M x 1,0 mL C1 = 1 x 10-3 M C1 = 1000 M
Utilizando a tabela 1, foi construdo o grfico da reta de calibrao que permite a
transformao dos valores de absorbncia em concentrao de acares redutores liberados:

Figura 1 Grfico da reta de calibrao utilizando a glicose.

Absorbncia em 540 nm
Regressao linear da reta

1,5

Absorbncia em 540 nm

1,2

0,9

0,6

0,3

0,0

-200

200

400

600

800

1000

1200

Concentraao da glicose (mM)

Este grfico possui extrema importncia, pois com a ajuda do grfico de curva padro
pode-se transformar o valor de absorbncia obtido na concentrao do produto formado
utilizando a seguinte equao:
[Acar redutor] = Absorbncia em 540 nm / (inclinao da reta * 5)

(2)

1.2 Propriedades catalticas da invertase

1.2.1 Anlise da concentrao da enzima
Para fazer esta anlise utilizaram-se os resultados de absorbncia obtidos na tabela a
seguir:
Tabela 2 Absorbncia das solues em diferentes volumes

Tubos
Branco
1
2
3
4

Volume da enzima (mL)

0
0,2
0,3
0,4
0,5

Absorbncia em 540 nm
0
0,270
0,456
0,560
0,716

Para o clculo da velocidade inicial (V0) primeiramente utilizada a equao 2 e

feito a clculo da concentrao do produto da reao:
Tubo 1: [acar redutor] = 0,270 / (0,00133 * 5) [acar redutor] = 40,60 M
Tubo 2: [acar redutor] = 0,456 / (0,00133 * 5) [acar redutor] = 68,57 M
Tubo 3: [acar redutor] = 0,560 / (0,00133 * 5) [acar redutor] = 84,21 M
Tubo 4: [acar redutor] = 0,716 / (0,00133 * 5) [acar redutor] = 107,67 M
Para o clculo da velocidade necessrio dividir a concentrao do produto obtido
pelo tempo de incubao (5 minutos) e com isso obtido quantidade de produto liberado
por minuto correspondente a sigla U.
Tubo 1: Produtos liberado por minuto = 40,60 M / 5 minutos 8,12 U (M / min)
Tubo 2: Produtos liberado por minuto = 68,57 M / 5 minutos 13,71 U (M / min)
Tubo 3: Produtos liberado por minuto = 84,21 M / 5 minutos 16,84 U (M / min)
Tubo 4: Produtos liberado por minuto = 107,67 M / 5 minutos 21,53 U (M / min)
Com esses resultados foi construdo um grfico para determinar o efeito que a
concentrao da enzima causa na velocidade de formao do acar formado.
Figura 2 Grfico da velocidade de formao do acar em funo do volume de enzima.

possvel observar que quanto maior o volume de enzima colocado, mais micro
moles de produto so formados. Isso ocorre, pois na medida em que a concentrao da enzima
aumenta, aumenta a quebra de ligaes peptdicas do substrato e isso leva a formao de mais
acares redutores (maior concentrao).

1.2.2 Velocidade enzimtica versus temperatura

Para verificar o efeito que a temperatura exerce sobre a velocidade de reao, foram
preparados tubos em diferentes condies de temperatura que podem ser observados na tabela
abaixo:
Tabela 3 Absorbncia das solues em diferentes temperaturas

Tubo
Branco
1
2
3
4

Temperatura (C)
~
0
24
60
90

Absorbncia em 540 nm
0
0,168
0,664
1,650
0,096

Para o clculo da velocidade de formao do produto por minuto, foi utilizado os

mesmos clculos da parte 1.2.1:
Tubo 1: [acar redutor] = 0,168 / (0,00133 * 5) [acar redutor] = 25,26 M
Tubo 2: [acar redutor] = 0,664 / (0,00133 * 5) [acar redutor] = 99,85 M
Tubo 3: [acar redutor] = 1,650 / (0,00133 * 5) [acar redutor] = 248,12 M
Tubo 4: [acar redutor] = 0,096 / (0,00133 * 5) [acar redutor] = 14,44 M
Para o clculo da velocidade:
Tubo 1: A.E = 25,26 M / 5 minutos 5,05 U (M / min)
Tubo 2: A.E = 99,85 M / 5 minutos 19,97 U (M / min)
Tubo 3: A.E = 248,12 M / 5 minutos 49,62 U (M / min)
Tubo 4: A.E = 14,44 M / 5 minutos 2,88 U (M / min)
Com esses valores foi construdo um grfico para verificar o efeito da temperatura
sobre a velocidade da reao:
Figura 3 Grfico da temperatura em funo da velocidade da reao.

 possvel verificar no grfico que a temperatura um fator importante na atividade

enzimtica. Em temperaturas baixas, perto de 0C, a formao de acares redutores muito
baixa devido enzima se encontrar em um estado inativo e temperaturas elevadas, perto de
100C, a formao de acares redutores muito baixa devido perda da estrutura pela
desnaturao da enzima.
Tambm atravs do grfico da figura 3, pode-se concluir que a temperatura tima da
enzima aproximadamente 60C e sua velocidade mxima aproximadamente 50 U.

1.2.3 Determinao de Vmax e Km da invertase

Para fazer essa determinao necessrio fazer alguns clculos para facilitar a
montagem dos grficos.
Na tabela abaixo observa-se as absorbncias obtidas das leituras das solues:
Tabela 4 - Absorbncia obtida nas solues para determinao de Vmax e Km.

Tubo
Branco
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Absorbncia em 540 nm
0
0,317
0,468
0,589
0,623
0,637
0,649
0,658
0,687
0,653

Para o clculo da velocidade utiliza-se o mesmo clculo das partes 1.2.1 e 1.2.2
(equao 2):
6

Tubo 1: [acar redutor] = 0,317 / (0,00133 * 5) [acar redutor] = 47,67 M

Tubo 2: [acar redutor] = 0,468 / (0,00133 * 5) [acar redutor] = 69,47 M
Tubo 3: [acar redutor] = 0,589 / (0,00133 * 5) [acar redutor] = 88,57 M
Tubo 4: [acar redutor] = 0,623 / (0,00133 * 5) [acar redutor] = 93,68 M
Tubo 5: [acar redutor] = 0,637 / (0,00133 * 5) [acar redutor] = 95,79 M
Tubo 6: [acar redutor] = 0,649 / (0,00133 * 5) [acar redutor] = 97,59 M
Tubo 7: [acar redutor] = 0,658 / (0,00133 * 5) [acar redutor] = 98,95 M
Tubo 8: [acar redutor] = 0,687 / (0,00133 * 5) [acar redutor] = 103,31 M
Tubo 9: [acar redutor] = 0,653 / (0,00133 * 5) [acar redutor] = 98,20 M
Para o clculo da velocidade:
Tubo 1: A.E = 47,67 M / 5 minutos 9,53 U (M / min)
Tubo 2: A.E = 69,47 M / 5 minutos 13,89 U (M / min)
Tubo 3: A.E = 88,57 M / 5 minutos 17,71 U (M / min)
Tubo 4: A.E = 93,68 M / 5 minutos 18,74 U (M / min)
Tubo 5: A.E = 95,79 M / 5 minutos 19,16 U (M / min)
Tubo 6: A.E = 97,59 M / 5 minutos 19,52 U (M / min)
Tubo 7: A.E = 98,95 M / 5 minutos 19,79 U (M / min)
Tubo 8: A.E = 103,31 M / 5 minutos 20,66 U (M / min)
Tubo 9: A.E = 98,20 M / 5 minutos 19,64 U (M / min)
Para o clculo da concentrao da sacarose foi utilizada a equao 1, onde C 1 a
concentrao da soluo de sacarose final V1 o volume total da soluo, C2 concentrao da
soluo de sacarose inicial e V2 o volume de glicose: :
Tubo 1: C1 x 10 mL = 0,3 M x 0,1 mL C1 = 3 x 10-3 M C1 = 3000 M
Tubo 2: C1 x 10 mL = 0,3 M x 0,2 mL C1 = 6 x 10-3 M C1 = 6000 M
Tubo 3: C1 x 10 mL = 0,3 M x 0,3 mL C1 = 9 x 10-3 M C1 = 9000 M
Tubo 4: C1 x 10 mL = 0,3 M x 0,4 mL C1 = 12 x 10-3 M C1 = 12000 M
Tubo 5: C1 x 10 mL = 0,3 M x 0,5 mL C1 = 15 x 10-3 M C1 = 15000 M
Tubo 6: C1 x 10 mL = 0,3 M x 0,6 mL C1 = 18 x 10-3 M C1 = 18000 M
Tubo 7: C1 x 10 mL = 0,3 M x 0,7 mL C1 = 21 x 10-3 M C1 = 21000 M
Tubo 8: C1 x 10 mL = 0,3 M x 0,8 mL C1 = 24 x 10-3 M C1 = 24000 M
Tubo 9: C1 x 10 mL = 0,3 M x 1,0 mL C1 = 3 x 10-2 M C1 = 30000 M

Os resultados obtidos nos clculos podem ser observados na tabela abaixo:

7

Tabela 5 Absorbncia obtida nas solues para determinao de Vmax e Km.

Tubo
Branco
1
2
3
4
5
6
7
8
9

A.E (M / min)
0
9,53
13,89
17,71
18,74
19,16
19,52
19,79
20,66
19,64

[Sacarose] (M)
~
3000
6000
9000
12000
15000
18000
21000
24000
30000

Com esses dados possvel construir o grfico hiperblico de Michaelis-Menten, nele

pode-se encontrar a Vmax e o Km. Porm, eles sero determinados no grfico de HanesWoolf.
Figura 4 Grfico de Michaelis-Menten.

Para a construo do grfico linear de Hanes-Woolf necessrio utilizar a equao

abaixo para um dos eixos:
[Sacarose] / Velocidade

(3)

Utilizando a equao 3, foi construda a tabela abaixo para facilitar a construo do

grfico:
8

Tabela 6 Dados para a montagem do grfico de Hanes-Woolf.

Tubo
Branco
1
2
3
4
5
6
7
8
9

[Sacarose] / Velocidade
(min)
0
314,79
431,96
508,19
640,45
782,88
922,13
1061,14
1161,67
1527,50

[Sacarose] (M)
~
3000
6000
9000
12000
15000
18000
21000
24000
30000

Figura 5 Grfico linear de Hanes-Woolf.

Observando a figura 5, pode-se utilizar a equao da reta para calcular os parmetros

Vmax e Km nas seguintes equaes:

Interseco eixo X = - Km
m = 1 / Vmx
Interseco eixo y = Km / Vmx

(4)
(5)
(6)

obtido ento fazendo o uso da equao da reta e depois das equaes 4,5 e 6:
0 = 0,04422 x + 138,7423 Interseco eixo x = - 3137,55 Km = 3137,55 M
9

0,04422 = 1 / Vmx Vmx = 22,62 M / min

y = 138,7423 138,7423 = 3137,55 / Vmx Vmx = 22,62 M / min
Portanto, o resultado foi que Vmx corresponde a 22,62 M / min e que o Km
corresponde a 3137,55 M.
2. Concluso
Pde-se verificar que a velocidade da reao enzimtica est relacionada com a
concentrao do substrato que quanto maior a concentrao maior ser a velocidade da
reao, e que atravs da equao de Michaelis-Menten possvel descrever o comportamento
cintico de grande maioria das enzimas.
Km uma medida da afinidade da enzima pelo substrato. Estabelecendo-se os
seguintes parmetros: Km ALTO = BAIXA afinidade e Km BAIXO = ALTA afinidade,
conclumos ento que houve uma baixa afinidade da enzima pelo substrato.
3. Referncias Bibliogrficas
I)
Lehninger, A.L.; Nelson, D. L.; Cox, M. M. Princpios de Bioqumica. So
Paulo: Sarvier, 1995
II)

Campbell, Mary K. Bioqumica. 3 ed. Porto Alegre : Artmed editora, 2000.

10