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Ps-Graduao em Fsica
Orientador:
Co-orientadoras:
Orientador:
Co-orientadoras:
III
IV
Agradecimentos
Esta dissertao o resultado de um verdadeiro trabalho em equipe, que
no seria possvel sem a importante colaborao de algumas pessoas,
agradeo em especial:
Primeiramente a Deus, por mais esta bno alcanada, e pelo conforto
encontrado nas oraes durante os momentos difceis.
Ao meu orientador, professor Dr. Mauro Luciano Baesso, por quem
aprendi a ter imensa admirao. Sou muito grato por sua pacincia, estmulo,
conhecimento adquirido e principalmente pela confiana em meu trabalho.
A minha co-orientadora professora Dra. Eneri Vieira de Souza L. Mello,
do Departamento de Cincias Morfolgicas (UEM), ao professor Dr. Joo
Carlos Palazzo de Mello, do Departamento de Farmcia (UEM), e doutoranda
Fernanda Bueno, parceiros no estudo da cicatrizao de feridas.
minha co-orientadora, professora Dr. Luzmarina Hernandes, do
Departamento de Cincias Morfolgicas (UEM), a Professora Dra. Terezinha
Inez Estivalet Svidzinski, do Departamento de Anlises Clnicas e Biomedicina
(UEM), e mestre Edilaine Martins Moratto, parceiras no trabalho com
Paracoccidiodes brasiliensis. Agradeo por todo conhecimento adquirido
durante este tempo de convvio e sobretudo pelo crdito depositado em mim e
pela afetuosa ateno.
professora Dr. Francielle Sato, por toda ajuda, tanto nos experimentos
quanto pela valiosa ateno e discusses. Jamais me esquecerei de todo esse
carinho e amizade.
Aos amigos e amigas: Ana Claudia, Giselly, Gustavo, Marcelo, Marcel,
Rogrio, Jos Renato e Vitor, pela ajuda, companheirismo e apoio;
Aos Professores do Mestrado, por todo conhecimento e ensinamento.
Obrigado pela pacincia e disponibilidade para ensinar.
Aos Professores do GEFF, pela colaborao, sugestes e importantes
discusses.
A todos os funcionrios do DFI-UEM, e em especial Akiko;
Capes, CNPq, FINEP, Fundao Araucria e UEM pelo apoio
financeiro.
VI
Resumo
Neste trabalho a Espectroscopia Fotoacstica (PAS) foi empregada na
realizao de dois estudos: no primeiro, utilizando-se as regies espectrais do
ultravioleta e do visvel, para a determinao ex-vivo, em feridas cutneas de
ratos, da taxa de difuso de uma frmula farmacutica gel, na qual foi
incorporado o extrato bruto a 1% obtido de cascas de Caesalpinia
peltophoroides Benth (sibipiruna), para estudo de sua ao cicatrizante; no
segundo estudo, a tcnica de espectroscopia fotoacstica de infravermelho com
transformada de Fourier (photoacoustic spectroscopy of the Fourier transform
infrared FTIR-PAS), foi empregada para a determinao ex-vivo das
mudanas
estruturais
no
pulmo
de
camundongos
infectados
por
Em concluso, os resultados
VII
Abstract
In this work, the Photoacoustic Spectroscopy (PAS) was applied for two different
studies: First, using the UV-Vis spectral region, to determine ex vivo, in rats
cutaneous wound, the diffusion rate of a pharmaceutical gel, in which a 1% of
extract of Caesalpinia peltophoroides Benth skin was incorporated, to study its
healing properties; next, the technique in the infrared with Fourier transform set
up and photoacoustic detection (FTIR-PAS) was employed for ex-vivo
determination of tissue structural changes of infected Swiss mouse lungs with
Paracoccidiodes brasiliensis (Pb). The first study was performed in induced
wounds in rats Wistar after 4, 7, 10 e 14 days of treatment with the gel of C.
peltophoroides. In the second study, Swiss mouse lungs were infected with a
strain of the Pb18. The infected lungs were investigated after 1, 2, 4 and 8
weeks of infection. The results of the first study showed that the C.
peltophoroides formulation diffusion rate was dependent on the wound healing
stages. The technique was able to demonstrate the penetration of the C.
peltophoroides gel in induced wounds in different stages of the healing. The
higher penetration rate occurred at the 10o day of treatment, period in which an
increase in the meta-hemoglobin optical absorption bands was also observed. In
the second study, the physico-chemical evaluation showed that the infected
lungs with Pb presented significant changes in the optical absorption bands of
the functional groups amide I, CH3 and phosphate, and that the changes in the
optical absorption bands occurred as a consequence of morphological
alterations in the infected lungs. In conclusion, the results of this work showed
once again that the photoacoustic spectroscopy is a technique useful to
determine the diffusion of formulations in biological systems, allowing to
perform, specially in cutaneous wound, a correlation between the diffusion rate
with the biological events in the healing processes. The FTIR-PAS technique
showed potential for physico-chemical alterations studies in biological systems
without the need of using chemical reagents and sample manipulation,
suggesting that this method is promising for the study of the processes involved
in cellular apoptosis.
Sumrio
Resumo ......................................................................................................................... VI
Abstract ............................................................................................................... VII
1.
Introduo .....................................................................................................9
1.1
Objetivos ............................................................................................................ 11
2.
2.1
2.2
Espectroscopia Fotoacstica.........................................................................14
Vibraes moleculares.................................................................................................. 22
3.
4.1
Concluses .................................................................................................60
Referncias .................................................................................................................. 60
ANEXO I ...............................................................................................................74
1. Introduo
Embora seja conhecida h mais de 30 anos como uma tcnica que apresenta
caractersticas especiais para estudos em sistemas biolgicos in vivo, ex vivo ou in
vitro
[1]
[3]
[5]
. Isto vem
para
diagnstico
clnico,
pois
possibilita
identificar
alteraes
10
[7]
[8-15]
. A
[16-[
[19]
[22-23]
[25-26]
. As manifestaes clnicas
11
[28-30]
. O uso da fotoacstica no
infravermelho parece ser promissor neste estudo, uma vez que os espectros de
absoro podem fornecer informaes sobre as mudanas conformacionais em
molculas que constituem o parnquima pulmonar.
1.1 Objetivos
Os objetivos deste trabalho so:
12
Espectroscopia ptica
Sir Isaac Newton (1643-1727), foi um dos pioneiros da espectroscopia
ptica. Embora tenha se tornado famoso por sua obra das leis da mecnica,
PhilosophiaeNaturalis Principia
publicada em latim em 1687
[31]
Mathematica,
mais
conhecida
por
Principia,
[32]
[7,37]
. Embora no haja uma definio especfica dos limites entre cada regio
13
absoro,
transmisso,
reflexo,
espalhamento,
luminescncia,
[35]
[39]
das molculas a partir da deteco das vibraes ou rotaes que elas apresentam.
Isto obtido, por exemplo, com a tcnica fotoacstica no infravermelho via
14
2.2
Espectroscopia fotoacstica
Figura 2.2. Foto da montagem experimental usada por Graham Bell para avaliar a
transmisso de efeitos sonoros [41].
15
[1,40,42]
[40-41]
16
[42]
amostra at sua intensidade ser atenuada a 1/e (do valor I0 incidente na superfcie)
caracteriza a absoro ptica do material. O parmetro que mede essa penetrao
denominado de comprimento de absoro ptica, l , que definido como: l 1 ,
sendo o coeficiente de absoro ptica do material.
A Figura 2.3 mostra as trs classificaes que uma dada amostra pode
receber em termos do seu comprimento de absoro ptica e de sua espessura, ls .
17
18
D
f
(2.1).
19
importante ressaltar que uma amostra opaca pode ter seu espectro
resolvido, desde que s<l. Na fotoacstica, uma amostra considerada saturada se
toda luz absorvida gera sinal acstico. A saturao pode ser contornada diminuindose as dimenses da amostra (tornando-a no opaca), ou aumentando-se a
frequncia de modulao (o que reduz o valor de s). Isto porque com o aumento da
frequncia o sinal gerado em camadas cada vez mais superficiais. Assim, com a
dependncia do comprimento de difuso trmica, s, em funo da frequncia de
modulao, possvel efetuar uma anlise do perfil de profundidade no material. Ou
seja, possvel obter espectros de absoro ptica das diferentes camadas da
amostra em estudo.
A Figura 2.8 mostra um esboo do perfil de penetrao numa amostra,
ilustrando o que ocorre se a frequncia angular de modulao da luz () for
modificada. As flechas representam as profundidades at onde o sinal PA gerado,
para a respectiva frequncia de modulao. Nesta figura, a frequncia cresce a
partir de 1 at 6. Quanto menor a frequncia de modulao da luz maior ser a
profundidade de gerao do sinal fotoacstico.
O Sinal Fotoacstico
No nosso objetivo neste trabalho apresentar todos os modelos tericos
para a espectroscopia fotoacstica. Mostraremos apenas os aspectos principais do
modelo de difuso trmica para o sinal fotoacstico de Rosencwaig e Gersho.
20
configurao
unidimensional
padro
da
clula
fotoacstica
est
21
Em que
(2.2).
A amplitude e a fase so os principais parmetros em medidas experimentais
com a fotoacstica. A intensidade do sinal depende linearmente da potncia
luminosa e do inverso do comprimento da coluna de gs. O sinal depende ainda do
comprimento de onda utilizado e da frequncia de modulao com que esta radiao
chega at o material a ser estudado. Por outro lado, a fase do sinal fotoacstico
independe da potncia incidente. Ela diferente para cada comprimento de difuso
trmica, s, variando com a profundidade onde h gerao de calor. Alm disso, ela
depende do tempo de relaxao no radiativa de cada centro absorvedor na
amostra, ou seja, pode distinguir absores geradas por diferentes molculas ou
estruturas moleculares nas amostras.
2.3
Espectroscopia no infravermelho
[43-44]
[45]
22
[47-48]
. Esta regio
subdivida em infravermelho prximo (4.000 12.500 cm-1), mdio (400 4.000 cm-1)
e longnquo (10 400 cm-1), ilustrado na Figura 2.11 [46-49].
Vibraes moleculares
Mesmo em um slido em temperaturas prximas do zero absoluto, os tomos
esto em continuas oscilaes em torno de uma posio de equilbrio. As amplitudes
das oscilaes so da ordem de 10-11 a 10-12 metros, enquanto suas frequncias
vibracionais correspondem s regies das radiaes infravermelhas.
As vibraes moleculares podem ser classificadas em dois tipos, vibrao de
deformao axial (stretching) e vibrao de deformao angular (bending), conforme
ilustrado na Figura 2.12. As deformaes axiais ou por estiramento so oscilaes
radiais das distncias entre os ncleos, enquanto que as deformaes angulares
envolvem mudanas nos ngulos entre o plano que contm a ligao e um plano de
referncia. Transies entre os nveis vibracionais podem ocorrer quando houver
mudana do momento dipolar devida variao da distribuio carga ao redor das
ligaes. Isto pode ser observado quando se aplica um campo eltrico no sistema.
Alteraes do momento dipolar
23
centro de massa da molcula e trs para a rotao da mesma em torno de trs eixos
perpendiculares. Logo restariam (3N-6) graus de liberdade para as vibraes [51].
[52]
. Neste modelo a
24
(2.5).
A energia vibracional (
Equao 2.6, na qual
a constante de
Planck.
(2.6).
25
a energia de dissociao,
no tenha unidade.
26
27
[56]
. Extratos da casca de C.
Figura 3.1. (A) Partes areas e (B) tronco de Caesalpinia peltophoroides [60].
3.2
Morfologia da pele
[61]
. Por
28
29
3.3
Fase inflamatria
Injria tecidual inicia uma resposta celular e vascular que limpa a ferida de
tecidos desvitalizados e estranhos e dispara os eventos para a cicatrizao e
regenerao.
A primeira reao do organismo ao trauma a vasoconstrio no local da
ferida, para controlar a hemorragia. Segue-se a vasodilatao com extravasamento
de sangue e formao de um cogulo de fibrina que tampona a leso fornecendo
assim uma matriz provisria para a migrao das clulas responsveis pelo
processo de reparo
[68-70]
[68-60]
[68]
[68]
30
Fase de reepitelizao
O processo de reepitelizao da ferida se inicia imediatamente aps a leso.
Os estgios mais importantes desta etapa compreendem: a) migrao das clulas
atravs da rea danificada; b) proliferao dos queratincitos basais prximas ao
leito da ferida.
Em uma pele normal os queratincitos esto presos na lmina basal por
hemidesmossomos e ligados uns aos outros por desmossomos. No stio da leso,
os hemidesmossomos so desmontados. Aps perderem a inibio por contato as
clulas adjacentes ferida so estimuladas a migrar ao longo da matriz provisria
[68]
.
So propostas duas estratgias diferentes para migrao celular: 1) por um
[66,70-71]
31
[70-71]
Fase de fibroplasia
A migrao e ativao de fibroblastos intensa devido presena de
macrfagos derivados de moncitos e produo e liberao dos mediadores
qumicos produzidos por eles. Com o aumento de fibroblastos ativados para a
sntese de colgeno, inicia-se a fibroplasia. Os fibroblastos so estimulados a migrar
atravs da matriz provisria formada e seguindo a orientao do gradiente qumico
de substncias quimioatraentes
[71-72]
32
Fase de remodelao
A ltima fase a de remodelao ou maturao. Nesta, a estruturao do
novo tecido da cicatriz extensivamente remodelada. medida que a angiognese
supre as necessidades metablicas, a sntese de colgeno comea a decair,
fibroblastos e macrfagos desaparecem e o colgeno excessivo removido
[66]
. Uma
33
Ferida incisional
Epiderme
A - 24 horas ps-leso
Neutrfilos
infiltrando
Derme
Subcutneo
Queratincitos
B Uma semana ps-leso
Processo mittico
Proliferao de clulas
Encurtamento da cicatriz
Restaurao da epiderme
C 6 semanas ps-leso
Fibroblastos
Figura 3.3. Fases de cicatrizao: (A) fase inflamatria, (B) fase proliferativa e (C) fase de
remodelao [73].
3.4
[23]
, que na
[74]
. A
[75]
natureza e onde est registrada a maior taxa de mortalidade por PCM do Sul e
Sudeste, cerca de 3,52 bitos por 1.000.000 de habitantes [75].
34
[77]
3.5
Estrutura do Pulmo
O
[78]
[79]
[80]
cavidade pleural, que contm lquido pleural produzido por estas membranas.
35
36
4.
utilizou-se um molde (punch) de 1 cm para marcar na pele a rea das feridas. Com
auxlio de tesoura realizou-se duas feridas, ou seja, com remoo da epiderme e
derme, como mostra a Figura 4.1.
Vinte e quatro horas aps a realizao das feridas, aquelas do lado esquerdo
receberam uma aplicao diria de uma frmula farmacutica gel contendo 1% de
extrato bruto obtido de cascas de C. peltophoroides. As feridas do lado direito
receberam o gel base sem a adio de extrato.
37
Figura 4.1. a) Feridas realizadas no dorso dos animais e b) punch utilizado para marcao
no dorso.
38
b)
39
40
peroxidase (Chemicon, Temecula CA, EUA). O lobo inferior e mdio direito de cada
pulmo foi encaminhado para anlise por FTIR-PAS.
41
[48]
[82]
[82-84]
42
5. Resultados e discusso
[84]
. Neste estudo
43
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
300
400
500
600
700
800
0,15
0,10
xc1
A1
xc2
A2
xc3
A3
0,05
249
10
295
3
353
2.8
2
1
2
1
1
0.1
0,00
250
300
350
400
450
44
[85]
0,20
0,20
Controle 4 dias
Controle 7 dias
Controle 10 dias
Controle 14 dias
0,15
Tratado 4 dias
Tratado 7 dias
Tratado 10 dias
Tratado 14 dias
Gel de C. peltophoroides
0,15
0,10
0,10
0,05
0,05
0,00
0,00
300
400
500
600
-1
700
800
300
400
500
600
700
Figura 5.3. Espectros de absoro ptica da face epidermal: do lado esquerdo, as amostras
controles com aplicao tpica do gel base; do lado direito, as amostras tratadas com
aplicao tpica do gel de C. peltophoroides. A iluminao foi no lado da epiderme, com a
frequncia de modulao em 22 Hz.
800
45
0,20
0,20
Controle 4 dias
Controle 7 dias
Controle 10 dias
Controle 14 dias
0,15
Tratado 4 dias
Tratado 7 dias
Tratado 10 dias
Tratado 14 dias
Gel de C. peltophoroides
0,15
0,10
0,10
0,05
0,05
0,00
0,00
300
400
500
600
700
800
300
400
500
600
700
800
Figura 5.4. Espectros de absoro ptica da face dermal: lado esquerdo, amostras controles
com aplicao tpica no lado epidermal do gel base; lado esquerdo, amostras tratadas com
aplicao tpica no lado epidermal do gel de C. peltophoroides. A iluminao foi no lado da
derme, com a frequncia de modulao em 22 Hz.
46
0,05
4 dias
7 dias
10 dias
14 dias
0,04
0,03
0,02
0,01
0,00
250
300
350
400
450
500
Figura 5.5. Subtrao dos espectros da face dermal tratada com o gel de C. peltophoroides
pela face dermal controle, que teve aplicao tpica do gel base no lado epidermal.
0,020
4 dias
Ajuste da curva da subtrao
Curva da gaussiana de referncia
0,015
xc1
w1
A1
xc2
w2
A2
xc3
w3
A3
0,010
7 dias
Ajuste da curva da subtrao
Curva da gaussiana de referncia
0,025
297
61
0.8
377
106
0.7
472
21
0.04
0,020
1
2
0.1
6
10
0.1
1
3
0.01
xc1
w1
A1
xc2
w2
A2
xc3
w3
A3
xc4
w4
A4
0,015
0,010
265
30
0.21
288
53
1.47
353
39
0.31
409
46
0.34
2
2
0.02
1
2
0.05
1
3
0.04
1
2
0.02
0,005
0,005
0,000
250
0,000
300
350
400
450
500
0,04
250
300
350
400
450
500
0,03
14 dias
Ajusteda curva da subtrao
Curva da gaussiana de referncia
0,03
xc1
w1
A1
xc2
w2
A2
xc3
w3
A3
0,02
291
38
1.59
331
25
0.15
362
40
0.42
1
1
0.02
1
1
0.02
1
1
0.02
xc1
w1
A1
xc2
w2
A2
xc3
w3
A3
0,02
287
41
1.29
354
47
0.32
422
35
0.22
1
1
0.02
1
2
0.01
1
1
0.01
0,01
0,01
0,00
250
300
350
400
450
500
0,00
250
300
350
400
450
500
Figura 5.6. Curvas da subtrao dos espectros da face dermal tratada com o gel de C.
peltophoroides pela face dermal controle, ajustadas com funes gaussianas.
47
1.4
1.2
rea (u.a)
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
4
10
12
14
Tempo (dias)
48
A anlise estatstica foi realizada pelo teste estatstico ANOVA com *(P<0,05) em relao ao
dados da amostra controle. Medidas realizadas pela doutoranda Fernanda Bueno [60].
[68]
. Segue-se
[68]
49
hipteses podem ser implicadas: a primeira sugere que a formulao tem elevado
poder de permeao; a segunda hiptese sugere que poderia ter ocorrido um atraso
na diferenciao dos queratincitos e consequentemente na queratinizao da
epiderme, permitindo desta forma que o gel permeasse com facilidade por um
perodo maior de tempo; e a terceira sugere uma reduo na vascularizao, o que
provocaria um retardo na absoro sistmica do medicamento que seria detectado
em maior concentrao na regio da ferida.
Pode-se observar na face epidermal (Fig. 5.3), nas amostras tratadas com o
gel de C. peltophoroides e nas amostras com o gel base, a presena de bandas
referentes hemoglobina. A hemoglobina oxigenada, ou oxi-hemoglobina, se
caracteriza pelo estado reduzido ou ferroso (Fe2+) do ferro inserido no grupo heme.
Entretanto, as contnuas reaes metablicas do organismo, entre elas a
cicatrizao, do organismo, liberam produtos qumicos com alto potencial oxidativo,
mudando o ferro da hemoglobina para o estado frrico (Fe3+) e formando a metahemoglobina [86-88].
A oxi-hemoglobina tem absores especficas em 540 e 577 nm, a metahemoglobina tem dois comprimentos de ondas com maior intensidade de absoro
em 500 nm e em 630 nm [87-88].
A figura 5.9 mostra que os espectros das amostras controles e tratadas, aps
quatro dias de tratamento, apresentam trs bandas de absoro ptica de baixa
intensidade, em 540 e 570 nm atribudas oxi-hemoglobina e em 630 nm metahemoglobina.
0.30
0.20
Controle 4 dias
Tratado 4 dias
Controle 4 dias
Tratado 4 dias
0.25
0.20
0.15
0.10
0.15
Duplicata
0.10
0.05
0.05
0.00
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
0.00
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
Figura 5.9. Espectro de absoro ptica da face epidermal controle e da tratada com o gel
de C. peltophoroides aps quatro dias de tratamento. Os espectros do lado direito referemse s duplicatas.
50
[85]
. As
feridas controles e tratadas de 10 dias apresentaram bandas semelhantes de oxihemoglobina com destaque neste perodo, para um aumento na banda de absoro
ptica em 630 nm, da meta-hemoglobina nas feridas tratadas com gel de C.
peltophoroides. Aos 14 dias as bandas de absoro foram menos intensas do que
aos 10 dias. Neste perodo as intensidades para oxi-hemoglobina e metahemoglobina foram maiores nas feridas tratadas com o gel de C. peltophoroides.
A formao de meta-hemoglobina, como dissemos antes, est relacionada
com a oxidao do Fe2+ da oxi-hemoglobina, que passa para Fe3+. A maior presena
de meta-hemoglobina nas feridas tratadas poderia estar relacionada com a
formulao do gel de C. peltophoroides, sendo, provavelmente, induzida pelos
nitratos presentes na planta, que absorve esta substncia do solo, resultando no
processo de nitrificao transformando nitrato em nitrito [89-90].
0.20
Tratada 7 dias
Controle 7 dias
Tratada 7 dias
Controle 7 dias
0.20
0.15
0.10
0.05
0.15
Duplicata
0.10
0.05
0.00
0.00
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
Figura 5.10. Espectro de absoro ptica da face epidermal controle e da tratada com o gel
de C. peltophoroides aps sete dias de tratamento. Os espectros do lado direito referem-se
s duplicatas.
[91]
nitrato, juntamente com transformao da oxi-hemoglobina em hidrxido de metahemoglobina e reduo da gua, conforme a equao:
(5.1)
51
0.25
0.20
Controle 10 dias
Tratado 10 dias
Controle 10 dias
Tratado 10 dias
Sinal Fotoac stico (u.a.)
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
250
Duplicata
0.15
0.10
0.05
0.00
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
250
800
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
Figura 5.11. Espectro de absoro ptica da face epidermal controle e da tratada com o gel
de C. peltophoroides aps 10 dias de tratamento. Os espectros do lado direito referem-se s
duplicatas.
0.25
0.25
Controle 14 dias
Tratado 14 dias
Controle 14 dias
Tratado 14 dias
0.20
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
250
Duplicata
0.15
0.10
0.05
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
0.00
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
Figura 5.12. Espectro de absoro ptica da face epidermal controle e da tratada com o gel
de C. peltophoroides aps 14 dias de tratamento. Os espectros do lado direito referem-se s
duplicatas.
52
700
Pulmo controle
600
-1
2924 cm
-1
2854 cm
500
-1
1242 cm
-1
1450 cm
-1
1398 cm
-1
1087 cm
400
-1
1527 cm
-1
972 cm
300
-1
3672 cm
-1
-1
1743 cm
1681 cm
-1
2360 cm
200
100
0
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
53
Posi
o
doPico
(cm-1)
3672
Atribuio
Maior
contribuio
Referncias
Protenas
2924
CH2anti-simtrico
Protenas e
Lipdios
2854
CH2 simtrico
Protenas e
Lipdios
2360
CO2
Protenas
1743
C=O
Vibrao em
estiramento
Amida I
(C=O,C - N, C-C, N-H)
Protenas
Protenas
1527
Amida II
(N-H, C-N,CN-H)
Protenas
1450
CH3anti-simtrico
Fosfolipdios
1398
Grupo COO-
Protenas
1234
cidos
Nuclicos
1087
PO2- antisimtrico(grupo do
fosfato)
PO2- simtrico
cidos
Nuclicos
972
C-C/C-O
1681
54
[105]
. Esta
banda foi adotada como referncia porque apresentou a menor variao ao longo do
perodo de tempo aps a infeco. Para minimizar fatores como o tamanho e
umidade da amostra, que podem influenciar na amplitude do sinal fotoacstico,
foram calculadas as razes entre as intensidades das bandas de absoro no
prprio espectro. Paralelamente, as mudanas espectrais foram relacionadas com
as observaes histolgicas.
Nos pulmes dos camundongos infectados com Pb foram encontradas
mudanas conformacionais nas seguintes regies do espectro de absoro: amida I
(1681 cm-1), CH3 (1450 cm-1), fosfato assimtrico (1242 cm-1) e grupo C-C/C-O (972
cm-1).
A razo amida I/amida II mostra as alteraes ocorridas na amida I em funo
da amida II no decorrer do perodo experimental, caracterizada por uma reduo na
2 semana, seguido de um aumento at a 8 semana (Figura 5.15). O aumento da
razo amida I/amida II poderia estar relacionado com a maior quantidade de
colectinas, que so protenas do surfactante pulmonar que tm a capacidade de
fazer ligao com molculas de superfcie expressas por microorganismos, e de
modular
vrias
funes
do
sistema
mononuclear
[106]
fagocitrio,
incluindo
55
3.5
Controle
1 Semana
2 Semana
4 Semana
8 Semana
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
-1
Figura 5.14. Espectro FTIR-PAS do pulmo de camundongo Swiss infectado com Pb18,
aps 1, 2, 4 e 8 semanas.
1.4
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0
Perodo (semanas)
Figura 5.15. Razo entre as intensidades das bandas de absoro ptica: amida I/amida II.
56
Figura 5.16. Fotomicrografia de pulmes de camundongos Swiss infectados com Pb18. E.1
e E.2 aps 2 semanas. E.3 e E.4 aps 8 semanas. E.1 e E.3 corados por H&E, E.2 e E.4
corados por Gomori-grocott. Aumento Original: 100x. Estas medidas foram realizadas pela
[81]
[107]
da razo amida I/amida II, que tem sido relacionada com o aumento do teor de
protenas
[101]
[101]
[108]
[108]
[109]
, contribuindo na
57
1.4
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0
Perodo (semanas)
Figura 5.17. Razo da intensidade da banda do grupo CH3 em relao a grupo da amida II.
[110]
. A avaliao
[111]
. O
[101]
58
[102]
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0
Perodo (semanas)
Figura 5.18. Em preto: razo do grupo fosfato pela Amida II; em azul: razo do grupo C-C/CO pela Amida II.
vez
que
foi
utilizado
FTIR-PAS
como
mtodo
de
estudo
da
59
60
Concluses
celular programada. Portanto, os resultados deste trabalho mostraram mais uma vez
que a espectroscopia fotoacstica uma tcnica importante para se determinar a
difuso de formulaes em sistemas biolgicos, permitindo que se faa,
especificamente na cicatrizao cutnea, uma correlao entre a taxa de difuso e
os eventos biolgicos do processo cicatricial. A tcnica FTIR-PAS mostrou grande
potencial para anlise de alteraes fsico-qumicas em sistemas biolgicos sem a
necessidade de reagentes ou manipulao da amostra, indicando que esta tcnica
pode tornar-se promissora para o estudo dos mecanismos fsico-qumicos
envolvidos nos processos que resultam em apoptose.
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74
ANEXO I
75