Universidad politcnica de Tlaxcala

Produccin de pectinasas

Ingeniera en biotecnologa

Materia: Biotecnologa Industrial

Profesor: Erick Ortega Snchez

Alumnos: Vianey Chamorro Ramrez
Erika Cern Delgado
Beatriz Camacho Snchez
Leticia Fernndez Romero
Yobani Ibez Reyes

9to D vespertino
Fecha de entrega: 06/08/2013

INDICE
INTRODUCCIN: .................................................................................................................................. 3
FUETES Y MTODOS ............................................................................................................................ 4
LOS SISTEMAS DE CULTIVO ............................................................................................................. 6
APLICACIONES INDUSTRIALES DE PECTINASAS ................................................................................... 6
IMPORTANCIA ECONMICA ............................................................................................................... 7
PERSPECTIVAS ..................................................................................................................................... 9
CLASIFICACIN: ................................................................................................................................. 11
MECANISMO DE ACCION: ................................................................................................................. 12
POLIGALACTURONASAS ................................................................................................................ 12
PECTIN Y PECTATO LIASAS ............................................................................................................ 13
PARMETROS CINTICOS: ................................................................................................................. 15
PRODUCCIN DE PECTINASA FNGICA EN MEDIO SLIDO UTILIZANDO POMAZA DE LIMN. ...... 17
INMOVILIZACION DE PECTINASAS Y EFECTOS EN EL JUGO DE GUAYABA ........................................ 18
INMOVILIZACION DE PECTINASAS EN GEL DE ALGINATO DE SODIO. ............................................... 20
CONCLUSIN ..................................................................................................................................... 21
BIBLIOGRAFA: ................................................................................................................................... 22

INTRODUCCIN:
La biotecnologa microbiana utiliza diversas herramientas metodolgicas para
explorar y explotar la biodiversidad natural de los microorganismos y sus enormes
capacidades metablicas. Esta disciplina incluye en su rea de estudio la
aplicacin de microorganismos para mejorar el medio ambiente, la identificacin
de microorganismos con potenciales metablicos que puedan ser utilizados para
aplicaciones industriales, y el uso de mtodos moleculares para valorar la
distribucin natural de los microorganismos en el medio ambiente y las funciones
ecolgicas que ellos realizan.
Los enzimas fueron descubiertos en la segunda mitad del siglo XIX y desde
entonces han sido progresivamente utilizados en diversos procesos industriales.
Son biocatalizadores extremadamente eficientes y altamente especficos. Con los
avances en biotecnologa en las ltimas tres dcadas, especialmente en las reas
de gentica molecular e ingeniera de protenas, los enzimas han encontrado
campo de aplicacin en muchos de los nuevos procesos industriales. En el siglo
pasado ha habido una preocupacin creciente por los efectos de la contaminacin
ambiental, y la presin pblica ha influido tanto en la industria como en los
gobiernos para su disminucin. Los enzimas microbianos presentan aplicacin
industrial debido a su elevada eficiencia cataltica, a que su uso no daa el medio
ambiente y a su alta rentabilidad econmica (Cherry y Fidantsef, 2003). Por este
motivo existe un renovado inters en sustituir los procesos productivos
convencionales por procesos biotecnolgicos en los que estn involucrados
microorganismos y enzimas microbianos tales como pectinasas (Alkorta et al.,
1998; Kashyap et al ., 2001), xilanasas (Beg et al., 2001; Viikari et al., 2001),
celulasas (Bhat, 2000), mananasas (Montiel et al., 2002), amilasas (Gupta et al
2003; Van der Maarel et al., 2002), lacasas y ligninasas (Bajpai, 1999); los cuales
no slo proporcionan alternativas econmicas viables, sino que adems permiten
el desarrollo de tecnologas respetuosas con el medio ambiente.

Las pectinasas son un conjunto de enzimas capaces de hidrolizar a la pectina, la

cual es un polisacrido formado principalmente por unidades de cido Dgalacturnico, que puede estar ono metilado.

Figura 1.estructura de las pectinasas

FUENTES Y MTODOS

La pared celular de los materiales ctricos est conformada en su mayora por tres
polisacridos: celulosa, hemicelulosa y pectina (de Vries&Visser, 2001). La pectina
forma parte de la pared celular primaria, y su funcin es estabilizar a las
microfibrillas de celulosa, as como a otros polmeros y protenas (Annis&Goodwin,
1997). Es un heteropolisacrido de estructura compleja formada por una cadena
lineal de unidades de cido D-galacturnico unidas entre s por enlaces ,1-4, en
la regin del homogalacturonano, misma que en ocasiones puede estar

intercaladas con unidades de L-ramnosa, lo que conforma la regin del

ramnogalacturonano.

Esta

regin

se

caracteriza

adems

por

presentar

ramificaciones de carbohidratos de diversos tipos, como arabinosa, galactosa,

xilosa, cido ferlico, apiosa y fucosa, entre otros (de Vries y Visser, 2001; Jayani
et al, 2005).
Las pectinasas son un grupo de enzimas de diversos tipos encargadas de
degradar a la pectina hasta sus compuestos monomricos elementales. Las
actividades enzimticas que actan sobre la cadena principal de la pectina
comprenden a las hidrolasas, que actan sobre los enlaces -1,4-glicosdicos.
Dado su modo de accin estas pueden ser del tipo endo, si actan de manera
aleatoria a lo largo de la cadena principal, o exo, si actan sobre los finales no
reductores de los oligogalacturnidos (Kashyap et al., 2001; Niture, 2008).
Las

pectinasas

pueden

tener

distintas

funciones,

en

dependencia

del

organismoque las produce. As, mientras que en los hongos saprfitos, como A.
niger, estas enzimas son importantes para proveer al microorganismo los
nutrientes a partir de los materiales de su medio ambiente, en el caso de los
microorganismos fitopatgenos, como A. flavus, intervienen en la degradacin de
la pared celular durante el proceso de invasin microbiana a las clulas vegetales
(Parenicov, 2000).

Los microorganismos producen enzimas activas en amplios intervalos de pH como

estrategia de supervivencia (Prusky&Yakobi, 2003). Aun cuando se ha
documentado la secrecin de enzimas y metabolitos de diversos tipos en
dependencia del pH del cultivo, todava no se ha profundizado en el estudio de
tales procesos regulatorios para la produccin de pectinasas por microorganismos
saprfitos.

LOS SISTEMAS DE CULTIVO

Dos de las tcnicas ms utilizadas para tal fin son el cultivo en lote y el cultivo en
lote alimentado. El cultivo en lote es uno de los mtodos ms simples empleados
para el desarrollo de cultivos lquidos. Se caracteriza por el hecho de que la
concentracin de sustratos, productos y clulas, as como el estado fisiolgico y
metablico celular, cambian con el tiempo del proceso. De igual manera,
parmetros como el pH y el oxgeno disuelto cambian, a menos de que se
establezcan estrategias adecuadas para su control (Ramrez Reivich, 2004).
Cuando la generacin de productos y subproductos provoca efectos negativos
sobre la formacin de los metabolitos de inters, o bien el sistema de produccin
es susceptible a represin por la concentracin del sustrato, una alternativa es el
empleo del cultivo alimentado. En este, uno o varios de los nutrientes limitantes se
suministran a lo largo del cultivo y la alimentacin de los sustratos puede hacerse
por pulsos, o de manera continua; por lo que el volumen del cultivo se incrementa.
A pesar del cambio en el volumen de operacin, el valor de ciertas variables clave,
como las concentraciones del sustrato y biomasa pueden controlarse en valores
relativamente constantes. Mediante el desarrollo del cultivo alimentado se puede
adems controlar la velocidad de crecimiento dentro de los intervalos que
favorezcan una funcin objetivo particular (Ramrez Reivich, 2004; Najafpour,
2007).

APLICACIONES INDUSTRIALES DE PECTINASAS

Existen diversas aplicaciones industriales de las enzimas pectinasas una de ellas,
en el procesamiento de jugos de frutas en el cual el producto obtenido
generalmente es viscoso, debido a la pectina disuelta, y turbio por los fragmentos
de paredes celulares en suspensin. Cuando se agregan pectinasas, la viscosidad
disminuye y las partculas pueden eliminarse fcilmente, centrifugando el lquido o
filtrndolo. Este mecanismo produce un lquido con una presentacin ms
atractiva para el consumidor. En los extractos comerciales de pectinasas usados
para la fabricacin de jugos de frutas coexisten tres enzimas: la pectinliasa, la
poligalacturonasa y lapectinesterasa. Estas enzimas en combinacin hidrolizan a
la pectina, que es un polisacrido constituido principalmente de cido

galacturnico que se encuentra parcialmente metoxilado. De tal manera que las

pectinliasas actan sobre la pectina; las pectinesterasas eliminan los grupos
metoxilo y la poligalacturonasa acta sobre la pectina una vez que sta ha sido
desmetilada. (Ma. Del Carmen Montes, 2002)

IMPORTANCIA ECONMICA
Los productos biotecnolgicos estn en todos los sectores de las drogas
(genricas y no-genricas) productos de belleza procesamiento de alimentos para
humanos y animales procesamiento textil y artculos de limpieza para produccin
masiva de alcohol y suplementos nutricionales de la vida diaria.
Es innegable que la expansin de mercado de enzimas observado en los ltimos
aos en los pases de latinoamerican, es un aliciente para la creacin de nuevas
empresas nacionales o mixtas que produzcan enzimas a nivel nacional o
subregional (lllanes, 1994).
En 1.800 millones de dlares se estima el mercado para enzimas industriales, con
aplicaciones en el procesamiento de alimentos, produccin de detergentes y
limpiadores, en textiles, cueros y pieles, pulpa y papel y fabricacin qumica
(Business Communications, 1998)

Figura 2. (Fuente: Kent y Riegel, 2007)

La produccin industrial de estos complejos enzimticos se lleva a cabo por FML,

o FMS. El primer mtodo es ms usado en comparacin con el segundo, por la
facilidad del control de las propiedades fisicoqumicas del sistema, sin embargo,
el segundo mtodo rinde mayor cantidad de enzima por gramo de sustrato (TrejoHernndez et al., 1991) obtenida a una concentracin mayor y es relativamente
ms econmico (Ghildyal et al., 1981.,Pandey, 1992)

Tabla 1: (Fuente: produccin mundial de enzimas Garcia y col., 1993)

En la tabla 1, se muestra Ia situacin del mercado internacional, de acuerdo con
los datos publicados por (Eveleigh y coL,1990). Es impactante, por un lado, el
hecho de que ms de 2000 enzimas registradas slo 60 sean producidas
comercialmente y de stas slo cinco cubran ms deI 80% del mercado (Garca y
col., 1993).

PERSPECTIVAS
En la actualidad, los procesos qumicos convencionales estn siendo sometidos a
un escrutinio considerable bajo consideraciones ambientales y econmicas. En
muchos rubros, la biotecnologa est ganando terreno rpidamente, ya que ofrece
varias ventajas sobre las tecnologas convencionales. Las enzimas industriales
representan el corazn de la biotecnologa.
La aplicacin industrial ha aumentado significativamente en los ltimos aos,
estimndose un crecimiento desde 2200 millones USD en el ao 2006 a 3300
millones USD en el 2010. Esperndose que alcance $ 4400 millones USD para el
ao 2015. El mercado de las enzimas puede ser dividido segn su rubro
aplicacin. Dentro de los que se destacan, los segmentos de enzimas con
aplicacin tcnica, en alimentacin animal y en la industria de alimentos y bebidas
(figura1).

Figura 3: mercado mundial de las enzimas de uso industrial

El mercado de enzimas tcnicas se ha valorado en torno de 1000 millones USD en

2010 y se estima que este sector crecer a una tasa de crecimiento compuesta del
6,6% anual para llegar a 1500 millones USD en el 2015. Siendo el mercado de
mayor crecimiento esperado. Las ventas ms significativas en este rubro han
ocurrido en el mercado de enzimas dirigidas a la industria del cuero, seguido por el
mercado del bioetanol.
Por su parte, para el segmento de enzimas con aplicacin en la industria de
alimentos y bebidas se espera que crezca desde valor de $ 975 millones USD en
2010 a alrededor de $ 1300 USD millones en 2015, creciendo a una tasa de
crecimiento anual compuesta del 5,1%. Dentro del segmento de este rubro, las
dirigidas al mercado leche y sus derivados registran la mayor parte de las ventas,
con $ 401,8 millones USD en 2009.
Unas 20 compaas de Europa, Japn y Estados Unidos realizan la produccin de
enzimas, pero el mercado es dominado por 3 de ellas: Novo Nordisk (Dinamarca)
con el 50% de las ventas a nivel mundial, seguida por GistBrocades
(Neatherlands) y Rhom and Haas (Alemania). El mercado de las enzimas ha
tenido gran crecimiento desde los aos 70 y este ha sido paralelo con el desarrollo
de un gran nmero de aplicaciones en la industria alimentaria.

El mercado de la produccin de enzimas est abarcado por 20 compaas de

Europa, Japn y Estados Unidos, principalmente por: Novo Nordisk de Dinamarca,
GistBrocades de Neatherlands y Rhom and Haas de Alemania. En Latinoamrica
hay empresas productoras de enzimas en Mxico, Brasil, Argentina y Uruguay,
que son subsidiadas por empresas internacionales, como la empresa Pfizer en
Mxico y Brasil y Novo en Brasil.
Entre las enzimas comercialmente importantes utilizadas destacan: la -amilasa
del Bacilluslicheniformis, Bacillusamyloliquefaciens y aspergillus Oryzae y la
amiloglucosidasa de aspergillus Nger.

10

CLASIFICACIN:
Las pectinasas se pueden clasificar en tres grupos de acuerdo a su forma de
actuar sobre el polisacrido (Taragano et al., 1997):
Pectinesterasas
Poligalacturonasas (endo y exo)
Pectin y pectatoliasas
Las pectinesterasas y poligalacturonasas pueden ser de origen vegetal o
microbiano, mientras que las pectin y pectatoliasas son sintetizadas por
microorganismos.

Figura 4. Clasificacin de las enzimas pectinolticas y su nombre de acuerdo con

la Comisin de Enzimas (EC) (Recomendaciones de la IUPAC-IUB).

11

MECANISMO DE ACCION:

Pectinesterasas
Las pectinesterasas transforman a la pectina metoxilada en pectina de bajo
metoxilo o pectato. Al actuar producen metanol a partir de los grupos carboxilos
esterificados. Esto ocurre en muchas plantas y se presenta frecuentemente en
ctricos y tomates, pero tambin son producidas en gran cantidad por hongos y
bacterias.
Las pectinesterasas producidas por los hongos tienen un pH ptimo alrededor de
4.5 mientras que el de las enzimas de plantas y bacterias se encuentra cerca de la
neutralidad. Todas las pectinesterasas son altamente especficas sobre el metil
ster del cido poligalaracturnico, ya que no son hidrolizados los enlaces ster
metlicos de otros compuestos (Daz, 1997).

Figura 5. Accin de las pectinesterasas.

POLIGALACTURONASAS
Las poligalacturonasas son enzimas que hidrolizan el enlace glucosdico contiguo
al grupo carboxilo libre; en consecuencia, las pectinas de alto metoxilo se
hidrolizan muy lentamente, mientras que las de bajo metoxilo son buen sustrato
considerandose al pectato como el mejor.

12

Las poligalacturonasas son producidas por la mayora de los hongos, por

levaduras y tambin por algunas bacterias (Rombouts y Pilnik, 1980). Su pH
ptimo

se

estima

exopoligalacturonasas;

entre
las

4.0

5.5.

Se

han

reconocido

endopoligalacturonasas(poli

(1,

endo

4--D-

galacturnido)glicano hidrolasa, EC. 3.2. 1. 15) atacan a la cadena pctica al azar;

un pequeo incremento en grupos reductores se manifiesta con un fuerte
descenso de la viscosidad de la solucin que contiene el sustrato. Las
exopoligalacturonasas (poli (1,4--D-gaIacturnido) galacturono hidrolasa, EC.
3.2.1.67) atacan del lado no reductor del polmero formando mono dimeros,
trayendo como consecuencia una muy lenta disminucin de la viscosidad.

Figura 6. Accin de las poligalacturonasas.

PECTIN Y PECTATO LIASAS

Las pectatoliasas rompen el enlace glucosldico por -eliminacin, su accin
produce dobles ligaduras entre los carbonos 4 y 5 de la molcula de cido Dgalacturnico. Al igual que las poligalacturonasas, stas actan del lado donde se
encuentra ms cercano el grupo carboxilo libre, y tambin se encuentran endo y

13

exopectatoliasas. Para las tipoexo, el pectato es el mejor sustrato y generalmente

se obtienen dmeros insaturados a partir del grupo reductor terminal. Para las
endo, las pectinas de bajo metoxilo son el mejor sustrato. Su pH ptimo est
alrededor de 8-9.5 y por esta razn son de baja importancia para el procesamiento
de frutas.
Las pectinliasas rompen el enlace glucosdico cercano al grupo metil ster por va
de la -oxidacin, su accin es similar a la de las pectatoliasas. El mejor sustrato
para estas enzimas; su pH ptimo est entre 5-6, pero con la adicin de iones
calcio se puede presentar un segundo pH ptimo en 8 (Daz, 1997).

Figura 7. Accin de las pectato y pectinliasas

14

PARMETROS CINTICOS:

Velocidad Maxima (Vmx).

Constante de Michaelis-Menten (Km).

Velocidad especifica de crecimiento ().

Velocidad especifica de crecimiento (en las cepas que se analizaron)

VALORES DE Vmax y Km OBTENIDOS EN DIFERENTES ESTUDIOS:

PRODUCCION

DE

PECTINASAS

DE

ASPERGILLUS

NIGER

POR

FERMENTACION SOLIDA
1) Efecto de la relacion pectina /sacarosa en medio solido sobre soporte en
esta parte. Las relaciones utilizadas fueron en: 1:1, 1:2 y 1:4 de
pectina/sacarosa y en la figura 3, se muestran los resultados obtenidos con
A. niger. La mejor relacin pectina/sacarosa fue la 1:2, con un mximo de
produccin de 672~0.5 U/g de substrato hmedo, despus de 76 h.

15

En la Fig. 5, se observa despus de 30 horas de fermentacin, una completa

asimilacin de la sacarosa presente en el medio y por otro lado, en este momento
comienza la sntesis de enzimas pcticas.
La actividad pectinoltica obtenida fue ms alta en cultivo en medio slido,
comparado con el cultivo sumergido.

(Viniegra, G. y col. 1991).

16

PRODUCCIN DE PECTINASA FNGICA EN MEDIO SLIDO UTILIZANDO

POMAZA DE LIMN.

La seleccin del microorganismo fue de 8 cepas. Se monitoreo la produccin de

pectinasa cada 12 h por 96 h y se calcularon los parmetros cinticos de la
fermentacin.
El microorganismo que present un mayor crecimiento fue Aspergillus niger a-20h,
con un valor de 0.0683 h-, la humedad en el sistema fue de 30% durante toda la
cintica. El consumo de sustrato vario de un valor inicial de 70.65 a 37.02 mg AT
/100 mg pomaza de limn al final de la cintica (50%). La cantidad de glucosamina
como cuantificacin de biomasa fue de 8.017 mg glucosamina/gr pomaza con una
velocidad especfica de crecimiento de 0.1269 h-1, valores mayores a los
obtenidos en estudios sobre bagazo de manzana (1). La produccin de pectinasa
fue de 2181.23 U/L a una concentracin de cido poligalacturnico (APG) de 0.8
g/L (Fig. 1b). Godinez et al (2) obtuvieron un productividad pectinasa de 1911 U/l,
utilizando poliuretano como soporte y sacarosa como fuente de carbono, mientras
que Huerta et al (3), obtuvieron una actividad pectinasa de 790 U/mg de protena
en el bioreactorZymotis. Las constantes de la ecuacin de Michaelis-Menten
fueron V max de 38.84 mol/(L*min) y Km de 0.155 mol/L. Para 0.4 g/L de APG
la reaccin fue de orden uno y a partir de 0.8, 1.6 y 3.2 fue de orden cero.

17

Actividad enzimtica a diferentes concentraciones de sustrato.

(Ruiz, H. y col, 2004)

INMOVILIZACION DE PECTINASAS Y EFECTOS EN EL JUGO DE GUAYABA

Lineweaber-burkpara pectinasas libre e inmovilizada

18

Una vez obtenida la relacin entre el aumento de concentracin de sustrato y

actividad cataltica, se procede a la linealizacion de los graficos anteriores para
obtener

de

estos

los

parmetros

cinticos.

A) Curva de lineweaber para la pectinasa libre.

B) Grfico de Lineweaber para la pectinasa inmovilizada

En los grficos A) y B) se determina que la velocidad mxima de reaccin de la
enzima libre encontrada es de 0.1071 (UI/mg) y comparada con la de la pectinasa
inmovilizada (0.00848896 UI/mg) es cien veces mayor, lo cual muestra que la
enzima libre acta mucho ms rpido que la enzima inmovilizada.
En el caso de la constante de Michaelis-Menten para la pectinasa libre (0.0328673
g/mL) en comparacin con la inmovilizada (0.5751/mL), el que se obtenga un valor
ms grande para la inmovilizada, indica que para llegar a una velocidad de

19

relacin mxima se necesita una alta concentracin de sustrato, en la cual se

requiere solamente cantidades pequeas de sustrato para ser saturada y el
mximo de velocidad es alcanzado a bajas concentraciones de sustrato.
(Daz, L. 2002)

INMOVILIZACION DE PECTINASAS EN GEL DE ALGINATO DE SODIO.

20

La enzima inmovilizada tiene menor afinidad por el sustrato que la enzima libre, y
esto se ve a travs de Km. Tambin hay una disminucin de la velocidad mxima
en la enzima inmovilizada respecto a la libre.

CONCLUSIN
Las aplicaciones industriales de las enzimas a nivel mundial van en aumento ya
que son de gran importancia en diversos sectores industriales, por otra parte las
pectinasas tienen un papel importante en la industria alimentaria ya que se utilizan
en un sinfin de procesos que van desde clarificantes hasta la extraccin de aceites
esenciales, su importancia econmica va en aumento debido a la demanda y a los
nuevos procesos que se inician dentro de las aplicaciones industriales. La
actividad pectinoltica obtenida fue ms alta en cultivo en medio slido, comparado
con el cultivo sumergido

21

BIBLIOGRAFA:
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GERMAN.,(2002)

Produccion

de

enzimas

pectinasas

por

actinomicetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cascaras de

naranja.

22

 Martnez-Trujillo, M. A., Aranda-Barradas, J., Gmez-Snchez, C., TrejoAguilar, B. and Aguilar-Osorio, G. 2009. Constitutive and inducible
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DESARROLLO DE UN BIOREACTOR PARA LA PRODUCCIN DE
PECTINASA FNGICA EN MEDIO SLIDO UTILIZANDO POMAZA DE
LIMN. Hctor Arturo Ruz Leza*, Rosa Mara Rodrguez Jasso, Juan
Carlos Contreras Esquivel, Ral Rodrguez Herrera yCristbal No Aguilar*.
2004

INMOVILIZACION

DE

PECTINASAS

Y/O

CELULASAS

DETERMINACION DE ALGUNOS DE SUS EFECTOS EN EL JUGO DE

GUAYABA. LUIS RONALDO DIAS ALZATE, FRANCISCO JAVIER ARIAS
VARGAS.UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA, FACULTAD DE
INGENIERIA QUIMICA.2002
INMOVILIZACION DE ENZIMAS: PECTINASAS SOBRE ALGINATO.
http://prezi.com/b2zflsa4wnmm/inmovilizacion-de-enzimas-pectinasa-sobrealginato/

23