Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
3.- METODOLOGA
3.1.- RECOLECCIN DE MUESTRAS
Las muestras fueron recolectadas en dos diferentes sitios productores de manzana y pera-pina
de la Ciudad de Ambato, en los sectores de Lacn ubicado en la parroquia de San Bartolom de
Pinllo (1 13 8" S; 78 39 2" W) y Querochaca el 17 de Abril del 2014. Las muestras se
almacenaron en fundas negras para su posterior trasladado al laboratorio. Se seleccionaron
frutos maduros de formacin completa debido a que contiene mayor concentracin de azcares
fermentables. Los frutos recolectados se dividieron por cada sector muestreado. Todos los
materiales para manipular y lavar las muestras fueron previamente esterilizados en el laboratorio.
Los frutos tras ser muestreados, fueron lavados con agua potable y posteriormente se realiz
una desinfeccin superficial al 20% con Hipoclorito sumergido por 2 min, luego se realiz
pequeos orificios en la fruta con ayuda de una aza de puncin para permitir el paso de oxgeno
y realice el proceso de fermentacin. Finalmente se guard en fundas hermticas con su
respectivo cdigo para ser llevadas a incubacin a 28C por 72 hr.
3.2.- CARACTERIZACIN FSICO-QUMICA DE LAS MUESTRAS DE MANZANA Y PERA
PIA
3.2.1 Determinacin del pH
Para determinar el pH de las muestras, se pes 10g de fruta (manzana y pera pia) y se coloc
en un frasco estril al que se aadieron 90ml de agua destilada luego se procedi a licuar
manteniendo condiciones estriles, finalmente se tomaron las lecturas correspondientes de cada
una de las muestras mediante el uso de un pH-metro.
3.2.2 Determinacin del porcentaje de humedad
Se pes 2 gramos de cada una de las muestras en trozos pequeos que fue coloco en una
balanza de humedad por 1 hora aproximadamente. Al retirar las muestras el equipo nos da el
valor directamente en %.
3.2.3 Determinacin del porcentaje de materia orgnica
Se pes previamente los crisoles a utilizarse y se coloc 2 gramos aproximadamente de cada
una de las muestras luego fueron llevadas a la estufa a 105C por 24 horas. Al retirar las
muestras se las dej enfriar en un desecador y se procedi a pesar nuevamente (Peso 1). Las
muestras procedentes de la estufa se colocaron en una mufla, a 400C por 3 horas. Al trmino
de este tiempo se las dej enfriar en un desecador y finalmente se obtuvo el peso final (Peso 2).
g
V . final * g.suelo. sec o
Para esto se utiliz los gramos obtenidos en el clculo de porcentaje del suelo seco.
3.5.- AISLAMIENTO, PURIFICACIN Y ALMACENAMIENTO DE LEVADURAS
Las cajas petri que presentaron crecimiento visible y diversidad de colonias de levaduras se
escogieron para proceder con el aislamiento y purificacin de las colonias. Con la ayuda de un
palillo estril se tom una pequea cantidad de biomasa de una colonia, para inocularla
mediante estra simple en cajas tetrapetri con agar YM. Los platos fueron incubados a 25 C, por
72 horas. Los cultivos puros fueron repicados en estra compuesta en nuevos platos con agar
YM. Aquellos que luego del perodo de incubacin presentaron caractersticas de cultivo puro,
fueron etiquetados y posteriormente almacenados en glicerol al 20% (w/v) en tubos crioviales a 18C en un congelador, para su preservacin a largo plazo. Adems de esto, se realizaron
suspensiones en agua de llave estril de los cultivos puros para utilizarlos en ensayos
posteriores.
4.- RESULTADOS:
Tabla N1: Informacin geogrfica de las muestras recolectadas
Fruta:
Manzana
Pera
Cdigo:
PIN001
QUE001
Lugar:
San Bartolom de Pinllo Sector Lacn Querochaca
Latitud:
1 13 8 5
1,868282
Longitud:
78 39 2 w
78,607640
Variedad:
Golden Delicious
Pera-Pia
Fuente: GPS
Elaborado por: Aguirre S., Muso E., Manjarrez I., Villarroel D., Jcome J. 2014
Tabla N2: Determinacin de pH de las muestras
Fruta:
pH1:
pH2:
Ph3:
Prom:
Pera
6,43
6,41
6,40
6,41
Manzana
6,25
6,24
6,23
6,24
Manzana
DILUCION
103
104
105
103
104
105
103
104
105
MEDIO
YM
Saboraud
YM
# COLONIAS
610
178
Incontable
366
67
38
Incontable
70
12
104
YM
1.602*108
7.899*108
PERA-PIA
104
105
Saboraud
3.420*108
6.03*107
1.686*109
2.973*109
MANZANA
104
YM
6.3*107
4.581*108
DILUCION FRUTA
103
103
104
103
PERA
104
103
103
104
MANZANA
105
LARGO
5
3
3
1
4
2
3
6
5
ANCHO
2
4
1
3
7
4
1
4
4
ESF
0
0
0
0
0
0
0
0
0
ELI
1
1
1
1
1
1
1
1
1
OVI
0
0
0
0
0
0
0
0
0
CIL
0
0
0
0
0
0
0
0
0
FP
0
0
0
0
0
0
0
0
0
LDS
001
Crema
LDS
002
Marrn
LDS
003
Marrn
LDS
004
Blanca
LDS
005
Marrn
LDS
006
Blanca
LDS
007
Marrn
CDS
008
Crema
CDS
009
Crema
Circular
Irregular
1
0
1
0
0
1
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
Entero
Ondulado
1
0
1
0
0
1
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
ELEVACIN
Plana
Convexa
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
SUPERFICIE DE LA
COLONIA
Lisa
Opaca
Traslucida
Viscosa
Membranosa
Butirosa
1
0
0
0
1
0
0
1
0
1
0
0
0
1
0
1
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
1
PIGMENTACION
FORMA
MARGEN
CARACTERIZACIN
PTICA
CONSISTENCIA
4C
0
0
0
0
0
0
0
TEMPERATURA
28C 35C Clasificacin
Mesfilo
1
1
Mesfilo
1
1
Mesfilo
1
1
Mesfilo
1
1
Mesfilo
1
1
Mesfilo
1
1
Mesfilo
1
1
NaCl (%)
1%
1
1
1
1
1
1
1
5%
1
0
0
1
1
1
0
10%
1
0
0
1
1
1
0
15%
1
0
0
1
0
1
0
Clasificacin
Halfilo extremo
Halfilo dbil
Halfilo dbil
Halfilo extremo
Halfilo
Halfilo extremo
Halfilo dbil
5. GRAFICO:
6.- DISCUSION:
El presente trabajo de investigacin se proyect a estudiar la poblacin y diversidad de levaduras asociadas a
frutas como, pera-pia y manzana, localizadas en el cantn Ambato que fueron recolectadas en los sectores
de Lacn ubicado en la parroquia de San Bartolom de Pinllo y Querochaca. Se obtuvieron un total de 9
levaduras con caractersticas morfolgicas casi similares 7 de pera-pia y 2 de manzana
En la investigacin se emplea frutas con alto contenido de azcar como es el caso de la manzana el 12.2% y
la pera pia el 10%, los cuales permiten que el proceso de fermentacin de azucares ocurra con eficiencia
para la produccin de alcohol siendo un factor importancia en la industrial de las levaduras.
CARACTERIZACIN FSICO-QUMICA
En la determinacin de los diferentes parmetro fsico qumicos evaluados a las frutas como mora, fresa,
pera-uvilla, membrillo, pera-pia y manzana presenta una similitud bibliogrficamente, al determinar su pH
indica que es acido en manzana 6.24 y pera-pia 6.41, al comparar el pH con mora, pera-uvilla y membrillo
indica un pH que oscila entre 6.1 - 6.5, mientras que en fresa presenta mayor acidez con pH 3, al determinar
el % de humedad la manzana 86 % y en pera-pia 80%, al ser comparado con el resto de frutas oscila entre
68-88% lo cual indica un alto contenido de agua en la composicin de cada fruta. Finalmente el contenido de
materia orgnica presente en pera-pia y manzana es del 18% y de igual forma el resto de frutas va desde
12-18%, tomando en cuenta que en fresa recolectada en Huachi La Magdalena posee mayor cantidad de
materia orgnica con el 31% .
DETERMINACIN DE LA POBLACIN Y DIVERSIDAD DE LEVADURAS
El aislamiento se realiz por el mtodo de difusin en placa y diluciones seriadas 104 y 105 para determinar la
poblacin y diversidad de levaduras en medios de cultivos selectivos como es el Saboraud y YM a los cuales
se aadi inhibidores sulfato de estreptomicina, a una concentracin de 10 g/ml, y rifampicina a una
concentracin de 50 g/ml para evitar el crecimiento de bacterias y solo permita el crecimiento de levaduras,
se encontr diferencias en los dos medios en cuanto al nmero de colonias y por consiguiente ufc/g seco. En
mora, fresa, pera-pia y manzana el medio YM resulto muy eficiente ya que se encontr mayor nmero de
colonias en comparacin al medio Saboraud, pudo ser por el nmero de fuentes nutritivas como glucosa
fuente de energa, peptona y el extracto de levadura fuente de nitrgeno. El extracto de malta debido a su
elevado contenido en diversos carbohidratos, sobre todo en maltosa y glucosa es la base para el crecimiento
de levaduras, siendo muy favorable para su crecimiento. Mientras que el medio Saboraud fue factible para
pera-uvilla y membrillo, presento mayor nmero de colonias en comparacin con el medio YM, tomando en
cuenta que la gran mayora de las levaduras son mesfilas, con una temperatura mxima de crecimiento
entre 24 y 48C, pero que responden mejor a temperaturas menores a 30C por lo que se incubo a 28C
asegurando as un ptimo crecimiento por otro lado el pH adecuado es acido que va entre 4.5 y 6.5
permitiendo as el crecimiento, cabe recalcar que de igual forma el medio de cultivo presenta un pH acido de
5.5-6.0, ajustndose as al pH de las muestras fermentadas como manzana 6.24 y pera-pia 6,41, llegando a
la conclusin que el pH de crecimiento , su fuente de nutricin y la fruta fermentada se encuentran en medio
acido lo cual garantiza buenas condiciones apropiadas para crecimiento de levadura.
El recuento obtenido dentro del rango de 30 300 colonias las unidades formadoras de colonias por gramo
de muestra seca (ufc/g) en medio YM mostraron valores altos en fresa AJC 8.76 *109 ufc/g y AJP 6.66*109
ufc/g con una diferencia altamente significativa seguida la mora con 7.99*109 ufc/g HB, membrillo 4.589*109
ufc/g en Querochaca, se encontraron mayor nmero de colonias resultando favorable, este tipo de frutas tal
vez se hallaron muy maduras las cuales facilito el proceso de fermentacin, partiendo de esta informacin se
podra dar paso una investigacin a fondo con el fin de encontrar especies nuevas que se aplique industrial,
mientras que en manzana su valor es menor en comparacin al resto de frutas 4.581*108 ufc/g. En medio
saboraud resulto favorable para pera-uvilla con 7.74*109 ufc/g en Huachi San Jos y seguido mora PT
2.21*109 ufc/g, pera-pia 2.973*109 ufc/g existe diferencia, puede deberse a varios factores como su proceso
de fermentacin no se dio completamente o lento.
AISLAMIENTO, PURIFICACIN Y ALMACENAMIENTO DE LEVADURAS
Se obtuvieron 2 levaduras aisladas de manzana proveniente del sector Lacn ubicado en la parroquia San
Bartolom de Pinllo correspondientes a los cdigos CSD008, CSD009. Los arboles de las cuales se tomaron
las muestras eran pequeas, frondosas y produccin normal, adems se encontr 7 levaduras aisladas de
perapia proveniente de Querochaca correspondientes a los cdigos LSD001, LSD002, LDS003, LSD004,
LDS004, LDS005, LDS005, LDS006, LDS007. Las arboles de donde se tomaron las muestras eran frondosas,
altas y cargadas.
En fresa se encontraron 15 levadura las cuales 8 provienen de Tisaleo y 7 de Huachi, mientras que en perauvilla se hall 5 levaduras provenientes de Huachi San Jos y membrillo 5 levaduras proveniente de
Querochaca, en mora 28 levaduras 15 provenientes del Casero Galpn Patate y 13 de Huachi Beln,
indicando mayor diversidad de levadura debido a su alto contenido de azcares fermentables.
CARACTERIZACIN MACROSCPICA
En la caracterizacin macroscpica de los cultivos aislados de levaduras a partir de frutas con alto contenido
de azucares. Fueron evaluados parmetros como margen de las colonias aisladas, obteniendo resultados
predominantes de margen entero un 83% se encuentra en fresa, mora, membrillo, pera-pia, manzana y el
17% presenta un margen ondulado en pera-pia. El 83 % de los aislados present la superficie de colonia lisa
en fresa, mora, pera-uvilla, pera-pia y manzana, mientras que 17% presenta la superficie de colonia rugosa
en membrillo.
Un 33% de las colonias aisladas presentaron brillo en pera-uvilla, y membrillo, mientras que el 67% de las
colonias fueron opacas presentes en manzana, pera-uvilla, mora, fresa y el 17% es translucida presente en
pera-pia. La textura predominante es butirosa con un 67% en manzana, pera-uvilla, mora, fresa mientras el
17% present una textura membranosa por parte de pera-pia y viscosa por el membrillo. El 33% de las
levaduras aisladas presentaron colonias de color blanco por parte de la mora, pera-uvilla, adems
presentaron color crema con el 33% por la manzana, fresa y tan slo un 17% de aislados present un color
de colonia blanco metlico por el membrillo y marrn en la pera-pia. Por ltimo, solamente presentaron
pigmento difusible de color rosa en el medio de cultivo las levaduras en fresa, mora y naranja en el medio de
cultivo las levaduras de y pera-uvilla.
CARACTERIZACIN MICROSCPICA
En la caracterizacin microscpica de los cultivos aislados de levaduras a partir de fresa, mora, pera-uvilla,
membrillo, pera-pia y manzana fueron evaluadas con ayuda del microscopio ptico, la diversidad de
morfologa celular siendo evidente la forma celular elipsoidal como predominante en 12 aisladas de fresa, (24
aisladas)mora, (4 aisladas) pera-uvilla, (7 aisladas)pera-pia, (2 aisladas)manzana corresponde al 87%,
seguida de la forma ovoide en 4 aisladas de membrillo correspondiente al 17%. Adems se midieron las
clulas obteniendo un rango que oscila entre 1 - 7 m de dimetro.
7.- CONCLUSIONES:
Al obtener levaduras aisladas se calcul las unidades formadoras de colonias por gramo
de Fruta seca (ufc/g), siendo la de mayor formacin la pera pia con mayor diversidad.
8.- BIBIOGRAFIA:
RODRIGUEZ ESTHER, 2007.Anlisis Genmico y Molecular de Levaduras Vnicas. Aplicacin a la
Mejora del Proceso de Fermentacin de Vinos mediante Seleccin de Levaduras Autctonas, CadizEspaa, 27-39.
CARRILLO Leonor. 2003. Los Hongos de los alimentos y forrajes. Universidad Nacional de Salta.
Garca, Vera, Cortez, 2004 Introduccin a la microbiologa, Editorial EUNED, Segunda edicin,
costa rica, 116-120 (Jhon L, 1999).
JOHN L., CATHERINE A., 1998, Introduccin a la microbiologia volume2 , Editorial reverte,
Edicin ilustrada,p 735.
9.- ANEXOS:
9.1 Receta de los medios de Cultivo
Anexo 1: MEDIO SABORAUD
Reactivos Cantidades
Peptona
10g
Glucosa
40g
Agar
15g
Agua
1000mL
pH
5
Anexo 2: MEDIO YM
Reactivos
Extracto de levadura
Extracto de Maltosa
Peptona
Glucosa
Agar
Agua
pH
Cantidades
0.3% p/v
0.3% p/v
0.5% p/v
1% p/v
2% p/v
1000mL
5
LDS 002
LDS 003
LDS 004
LDS 005
LDS 006