Juliana Dutra Barbosa da Rocha

Modulao da Atividade de Linfcitos B pela Warifteina isolada de

Cissampelos sympodialis.

Dissertao de Mestrado apresentada ao Programa de PsGraduao em Cincias (Microbiologia), Instituto de Microbiologia

Prof. Paulo de Ges da Universidade Federal do Rio de Janeiro,
como parte dos requisitos necessrios obteno do ttulo de
Mestre em Cincias Biolgicas (Microbiologia)

Orientador: Ligia Maria Torres Peanha

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA PROF PAULO DE GES
RIO DE JANEIRO
FEVEREIRO DE 2009

Rocha, Juliana Dutra Barbosa da Rocha

Modulao da atividade de linfcitos B pela warifteina isolada de
Cissampelos sympodialis. Juliana Dutra Barbosa da Rocha Rio de Janeiro,
2009
xv, 64.
Dissertao (Mestrado em Cincias Biolgicas)
Universidade Federal do Rio de Janeiro/ Instituto de Microbiologia Prof.
Paulo de Ges, 2006.
Orientador: Ligia Maria Torres Peanha.
Referncias bibliogrficas:f 113
1. Warifteina 2. Linfcitos B 3. cAMP 4. Cissampelos sympodialis 5.
Transduo de sinal 6. Receptores tipo Toll I. Peanha Ligia Maria Torres.
II. UFRJ, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Ges, Mestrado em
Cincias Biolgicas. III. Modulao da atividade de linfcitos B pela
warifteina isolada de Cissampelos sympodialis.

ii

Juliana Dutra Barbosa da Rocha

Modulaao da Atividade de Linfcitos B pela Warifteina isolada de

Cisssampelos sympodialis.
Rio de Janeiro, 6 de Fevereiro de 2009.

Ligia Maria Torres Peanha, Doutora em Cincias Biolgicas (Biofsica),

Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Ges, Universidade
Federal do Rio de Janeiro

Jos Mauro Peralta, Doutor em Cincias (Microbiologia), Instituto de

Microbiologia Professor Paulo de Ges, Universidade Federal do Rio de
Janeiro

Adriana Cesar Bonomo, Doutora em Cincias Biolgicas (Biofsica),

Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Ges, Universidade
Federal do Rio de Janeiro

Maria Isabel Doria Rossi, Doutora em Patologia, Instituto de Cincias

Biomdicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro

Maria Bellio, Doutora em Cincias Biolgicas (Biofsica), Instituto de

Microbiologia Professor Paulo de Ges

iii

O
presente
trabalho
foi
realizado
no
Laboratrio
de
Imunoparasitologia, Departamento de Imunologia, Instituto de
Microbiologia Prof. Paulo de Ges, Centro de Cincias da Sade (CCS),
Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientao da Prof Ligia
Maria Torres Peanha.

iv

AGRADECIMENTOS

Agradeo muita a toda a minha famlia, em especial a papai, mame e ao meu

irmo Raphael, que mesmo nos momentos mais difceis das nossas vidas sempre
me incentivaram a perseverar e lutar pelos meus objetivos.

A minha orientadora Prof Lgia Peanha.

A minha co-orientadora Prof Luciana Arruda.

Um agradecimento especial aos no menos fundamentais para essa dissertao,

Dbora Decote-Ricardo, e ao Sidney Gomes da Costa.

A todos os alunos do laboratrio de Imunoparasitologia e do laboratrio

LGIIVIR.

A Prof Maria Belio pela reviso dessa dissertao.

A banca avaliadora pela disponibilidade e pelo tempo a mim concedido.

A Dr Mrcia Piuvezam por gentilmente ceder a wariftena purificada.

Ao Dr Ulisses Lopes e ao doutorando Paulo Redner por colaborarem com nossos

dados com os experimentos de dosagem de NFB.

Ao Dr Alberto Nbrega por gentilmente ceder os estmulos Pam3Cys e

oligodeoxinucleotdeos com seqncias CpG.

A todos os alunos e professores do Departamento de Imunologia do IMPPG, que

sempre me ensinaram e auxiliaram quando precisei de ajuda.

Aos meus amigos da vida inteira, que sempre presentes me permitiram relaxar e
desestressar da rotina do laboratrio.

Ao CNPq, CAPES e FAPERJ pelo apoio financeiro.

Dedico a minha Famlia e Amigos,

vi

Juliana Dutra Barbosa da Rocha

Modulao da Atividade de Linfcitos B pela warifteina isolada de

Cissampelos sympodialis.
Orientador: Ligia Maria torres Peanha
Resumo da Dissertao de Mestrado submetida ao Programa de Ps-Graduao em
Cincias (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Ges da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessrios para a
obteno do ttulo de Mestre em Cincias Biolgicas.

O extrato hidroalcolico da folha de Cissampelos sympodialis (CS) apresenta ao

inibitria sobre o funcionamento de clulas B e T. A wariftena o alcalide majoritrio
presente neste extrato. No presente estudo investigamos se a wariftena inibiria as
funes da clula B e caracterizamos seu mecanismo de ao. Clulas B esplnicas
murinas purificadas foram estimuladas ou no com ligantes de receptors tipo-Toll (LPS,
Pam3Cys e oligodeoxinucleotdeos com sequncias CpG) ou anti-IgM. Wariftena inibiu
a resposta proliferativa e a secreo de imunoglobulinas induzidas por esses estmulos.
Estudos cinticos demonstraram que a wariftena bloqueia a funo de linfcitos B
mesmo se adicionadas 24h aps o incio da cultura. A wariftena tambm inibiu a
resposta proliferativa induzida por aceteto mirstico de forbol (PMA) e o ionforo de
clcio A23187. A secreo de IgM in vitro (induzida tanto por LPS quanto por Pam3Cys),
e de IgM e IgG in vivo (induzida pelo antgeno TI-2 TNP-ficoll) foram inibidas pela
wariftena. Foram investigadas, ainda, as vias de sinalizao bloqueadas pela wariftena.
Nenhuma diferena foi observada nos nveis de fosforilao de protenas em resduos de
tirosinas. A warifteina inibiu o influxo de clcio induzido por anticorpo anti-IgM. Os
nveis de p-ERK foram reduzidos pela adio de wariftena a culturas de clulas B
estimuladas por LPS. A wariftena tambm diminuiu os nveis intranucleares de NFB.
Observou-se que a wariftena induz um aumento nos nveis intracelulares de cAMP, um
conhecido mensageiro que inibe a ativao da clula B. Nossos resultados sugerem que a
wariftena um potente inibidor da resposta da clula B in vitro e in vivo e seu efeito
vii

mediado pela reduo da fosforilao de ERK e da tranlocao do NFB ao ncleo,

provavelmente consequentes de um aumento nos nveis de cAMP. Esses achados indicam
que a wariftena pode ser uma ferramenta importante para estudos de sinalizao em
clulas B.

Palavras-chave: Warifteina, Linfocitos B, cAMP,

sympodialis, Transduo de sinal, Receptores tipo Toll.
Rio de Janeiro
Fevereiro de 2009

viii

Cissampelos

Juliana Dutra Barbosa da Rocha

Modulacao da Atividade de linfcitos B pela Warifteina isolada de

Cissampelos sympodialis.
Orientador:Ligia Maria Torres Pecanha
Resumo da Dissertao de Mestrado submetida ao Programa de Ps-Graduao em
Cincias (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Ges da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessrios para a
obteno do ttulo de Mestre em Cincias Biolgicas.

The hydroalcoholic leaf extract from Cissampelos sympodialis (CS) was previously
shown to inhibit both T and B cell function. Warifteine is the major alkaloid found in the
CS extract. In the present study we investigated whether warifteine would inhibit B cell
function and characterized its mechanism of action. Splenic purified murine B cells were
stimulated

with

either

Toll

like

receptor

ligands

(LPS,

Pam3Cys,

and

oligodeoxynucleotides with CpG sequences) or anti-mouse IgM. Warifteine inhibited

both proliferative response and immunoglobulin secretion induced by these stimuli.
Kinetics studies demonstrated that warifteine blocked B cell function even when added
24h after the beginning of the culture. Warifteine also inhibited the proliferative response
induced by Phorbol Myristate Acetate (PMA) and the calcium ionophore A23187. In
vitro IgM production (induced by both LPS and Pam3Cys) and in vivo TI-2 antigen
(TNP-ficoll)-induced IgM and IgG production were both inhibited by warifteine. We
further investigated the signaling pathways blocked by warifteine. No differences were
observed when the total levels of protein-associated phosphotyrosine were analyzed. We
observed that warifteine inhibited anti-IgM-induced the calcium influx. The levels of pERK were decreased in LPS-stimulated and warifteine-treated cultures. This substance
also diminished the nuclear levels of NFB. The alkaloid induced an increase in
intracellular cAMP levels, an intracellular messenger that was shown to inhibit B cell
activation. Our results suggested that warifteine was a potent inhibitor of B cell response
both in vivo and in vitro and this effect was mediated by a reduction in p-ERK levels and
ix

inhibition of NFB nuclear localization. These alterations were, probably, due to an

increase in intracellular cAMP concentrations. These findings indicate that warifteine
could be a useful tool for studying B cell signaling.

Key words: Warifteine, B Lymphocytes, cAMP,

sympodialis, Signal transduction, Toll-like receptors.
Rio de Janeiro
Fevereiro de 2009

Cissampelos

NDICE

RESUMO -----------------------------------------------------------------------------

vii

ABSTRACT --------------------------------------------------------------------------

ix

ABREVIATURAS ------------------------------------------------------------------

xiv

1. INTRODUO ------------------------------------------------------------------

1.1)Produtos Naturais ---------------------------------------------------------------

1.1.1) Relevncia e viabilidade do estudo de compostos derivados de plantas

medicinais.--------------------------------------------------------------------------

1.1.2) Alcaloides e suas funes biolgicas --------------------------------------

1.1.3) Cissampelos sympodialis ---------------------------------------------------

1.1.4) Wariftena ---------------------------------------------------------------------

1.2) Mecanismos de Ativao da clula B ---------------------------------------

1.2.1) Resposta a antgenos T dependentes ------------------------------------

1.2.1.1) Ligao ao CD40 ----------------------------------------------------------

1.2.1.2) Citocinas --------------------------------------------------------------------

11

1. 2. 2) Resposta de linfcitos B a antgenos Tindependentes ---------------

12

1.2.2.1) Ativao de linfcitos B por antgenos T independentes tipo 1 ---

12

1.2.2.2) Mecanismo de ativao de linfcitos B por antgeno T

independentes tipo 2 ----------------------------------------------------------------

15

1.3) Linfcitos B e cAMP ----------------------------------------------------------

16

2. OBJETIVOS ---------------------------------------------------------------------

19

3. OBJETIVOS ESPECIFICOS------------------------------------------------

19

4. MATERIAIS E MTODOS -------------------------------------------------

20

4.1) Reagentes ------------------------------------------------------------------------

20

4.2) Purificao da wariftena-------------------------------------------------------

20

xi

4.3) Animais --------------------------------------------------------------------------

21

4.4) Isolamento de linfcitos B murinos e preparo das culturas ---------------

21

4.5) Linhagens celulares ------------------------------------------------------------

22

4.6) Verificao da toxicidade da wariftena -------------------------------------

22

4.7) Medida da resposta proliferativa de linfcitos B----------------------------

23

4.8) Avaliao da secreo de Imunoglobulinas induzida por molculas

ativadoras policlonais in vitro ------------------------------------------------------

23

4.9) Avaliao da secreo de imunoglobulinas antgeno-especficas em soro

de animais imunizados --------------------------------------------------------------

24

4.10) Dosagem de clcio-------------------------------------------------------------

25

4.11) Anlise da inibio da fosforilao total e de protenas da famlia ERK

por Western Blotting ----------------------------------------------------------------

25

4.12) Dosagem de NFB em extratos nucleares por EMSA -------------------

27

4.13) Dosagem de Adenosina monofosfato cclico (cAMP) -------------------

27

4.14) Anlise estatstica -------------------------------------------------------------

28

5. RESULTADOS------------------------------------------------------------------

29

5.1) Wariftena no apresenta efeito citotxico sobre a clula B --------------

29

5.2) Wariftena inibe a proliferao celular induzida por diversos ativadores

policlonais da clula B ---------------------------------------------------------------

29

5.3) Efeito inibitrio da wariftena ocorre mesmo em etapas mais tardias do

processo de ativao da clula B ---------------------------------------------------

30

5.4) Wariftena reduziu a secreo de imunoglobulinas in vitro e in vivo ---

30

5.5) Efeito inibitrio da wariftena ocorre mesmo quando PMA e A23187 so

adicionados cultura de linfcitos B -----------------------------------------

31

5.7) Wariftena bloqueia o influxo de clcio em linfcitos B murinos

estimulados por anti-IgM -----------------------------------------------------------

31

5.8) Wariftena no altera o padro de fosforilao total de clulas B, porm

inibe a fosforilao da protena ERK presentes em linfcitos B tratados e
estimulados por LPS ----------------------------------------------------

xii

32

5.9) Reduo na concentrao de NFB no ncleo de clulas B estimuladas

com LPS e tratadas com wariftena------------------------------------------------

32

5.10) Wariftena induz aumento na concentrao intracelular de cAMP -----

32

6. FIGURAS -------------------------------------------------------------------------

33

7. DISCUSSO ----------------------------------------------------------------------

47

8. COLCLUSES ------------------------------------------------------------------

54

9. REFERNCIAS ----------------------------------------------------------------

56

10. ANEXOS __________________________________________________

64

xiii

ABREVIATURAS

AC

Adenilato ciclase

AFL

Frao aquosa do extrato hidroalcolico de folhas de Cissampelos sympodialis

(Aqueous fraction from leaf)

AP-1

Protena ativadora 1 (activator protein 1)

BCR

Receptor para antgenos da clula B

cAMP

Adenosina 3,5 monofosfato cclica

CD80

B7.1

CD86

B7.2

cre

Elementos responsivos ao cAMP (cAMP response elements)

CREB

Protenas que se ligam ao cre (cre biding protein)

Csk

Src quinase que fosforila resduos caboxi-terminais (carboxi src kinase)

EPAC

Fator de troca de nucleotdeo guanina responsivo ao cAMP (cAMP responsive

guanine nucleotide exchange factor)

ERK

Protena quinase regulada por sinais extracelulares (extracellular signal-regulated

kinase)

DAG

Diacilglicerol

GEF

Fatores de troca de nucleotdeos guanina (guanine-nucleotide exchange factors)

ICER

Repressor precoce induzido pelo cAMP (inducible cAMP early repressor)

INF-

Interferon gama

IB

Molcula inibidora do NFB

IP3

Inositol-trifosfato

IRAK

Receptor de IL-1 associado a protenas tirosinas quinases (IL-1 receptor

associated protein kinases)

ITAM

Padres de ativao de imunoreceptores com resduos de tirosina

(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs)

xiv

JNK

Protena quinase da poro N-terminal de Jun (Jun N-terminal kinase)

LPS

Lipopolissacardeo bacteriano

MAPK

Protenas quinases ativadas por mitgenos (Mitogen-activated protein kinases)

MyD88

Protena adaptadora associada aos TLR

NF-AT

Fator nuclear de ativao da clula T ativada. (nuclear factor of activated T cell)

NFB

Fator nuclear B

Pam3Cys

Ligante de TLR2

PDE

Fosfodiesterase

PGE2

Prostaglandina E2

PIP2

Fostatidil inositol bifosfato

PLC

Fosfolipase C

PMA

Acetato miristtico forblico

PKA

Protena quinase dependente de cAMP (Protein kinase A)

PKC

Protena quinase C (Protein kinase C)

PKR

Protena quinase R (Protein kinase R)

SH

Domnio com homologia as Src quinases (Src homology domain)

Src quinases

Famlia de protenas com atividade de quinase de tirosinas identificada

inicialmente como uma protena derivada do vrus de Sarcoma de Rous (RSV),
protean essa derivada da protena c-Src de mamferos.

Stat

Protena transdutora de sinal e ativadora da transcrio (Signal transduction and

activators of transcription)

TCR

Receptor da clula T

TIR

Toll-IL-1 receptor

TLR

Receptores tipo-toll (Toll-like receptors)

TRAFF

Fatores associados aos receptores de TNF (TNF receptors-associated factors)

xv

1. INTRODUO
1.1) Produtos Naturais
1.1.1) Relevncia e viabilidade do estudo de compostos derivados de plantas
medicinais.
Segundo um levantamento realizado pelo rgo norte-americano National
Institutes of Health (NIH), estima-se que oitenta porcento da populao mundial utiliza
plantas medicinais como forma de terapia primria (Schuster, 2001).
Produtos naturais e seus derivados tm sido tradicionalmente utilizados pela
medicina como fonte para produo de diversos frmacos. Ao mesmo tempo, o seu
estudo gera uma enorme lucratividade para as importantes indstrias farmacuticas
(Kaul, 1998).
Um levantamento realizado em 1985 mostrou que vinte e cinco porcento dos
compostos ativos presentes nos frmacos eram provenientes de plantas (Balandrin et al,
1985; Halbeirstein, 2005). Dez anos mais tarde, vinte mil plantas medicinais foram
avaliadas pela Organizao Mundial de Sade (OMS), entretanto, desses estudos,
somente 250 investigavam quais compostos qumicos ativos estavam presentes nessas
plantas (Naranjo, 2003). Um estudo mais recente revelou que cinquenta porcento dos
frmacos mais vendidos pela indstria farmacutica possuiam compostos ativos
devivados de plantas (Schuster, 2001).
Esses fatos associados indicam uma necessidade no fomento das pesquisas na
rea de isolamento de compostos ativos e do estudo da funo dessas substncias
presentes em plantas medicinais, normalmente j utilizadas pela medicina popular.

1.1.2) Alcalides e suas funes biolgicas.

Alcalides so um grande grupo metablitos secundrios que contm nitrognio
em sua estrutura (Pelletier, 1982). Originalmente o termo alcalide estava associado a
molculas farmacologicamente ativas derivadas de metablitos secundrios de plantas.
Atualmente, o termo ganhou uma utilizao mais geral e se refere a molculas
nitrogenadas de origem natural que contm nitrognio em sua estrutura, com exceo dos
aminocidos simples, protenas e substncias que contm origem policetdeas (como

alguns antibiticos aminoglicosdeos). Assim eles so divididos em diferentes grupos de

acordo com o aminocido que os originou (Pelletier, 1982). Eles podem ser derivados de
plantas, insetos, micorganismos (como fungos e bactrias) e ate mesmo mamferos
(Kutcham, 1995).
A palavra alcalide deriva da palavra rabe al-quali que significa o nome da
planta da qual a soda foi primeiramente extrada. O primeiro alcalide isolado foi a
morfina, derivada da planta Papaver somniferum em 1806 por Sertner (Kutcham, 1995).
Alcalides bisbenzilisoquinolnicos so formados a partir dos aminocidos
tirosina ou fenilalanina (Pelletier, 1982). So molculas bsicas heterocclicas, que
possuem a molcula de nitrognio em sua estrutura. Em sua grande maioria so
metablitos secundrios de plantas e a eles so atribudas diferentes funes biolgicas
(Pelletier, 1982). Eles representam o maior grupo de compostos dentro da famlia dos
alcalides isoquinol;ilicos com mais de 350 membros descritos (Keseru & Ngradi,
1995).
De acordo com a literatura, diferentes alcalides bisbenzilisoquinolnicos so
conhecidos por possurem atividades antiinflamatrias (Ferrante et al, 1990), antiproliferativas (Yoo et al, 2002) e por inibir a invaso e o crescimento de diferentes
parasitos, como Trypanosoma cruzi (Fournet et al, 2000), Leishmania sp. (Fournet et al,
1993) e Plasmodium sp. (Dreyfuss et al, 1987).
Dentre os diferentes alcalides bisbenzilisoquinolinicos j conhecidos pela
comunidade cientfica podemos citar a tetrandrina, a cepharanthina, a daphnolina, a
andrina, a linacina, a pheanthina, entre tantos outros com atividade biolgica comprovada
(Fournet et al, 1997; Fournet et al, 2002).
A tetrandrina um dos alcalides bisbenzilisoquinolnicos mais estudados. Ela
isolada da raiz da planta Stephania tetrandra S Moore, que amplamente utilizada pela
Medicina Tradicional Chinesa (Ferrante et al, 1990). Alm de apresentar aes antiinflamatrias, anti-proliferativa, e anti-parasitaria j comprovadas (Ferrante et al, 1990;
Fournet et al, 2000; Yoo et al, 2002). Dentre os alcalides bisbenzilisoquinolnicos, ela
uma das poucas substncias a possurem seu mecanismo de ao j descrito. Acredita-se
que ela possua diferentes alvos moleculares de acordo com sua atividade esperada. Com
relao atividade parasiticida ela atua bloqueando canais de clcio que impede a entrada

do parasito (Felix, King & Shevell, 1992). J sobre o mecanismo anti-inflamatrio

observou-se uma ao pleiotrpica, com a substncia inibindo a secreo de TNF-, a
proliferao celular, a produo de espcies reativas de oxignio e a translocao do fator
de transcrio NFB ( Chem et al, 1997).
Nesta dissertao avaliamos o efeito de um derivado de um produto natural, a
wariftena, que um alcalide bisbenzilisoquinolnico, sobre os linfcitos B e
investigamos o seu mecanismo de ao. Esse alcalide isolado da planta Cissampelos
sympodialis da famlia Menispermaceae (Rodhes, 1975).

1.1.3) Cissampelos sympodialis

J foram caracterizadas 19 espcies do gnero Cissampelos e 9 destas so
encontradas no Brasil (Rodhes, 1975). Uma das espcies, Cissampelos sympodialis Eich
(Menispermaceae), popularmente conhecida por Milona (ou tambm conhecida por:
jarrinha, orelha de ona ou abuteira), encontrada no Nordeste e Sudeste do Brasil e o
ch da raiz desta planta largamente usado na medicina popular para o tratamento de
doenas de carter inflamatrio e alrgico (Correa, 1984). Abaixo uma foto da folha da
Cissampelos sympodialis (Esquema 1).
Diversos trabalhos demonstraram o efeito da frao aquosa do extrato
hidroalcolico (AFL) de Cissampelos sympodialis sobre musculatura lisa. Foi observada
a induo do relaxamento da musculatura lisa brnquica e inibio de broncoespasmo
induzido por histamina em cobaios sensibilizados por ovoalbumina (Thomas et al,
1997a). Alm disso, foi demonstrado um aumento no nmero de clulas mononucleares
presentes no lavado broncoalveolar de animais tratados com a AFL (Ferreira et al, 1996).
Em relao ao mecanismo de ao desta substncia, foi demonstrado que a AFL
aumenta os nveis intracelulares de cAMP em clulas musculares traqueais e foi
observada a inibio de fosfodiesterases (PDE) IV e V (enzimas que degradam o cAMP)
em musculatura pulmonar de cobaios. Assim, uma possibilidade que a AFL atue
inibindo essas enzimas e aumentando os nveis intracelulares desse mensageiro
secundrio. (Thomas et al, 1997b).

Esquema 1. Folha da Cissampelos sympodialis (Porto et al, 2008).

A AFL age em clulas que participam da resposta imunolgica, esta ao pode
estar relacionada ao seu efeito antiinflamatrio. O extrato inibe a desgranulao induzida
por Formyl-Met-Phe-Pro (fMLP) em neutrfilos isolados de sangue perifrico. Este
efeito decorre do aumento de cAMP atravs da ativao da enzima PKA (Thomas, Selak,
& Henson, 1999). Alm disso, a AFL inibe, ainda, a migrao de neutrfilos para a
cavidade peritoneal de ratos (Batista-Lima et al, 2001). O extrato possui propriedades
antialrgicas e foi observado no modelo experimental de asma que esta atividade decorre
da inibio da produo de leucotrienos e do bloqueio da migrao de eosinfilos
(Bezzerra-Santos et al, 2006). Tambm foi observado que a AFL inibe a atividade
microbicida de macrfagos (Alexandre-Moreira et al, 2003).
A AFL isolada de C. sympodialis apresenta, ainda, ao sobre clulas linfides. J
foi descrito que este extrato inibe in vitro a resposta proliferativa de clulas T e aumenta a
produo das citocinas IL-10 e IL-4 em culturas estimuladas por concanavalina A
(Piuvezam, Peanha & Thomas, 1999). Da mesma maneira, foi descrito que a AFL
diminui os nveis de IgE e induz a secreo da citocina interferon (INF) em
camundongos sensibilizados por ovoalbumina (Bezzera-Santos et al, 2004). Estes
achados indicam que no modelo de ativao de linfcitos T in vitro, a AFL induziria
aumento da produo da citocina Th2 IL-4 e no modelo de alergia in vivo seria
aumentada a produo de IFN. Como estas citocinas apresentam efeito antagnico,
necessrio um estudo mais aprofundado para esclarecer o mecanismo de ao anti-

alrgica desse extrato. Porem vale ressaltar que os modelos experimentais utilizados para
a avaliao desses aspectos forem diferentes e que isso poderia justificar esses diferentes
efeitos da AFL.
Em relao ao efeito da AFL na resposta de linfcitos B, foi observado que este
extrato inibe a resposta proliferativa da clula B estimulada por LPS, anti-delta-dextrana
e anti-IgM, entretanto, no foi observada inibio da resposta proliferativa quando clulas
B ativadas eram previamente tratadas com anticorpo anti- MHC de classe II (AlexandreMoreira, Piuvezam & Peanha, 2003). Foi observada, ainda, neste mesmo trabalho, a
inibio da secreo de imunoglobulinas quando a AFL era adicionada a culturas de
linfcitos B de animais infectados com Trypanossoma cruzi. A AFL induz em clulas B
um aumento no nvel de cAMP (Alexandre-Moreira, Piuvezam & Peanha, 2003). Esse
fato, em conjunto com os dados citados anteriormente em outros modelos, pode indicar
que o aumento da produo de cAMP poderia estar relacionado com o mecanismo de
ao da AFL.
1.1.4) Wariftena
Estudos fitoqumicos da frao hidroalcolica da AFL culminaram com o
isolamento de alguns alcalides: wariftena, metilwariftena, milonina, laurofolina,
liriodenina e roramina (Lira et al, 2002).
A wariftena (estrutura mostrada no esquema 2) um alcalide tercirio do tipo
bisbenzilisoquinolnico e o alcalide majoritrio isolado tanto da raiz quanto das folhas
da espcie Cissampelos sympodialis (Barbosa-Filho, Agra & Thomas, 1997)
J foi descrito que a wariftena apresenta ao espasmoltica sobre msculo
cardaco, traquia e tero de cobaios. Alm disso, foi observado que a wariftena inibiria
diversos processos que regulam a liberao intracelular de clcio (Freitas et al, 1996).
Foi sugerido que essa diminuio na liberao de clcio decorreria de um aumento
intracelular de nucleotdeos cclicos como a adenosina monofosfato cclica (cAMP), e
que esse acmulo seria decorrente de uma ao inibitria da wariftena sobre as
fosfodiesterases (Thomas et al, 1997b; Thorphy, 1994). Estudo de citotoxicidade da
wariftena em linhagens de hepatcitos e fibroblastos mostram que o IC50 da wariftena
varia entre 10 M e 35 M (Melo et al, 2003).
5

Esquema 2. Estrutura qumica dos diferentes alcalides isolados da folha da

Cissampelos sympodialis (Barbosa-Filho et al, 1997 ).
Recentemente, foram observadas propriedades antialrgicas desse alcalide, e esta
atividade seria decorrente da inibio da produo de leucotrienos e do bloqueio da
funo de eosinfilos em modelos de asma experimentais (Bezzerra-Santos et al, 2006).
Tambm foi observado que o tratamento com a wariftena, em animais sensibilizados por
ovoalbumina, inibe choque anafiltico e diminui os nveis sricos de IgE. Alm disso, foi
observado que a wariftena inibe a proliferao de leuccitos especficos para
ovoalbumina nesse sistema; indicando que essa substncia possui ao inibitria
marcante mesmo em clulas pr-ativadas (Costa et al, 2008).
1. 2) Mecanismos de Ativao da clula B
Clulas B maduras podem ser ativadas por diferentes mecanismos. Esta ativao
pode decorrer do contato com o linfcito T ou ser conseqncia da ligao de molculas
a diferentes protenas da superfcie da clula B. Aps a ativao celular induzida pelo
6

contato com o antgeno, a clula passa por um processo de diviso celular e de

diferenciao em plasmcitos (clulas secretoras de imunoglobulinas) ou de
diferenciao em clulas de memria (Parker, 1993).
No processo de

ativao T-dependente sinais seriam dados pela ligao do

antgeno a imunoglobulina (IgM ou IgD) de superfcie (conhecido como receptor da

clula B - BCR), pela interao entre o CD40 e o seu ligante e por sinais dados por
citocinas como IL-4 (Parker, 1993; Bishop & Hortager, 2003). No processo de ativao
T-independente, os sinais seriam dados pela ligao a receptores tipo toll (resposta Tindependente tipo 1) ou pela ligao cruzada do BCR na presena de diferentes sinais
acessrios (resposta T-independente tipo 2) (Mond et al, 1995; Ruprecht et al, 2006).
1.2.1) Resposta a antgenos T dependentes.
A primeira etapa da resposta T-dependente ocorre a partir da internalizao do
antgeno aps seu contato com o BCR. Esta interao do antgeno com o seu receptor
especfico dispara uma srie de sinais intracelulares (Cambier & Julies, 1987).
A ligao do antgeno ao BCR leva a uma agregao destas molculas. A partir
dessa agregao, resduos de tirosina presentes na poro intracelular das molculas Ig e
Ig, que esto associadas a este receptor, so fosforilados (Reth & Wienands, 1997).
Aps esta fosforilao, estas molculas atuam como stios de ligao para uma srie de
protenas de sinalizao. As molculas Ig e Ig so essenciais para a sinalizao, j que
o BCR no apresenta poro intracitoplasmtica. A fosforilao dos resduos de tirosina
(presentes em seqncias de aminocidos denominadas ITAM) mediada por protenas
quinases de tirosinas da famlia Src (Cambier, 1995). Aps a ligao das protenas da
famlia Src na poro fosforilada de Ig e Ig, ocorre o recrutamento da protena tirosina
quinase da famlia Syk, elemento chave do processo de sinalizao (Kurosaki, 1999).
A esta sinalizao inicial seguem-se uma srie de sinais em cascata que
culminam com a ativao de diversos fatores de transcrio. Uma das protenas ativadas
aps a sinalizao inicial mediada pela ativao de protenas quinases de tirosinas a
enzima fosfolipase C (PLC). Esta enzima catalisa a quebra do fosfolipdio de
membrana fosfatidilinositol 4, 5 difosfato (PIP2) em inositol 1,4,5 trifosfato (IP3) e

diacilglicerol (DAG). O DAG participa no processo de ativao da protena quinase C

(PKC) o que tem, provavelmente, como uma das conseqncias, a translocao do fator
de transcrio NFB para o ncleo. O IP3 atua induzindo a liberao de clcio do retculo
endoplasmtico. Este aumento de clcio intracelular vai induzir a desfosforilao do fator
nuclear NFAT pela Calcioneurina, que , assim, induzido a translocar-se para o ncleo
(De Franco, 1994; Yamamura, 1998; Campbell, 1999).
A sinalizao inicial leva, ainda, a ativao de duas vias de MAP quinases
(MAPK - mitogen activated protein kinase). Uma destas vias iniciada pela
fosforilao da protena trocadora de nucleotdeos (GEF) Vav, que leva a ativao da
protena G de baixo peso molecular Ras. A outra via iniciada pela GEF denominada
Sos. Essas GEF podem se ligar, respectivamente, a dois tipos de molculas adaptadoras
Rac (Crespo et al, 1997) e Ras (Boriack-Sjodin et al, 1998). Essa ativao leva a
estimulao das quinases ativadas por mitgenos (ERK e JNK) e a conseqente formao
do fator de transcrio AP-1. Um modelo esquemtico apresentado no Esquema 3.
Acredita-se que o complexo antgeno-BCR seja internalizado aps a ligao do
antgeno e que este processo seja decorrente da ligao cruzada do antgeno ao BCR e da
formao de lipid-rafts (pores de membrana ricas em colesterol e esfingolipdios)
associados clatrinas (Ma et al, 2004; Stoddart et al, 2002). A utilizao de clatrinas e a
formao dos lipid-rafts, no entanto, ainda especulativa e no amplamente aceita, j
que alguns estudos demonstraram a internalizaro direta desse complexo sem a formao
desses lipd-rafts (Chung, Bawmeister & Monroe, 2001; Putmam et al, 2003).
O sinal dado pela ligao do antgeno ao BCR amplificado pelo complexo coreceptor formado pelas protenas CD19, CD21 (receptor da molcula C3d do sistema
complemento) e CD81. Acredita-se que a ligao do C3d a esse complexo amplifique a
ativao induzida pela ligao ao BCR. Provavelmente, a sinalizao se inicia pela
ligao de CD3d acoplado molcula de antgeno ao CD21 e se propaga via CD19, j
que essa molcula a nica que possui cauda intracitoplasmtica, sendo, assim, a nica
capaz de transduzir sinalizao. O papel importante desta molcula na resposta a
antgenos foi demonstrado atravs de estudos que demonstraram que animais deficientes
de C3 apresentavam resposta deficiente a antgenos (Toapanta et al, 2006).

Esquema 3. Modelo de sinalizao aps ligao do antgeno ao BCR. A ligao

ao BCR inicia a fosforilao dos resduos ITAM presentes nas caudas
intracitoplasmticas de Ig e Ig por protenas da famlia Src. A partir desse
processo, as diversas vias de sinalizao indicadas (ativao de PLC, PKC, via da
calcioneurina, via das MAP quinases e migrao de NFB para o ncleo) so
induzidas (figura retirada de Goldsby et al, 2000).
1.2.1.1) Ligao ao CD40.
Aps a ligao de antgenos proticos ao BCR essas molculas so internalizadas,
processadas e apresentadas via MHC de classe II pela clula B. O complexo peptdeoMHC de classe II liga ao TCR (receptor da clula T) e ocorre interao entre molculas
de superfcie da clula B e molculas acessrias presentes na clula T (Parker et al,
1993).
O CD40 uma molcula de funo crucial no processo de ativao de linfcitos
B, a ligao desta ao seu receptor (CD154) induz a entrada em ciclo celular (Bishop &
Hortager, 2003). Esta molcula est presente em outros tipos celulares, entretanto, seu
papel biolgico foi primeiramente investigado nos linfcitos B (Bishop & Hortager,
2003). O CD40 uma glicoprotena transmenbrana de 48 KDa da famlia do receptor do
fator de necrose tumoral (TNFR). O CD40 liga ao CD154, uma protena de 30 KDa
expressa na membrana de clulas T ativadas (Klaus et al, 1997).
9

Por muito tempo ficou desconhecido o ligante da molcula CD40, e sua exata
funo nas clulas do sistema imune. J era sabido no final da dcada de 1980 e inicio da
dcada de 1990, que a adio in vitro anticorpo anti-CD40 associado citocina IL-4,
fazia com que a clula B proliferasse e que essa proliferao era mantida na presena
desses estmulos (Gordon, 1995). Porem no se sabia ao certo quem seria a fonte
fisiolgica desse ligante, nem qual o papel dessa ligao na sobrevivncia,
desenvolvimento e diferenciao dos linfcitos B e das outras clulas que o expressavam
(Banchereau et al, 1993). Entretanto estudos de mapeamento gentico demonstraram que
pacientes que sofriam de diferentes doenas genticas como agamaglobulinemia
associada ao cromossoma X (X-linked agamaglobulinemia), sindrome de WiskottAldrich, imunodeficincia severa combinada associada ao cromossoma X (X-linked
severe

combined

immunodeficiency),

sindrome

linfoproliferativa

associada

ao

cromossoma X (X-linked linfoproliferative sindrome) e sndrome de hiper-IgM associada

ao cromossoma X (X-linked hiper-IgM simndrome) indicaram o caminho para o
entendimento das funes da molcula de CD40 e de seu ligante (Banchereau et al,
1993).
Nesses estudos foi identificado que as alteraes genticas que induziam a doena
estavam associadas ao gene do ligante do CD40. Assim, em modelos experimentais onde
era mutada a regio relaciona ao CD40L ou em modelos que nocauteavam a molcula de
CD40 os amimais apresentavam sintomatologia semelhante dessas doenas. Essas
estavam associadas incapacidade de montar uma resposta imune duradoura, com
presena de clulas de memria, produo de diferentes isotipos de imunoglobulinas e
formao de centro germinativo. Assim se associou a molcula de CD40 e seu ligante ao
mecanismo de ativao T-dependente dos linfcitos B (Banchereau et al, 1993).
O sinal via a ligao do CD40 ao seu ligante leva a ativao de protenas da
Famlia TRAFF (TNF receptor associated factors) que so protenas adaptadoras que
fazem a ligao entre a cadeia intracitoplasmtica do CD40 e diversas protenas com
atividade de protena quinase de tirosina (por exemplo, JNK, p38, GCK, MEKK1, IKK,
MAPK3) (Bishop & Hortager, 2003). A ativao destas quinases leva ativao de
fatores de transcrio como o NFB, AP-1, NF-AT, NF-IL6, Stat6 e BSAP (Bishop &

10

Hortager, 2003). Acredita-se que o NFB seja o fator principal que orquestraria as
principais funes do CD40 (Hsing & Bishop, 1999; Weih et al, 1995). Esta ligao,
entre outros efeitos j citados anteriormente, leva a modulao positiva da expresso de
molculas de CD86 (B7-2) e CD80 (B7-1), sinal este que melhora interao com a clula
T (via CD28) (Bishop & Hortager, 2003; Yang & Wilson, 1996).
1.2.1.2) Citocinas.
Para que a clula B secrete imunoglobulinas e realize mudana de classe, so
necessrios sinais adicionais ligao ao CD40. Este sinal adicional dado por algumas
citocinas. Entre as citocinas mais relevantes para a resposta de linfcitos B murinos esto
IL-2, IL-4 e IL-5, que atuam, cada uma delas, de forma especfica na clula B (Paul &
Ohara, 1987; Zubler et al, 1987; Takatsu, 1997). A ativao T-dependente in vivo leva a
clula B expanso clonal, formao do centro germinativo, mudana de classe de
imunoglobulinas e formao de plasmcitos de longa durao (Garside et al, 1998).
Alguns autores acreditam que seria necessrio um terceiro sinal para uma plena
ativao T-dependente da clula B. Esse sinal seria dado pelos ligantes de receptores
tipo-Toll (Passare & Medzhitov, 2006; Ruprecht & Lanzavecchia, 2006), molculas que
se acreditava estarem relacionadas exclusivamente com a resposta T independente tipo I.
Esses ativadores sero descritos posteriormente. Ainda existem, no entanto, especulaes
sobre o papel fundamental destas molculas na resposta T-dependente (Gavin et al, 2006;
Nemazee et al, 2006). Atualmente mais aceita a hiptese de que os sinais dados pelos
receptores tipo-toll seriam complementares, mas no fundamentais. Eles atuariam
amplificando a resposta humoral (Meyer-Bahlburg, Khim & Rawlings, 2007). Abaixo um
modelo do mecanismo molecular associado a resposta T-dependente (Esquema 4).

11

Esquema 4. Mecanismo molecular associado reposta a antgenos T-dependente.

Interao entre o linfcito B e o linfcito T, ligao do MHC de classe II ao TCR;
ligao do CD40 com o CD154; ligao das citocinas aos seus receptores (Banchereau et
al, 1993).
1.2.2)RespostadelinfcitosBaantgenosTindependentes.

1.2.2.1) Ativao de linfcitos B por antgenos T independentes tipo 1.

A resposta conhecida como resposta T-independente tipo I consiste na ativao
direta dos linfcitos B por um grupo de molculas de estrutura varivel. Essas molculas
se caracterizam pela ligao a receptores tipo-Toll (TLR). Os receptores Toll foram
primeiramente caracterizados em Drosophila melanogaster, e nomeados como receptores
tipo-Toll (TLR toll-like receptor) em mamferos (Lemaitre et al, 1996). J foram
caracterizados 12 membros dessa famlia em mamferos, sendo o TLR4 o primeiro a ser
descrito (Akira & Takeda, 2004). Os TLR so glicoprotenas de membrana que possuem
na sua cadeia intracitoplasmtica um domnio rico em prolina conhecido como TIR (TollIL-1 receptor) que similar mesma poro presentes em receptores para a citocina IL-1
(Takeda e Akira, 2004).

12

Com o avano dos estudos foi descoberto que esses receptores so expressos em
diversas espcies e em diferentes tipos celulares (Akira & Takeda, 2004). O TLR4
normalmente associado ao reconhecimento do lipopolissacardio (LPS) presente em
bactrias Gram-negativas; o TLR9 um receptor intracelular que reconhece
oligodeoxinucleotdeos com seqncias CpG. O TLR2 reconhece lipoprotenas
bacterianas e molculas fngicas como o zimozam. Esses so apenas exemplos da
diversidade de molculas reconhecidas pelos TLR (Takeda & Akira, 2004; Takeda,
Kaisho & Akira; 2003).
A ligao destes estmulos em TLR expressos por linfcitos B inicia uma cascata
de sinalizao que culmina na expresso de fatores de transcrio que levaro ativao
policlonal (Coutinho, et al; 1974; Krieg, et al, 2002). Esse tipo de ativao normalmente
leva a clula B a proliferar e secretar imunoglobulinas (que so inespecficas na grande
maioria). Esta ativao inicial seguida por diferenciao em plasmcitos e a mudana
de classe de imunoglobulinas (Jegerlehner et al, 2007). A expresso de citidina
deaminase (AID), uma enzima fundamental para a induo de mudana de classe e
hipermutao somtica, tambm j foi descrita aps a ativao via TLR (Meyer-Bahlburg
& Rawlings, 2008).
A sinalizao via TLR induz, ainda, a entrada da clula em ciclo celular e,
conseqentemente, a produo citocinas (como IL-6, IL-10 e interferon do tipo 1) e um
aumento da expresso de marcadores de ativao como as molculas de CD80, CD86,
CD25 e MHC de classe II (Rhee & Hwang, 2000; Chiron et al, 2008; Vanden-Bush &
Bishop, 2008; Meyer-Bahlburg & Rawlings, 2008).
Os linfcitos B expressam algumas molculas da famlia dos TLR (Dassari et al,
2005). Entretanto, existem diferenas entre a expresso destas molculas em clulas
humanas e murinas. Acredita-se que essa diferena esteja relacionada a uma modificao
evolutiva. Clulas B de camundongos expressam constitutivamente TLR4, TLR9 e TLR2
(Iwasaki & Medzhitov, 2004; Takeda & Akira, 2003), e a expresso de TLR3 restrita a
clulas B de zona marginal (Genestier et al, 2007; Gurujaram, Jacob & Pulendram,
2007).
J as clulas B humanas normalmente s expressam os TLR aps serem
estimuladas (Bernasconi, Onai & Lanzavecchia, 2003; Bernasconi, Traggiai &

13

Lanzavecchia, 2002; Bourke et al, 2003). A presena desses receptores maior em

plasmcitos e clulas de memria. Os linfcitos B humanos ativados expressam os
receptores TLR3, TLR6, TLR7, TLR9 e TLR10. Assim, a maioria dos estudos utilizando
clulas B humanas investiga a resposta induzida por TLR9 (Bernasconi, Onai &
Lazavecchia, 2003; Bourke et al, 2003). A presena da molcula adaptadora TRIF em
linfcitos B humanos no foi comprovada, assim, ainda no clara a participao dessa
molcula adaptadora na ativao dos linfcitos B pelos receptores tipo-toll (Chiron et al,
2008).
Existe controvrsia quanto presena do TLR4 em clulas B humanas (Mita et al,
2002). No entanto, como esse receptor expresso constitutivamente em camundongos e
apresenta importantes vias de sinalizao comuns a outros ligantes de receptores tipo-toll,
o TLR4 considerado um bom modelo de estudo (Horng et al, 2002).
A ativao dos TLR se inicia pelos domnios TIR e, associado a esse domnio,
existe uma protena adaptadora chamada MyD88. A partir do recrutamento dessa protena
e da associao com protenas da famlia IRAK (IL-1 receptor associated protein
kinases) ocorre a expresso de fatores de transcrio.
O lipopolissacardeo bacteriano (LPS) o ligante mais conhecido e estudado da
via de sinalizao do TLR4. Esta molcula, aps sua interao com a molcula MD2 (o
qual se associa ao TLR4) induz a homodimerizao do TLR4 ou a dimerizao do TLR4
com a molcula de RP105 (nessa situao o LPS se associada molcula MD1) (Peng,
2005). O RP105 tambm conhecido como CD180, tem estrutura muito similar ao TLR4,
porm no possui o domnio TIR. Em linfcitos B de camundongos ela capaz de induzir
ativao via LPS (Chiron et al, 2008), porm em outros modelos celulares (clulas
dendrticas) ele considerado um mecanismo de regulao da ativao, j que nessas
clulas ele no induz ativao quando associado ao LPS (Divanovic et al, 2007). Aps a
ligao ao receptor, a sinalizao via TLR4 pode seguir duas vias: uma mediada pela
associao das protenas TIRAP-MyD88 (dependente de MyD88) e outra mediada por
TRIF-TRAM (independente de MyD88). A via dependente de MyD88 leva a ativao de
trs protenas quinases: IRAK, TRAF6 e TAK1 e tem como produto final a translocao
do NFB para o ncleo. Alm disso, a protena TAK 1 ativa a via das MAPK, levando a
formao de AP-1. A via independente de MyD88, alm de induzir a migrao de NFB

14

para o ncleo, ativa a protena quinase R (PKR), que est envolvida na expresso de
outros fatores de transcrio como STAT 1e IRF3, que esto associados a induo de
genes da famlia do interferon (Peng, 2005). A maioria dos TLR utiliza a via de
sinalizao, dependente MyD88. Entretanto, j sabido que as molculas de TLR3,
aparentemente, no utilizam essa via. Assim, durante sua ativao, no existe o
recrutamento de MyD88, e sim da molcula TRIF, que tambm possui domnios TIR.
Uma esquematizao da ligao do LPS ao TLR4 esta presente no esquema 5.

Esquema 5. Sinalizao do TLR4 em clulas B. O LPS se liga ao MD2 ou MD1,

que esto associadas s molculas TLR4 e RP105, respectivamente. Por
homodimerizao ou heterodimerizao a cauda intracitoplasmtica do TLR4
associa a molcula adaptadora MyD88 ou a protena TRIF. Estas vias de sinalizao
culminam, respectivamente, na ativao dos fatores de transcrio NFB e AP-1 ou
na induo de genes da famlia do INF do tipo I (Adaptado de Peng, 2005).

15

1.2.2.2) Mecanismo de ativao de linfcitos B por antgeno T independentes tipo

2.
Os antgenos T-independente tipo 2 so molculas de alto peso molecular que apresentam
stios repetitivos. So exemplos dessas molculas polissacardeos, glicolipdeos e cidos
nuclicos (Mosier, Mond & Golding, 1977). O prottipo dos antgenos T-independentes
tipo 2 so polissacardeos de alto peso molecular que, ao se ligarem clula B, levam
transduo de sinais e ativao direta desta clula (Mond, Lees & Snapper, 1995). Estas
molculas normalmente so grandes e multivalentes e podem induzir ligaes cruzadas
dos BCR e agregao destas molculas (Mond, Lees & Snapper, 1995). Normalmente
uma pequena quantidade destes antgenos suficiente para induo de ativao, j que
estas induzem uma sinalizao intensa e de longa durao (Brunswick et al, 1988;
Yamada et al, 1993).
A ocorrncia de mudana de classe de imunoglobulina aps a ativao por
antgenos T-independentes tipo II depende da presena de um segundo sinal. Este sinal
pode ser dado, por exemplo, por citocinas secretadas por clulas T e NK (Mond, Lees &
Snapper, 1995). Este sinal pode ser ainda, induzido por produtos microbianos que se
ligam a receptores tipo TLR (Mond, Lees & Snapper, 1995).

1.3) cAMP e o Sistema Imunolgico.

O 3,5- Monofosfato de adenosina cclico (cAMP) um mensageiro secundrio
gerado a partir do ATP pelas protenas da famlia da adenilato ciclase (AC) e estas
molculas so degradadas pelas protenas da famlia das fosfodiesterases (PDE)
(Torgersen et al, 2002). O cAMP pode atuar de diferentes maneiras em diferentes tipos
celulares, porm somente so descritos trs substratos para o cAMP: canais de ons
dependentes de cAMP, protenas quinases dependentes de cAMP (PKA) e protenas
trocadoras de guanidinas (GEF) dependentes de cAMP (Skalhegg et al, 2005). A ao
desta molcula sobre o sistema imunolgico mediada, principalmente, pela ativao da
protena quinase dependente de cAMP (PKA), porm j foi descrito que as GEF (EPAC 1
e 2) tambm podem atuar como substrato do cAMP em linhagens de clulas T (Cambier
& Julies, 1987; Fuld et al, 2005).
16

Na maioria das situaes o aumento dos nveis intracelulares de cAMP em clulas

do sistema imunolgico, em modelos de aumento farmacolgico dos nveis deste
nucleotdeo cclico, leva a um estado de desativao celular. A adio de agentes
farmacolgicos que ativam diretamente as AC ou que inibem a ao das PDE, como, por
exemplo, forskolin e rolipran, respectivamente, levam a inibio da proliferao clulas
de clulas T e B, a inibio da atividade citotxica de clulas NK e a inibio da induo
de secreo de imunoglobulinas pela clula B (Muraguchi et al, 1984; Skalhegg et
al,1994; Torgensen et al,1997; Irvin et al, 2001). J foi demonstrado que esses efeitos
seriam decorrentes do bloqueio da passagem dessas clulas da fase G1 para a fase S do
ciclo celular (Irvin et al, 2001).
Acredita-se que de forma fisiolgica essa molcula deve estar associada
regulao fina dos processos de sinalizao celular envolvidos na ativao das clulas do
sistema imune. Diversos trabalhos descrevem vias de sinalizao celular inibidas pelo
aumento de cAMP como, por exemplo, as vias que culminam na formao do fator de
transcrio AP-1 e na ativo dos fatores de transcrio NF-AT e NFB (Torgersen et al,
2002; Skalhegg et al, 2005).
O cAMP atua de forma bastante incisiva na inibio das clulas do sistema imune
e j foram demonstrados diversos nveis de atuao dessa molcula, desde a atuao
sobre protenas presentes no incio da via de sinalizao, at em molculas tardias no
processo de transduo de sinal. Com relao inibio dos nveis iniciais da sinalizao,
j foi descrito que a PKA ativada pelo acmulo de cAMP leva a ativao da protena da
famlia Src quinase Csk,. Esta protena, quando ativada, fosforila resduos de tirosina na
poro carboxi-terminal de outras enzimas da famlia Src, levando a inibio destas
protenas, que so fundamentais para o incio do processo de transduo de sinal
(Torgersen et al, 2002; Skalhegg et al, 2005). Alm disso, estudos realizados para avaliar
a localizao da PKA em linfcitos T, mostraram que esta protena se co-localizava com
o TCR, estando ambos os presentes em regies ricas em colesterol e esfingolipdios
(lipid rafts), indicando necessidade de proximidade fsica para que essa interao
acontea (Torgersen et al, 2002 e Skalhegg et al, 1994).
Mais recentemente, foi demonstrada a presena de uma protena capaz de inibir a
ligao dos fatores de transcrio NF-AT e NFB ao DNA, e a expresso dessa protena

17

era dependente do acmulo de cAMP. Essa protena chamada de ICER (inducible

cAMP early repressor) e faz parte da famlia de protenas CREB (cre-biding protein),
que se ligam regio cre do DNA (cAMP response elements). As protenas CREB,
entre elas a ICER, so dependentes da ao da PKA (Fazia et al, 1997; Bordor et al,
2001). J foi mostrada a expresso de ICER em clulas do sistema imunolgico (clulas
T, NK e em menor escala linfcitos B) quando essas clulas eram estimuladas com
agentes que levavam ao acmulo de cAMP (Bodor et al, 2007).
Mais especificamente sobre os linfcitos B, foco desse estudo, o acmulo
intracelular de cAMP tem diversos efeitos. Foi observado efeito inibitrio sobre a
resposta proliferativa de linfcitos B em repouso quando essas clulas so estimuladas
via MHC de classe II, via CD23, via receptor de prostaglandina E2 (PGE2) e durante a
interao com linfcitos T (Roper et al, 1994, Minguet et al, 2005).
A sinalizao via BCR pode ser influenciada pela concentrao intracelular de
cAMP. J foi descrito na literatura que o acmulo desse nucleotdeo cclico inibe a
fosforilao do IB (impedindo, assim, a translocao do NFB ao ncleo) e a
fosforilao da MAPK ERK (Minguet et al, 2005). Foi verificado, ainda, que a inibio
da resposta de clulas B aps ligao ao BCR estaria relacionada com modulao da
ativao de PLC e da mobilizao de clcio e acredita-se que essa inibio seja
dependente da ativao da PKA (Venkataraman et al, 1998). Esta molcula tambm
capaz de inibir a via de sinalizao induzida por ligantes de receptores tipo-Toll, mais
especificamente TLR4, atravs da diminuio da fosforilao do IB (Minguet et al,
2005).
A ao da PKA, ativada pelo cAMP, em linfcitos B, pode estar relacionada com
a induo dos mecanismos pr-apoptticos e inibio do crescimento celular atravs da
modulao de fatores de sobrevivncia como Bcl-XL. J foi relatado que essa inibio da
resposta via BCR dependente de PKA pode ser revertida pela adio da citocina IL-4,
que atuaria de forma protetora durante a ativao da PKA (Venkataraman et al, 1998;
Smith et al, 2005). Por outro lado, j foi descrito que vias de sinalizaes complexas
como a do CD40 e do CD72 no so alteradas pelo aumento da concentrao de cAMP
(Minguet et al, 2005).

18

2) OBJETIVOS GERAIS
Essa dissertao de mestrado tem por objetivo geral verificar se a wariftena,
alcalide majoritrio presente na frao aquosa do extrato hidroalcolico da Cissampelos
sympodialis (AFL), seria o composto ativo presente no mesmo e o responsvel pelas
aes imunomodultrias do extrato j descritas anteriormente. Alm disso, pretendemos
caracterizar o mecanismo de ao desta substncia utilizando como modelo os linfcitos
B.
3) OBJETIVOS ESPECFICOS

Verificar a toxicidade da wariftena quando adicionada a culturas de clulas B

primrias e em cultura de linhagens de clulas B humanas (DAUDI).

Avaliar a se a wariftena possui ao inibitria sobre a proliferao de linfcitos B

murinos estimulados com ligantes de TLR ou anti-IgM.

Avaliar se a wariftena inibe a secreo de imunoglobulinas in vivo e in vitro.

Avaliar, atravs de estudos cinticos, a etapa da ativao de linfcitos B inibida

pela wariftena.

Verificar se o efeito inibitrio da wariftena seria revertido pelo estmulo com

acetato mirstico de forbol e A23187.

Investigar as possveis vias de sinalizao nas quais a wariftena poderia atuar:

mobilizao de clcio, fosforilao de protenas com resduos de tirosina,
fosforilao de ERK, ativao de NFB e induo de aumento intracelular de
cAMP.

19

4) MATERIAIS E MTODOS
4.1) Reagentes.
Meio de Cultura RMPI 1640, soro fetal bovino e o antibitico gentamicina
(utilizado na concentrao de 50 g/ml) foram obtidos da Gibco (Invitrogen, Grand
Island, NY, EUA). Suplementos para cultura (hepes, bicarbonato de sdio, Glutamina e
-mercaptoetanol), os reagentes acetato mirstico de forbol (PMA), ionforo de clcio
(A23187), ligante de TLR4 (LPS extrado de E. coli, sorotipo (O111:B4) e o anticorpo
policlonal de cabra anti-IgM de camundongo foram obtidos da Sigma Chem. Co. (St.
Louis, MO, EUA).

O reagente TNP-Ficoll foi fornecido pelo Dr. Andrew Lees

(Biosynexus, Rockville, MD, EUA). Ligante de TLR2 (lipopeptdeo bacteriano sinttico

Pam3CysSerLys4) foi obtido da EMC Micro-collections (Tubingen, Alemanha); ligante
de TLR9 foi obtido da Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). Esses dois reagentes foram
gentilmente cedidos pelo Dr. Alberto Nbrega do Departamento de Imunologia do
IMPPG da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
4.2) Purificao da wariftena.
A wariftena foi isolada da planta Cissampelos sympodialis Eichl (Menispermaceae). Ela
foi gentilmente fornecida pela Dra Marcia Regina Piuvezam do Laboratrio de
Tecnologia Farmacutica da Universidade Federal da Paraba. A planta foi crescida no
Jardim Botnico do Laboratrio de Tecnologia Farmacutica da Universidade Federal da
Paraba (UFPB). A planta foi identificada pela Dr Maria de Ftima Agra (UFPB) e a
espcie padro est depositada no Herbrio Lauro Pires Xavier da UFPB. A wariftena foi
purificada como descrita previamente (Costa et al, 2008). As folhas foram desidratadas
50oC e depois pulverizadas. O extrato hidroalcolico (AFL) foi obtido atravs do
tratamento com soluo de etanol 80% em gua a 70oC por cinco dias. O material obtido
foi dissolvido em cido clordrico (HCl) 3% e extrado diversas vezes com clorofrmio
(CHCl3). A frao aquosa obtida foi alcalinizada com hidrxido de amnio (NH4OH) pH
9,0 e mais uma vez extrado com clorofrmio (CHCl3). Esse extrato foi lavado com gua,
foi adicionado sulfato de magnsio at que o solvente evaporasse totalmente e fosse
obtida a frao total de alcalides tercirios (TTA). A TTA foi purificada em uma coluna
de cromatografia de alumnio eluda com hexano contendo concentraes crescentes de
20

clorofrmio, seguida de eluio com clorofrmio contendo concentraes crescentes de

metanol e finalmente eluio com metanol. A frao eluda com clorofrmio-Metanol
(CHCl3:MeOH 49:1) foi submetida a uma cromatografia de camada fina (TLC, com 1
mm de espessura); e a wariftena foi purificada obtendo um rendimento final de 0.031%.
A identificao da wariftena foi realizada atravs de anlise do espectro de 1H e 13C por
ressonncia magntica nuclear espectral (NMR) e o resultado foi comparado com dados
conhecidos da literatura (Costa et al, 2008). A wariftena isolada foi obtida com 100% de
pureza em dados avaliados por NMR e espectrometria de massa (Costa et al, 2008).
4.3) Animais
Foram utilizados camundongos machos e fmeas da linhagem BALB/c com 6 a 8
semanas de idade fornecidos pelo biotrio do Departamento de Imunologia do Instituto
de Microbiologia Professor Paulo de Ges (IMPPG) da Universidade Federal do Rio de
Janeiro (UFRJ).
4.4) Isolamento de linfcitos B murinos e preparo das culturas
Os linfcitos B murinos foram isolados de bao atravs da depleo de linfcitos
T pela utilizao de anticorpos que se ligam a molculas de superfcie de clula T (antiCD4, anti-CD8 e anti-Thy). A incubao com estes anticorpos foi seguida do tratamento
com anticorpo anti-cadeia kappa de Ig de ratos (MAR18.5) e complemento de coelho
(Low Tox Rabbit Complement, Cedarlane Inc., Canad).
Em seguida, as clulas B foram obtidas por fracionamento em gradiente de
Percoll descontnuo (Sigma Chem Co; St Louis, MO, EUA). Para esse procedimento a
soluo de Percoll foi diluda em soluo salina 10 vezes concentrada (NaCl 9%), na
proporo 1:10 (1 mL de salina 10X + 9 mL de Percoll). Aps isso, essa soluo diluda
de Percoll e salina (100%) foi utilizada para o preparo do gradiente descontnuo. Foram
utilizadas as concentraes de 50%, 60%, 65% e 70%, diludas em meio RPMI. Para um
melhor rendimento as fraes de Percoll foram mantidas a 4oC at o momento da
montagem do gradiente descontnuo. Foram recolhidas as clulas de alta densidade
(presentes entre as fraes de 65 % e 70%), que representam as clulas B virgens.
Os linfcitos B isolados foram adicionados a placas de cultura contendo meio
RPMI suplementado (com -mercaptoetanol 50 M, L-glutamina - 2 M, bicarbonato

21

de sdio - 2 g/mL e Hepes 2,4 g/mL) contento gentamicina (50 g/mL) e 10% de
soro fetal bovino. Estas culturas foram tratadas com diferentes doses de wariftena
(0,02M, 0,2 M e 2 M) e os diferentes estmulos. Todas as culturas foram realizadas
em triplicata e foram incubadas em estufa de CO2 (7%) temperatura de 37C.
A pureza da preparao de linfcitos B nos diferentes experimentos foi verificada
periodicamente atravs de marcao com anticorpo anti-B220 (Bencton & Dickinson,
Franklin Lakes, NJ, EUA), um marcador de linfcitos B. Essa variava entre 80% e 90%.
4.5) Linhagen celular
Foi utilizado o linfoma B humano DAUDI (ATCC, Rockville, MD, EUA). A
linhagem DAUDI foi mantida com meio RPMI contendo 10% de soro fetal bovino e os
suplementos descritos no item anterior e incubados em estufa de CO2 (7%) temperatura
de 37C.
4.6) Verificao da toxicidade da wariftena.
Ensaios de toxicidade utilizaram dois protocolos diferentes: incorporao do
iodeto de propdeo avaliada por citometria de fluxo e medida da viabilidade celular por
excluso do azul de Trypan.
O iodeto de propdeo (PI) um corante vital que no internalizado por clulas
vivas; quando submetido a presena de um feixe de laser este composto emite
fluorescncia no comprimento de onda cujo maximo 630nm. Esta fluorescncia foi
medida por citometria de fluxo (utilizando um FACSCalibur Bencton & Dickinson).
Esse ensaio foi realizado com clulas B murinas isoladas e marcadas com anticorpo antiB220 conjugado a isotiocianato de fluorecena (FITC) (Bencton & Dickinson, Franklin
Lake, NJ, EUA) e o iodeto de propdeo (utilizado a 2,5 g/ml diludo em PBS; Sigma St.
Louis, MO, USA) foi acrescentado no momento da leitura.
O azul de Trypan um corante vital e assim possvel avaliar a viabilidade
celular atravs de microscopia optica. Para estes ensaios, foi feita cultura do linfoma B
DAUDI por um perodo de um ou dois dias na presena ou ausncia de wariftena. Aps
este perodo, foi feita contagem do nmero de clulas mortas e viveis aps a adio do

22

corante Azul de Trypan (utilizado na concentrao de 0,1 mg/mL; Sigma Chem. Co., St.
Louis, MO, EUA) com o auxlio da cmara de Neubauer, atravs de microscopia ptica.
4.7) Medida da resposta proliferativa de linfcitos B.
A medida de proliferao celular foi realizada pela tcnica de incorporao de
timidina tritiada conforme previamente descrito (Brunswick et al,1988). Clulas B
frescas isoladas em gradiente de percoll foram estabelecidas como descrito anteriormente
e adicionadas cultura (2 x 105 clulas/ poo). Aps 48 horas de incubao, foi
adicionado 0,5Ci de timidina tritiada e as culturas foram incubadas por mais 18hs. As
culturas foram recolhidas em papel de filtro de vidro Whatmam, que retm o DNA. Os
filtros foram lavados, secos e foi adicionado lquido de cintilao. A incorporao de
timidina tritiada foi avaliada atravs de um espectrmetro de cintilao lquida da
Beckman Coulter, modelo LS6500. Foi utilizado um minuto de contagem para cada
amostra e os resultados obtidos foram expressos em contagem por minuto (CPM). Aps
contagem, foi obtida a mdia dos valores de incorporao das triplicatas e calculou-se o
desvio padro das mesmas.
4.8) Avaliao da secreo de Imunoglobulinas induzida por molculas ativadoras
policlonais in vitro.
Para realizar a dosagem de imunoglobulinas (IgM) presente nos sobrenadantes de
culturas, clulas B murinas foram cultivadas (5 x 104 por poo) e tratadas ou no com os
seguintes reagentes: LPS bacteriano (10 g/mL), Pam3Cys (10 g/mL), e wariftena
(0,02M, 0,2 M e 2 M). Estas culturas foram incubadas por 7 dias a 37C em presena
de CO2 a 7%.
Aps a incubao, as culturas (que foram realizadas em triplicatas) foram
recolhidas e foi feito um pool dos sobrenadantes. Estes sobrenadantes foram utilizados
para a dosagem de IgM, pela tcnica de ELISA sandwich descrita por Sapper & Paul
(1987). Para a efetuao do ensaio imunoenzimtico foram utilizadas placas de
poliestireno de fundo chato da Corning modelo Costar 3590 (Corning, NY, EUA) que
foram cobertas com anticorpo de cabra anti-IgM de camundongo (Sigma Chem. Co., St.
Louis, MO, EUA) (5g/m) diluido em PBS (50 l de soluo por poo).

23

Essas placas foram incubadas de um dia para o outro (overnight) e depois

lavadas quatro vezes com PBS. Aps isso, foi realizada uma nova incubao por 1 hora
com PBS contendo 1% de soro fetal bovino (Gibco BRL, Grand Island, NY, EUA)
temperatura ambiente para bloquear ligaes inespecficas. Esse bloqueio foi seguido da
adio das amostres diludas em soluo de PBS contendo 1% de soro-fetal bovino
(diludas a 1:1, 1:5, 1:25, 1:125). Simultaneamente, foram diludas e plaqueadas as
diluies do padro de IgM purificada (ICN, Biomedicals, Irvine, CA, EUA) que
serviram para elaborao de uma curva padro a ser utilizada para clculo da
concentrao de imunoglobulinas presente nas amostras testadas. Aps nova incubao
de 6h a temperatura ambiente, foi adicionado aos poos um anticorpo secundrio antiIgM marcado com fosfatase alcalina (Southern Biotechnology Ass Inc., Brimingham,
AL, EUA) diludas em PBS contendo 1% de soro fetal bovino e as placas foram
incubadas de um dia para o outro.
A ligao do anticorpo e a revelao do ensaio foi realizada pela adio do
substrato cromognico p- nitrofenolfosfato (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, EUA)
diludo em tampo Tris-MgCl2 pH 9,5. Esta etapa foi seguida da medida da A405 nm
realizada em um leitor de leitor de microplacas da BIORAD (modelo 550).
4.9) Avaliao da secreo de imunoglobulinas antgeno-especficas em soro de
animais imunizados.
Animais foram tratados por via intraperitoneal com 50 g de wariftena (diludas
em 200 L de PBS). Aps uma hora da injeo, os animais foram imunizados por via
endovenosa com TNP-ficoll (50 g/animal). Os soros foram obtidos por sangramento da
veia caudal nos dias 7, 14, e 21 aps o tratamento/imunizao. Os animais foram
divididos em quatro grupos de seis animais: um grupo controle, um grupo somente
imunizado, um grupo somente tratado e um grupo imunizado e tratado. Ttulos sricos de
anticorpos contra TNP-Ficoll foram determinados por ELISA, segundo metodologia
previamente descrita (Mond et al, 1989). Foram utilizadas placas de cloreto de polivinil
Falcon Microtest III (Becton Dickinson, Franklin Lake, NJ, EUA). As placas foram
cobertas com TNP-Ficoll na dose de 50 g/mL em tampo Tris-HCl 0,1M pH 8,3 (foi
feita incubao de 18hs a 4C). Aps a incubao, as placas foram bloqueadas por 1h

24

com PBS contendo 1% de soro fetal bovino. As amostras foram adicionadas em

diferentes diluies e as placas foram incubadas por 4hs temperatura ambiente. Em
seguida, as placas foram novamente lavadas e incubadas com anticorpos secundrios
marcados com fosfatase alcalina (anti-IgM, IgG1 e IgG2a de camundongo, obtidos da
Southern Biotech. Assoc. Inc., Birminghan, AL, EUA). A reao foi medida utilizando o
substrato cromognico para-nitrofenolfosfato (Sigma Chem. Co.,St. Louis, MO, EUA).
A405 foi medida utilizando leitor de microplacas da BIORAD (modelo 550). Os ttulos de
anticorpos foram obtidos a partir da diluio de soro de animal tratado/imunizado que
apresentava densidade ptica equivalente leitura do soro controle como descrito por
Mond et al (1989).
4.10) Dosagem de clcio.
Linfcitos B purificados (2 x 107/mL) foram incubados com Fura-2acetoxymethyl ester (Fura-2/AM) obtido da Calbiochem (La Jolla, CA, EUA) a 37C por
40 min em ausncia de luz. As clulas marcadas (106/mL) foram lavadas em HBBS livre
de clcio e transferidas para uma cubeta de quartzo contendo um im magntico. Nesse
momento foi adicionado 1 M de cloreto de clcio. A variao de fluorescncia foi
avaliada a 37oC em um esprectrofluormetro Hitachi F4500. A concentrao de clcio
ligado ao Fura-2 AM foi avaliada na excitao de 340 nm e com emisso 490 nm. O
[Ca+2]i foi calculado como descrito anteriormente (Grynkiewicz, Poenie & Tsien, 1985).

4.11) Anlise da inibio da fosforilao total e de protenas da famlia ERK por

Western Blotting.
Culturas de clulas B esplnicas foram cultivadas na concentrao de 5-10 x 106
clulas/mL. Estas foram estimuladas com anticorpo anti-IgM por 5 minutos (nas
concentraes de 20 g/ml e 8 g/ml) ou LPS (na concentrao de 10 g/ml) e tratadas
com wariftena (na concentrao de 2 M). A wariftena foi adicionada 15 minutos antes
da estimulao.
Todos

esses

processos

ocorreram

37C.

Imediatamente

aps

estimulao/tratamento, essas culturas foram lisadas com 100 L tampo de lise NP-40
(Gibco, Grand Island, NY, EUA), contendo 1% de inibidor de protease (Calbiochem, San

25

Diego, CA, EUA). O lisado foi incubado por 20 minutos a 4C, seguido de diluio em
tampo de amostra diludo 1:3 ( 5% Tris pH 6,8 - 0,5M, 10% de SDS, 10% de mercaptoetanol, 10% de glicerol e azul de bromofenol, H2O q.s.p.).
Em seguida, foi realizado um SDS-PAGE e, aps a corrida eletrofortica, foi
efetuada a transferncia para uma membrana de PVDF (Milipore) previamente ativada
com metanol e foi realizado um Western Blotting. Para a realizao dessa etapa, as
membranas recm transferidas foram bloqueadas com TBS-2% BSA (Sigma Chem Co,
Maryland, MO, EUA) e incubadas com os anticorpos primrios de um dia para o outro.
Os anticorpos utilizados como primrios foram o 4G10 (esse anticorpo
monoclocal foi gentilmente cedido pelo Dr John Cambier - National Jewish Institute, e
proveniente do sobrenadante do hibridoma 4G10), que reconhece molculas de tirosina
fosforiladas (usado na diluio 1:10000 do sobrenadante do hibridoma 4G10) e o IgG de
camundongo anti-pERK (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), que reconhece
molculas de ERK fosforiladas (utilizado na concentrao de 200 ng/mL). Tambm
foram realizados ensaios utilizando os anticorpos anti-ERK2 utilizado na concentrao de
200 ng/mL (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), como anticorpo primrio, a fim de
demonstrar equivalncia nas concentraes de protenas utilizadas nas diferentes
amostras carreadas nos gis. Nesses experimentos o mesmo gel que foi marcado com o
anticorpo fosforilado foi utilizado para a marcao com a forma no fosforilada da
protena.
Aps lavagem com TBS Tween (3X) as membranas foram incubadas por 2 horas
com um anticorpo anti-Ig de camundongo conjugado peroxidase (Jackson
Immunoresearch, PA, EUA) utilizado na concentrao 0,2 g/mL. Aps esta incubao,
a ligao dos anticorpos foi revelada utilizando um sistema de quimiluminescncia
(SuperSignal, Amersham Biosisences, UK) e filme fotogrfico (Kodak, EUA).
Para uma melhor avaliao quantitativa das diferenas existentes entre as
amostras tratadas ou no com a wariftena, foi realizada a dosagem e normalizao do
resultado experimental do Western Blotting. Para isso, foi utilizado o software Scion
Image (Scion Corporation, Maryland, EUA).

26

4. 12) Dosagem de NFB em extratos nucleares por EMSA.

Os extratos nucleares provenientes de culturas de clulas B murinas estimuladas
por LPS (10 g/ml) e tratadas com wariftena (2 M) por 16hs foram obtidos como
descrito anteriormente (Scheinman, et al, 1995). As clulas foram lavadas em PBS e
transferidas para tubos de microcentrfuga. O pellet foi ressuspendido em 100 a 200 l
de tampo de lise (10 mM Tris pH 8.0, 60 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de
dithiothreitol - DTT, 0,1% de NP-40, 1 mM dephenylmethylsulfonyl fluoride - PMSF) e
incubado a 4C por 5 minutos. O lisado celular foi novamente centrifugado e o pellet
contendo o ncleo foi imediatamente ressuspendido em tampo de lise (sem NP-40) e
incubado por 5 minutos a 4C. O novo lisado foi ressuspendido em 50 l de tampo C
(contendo 20 mM HEPES pH 7.9, 0.75 mM espermidina, 0.15 mM espermina, 0.2 mM
EDTA, 2 mM EGTA, 2 mM DTT, 20% glycerol, 1mM PMSF). Em seguida, foi
adicionado a essa soluo 5M de NaCl para que a molaridade final da soluo ficasse em
0,4 M. Aps isso, essa soluo foi

incubada a 4C por 10 minutos e novamente

centrifugada. O sobrenadante, contendo o lisado nuclear foi recolhido e armazenado a 80C.

O EMSA (Electrophoretic mobility shift assay) foi realizado atravs da
incubao do extrato de protena nuclear com 40,000 cpm de

32

P associado a seqncia

dupla-fita consenso de oligonucleotdeo de NFB (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)

em tampo de ligao (10 mM Hepes, pH 7.9, 4% glycerol, 1 mM DTT, 1 mM EDTA,
and 0.1 lg BSA). Um oligonucleotdeo dupla-fita mutante (Santa Cruz Biotechnology)
foi utilizado para verificar a especificidade da ligao do DNA com o NFB. A
incubao foi realizada por 30 minutos a 25C.
O complexo protena-DNA foi separado das seqncias livres atravs de um gel
de poliacrilamida nativa (4%). Aps secagem, este complexo foi visualizado pelo
programa PhosphoImage analysis (Molecular Dynamics, Amersham).
4.13) Dosagem de adenosina monofosfato cclico (cAMP).
Para verificar a concentrao de monofosfato cclico de adenosina (cAMP)
presentes em culturas de clulas B foi utilizado o kit cAMP Enzimeimmunoassay
BiotrakTM (EIA) System (dual range) (Amersham Biosciences, UK). Culturas de clulas
27

B (2 x 105 clulas/poo) foram isoladas no dia anterior e incubadas durante a noite a 37C
com 7% de CO2.
Aps 24hs, as culturas foram estimuladas com LPS (10 g/ml), Rolipran
(inibidor de fosfodiesterases) e Forskolin (ativador da protena quinase A), os dois
ltimos gentilmente cedidos pela Dr Patrcia Silva (IOC, FIOCRUZ) (utilizados na
concentrao de 10 M). Aps duas horas de incubao as clulas foram lisadas e foi
realizado um ELISA de competio de acordo com as especificaes do fabricante.
Os resultados foram obtidos atravs de leitura da determinao do A450 em leitor
de microplacas e a concentrao de cAMP foi determinada a partir de uma curva padro
relacionando concentraes conhecidas deste nucleotdeo cclico.
4.14) Anlises estatsticas
Foi realizado o teste t de Student para amostras no pareadas atravs do assistente
grfico PrimGraphPad 4. Os dados foram expressos com significncia estatstica quando
p 0,05.

28

5) RESULTADOS
5.1) Wariftena no apresenta efeito citotxico sobre a clula B.
Inicialmente foi analisado se a wariftena teria efeito inespecfico induzindo morte
celular de linfcitos B. Para isso, verificamos a presena de clulas no viveis em nossas
culturas.
Foi realizado um ensaio de incorporao de iodeto de Propdeo (PI) em culturas
de clulas B murinas purificadas. As culturas foram tratadas ou no com wariftena e
estimuladas ou no com LPS. Aps 24hs as clulas foram marcadas com anticorpo antiB220 (marcador de clulas B murinas), tratadas com PI e imediatamente analisadas por
citometria de fluxo. Foi avaliada na populao B220+ a porcentagem de clulas que
incorporaram do iodeto de propdeo (Figura 1). No foram observadas alteraes
significativas no percentual de clulas no viveis quando era adicionado wariftena (nas
concentraes de 0,2 e 2 M) a essas culturas, independente da clula estar ativada ou
no.
Adicionalmente analisamos o efeito da wariftena no crescimento da linhagem
tumoral DAUDI. Observamos que a adio de wariftena (em diferentes concentraes)
no induz morte celular quando os nmeros de clulas viveis e no viveis foram
contadas diretamente utilizando o corante azul de Trypan (Figura 2).
5.2) Wariftena inibe a proliferao celular induzida por diversos ativadores
policlonais da clula B.
Inicialmente foi investigado se a wariftena teria efeito inibitrio na resposta
proliferativa de linfcitos B. Foram estabelecidas culturas estimuladas com LPS e
tratadas com diferentes doses de wariftena. A seguir foi feita medida da resposta
proliferativa destas clulas. Foi observado um efeito dose-dependente. Na dose de 2 M,
a wariftena tem efeito inibitrio marcante na proliferao de linfcitos B (Figura 3).
Testamos, a seguir, se outros ativadores policlonais de linfcitos B teriam seu
efeito estimulatrio inibido pela wariftena. Observamos que este alcalide, alm de
inibir a resposta proliferativa estimulada por LPS, inibe a resposta proliferativa induzida
por outros ligantes de receptores tipo-Toll (como o ligante de TLR2 Pam3Cys e pelo
ligante de TLR9, oligodeoxinucleotdeo com seqncias CpG) (Figura 4). Tambm foi
29

observada a inibio da proliferao celular quando as clulas foram estimuladas pela

ligao direta ao BCR, atravs da utilizao de anticorpo estimulatrio anti-IgM (Figura
4).
5.3) Efeito inibitrio da wariftena ocorre mesmo em etapas mais tardias do
processo de ativao da clula B.
Para verificar se a wariftena estaria bloqueando etapas iniciais ou tardias da
sinalizao celular foram realizados estudos cinticos para estabelecer em que etapa do
processo de ativao de linfcitos B a wariftena teria efeito. Foi realizada uma cintica
medindo resposta proliferativa estimulada pelo ligante de TLR4 (LPS), pelo ligante de
TLR2 (PamCys3), pelo ligente de TLR9 (oligodeoxinucleotdeo com sequncias CpG) e
por anticorpo anti-IgM. (Figura 5). Nesse ensaio a wariftena foi adicionada no incio da
cultura e aps 2h, 4h, 8h e 24h. O efeito inibitrio da wariftena ocorreu mesmo quando
esta droga era adicionada em etapas mais tardias da cultura.

5.4) A wariftena reduz a secreo de imunoglobulinas in vitro e in vivo.

Verificamos a seguir a ao da wariftena sobre a secreo de imunoglobulinas in
vitro. Observamos que a wariftena inibiu significantemente a secreo de IgM quando
as clulas foram tratadas com wariftena e estimuladas com LPS ou Pam3Cys. (Figura 6).
Adicionalmente, foram realizados estudos cinticos, onde os estmulos (LPS ou
Pam3Cys) foram adicionados s culturas no momento inicial e o tratamento com a
wariftena foi efetuado no incio da cultura, e nos tempos de 2hs, 4hs, 6hs, 8hs e 24hs
aps o incio da cultura. Nesses ensaios verificamos que a wariftena continuou a inibir a
secreo de IgM mesmo quando adicionada em momentos mais tardios da cultura (Figura
7).
Aps estes estudos realizados in vitro, passamos a testar se a wariftena
tambm teria o mesmo efeito na secreo de imunoglobulinas em animais tratados com
este composto in vivo. Foi avaliado o efeito inibitrio da wariftena in vivo sobre a
secreo de imunoglobulinas das classes IgM e IgG (IgG1 e IgG2a) aps a imunizao
com TNP-Ficoll (antgeno T-independente tipo II).

Observou-se uma reduo

significativa nos nveis sricos de anticorpos anti-TNP-ficoll de ambas as classes. Este

30

efeito inibitrio foi mais acentuado nos dias 7 e 14 aps a imunizao no caso da
immunoglobulina da classe IgM; e no dia 21 aps a imunizao no caso da
imunoglobulina da classe IgG (IgG1 e IgG2a) (Figura 8).
5.5) Efeito inibitrio da wariftena ocorre mesmo quando PMA e A23187 so
adicionados cultura de linfcitos B.
Foi verificado a seguir, se o efeito inibitrio da wariftena seria revertido quando
fossem adicionados s culturas acetato mirstico de forbol e o ionforo de clcio
(A23187). J sabido que esses dois estmulos mimetizam a ativao de PKC e o
influxo de clcio observado inicialmente quando o linfcito ativado pela ligao do
antgeno ao BCR. O acetato mirsttico forblico se insere na membrana e induz a ligao
e a ativao da PKC.
O efeito inibitrio da wariftena no foi revertido nem pela adio de acetato
mirstico de forbol e ionforo de clcio (A23187) cultura (Figura 9). Esses dados
sugerem que a wariftena provavelmente bloqueie a sinalizao celular em etapas
posteriores durante o processo de ativao de linfcitos B.

5.6) A wariftena bloqueia o influxo de clcio em linfcitos B murinos estimulados

por anti-IgM.
At o momento observamos que a wariftena capaz de modular negativamente
tanto a proliferao celular quanto a secreo de imunoglobulinas. Alm disso,
verificamos que provavelmente a wariftena atue em etapas mais tardias da sinalizao
celular. Para tentar esclarecer que etapas poderiam estar relacionadas e tambm com
objetivo de avaliar o possvel mecanismo de ao da wariftena, comeamos a investigar
uma possvel ao da wariftena sobre as principais vias de sinalizao em linfcitos B.
Umas das vias inicias de sinalizao a via que culmina na mobilizao de clcio. Para
avaliar diretamente se a wariftena atua bloqueando o influxo de clcio ns realizamos
um ensaio de dosagem de ccio intracelular. Ns observamos que a wariftena reduz em
nveis signifcativos a concentrao intacelular de clcio em clulas estimuladas por
anticorpo anti-IgM (Figura 10).

31

5.7) A wariftena no altera o padro de fosforilao total em resduos de tirosina de

molculas de clulas B, porm inibe a fosforilao da protena ERK presente em
linfcitos B tratados e estimulados por LPS.
Outro sinal importante durante o processo de ativao inicial do linfcito B a
fosforilao de resduos de tirosina. Assim, ns avaliamos o perfil de fosforilao total de
resduos de tirosina (utilizando o anticorpo 4G10) em clulas B murinas tratadas ou no
com wariftena e estimuladas ou no com LPS e anti-IgM. Nenhuma alterao no perfil
de fosforilao em resduos de tirosina de protenas totais foi observada (Figura 11).
Tambm avaliamos o padro de fosforilao molcula ERK da famlia das
MAPK, aps o tratamento ou no com wariftena e a estimulao ou no com LPS ou
anti-IgM. Verificamos que, quando a clula B murina era estimulada com LPS e tratada
com wariftena, ocorria uma inibio marcante na fosforilao dessa molcula. Porm,
nao foi observada alterao na fosforilao de ERK nos linfcitos estimulados com o
anti-corpo anti-IgM e tratado com a wariftena (Figura 12).
5.8) Reduo na concentrao de NFB no ncleo de clulas B estimuladas com LPS
e tratadas com wariftena.
Adicionalmente, avaliamos os nveis de NFB presentes nas fraes nucleares de
clulas B murinas tratada ou no com wariftena e estimuladas ou no por LPS.
Observamos uma reduo nos nveis nucleares desse fator de transcrio quando a clula
estimulada era tratada com wariftena (Figura 13).
5.9) Wariftena induz aumento na concentrao intracelular de cAMP.
Avaliamos, a seguir, se um aumento intracelular de cAMP seria um dos possveis
mecanismos de ao da wariftena. Para isso, ns realizamos a dosagem do cAMP em
culturas de clulas B tratadas ou no com wariftena a 0,2 M e 2 M por 2h e
estimuladas ou no com LPS. Culturas controles foram tratadas com Rolipran (inibidor
de PDE). A partir dessas culturas verificamos que a wariftena induz um aumento nos
nveis intracelulares de cAMP (evidente nas culturas tratadas com rolipran), indicando
que esse poderia ser seu mecanismo de ao (Figura 14).

32

6) FIGURAS

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7. DISCUSSO
A Cissampelos sympodialis uma planta largamente encontrada no nordeste e
sudeste do Brasil. Essa planta utilizada popularmente no tratamento de quadros de
inflamao e asma (Barbosa-filho, Agra & Thomas, 1997). Estudos fitoqumicos levaram
ao isolamento de vrios alcalides do extrato de folha dessa planta (Lira et al, 2002). A
wariftena o alcalide presente em maior quantidade (Barbosa-filho, Agra & Thomas,
1997). O IC50 da wariftena j foi descrito anteriormente em estudo realizado por Melo et
al (2003) utilizando culturas de clulas hepticas. Esse dado uma medida importante na
determinao da citotoxicidade de uma substncia. O experimento foi realizado em
clulas de hepatcitos e em fibroblastos V79, e o valor do IC50 estava na faixa de 10 M
a 35 M. Esta cerca de cinco vezes maior do que a maior dose utilizada por ns em
nossa pesquisa (2 M). Esse dado confirmado pelos resultados observados por ns de
que as doses utilizadas em nosso estudo no so txicas para os linfcitos B.
A fim de verificar se os efeitos inibitrios do extrato de Cissampelos sympodialis
seriam mediados pela wariftena investigamos seu efeito na proliferao de linfcitos B e
na secreo de imunoglobulinas. Detectamos uma inibio da proliferao nas culturas
tratadas com wariftena. Foi observada uma inibio na proliferao clula de cerca de
90% quando as clulas eram estimuladas com o ligante de TLR4 LPS, de 75% nas
culturas estimuladas pelo ligante de TLR9 oligodeoxinucleotdeos com seqncias CpG e
de cerca de 50% quando as clulas eram estimuladas pelo ligante de TLR2. Alm da
inibio das vias de sinalizao dos receptores tipo-Toll, a wariftena tambm inibiu a
proliferao celular induzida por estimulao via BCR (estimulado pela adio de
anticorpo anti-IgM s culturas) e o percentual de inibio foi de aproximadamente 60%
em relao ao controle no tratado.
A wariftena inibiu a proliferao celular mesmo se adicionada em tempos tardios
de cultura (mesmo aps 24h), indicando que ela poderia atuar em etapas tardias do
processo de sinalizao celular. Associada a esse fato foi observada uma inibio da
resposta induzida pela adio combinada de acetato mirstico de forbol (PMA) e ionforo
de clcio (A23187) s culturas. Esta inibio foi de cerca de 80%, indicando uma inibio
mesmo frente a estmulos que mimetizam eventos iniciais da ativao celular. Esses
achados sugerem que a wariftena, assim como o extrato de Cissampelos sympodialis,

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inibe eventos de sinalizao que acontecem aps etapas inicias dos da sinalizao nos
linfcitos B.
A secreo de imunoglobulinas um evento que envolve vrias etapas diferentes
que dependem de um conjunto de sinais fornecidos ao linfcito B. A secreo de
imunoglobulinas depende das etapas iniciais de sinalizao e, ocorre somente aps a
proliferao. Assim, a inibio da secreo de imunoglobulinas pode ser uma
consequencia do bloqueio da proliferao celular. Observamos que a wariftena induz
uma inibio de aproximadamente 50% na secreo do isotipo IgM quando as clulas
foram estimuladas pelo ligante de TLR 2 Pam3Cys e de cerca de 85% quando as clulas
foram estimuladas pelo LPS (ligante de TLR4). Foi observada a reduo da secreo de
imunoglobulina mesmo quando a wariftena foi acrescentada aps 24h do incio da
cultura, sendo o valor inibitrio obtido foi maior que 70% do valor observado em culturas
estimuladas pelo ligante de TLR4 LPS.
Alm disso, a wariftena reduziu a secreo de imunoglobulinas antgeno
especficas do isotipo IgM e IgG in vivo em at 50%, indicando uma correta absoro e
uma possvel ao sistmica da droga. Essse dado est de acordo com dados anteriores da
literatura que indica que a wariftena capaz de inibir os nves sricos de IgE em
modelos experimentis de alergia (Costa et al, 2008).
Aps avaliao do efeito inibitrio da wariftena na resposta induzida por ligantes
de receptores tipo-Toll ou estimulada pela ativao via BCR, avaliamos o mecanismo de
ao da wariftena nessas vias de sinalizao. Um dos eventos mais marcantes durante o
processo de ativaao celular do linfcito B, o aumento dos nveis de clcio aps a
ligaao ao BCR. Assim, para avaliar qual o possvel mecanismo da wariftena, ns
avaliamos se ela era capaz de inibir esse aumento. A wariftena diminui os nveis de
clcio intracelular frente ao estmulo via BCR. A ligao ao BCR leva a ativao de
diferentes vias de sinalizao, inclusive as que medeiam a ativao da fosfolipase
C (PLC), que culmina na liberao de do diacilglicerol (DAG) e no inositol trifosfato
(IP3). Essas molculas atuam, respectivamente, atravs da ativao da PKC e da ativao
de canais de calcio depententes de IP3 (IP3R), esses presentes na menbrana do retculo
endoplamtico (ER) e da mitocondria (De Franco, 1994; Yamamura, 1998; Campbell,
1999).

48

A ativao dos IP3R leva ao primeiro aumento de clcio detectvel frente a

ligao ao BCR. Aps sua ativao, e consequente queda nos nveis de clcio do retculo
plasmtico, existe o recrutamento de canais de calcio presentes na menbrana plasmtica
que, ao serem recrutados, manteem os nveis intracelulares de clcio elevados. A ativao
dos IP3R fundamental para a ativao dos canais de clcio presentes na menbrana. A
partir de um mecanismo conhecido com entrada de clcio dependente de reserva (SOCE
store operated calcium entry), a baixa de ccio no ER leva ao recrutamento de
protenas da famlia STIM (stromal interaction molecules) que, ao se ligarem
conformacionalmente com as molculas de clcio presentes no citoplasma, so ativadas e
interagem com os canais de clcio depentente de clcio (CRAC calcium realeseactiveted calcium channels) presentes na membrana plasmtica (Scharenberg, Huphries
& Rawlings, 2007). Alm do SOCE, um mecanismo interdependente de manuteno dos
nveis intracelulares de clcio, existe a possibilidade da ativao direta de canais de clcio
que no os CRAC na membrana. Eles auxiliariam na manuteno dos nveis
intracitoplasmtico de clcio, e na manuteo da sinalizao dependente do mesmo.
Canais de troca de ons, como as protenas da famlia TRPC (transient recptor potencial
cations channels) poderiam atuar independente do mecanismo dependente do IP3R
(Engelkel et al, 2007).
O aumento de clcio intracelular vai induz a ativao da calmodulina (por
alterao conformacional - devido contato direto com as molculas de clcio) que atua
ativivando a fosfatase calcioneurina. Esta por sua vez, atua desfosforilando do fator
nuclear NFAT, que , assim, induzido a translocar-se para o ncleo (De Franco, 1994;
Yamamura, 1998; Campbell, 1999). O aumento nos nveis intracitoplasmtico de clcio
tambm leva a translocao do fator de trancrio NFB para o ncleo. Nessa situao,
existe a ativao da protena quinase C- (PKC-) que ativada pelo acmulo
intracitoplasmtico de clcio e assim, inicia a via que sinalizao que leva a translocao
do NFkB ao ncleo (Engelkel et al, 2007).
J foi descrito que diferentes alcalides bisbenzilisoquinolnicos so capazes de
inibir vias de sinalizao dependentes de clcio. Dentre eles, a berbanina (derivada da
planta Berberis chilensis) possui atividade inibitria da enzima calmodulina, que e

49

ativada aps o aumento dos nveis intracitoplasmtico de clcio. Nesse estudo foi
avaliada que essa substancia inibe a ativao da calmodulina, assim, inibindo a
capacidade da calmodulina ativar a fosfodiesterase-dependente de calmodulina (CaMPDE). Esse dado indica que alcalides bisbenzilisoquinolinicos podem alterar o
metabolismo dos derivados da adenilato ciclase (cAMP), molculas essas alvo da ao
das fosfodiesterases (Zy et al, 1989). Outros compostos bisbenzilisoquinolinicos j foram
descritos como antagonistas da vias de sinalizao dependentes de clcio, dentre eles a
dauricina e a cycleanina (Zy et al, 1989; Martinez et al, 1998).
Assim, a wariftena poderia estar atuando em diferentes etapas do processo de
sinalizao mediante o acmulo de clcio, j que foi observado por ns que ela capaz
de inibir o acmulo dessa molcula frente a ligao ao BCR. Ela poderia atuar em etapas
inicias da via de sinalizao, tal qual inibindo os mecanismos que levam ao acmulo do
IP3 e da formao dos canais de membrana, Alm disso, ela poderia estar atuando de
acordo com os outros alcalides bisbenzilisoquinolnicos que inibem vias de sinalizao
dependentes de clcio, assim inibindo a ao da calmodulina e, at mesmo alterando o
metabolismo do cAMP, induzindo seu aumento e conseqentemente, inibindo diferentes
funes dos linfcitos B (Wishler et al, 1992).
Ainda, para melhor elucidar o papel da warifteina na via de sinalizao induzida
pelo acmulo de clcio, ns adicionados acetato mirstico de forbol (PMA) e ionforo de
clcio (molculas que ativam vias que culminam no acmulo intracelular de clcio) e
observamos que mesmo sendo induzido um acmulo intracelular de clcio artificia (pela
presena do ionforo de clcio), a wariftena ainda era capaz de inibir a proliferao
celular dos linfcitos B. Esse dado indica que a wariftena nesse modelo estava utilizando
um outro alvo molecular que no a inibio direta do acmulo de ccio, indicando que
outras vias de sinalizao deveriam ser investigadas por ns.
Ainda no contexto de investigao do mecanismo de ao da wariftena
avaliamos se a sua presena alteraria o padro de fosforilao total de resduos de tirosina
em protenas celulares. No observamos nenhum efeito importante. No entanto,
observamos uma inibio da fosforilao da MAPK ERK quando as culturas eram
estimuladas por LPS. Esse padro de inibio, no entanto, no foi observado quando
avaliamos a ativao induzida por anticorpo anti-IgM. Uma hiptese para tentar
50

esclarecer essa diferente ao em vias que convergem para um mesmo alvo molecular
(como as vias de ativao via BCR e via TLR4, onde ambas levam a fosforilao da
protena ERK), poderia estar relacionada a ao da warifteina pode possuir diferentes
alvos moleculares, em diferentes etapas do processo de ativao celular. Assim, ela
atuaria de maneira distinta dependendo da via de ativao do linfcito B que foi
estimulada, tal qual foi observado quando foi investigada a ao da warifteina frente a
induao farmacolgica do acmulo de clcio.
Avaliamos, ainda, o efeito da wariftena na migrao para o ncleo da protena
NFB, j que esse fator de transcrio participa das etapas tardias da sinalizao via
receptores tipo-Toll e da sinalizao via BCR. Observamos uma inibio marcante na
localizao nuclear desse fator de transcrio, tendo o mesmo atingido nveis similares ao
controle no estimulado nas culturas estimuladas e tratadas com a wariftena. Nos
avaliamos o papel da wariftena sobre o NFB somente frente ao estmulo via TLR4; no
avaliamos frente a ligaao direta ao BCR.
J conhecida a ao imunossupressora do cAMP em diversos tipos celulares do
sistema imunolgico, incluindo em clulas B (Wishler et al, 1992; Apasov & Sitkovsky,
1999; Apasov et al, 2000). Em contraste, somente recentemente na literatura, alguns
mecanismos moleculares sobre a ao do acmulo intracelular de cAMP nas clulas B,
foram descritos (Minguet et al, 2005). Alm disso, j foi observado um aumento na
concentrao de cAMP em clulas B tratadas com o extrato de Cissampelos sympodialis
(Alexamdre-Moreira, Piuvezam & Peanha, 2003b). Para verificar se o efeito inibitrio
da wariftena sobre os linfcitos B estaria relacionado ao aumento intracelular de cAMP,
avaliamos a concentrao dessa molcula em culturas de linfcitos B. Utilizamos como
controle nesses experimentos a droga Rolipran (um inibidor das fosfodiesterases, que
atua aumentando os nveis intracelulares de cAMP). Verificamos um aumento de em
mdia 50% nos nveis intracelulares de cAMP quando as culturas eram tratadas com
wariftena en associao ao Rolipran.
J foi descrito que o acmulo de cAMP leva a uma inibio na proliferao
celular quando as clulas so estimuladas via BCR (Wishler et al,1992). Tambm foi
observado que esse aumento leva inibio na via de sinalizao induzida por TLR4
(Minguet et al, 2005). Esses achados esto de acordo com a ao da wariftena descrita

51

em nosso estudo, j que nossos dados sugerem que a wariftena atuaria inibindo a
ativao de linfcitos B por aumento da concentrao de cAMP.
Estudos anteriores mostraram que, em nvel molecular, o acmulo de cAMP,
atravs da adio de IBMX (inibidor de fosfodiesterases) e Forskolin (ativador da
adenilato ciclase), inibiu a fosforilao das protenas ERK 1 e 2, e essa ao foi revertida
pela adio de H-89 (inibidor de PKA) (Minguet et al, 2005). Estes estudos sugerem que
o aumento de cAMP levaria a uma inibio da via MEK-ERK de sinalizao, e que essa
inibio seria dependente da atividade da PKA (Minguet et al, 2005) . Baseado nesses
achados, testamos se a inibio da fosforilao da protena ERK seria observada quando a
wariftena adicionada cultura e observamos que em nosso modelo, onde a ao da
wariftena aumenta a concentrao de cAMP, tambm ocorre a inibio da ativao de
ERK.
Nossos dados sugerem que a wariftena, atravs do aumento intracelular de
cAMP, induz uma reduo nos nveis nucleares de NFB em linfcitos B. Estudos
anteriores mostraram que o acmulo de cAMP leva a uma inibio da localizao nuclear
do fator de transcrio NFB, tanto em clulas estimuladas via BCR, quanto em clulas
estimuladas via TLR4 (Neumann et al, 1995; Minguet et al, 2005). Alm disso, j foi
sugerido que, em clulas estimuladas via BCR e via TLR4 a ao inibitria sobre o NFB
ocorreria por ao da PKA, j que foi observada uma reverso na inibio da resposta
pela adio do inibidor de PKA H-89 (Minguet et al, 2005). Esses achados da literatura
esto de acordo com o efeito da wariftena na localizao nuclear do NFkB observada
nesse estudo.
Observamos em nosso estudo que a wariftena inibe a resposta induzida por
ionforo de clcio e PMA, substncias que mimetizam a sinalizao via BCR por levar a
um aumento nos nveis de clcio intracelulares e ativao de PKC, respectivamente.
Alm disso, tambm foi observada por ns uma significativa reduo no influxo de clcio
quando a warifteina foi adicionada. Estudos anteriores demonstraram que o aumento de
cAMP, provvel mecanismo de ao da wariftena, no bloqueia a ativao induzida por
ionforo de clcio e PMA (Whishler et al, 1992). Esses achados no esto em
concordncia com o que observamos, o que sugere que, apesar da wariftena induzir
aumento de cAMP, talvez esta droga inibiria outras vias de sinalizao em adio a esse

52

efeito. De fato, observamos em estudos cinticos que, independente do estmulo

utilizado, a wariftena inibe a resposta de linfcitos B mesmo se adicionada aps 24h do
incio da cultura, etapa que posterior aos sinais mediados por ativao de PKC e
aumento intracelular de clcio.
Tomados em conjunto, nossos dados indicam que, provavelmente, um dos
possveis mecanismos de ao da wariftena seria a induo do aumento intracelular de
cAMP, que seguido da ativao da PKA, assim alterando a ao do NFB, e inibindo
tanto a proliferao celular quanto a secreo de imunoglobulinas. O aumento na
concentrao de clcio e a ativao de PKC so eventos que ocorrem rapidamente e
atingem seu nvel mximo alguns minutos aps a ativao. Alm destes efeitos iniciais,
no entanto, nossos dados sugerem que outras vias de sinalizao tardias tambm seriam
bloqueadas pela wariftena.
Ja foi mostrado que o extrato de Cissampelos sympodialis apresenta efeitos aniinflamatrios, imunomoduladores e anti-alergicos (Costa et al, 2008). No presente estudo
mostramos que a warifteina atua como um inibidor farmacolgico da resposta dos
linfcitos B. Estudos prvios mostraram que o uso do produto natural curcumina teve
efeito teraputico no modelo de doena auto-imune encefalomielite autoimune alrgica
(Natajaram & Byth, 2002). Nossos achados de que a wariftena inibe a produo de
anticorpos tanto in vitro quanto in vivo abrem a possibilidade de uso dessa substncia no
tratamento de doenas onde o controle da resposta de linfcitos B diminuiria a
morbidade.

53

8. CONCLUSES

A wariftena no apresenta toxicidade sobre linfcito B e a linhagen tumoral

DAUDI.

Foi observada inibio da proliferao celular em culturas de linfcitos B tratadas

com wariftena e estimuladas por diversos ativadores policlonais (LPS, Pam3Cys,
oligodeoxinucleotdeo com seqncias CpG e anticorpo anti-IgM).

Foi observado que a inibio da proliferao celular estimulada por diversos

estmulos

policlonais

(LPS,

Pam3Cys,

anticorpo

anti-IgM

oligodeoxinucleotdeo com seqncias CpG) ocorre mesmo quando a wariftena

acrescentada em etapas posteriores da cultura, indicando possivelmente uma ao
tardia na via de sinalizao da clula B.

A wariftena induz inibio da secreo de imunoglobulinas in vivo em animais

imunizados com TNP-Ficoll e in vitro em culturas estimuladas por ligantes de
receptores tipo-toll. Esse efeito inibitrio ocorre mesmo quando a wariftena
acrescentada em etapas mais tardias da cultura.

Tambm observado que a ao inibitria da wariftena no revertida quando

so adicionados a cultura acetato mirsticode forbol (PMA) e ionforo de clcio
(A23187), reforando a possibilidade da wariftena atuar em etapas posteriores da
sinalizao em clulas clula B.

O tratamento com warifteina inibe o influxo de calcio em culturas de linfocitos B

estimulados com anticorpo anti-IgM.

Em culturas estimuladas por LPS, a wariftena no induz alterao no padro de

fosforilao de resduos de tirosina, porm ela diminui a induo da forma

54

fosforilada da protena ERK. Esses dados indicam que um dos possveis

mecanismos de ao da wariftena a inibio da via das MAPK.

A wariftena induz uma reduo na migrao para o ncleo do fator de transcrio

NFB em clulas B tratadas e estimuladas por LPS.

A wariftena aumentou os nveis intracelulares de cAMP, indicando que este um

dos mecanismos de induo do bloqueio da resposta de linfcitos B induzido por
esta substncia.

55

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10) ANEXO

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