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APLICACIN DE LA TECNICA DE ELECTROFORESIS DISCONTINUA PARA

LA DETERMINACION DE Y CASEINA EN LECHE FRESCA


En el resumen de la aplicacin de la tcnica de electroforesis discontinua en geles
de policrilamida y bis acrilamida en presencia de SDS segn el mtodo de LEMNI

ENSAMBLAJE DE LA CAMARA DE ELECTROFORESIS

El procedimiento para el ensamblaje de la cmara de electroforesis vara de


acuerdo al modelo del equipo, en consecuencia el investigador deber
seguir las instrucciones que recomienda el fabricante.

En general, una cmara de electroforesis vertical puede tener los siguientes componentes:
Dos placas de vidrio del mismo grosor y anchura, de acuerdo al fabricante. En algunos modelos, la
altitud de los vidrios es diferente (uno con mayor altitud que el otro). En general, el tamao de los
vidrios es variable, dependiendo de la dimensin de la cmara.
Un peine, cuyos dientes pueden variar en nmero, tamao y grosor. Tiene el mismo grosor de los
espaciadores y est confeccionado del mismo material. Sirve para moldear los pocillos donde se
colocarn las muestras
Un soporte o base: dispositivo que sirve para permitir el ensamblaje de los vidrios con los
espaciadores,a travs de unas serie de prensas que ejercen presin y mantiene fijo todo el sistema
El tanque de electroforesis: recipiente que contiene el buffer de corrida superior e inferior. En algunos
sistemas, este tanque contiene electrodos permanentes a lo largo de sus bases listos para ser
conectados. En otras cmaras existe una tapa que contiene los electrodos, de tal manera que el
investigador ya no tiene contacto directo con el buffer durante el proceso de electroforesis
Fuente de poder: aparato que tiene por funcin proveer de energa elctrica a la cmara de
electroforesis. El voltaje, el amperaje y el tiempo, pueden ser regulados de acuerdo a las
necesidades del investigador.

Es discontinuo porque est conformado por dos geles de poliacrilamida de resolucin y empacamiento que
presentan diferente concentracin, composicin y pH. Ambos geles se encuentran unidos pero limitados por
una fase de separacin visible al trasluz. Debido a que en estado lquido ambos geles pueden mezclarse
fcilmente, deben ser preparados por separado esperando la total polimeracin del primero para continuar
con la polimerizacin del otro.

PREPARACION DE DISOLUCION MUESTRA


-

7-8 ml DE LECHE SE MEZCLA CON 30 ml DE TAMPON TRIS/GLICINA SE


DEJA EL TUBO CERRADO EN LA ESTUFA A 37 DESPUES DE DEJARLO
ENFRIAR A TEMPERATURA AMBIENTE SE CENTRIFUGA
AL SOBRENADANTE SE LE AGREGO SACAROSA NECESARIA PARA LA
DILUCION SEA 1 M
ESTA ES LA DISOLUCION MUESTRA

PREPARACION DE GELES

PREPARACION DEL PRIMER GEL LLAMADO GEL SEPARADOR

A/D + tampn del gel separador Ph 8.8 + mezcla de acrilamida y bis acrilamida al 30% + SDS +
PERSULFATO AMONICO + REACTIVO DE TEMED
Este ultimo completa la polimerizacin
Homogenizar mezcla
Se aade al espacio entre los cristales para un siguiente llenado con el gel concentrador

Preparacin del 2do ge LLAMADO GEL CONCENTRADOR

A/D + mezcla de acrilamida y bis acrilamida al 30 % + tampn concentrador + SDS + persulfato de


amonio + TEMED
Las proporciones de los componentes cambian para lograr un tamao de poro mayor , el PH reduce
a 6.8

COLOCAR PEINE

Para obtener los posillos donde se depositara la muestra

APLICACIN DE LAS MUESTRAS

EL GEL SE SITUA EN UNA SERIE DE SOPORTES VERTICALMENTE QUE PERMITE FIJARLO AL


TANQUE DE ELECTROFORESIS
EL SOPORTE CENTRAL CONTIENE LOS ELECTRODOS QUE PERMITIRAN SUMINISTRAR
CORRIENTE ELECTRICA AL SISTEMA UNA VEZ EN CONTACTO CON EL TAMPON DE
ELECTROFORESIS

TINCION DE PROTEINAS
-

Se lava con abundante agua para retirar restos de tampn


Se retira cuidadosamente el gel evitando que este se rompa en el proceso
Se aade a un recipiente de tincinque cubra todo el gel el tiempo suficiente para
que se produzca la tincin
SE RETIRA LA SOLUCION COLORANTE ( DE TINCION ) , SE LAVA CON
ABUNDANTE AGUA
ENCUBAR EL GEL AHORA EN SOLUCION DECOLORANTE

IDENTIFICACION DE PROTEINAS
-

AHORA SE PUEDE OBSERVAR LA TRAYECTORIA SE LAS PROTEINAS


LA MIGRACION DE LAS PROTEINAS EN EL INTERIOR DEL GEL ES IN
VERDAMENTE PROPORCIONAL A SU TAMAO, A MENOR TAMANO
MAYOR MIGRACION

ES DECIR MAS CERCA DE LA PARTE INFERIOR DEL GEL


CON AYUDA DE PATRONES DE PESO NOLECULAR PODREMOS
IDENTIFICAR LAS PROTEINAS EN ESTE CASO Y CASEINA
PRESENTES EN LA MUESTRA DE LECHE