TCNICAS

MICROSCPICAS
ESTUDO DA MORFOLOGIA E DA ESTRUTURA CELULAR

(In L. McKane, J Kandel, Microbiology Essentials and Applications, McGraw Hill, 2nd ed)

MICROSCPIO PTICO COMPOSTO*

* Imagem formada pela aco de 2 conjuntos de lentes (objectiva x oculares)

O poder de resoluo de um microscpio determina a

ampliao mxima til do microscpio

*Capacidade de tornar
claramente visveis e distinguir
como entidades separadas
dois objectos separados

Poder de
Resoluo do
Microscpio
ptico*

Comprimento de onda da luz

que incide no objecto
(normalmente, entre 400 e 750 nm)

0,5 .
________
d=
. Sen

Indice de
refraco
do meio
entre a lamina
de vidro
e a lente da
objectiva
=1

Ar

=1,52 vidro;
leo de
imerso

Abertura
angular

Light (
)
Condenser
Light (
)
Lamp
d distncia mnima entre dois objectos (p.ex. Clulas ou
estruturas subcelulares) que os revela como entidades
claramente distintas

Menor valor d maior poder de resoluo

do microscpio

Imersion oil
100x
(Imersion
lens)

40 x

0.5-0.7 mm
0.1 mm

Resolution power
(with blue light
= 450 nm)

0.35 m

0.20 m

Refracted light
Objective lens

Reflected light
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Staining:
increasing
contrast
for bright-field
microscopy

Colorao

de clulas

Aumenta o contraste / visibilidade das clulas ou estruturas subcelulares

Acentua caracteristicas morfolgicas especficas
Permite preservar as preparaes
Facilita diagnstico de microrganismos especficos (ex. Colorao de Gram,
colorao com fluorocromos, etc.)

PASSOS PRINCIPAIS
1. Fixao
(estruturas internas e externas so preservadas e mantidas em posio fixa;
as clulas so fixadas lmina de vidro)
. Fixao qumica (preserva estrutura subcellular fina)
. Fixao por aco do calor

2. Tratamento da preparao com corantes

. Colorao simples
(p.ex. com corantes bsicos carga positiva)
. Colorao diferencial (envolve o uso de mais do que um corante)
- Divide microrganismos em grupos com base na sua colorao
(P.ex. Colorao de Gram
Distingue bactrias Gram negativas e Gram positivas, devido a
diferenas na estrutura da parede celular)
. Colorao de estruturas especficas

Some stains used in bacteriology

Colorao negativa
(observao de cpsula
volta das clulas)

Escherichia coli
(bactria Gram negativa)

Colorao de flagelos
de Salmonella thyphi

(In L McKane & J Kandel, Microbiology: essentials and applications, McGrawHill, 2nd ed.)

VRIOS TIPOS DE MICROSCPIO PTICO COMPOSTO

Microscpio de campo claro (bright-field microscope)

Microscpio de campo escuro (dark-field microscope)

Microscpio de contraste de fase (phase-contrast microscope)
Microscpio de contraste de interferncia diferencial
(DIC, differential interference contrast microscope)

Microscpio de fluorescncia (fluorescence microscope)

Imagem
com
maior
contraste

Clulas da levedura Saccharomyces cerevisiae

Campo claro
- usa luz visvel
- No resolve estruturas
mais pequenas que 0,20 m
- Simples e barato
- Ideal para observao de
clulas coradas
(ver COLORAO)
-Desvantagem: baixo contraste
entre as clulas e o meio
exterior, e entre as estruturas
subcelulares/organelos e o
citoplasma das clulas.

Contraste de fase
- usa luz visvel
- Poder de resoluo mx: 0,20 m
- Sistema ptico especial
(condensador; objectivas)
que permite distinguir
pequenas diferenas no
indice de refraco
(p.ex. entre o citoplasma e o
exterior; entre os organelos
e o citoplasma)
- Resultado: melhor contraste
- Permite observao de
alguns detalhe intracelulares
em clulas vivas

Campo escuro
- usa luz visvel
- Poder de resoluo mx: 0,20 m
- Condensador especial
(disco opaco bloqueia a entrada
de luz directamente na objectiva;
somente observada a luz
reflectida pelo objecto)
- Resultado: melhor contraste
que campo claro (celulas
brilhantes sobre fundo escuro)
- Desvantagem: pouco detalhe
subcelular

Excelentes para observar clulas vivas, no coradas

Clula do protozorio Paramecium

Microscpio de
Contraste de interferncia diferencial
(DIC; Nomarski)

Contraste de fase

- Como no microscpio de contraste de fase,

usa diferenas nos indices de refraco das
estruturas ou materiais que a luz atravessa, para
formar imagens. Usa dois feixes de luz,
separados por aco de prismas.
- Resultado: imagem tridimensional,
colorida (cor artificial).
- No requere colorao das clulas.
- Melhor resoluo que microscpio de contraste de fase
- Excelente para observar clulas vivas
(detalhes de estruturas subcelulares)

Yeast cells

nucleus

Imagens obtidas com o microscpio de fluorescncia

Quistos do protozorio Giardia sp.
(contaminante de gua) em matria fecal
2 tipos de bactrias, Micrococcus sp. e Bacillus sp.,
em amostra de solo

(IMUNOFLUORESCNCIA)

(clulas coradas com o corante comercial

LIVE/DEAD Bac Light Bacterial Viability Staining kit
mistura de 2 corantes que fluorescem com cores diferentes:
Corante verde penetra clulas com membrana plasmtica intacta;
Corante vermelho penetra clulas com membrana danificada)

viveis
mortas

(http://www.epa.gov/nerlcwww/gda_seq1.htm)

Bacillus cereus e Pseudomonas aeruginosa

(Imunofluorescncia)
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

(Handbook of Fluorescent Probes and

Reserch Chemicals, Molecular probes, 1999)

Microscpio de Fluorescncia
- Expe o objecto a radiao Ultra-Violeta, violeta ou azul ( ~ 300-400 nm);
- As clulas a observar esto normalmente coradas com
um composto fluorescente (fluorocromo) ou apresentam
auto-fluorescncia;
- Imagem formada com base na luz fluorescente emitida pelo
fluorocromo (na clula) aps excitao;

- Poder de resoluo mx: 0,18 m

- Aplicaes:
- Visualizao de clulas in situ (coradas com
fluorocromos ou autofluorescentes)
- Distino entre clulas viveis (activas) ou mortas
(uso de fluorocromos especficos)
- Diagnstico rpido de microrganismos
especficos em amostras clnicas,
ambientais, alimentares, etc.
(p.ex. por imunofluorescncia, e
por tcnicas de
FISH - Fluorescent in situ hybridization,
etc.)

Instrumento essencial em
estudos de ecologia
microbiana do solo, diagnstico
de microrganismos em
alimentos, microbiologia clnica,
etc.

(
)
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Espectro electromagntico

Fluorescncia

(http://praxis.pha.jhu.edu/pictures/emspec.gif)

Diagrama de Jablonski
Processos envolvidos na criao dum estado electrnico
singleto excitado numa molcula ( fluorocromo),
por absoro de um foto de energia, e
subsequente emisso de fluorescncia.
(Handbook of Fluorescent Probes and Reserch Chemicals, Molecular probes, 1999)

1 Excitao (por radiao ultravioleta, violeta ou azul;

fonte externa de energia: lmpada incandescente,
p.ex. de Hg, ou laser)
2 Tempo de vida do estado-excitado (1-10 x 10-9 segundos)

3 - Emisso de fluorescncia

Exemplo de IMUNOFLUORESCNCIA (no diagnstico de microrganismos)

. Anticorpo que se liga especificamente
a um determinado microrganismo
combinado com fluorocromo.
(P.ex. Fluorescena emite luz verde)

. O anticorpo combinado adicionado

s clulas fixadas sobre uma lmina e
vai ligar-se a molculas especficas
(antigneos) presentes na superfcie das
clulas do microrganismo que se pretende
detectar;

In M McKane & J Kandel, Microbiology: essentials and

applications, McGrawHill, 2nd ed.)

. As clulas s quais o anticorpo se ligou

fluorescem (cor verde, no caso do fluorocromo
ser a fluorescena) aps serem sujeitas a
radiao com comprimento de onda adequado
para excitar a molcula do fluorocromo.

OBTENO DOS ANTICORPOS (disponveis comercialmente)

ANTIGNEOS

ANTICORPOS

macromolculas presentes nas clulas

microbianas (p.ex. protenas, lipoprotenas,
polissacridos da parede celular, etc. ) ou nos vrus

molculas que so produzidas por animal infectado

(resposta imunitria) e que tm a capacidade de
se ligar especficamente aos antigneos que
induziram a sua produo

Imagens obtidas com o microscpio de fluorescncia

Cistos do protozorio Giardia sp.
(contaminante de gua) em matria fecal
2 tipos de bactrias, Micrococcus sp. e Bacillus sp.,
em amostra de solo

(IMUNOFLUORESCNCIA)

(clulas coradas com o corante comercial

LIVE/DEAD Bac Light Bacterial Viability Staining kit
mistura de 2 corantes que fluorescem com cores diferentes:
Corante verde penetra clulas com membrana plasmtica intacta;
Corante vermelho penetra clulas com membrana danificada)

viveis
mortas

(http://www.epa.gov/nerlcwww/gda_seq1.htm)

Bacillus cereus e Pseudomonas aeruginosa

(Imunofluorescncia)
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

(Handbook of Fluorescent Probes and

Reserch Chemicals, Molecular probes, 1999)

Microscpio confocal de laser

- Usa luz emitida

por laser para iluminar
um plano do objecto
de cada vez.
- Normalmente, clulas so
coradas com fluorocromo(s)
- Imagem bi-dimensional
ou tri-dimensional final
construida por
aplicao
informtica
- Poder de resoluo
elevado

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

- Aplicaes:
- anlise de camadas
de microrganismos
em biofilmes;
- anlise do conteudo
microbiano de amostras
espessas, em
profundidade
(p.ex.,em tecidos, solo) ;
- ecologia microbiana
(amostras ambientais)

Filamentos de cianobactria
em amostra de solo
(In Brock Biology of Microorganisms, 11th edition, Prentice Hall)

Transmission Electron Microscope

Resolution power of optical and electronic microscopes
Phase contrast microscope (1000 x)
compared to the dimensions of cells, organelles and molecules:

Transmission electron microscope

(282 000 x)

Subcellular
structures

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Virus influenza

Bacteria Rhodospirillum rubrum

Microscpio Electrnico de Transmisso

- Usa um feixe de electres (em vez de luz visvel)
(comprimento de onda muito mais curto: ~ 0,012 nm)
e magnetes em vez de lentes de vidro nas objectivas,
condensadores, etc.
- Poder de resoluo mximo ~ 0,5 nm
( permite resolver estruturas muito pequenas, em
comparao com o microscpio ptico))
- Ampliao mxima til: ~200 000 x
- Imagem bi-dimensional, formada com base no
desvio de electres pelas estruturas mais densas
do objecto e transmisso atravs das regies de
baixa densidade.
(regies densas vs. transparentes)
- Meio de propagao do feixe electres o alto-vcuo
(para evitar desvio de electres por particulas do ar)
- Aplicaes:
observao de virus; observao da
ultraestrutura interna de clulas do tipo
procaritico ou eucaritico.
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

- Preparao da amostra complexa e morosa.

Microscpio Electrnico de Varrimento

(Scanning Electron Microscope)

- Usa electres reflectidos pela

superfcie do objecto para
formar a imagem;
- Poder de resoluo: ~ 5 nm
- Imagem tridimensional

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

- Observao de caractersticas da
superficie de clulas e virus e
estrutura de colnias, directamente
na superfcie de tecidos e diversos tipos
de outros materiais.

Scanning Electron Micrographs

Hyphae of fungi, and

Bacteria colonies

bacterial cells

over a soil particle

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

In L. McKane e J. Kandel, Microbiology: essentials and applications, McGrawHill, 2nd ed.)

Dupla hlice de DNA (3 voltas) observada

por microscopia de varrimento de tnel
(cor artificial)
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)