BIOLOGIA

CELULAR
3 GRADO BIOLOGIA
Raquel

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-Profesores: Alberto cuesta, M Engracia Abad.

-6 Prcticas (en la ltima se hace el examen)
-Trabajos por grupo (4-6 personas) 12 Noviembre
-Examen: 30 preguntas tipo test (3 puntos) + 3 preguntas desarrollo (3 puntos).
-Tutoras y seminarios 15% (0,25 asistencia). No entran los seminarios en el examen.
Presentacin seminario 1,25.
-Prcticas 25% (0,2 asistencia). Habr dos controles que puntuarn 0,5 y 0,3. El examen de
prcticas vale 1,5.
-Libros: Biologa celular y molecular. Conceptos y experimentos (G. Karp). Biologa
molecular de la clula (B. Alberts). Biologa celular y molecular (H. Lodish y
Otros). La clula (G.M. Cooper)

TEMA 1: MTODOS DE ESTUDIO DE

CLULAS Y TEJIDOS
1. HISTORIA DE LA BIOLOGIA CELULAR
La biologa celular se basa en el estudio de la clula eucariota. Su inters es muy relevante
(estudio de clulas madre, cncer, etc.) pero sin embargo, en sus comienzos no pareca tan
importante pues no se disponan de tcnicas e instrumentos necesarios para su estudio. Con
el desarrollo del microscopio ptico se empiezan a estudiar clulas.
En los primeros estudios (siglo XIII-XVI) apenas hay inters por el estudio de la biologa
celular, pues se estn desarrollando los microscopios que permiten aumentar las cosas de
tamao sentando la base para crear buenos microscopios. Con estos primeros microscopios
que presentan lentes rudimentarias no se permita ver bien las cosas.
Lo invent Jansen (1590) o Galileo Galilei (1610). En 1665 Robert Hooke crea un
microscopio con dos lentes suficientemente bueno para observar clulas. Robert Hooke vio
mediante el microscopio compuesto en el corcho estructuras como de celdas vacas a las
que llam clulas (aunque realmente vea paredes).
En 1674, Leeuwenhoek es el que describe por primera vez clulas vivas, describiendo gran
cantidad de bacterias, clulas libres, ncleos, etc. Llamndolos animculos. Usaba un
microscopio simple.
Entre los siglos XVIII y XIX se mejoran las lentes y los microscopios. En 1934. Se crea el
microscopio de contraste de fases por Zernike. En 1942 Max Knoll y Ernst Ruska inventan
el MET. En 1957 Minsky inventa el microscopio de Barrido Confocal. En 1965 se inventa
el MEB.
En el siglo XIX en 1838-39, Schleiden y Schwann tras una serie de hallazgos en muchos
organismos, llegaron a concluir que todos los organismos estn compuestos por clulas y
que esta era la mnima unidad funcional y estructural de los seres vivos.
Posteriormente Virchov confirma que toda clula proviene de una clula anterior. Estos 3
enunciados conforman la teora celular tal y como la conocemos.
TEORIA CELULAR
- Todos los organismos estn compuestos de clulas.
- La clula es la unidad funcional y estructural de los seres vivos.
- Toda clula proviene de otra clula

Posteriormente a finales del XIX se dan tambin una serie de hechos fundamentales
corroborando todo lo anterior ya que se observa la mitosis y se demuestra la fusin de
gametos y la meiosis.
3

2. DIFERENCIAS ENTRE EUCARIOTAS Y

PROCARIOTAS
Las procariotas son las bacterias y las eucariotas son las clulas que forman parte de
Protistas, plantas y animales. Las principales diferencias son:
1) Las bacterias son unicelulares simples (aunque pueden vivir en colonias) y los
eucariotas son unicelulares o pluricelulares.
2) Los procariotas suelen ser ms pequeos que los eucariotas.
3) A nivel de membrana plasmtica, los procariotas nunca presentan esteroles, en
cambio los eucariotas s.
4) Los procariotas no tienen protenas del citoesqueleto, los eucariotas si.
5) Adems, los eucariotas tienen pared celular. Los procariotas pueden no tenerla.
6) Otra diferencia es en la presencia de ncleo, que solo est en eucariotas. La
presencia del material gentico est en una sola molcula en procariotas, y en
eucariotas aparece como una molcula lineal y en un nmero mayor de uno
(cromosomas).
7) Otra diferencia es el sistema respiratorio, en procariotas est integrado en la
membrana plasmtica y en las mitocondrias en las eucariotas.
8) Otra diferencia es la propiedad de sedimentacin del ribosoma, son de 70S en
procariotas y 80S en eucariotas, excepto el de las mitocondrias que es de 70S. Estos
datos confirman que las mitocondrias proceden de bacterias.

3. PROPIEDADES DE LAS CLULAS

1) Son muy pequeas y no podemos verlas.
MICROSCOPIOS
2) Son transparentes (ofrecen poco contraste a la luz).
3) Son complejas y organizadas.
4) Son capaces de obtener energa y utilizarla.
5) Poseen un programa gentico.
6) Crecen y se reproducen pues obtienen energa.
7) Producen reacciones qumicas pues tienen un metabolismo.
8) Producen y reaccionan a estmulos del exterior
9) Pueden moverse y cambiar de forma pues son plsticas.
10) En organismos multicelulares sobretodo se autorregulan. Las clulas estn en un
proceso de homeostasis (Se regeneran, unas mueren y otras nacen).
11) Las clulas evoluciona
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4. MICROSCOPIA
-TAMAOS RELATIVOS
El desarrollo del estudio de la clula se da con el desarrollo de la microscopia. Nuestro ojo es
capaz de ver hasta 01 o 02 mm y las clulas presentan un tamao de 5-10 . De manera que en
funcin de la disminucin del tamao de las formas celulares tendremos 2 tipos de microscopio
que nos permite estudiar clulas y componentes celulares.

-CARACTERISTICAS DE LAS CELULAS

Adems de que las clulas son pequeas, son transparentes, de manera que tienen poco contraste
(pequeas, acuosas y tienen tomos ligeros) y no se pueden observar fcilmente. Para poder ser
estudiadas por un microscopio podemos modificar el contraste de la muestra (tinciones o
podemos modificar la fsica del microscopio. En funcin de estos dos factores presentamos
distintos tipos de microscopia.

5. MICROSCOPIOS OPTICOS
En estos usamos una fuente lumnica. Dentro de estos tenemos:
1) Microscopio ptico de campo claro
Usa la luz como fuente de energa que se conduce hasta el ojo a travs de unas
lentes. El microscopio ptico (de campo claro) presenta dos lentes que nos permiten
ver el objeto. En el de Leeuwenhoek (microscopio simple) es un microscopio con
una lente que nos amplifica la muestra.

La luz que pasa por el microscopio viaja por un sistema de espejos para que
confluya toda la luz en la muestra concentrndose sobre ella y en funcin del
contraste, esa luz va a cambiar su direccin y vamos a tener despus un sistema
de lentes (el objetivo) que nos recogen toda o parte de esa luz que ha atravesado
la muestra. Gracias a un sistema de espejos y lentes (el ocular) nos va a llegar
hasta el ojo siendo capaces de visualizar de forma aumentada la muestra y su
contenido.
El microscopio de Hooke era compuesto (dos lentes):

El lmite de resolucin es muy importante para el microscopio. Cuanto mayor sea

su lmite ms separadas se ven las estructuras. Cuanto mayor sea el lmite de
resolucin mejor es el microscopio y se calcula por una frmula:

(AN es apertura numrica)

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LUZ BLANCA = 550nm

AN= n sen
AN ACEITE= 1, 5
Cuanto mayor es la apertura numrica (AN) menor es el lmite de resolucin.
Cuanto ms cerca est la muestra del objetivo menor ser el lmite de resolucin.
Con aceite de inmersin, el lmite de resolucin aumenta hasta 1000 veces con
respecto al ojo humano. El microscopio de campo claro necesita aumentar el
contraste de la muestra, para ello se tie la muestra de manera que para suministrar
coloracin se trabaja con material muerto, de manera que esta microscopa no
permite material vivo salvo que tenga pigmentos naturales.

2)

Microscopio de campo oscuro

El microscopio de campo oscuro presenta una ventaja y es que permite trabajar con
material vivo, que no tiene por qu estar coloreado. Lo que se hace es variar la
fsica de la luz de manera que nos ofrece en el material vivo unos contornos
brillantes con un fondo oscuro, ya que entre el condensador y la fuente de luz se
pone un cilindro que bloquea toda la parte central de la luz, solo llegando la parte
perifrica de la luz haciendo que toda la luz llegue inclinada hacia la muestra y toda
aquella luz que no es dispersada por la muestra no la vemos y vemos la dispersada
por ello vemos brillo sobre un campo oscuro. En este caso no se permite estudiar
con mucho detalle, es decir, no tiene buen lmite de resolucin, pues su apertura
numrica no pasa de 1.

3)

Microscopio de contraste de fase

El microscopio de contraste de fase es muy usado, y nos permite estudiar material
vivo debido a su fsica, ya que se introduce un condensador de anillo y un plato de
fase en el microscopio. El condensador solo permite que pase un cilindro de luz
hueco en el centro que luego hace que una vez que la luz llega sobre la muestra se
produzca un pequeo desfase en la luz (de un cuarto) que llega a travs de la clula
produciendo una refraccin muy pequea, pero al colocar el plato de fase hace que
la longitud de onda que va desfasada la vuelve a retrasar (otro cuarto) de manera
que se retrasa la mitad la longitud de onda y esta mitad si se puede recoger y ver. Su
poder de resolucin es bajo pero nos permite distinguir el contorno celular, el
ncleo, etc.

4) Microscopio de Nomarski o contraste por interferencia diferencial

(DIC)
En este caso podemos trabajar
tambin sobre material vivo pero
adems podemos trabajar sobre
material grueso incluso hasta con
pequeos organismos completos.
Este microscopio va a trabajar sobre
las pequeas variaciones del ndice
de refraccin que exista entre los
distintos componentes extracelulares
amplificndolos, sacando as una
buena imagen. Para ello utilizamos
luz normal la cual pasaremos por
polarizadores, incidiendo en la
muestra luz polarizada
monocromtica, por lo que toda la
luz presenta una misma longitud de
onda.
Todos los rayos de luz son paralelos y deben llegar al mismo tiempo y con la
misma inclinacin, pero no es del todo cierto, ya que se introduce un prisma, por lo
que todas estas longitudes las separa en dos rayos paralelos con las mismas
longitudes de onda. Estos dos rayos atraviesan los condensadores, muestras y
llegan a otro prisma que los junta. Si los dos llegan al mismo tiempo al prisma se
fusionan y llega una nica longitud de onda. Si esos dos rayos atraviesan muestras
con distinto ndice de refraccin sufren un retardo y al fusionarse no lo hacen en la
misma fase, de manera que uno llegar antes que otro, por lo que la imagen nos
llega una antes que otra, formando una imagen tridimensional, eliminndose los
halos de microscopa de contraste de fases.

5)

Microscopio de fluorescencia/epifluorescencia (MF)

En epifluorescencia el haz de luz llega por arriba incide sobre la muestra y vuelve
de nuevo hacia arriba. Estos microscopios se basan en la fluorescencia, que es la
capacidad de ciertas molculas de absorber luz de una determinada longitud de onda
y emitir luz a mayor longitud de onda durante un periodo de tiempo. Esto produce
la emisin de energa que provoca esta fluorescencia por accin de los
fluorocromos. La parte del fluorocromo que produce esta fluorescencia es el
fluoroforo. Cada fluorocromo tiene un espectro de excitacin con un mximo y va a
tener un espectro de emisin de mayor longitud de onda con un mximo tambin.
Estos espectros pueden solaparse en parte y pueden darnos imgenes que no se
adecuen a la realidad. En este tipo de microscopio se cambian las fuentes de
iluminacin puesto que tenemos una luz ultravioleta y se parte con una longitud de
onda baja para emitir longitudes mayores y puedan ser visibles, por eso se usa la luz
ultravioleta (340-500 nm). Estos microscopios presentan una serie de filtros que no
deben porque estar en el microscopio sino que se aaden a un microscopio
cualquiera al que se le aade la fuente de luz ultravioleta y quita la luz. Hay un filtro
que ser el de excitacin al que le llegar una luz y se elige la longitud de onda que
queremos que atraviese ese filtro y que excite al fluorocromo. Despus tenemos los
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filtros de barrera. Estos eliminan todos los fluorocromos que se puedan solapar y
pueden ser de 3 tipos:
Filtro de paso de banda, que puede pasar un rango ms o menos estrecho de
longitudes de onda. Puede pasar la longitud de onda de una franja.
Filtro de paso corto, donde pasan todas las longitudes que sean menores de 600
nm por ejemplo, y las que no lo sean, no pasan.
Filtro de paso largo donde pasan todas las longitudes de onda que sean
mayores a X (por ejemplo, 600nm), mientras que las menores no.

En esta microscopia se pueden estudiar tanto material vivo como material muerto.
Se puede usar para determinar una muestra concreta, para la presencia de una
enzima, de ADN, protenas, etc. Adems se pueden utilizar distintos fluorocromos
en la misma muestra, generalmente se trabaja con equipos rutinarios con verde, rojo
y azul. El problema es que las muestras que se colorean no se saben con exactitud
donde se encuentran cada estructura, por lo que se deben comparar con otras
imgenes de la misma muestra con distinto microscopio para ver de qu estructura
se trata.
A la hora de trabajar con microscopia de fluorescencia debemos saber que:
- Se presenta una emisin a mayor longitud de onda.
La excitacin del fluorocromo dura muy poco por lo que la fluorescencia es
muy rpida, por ello se necesita un capturador de imgenes, muy rpido y
sensible.
Adems, los fluorocromos presentan el apagado o quenching, que quiere
decir que existen sustancias que enmascaran el espectro de emisin del
fluorocromo por lo tanto no se podr ver.
- Se presenta tambin el blanqueamiento o photobleacing que quiere decir que
la exposicin continuada del fluorocromo hace que este no sea capaz de
excitarse. Podemos estudiar tanto el apagado como la reaparicin.

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Prctica 1

6) Microscopio de barrido confocal (MBF)

En este caso usamos un rayo lser en lugar de luz y lo que tenemos son detectores y
fuentes que actan haciendo pinhole. Estos hacen que el rayo laser no incida sobre
toda la muestra al mismo tiempo, de manera que, variando la apertura y la distancia
de los pinhole, hacemos que la luz incida sobre una determinada parte de la muestra
dndonos imgenes muy ntidas, por eso se llama barrido confocal (se puede
focalizar todo el sistema en un plano y se puede cambiar la altura de ese plano).
Resolucin de 01 m. Hasta 15.000X.

Ventajas:
La mejora ptica, que va asociado a software muy buen. Produce la digitalizacin
de imgenes, elimina los inconvenientes de la microscopa de fluorescencia, adems
la iluminacin es ms dbil y ms rpida, por lo que hay un sistema de captura ms
sensible; se excita menos el fluorocromo gastndolo menos, asique se puede excitar
peridicamente pudiendo hacer estudios cinticos. Se mejora la resolucin al
enfocar un solo plano. La toma de muchos planos nos permite hacer imgenes
tridimensionales.
Preparacin de muestras:
Las muestras pueden estar tanto vivas como fijadas. Enteras o secciones gruesas.
Modos de recoger las imgenes:
Las imgenes se recogen por secciones individuales (seccin ptica). Podemos
obtener imgenes 3D moviendo en el eje Z la profundidad, y podemos obtener
imgenes 4D.
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6. MICROSCOPIOS ELECTRONICOS
1) Microscopio electrnico de transmisin (MET)
Se utiliza para estudiar la ultraestructura. Tenemos un
microscopio con alto poder de resolucin (1 nm). Esta
microscopa es similar al microscopio ptico, se trabaja
a alto vacio. Esto hace que los electrones se aceleren a
un nodo perforado pasando los electrones por el vacio
por lentes electromagnticas hasta llegar a la muestra y a
travs de unas lentes llega a una cmara digital.
Al chocar los electrones sobre la muestra, estos se
dispersan en todas las direcciones. En esta microscopa
se recogen los electrones que no se dispersan por lo que
en la imagen se ver en tonos negros, blancos y grises.
Se trata de muestras sin nada de agua, estabilizadas y
que estn contrastadas, pues todos los componentes
celulares tienen muy baja densidad y eso no ofrece
resistencia a los electrones. Se usan tcnicas de tincin
que nos permitan identificar estructuras y que sean muy
electrodensos, siendo capaces de ser reflejados los
electrones viendo as estructuras que sin contrastar no
veramos. Se obtendra una imagen similar a las de
campo claro pero sin color. Adems, para favorecer la
penetracin y transmisin de estos electrones la muestra
debe ser muy fina. Se aumenta la imagen 200.000 veces.

2) Microscopio electrnica de barrido

En este caso no estudiamos los electrones
transmitidos, sino los dispersados. Esta
microscopa nos permite estudiar la
superficie, y su resolucin es menor a la
anterior (10nm), trabajando a 10.000 o
20.000 aumentos.
Una vez que los electrones inciden sobre la
muestra se recogen los electrones
dispersados. En este caso las muestras se
metalizan (material electrondenso) para
hacer que los electrones se dispersen,
pudiendo estudiar la superficie.

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7. COMPARACION ENTRE MO Y MET

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TCNICAS APLICADAS A BIOLOGA

CELULAR
8. TECNICAS PARA MICROSCOPIA PTICA
Consisten en un conjunto de tcnicas encaminadas a identificar, localizar y cuantificar
una molcula o estructura en un tejido (histoqumica) o clula (citoqumica). Estas
tcnicas pueden ser generales o especiales. Las tcnicas especiales puedes ser
enzimohistoqumica (la presencia de una enzima), inmunocitoqumica (presencia de un
antgeno) y lectinohistoqumica (presencia de un azcar). Se necesita contrastar el
material mediante colorante. En cuanto al procesado de las muestras se realiza en
varias partes:
1) Toma de la muestra mediante las tcnicas apropiadas. El tamao debe ser inferior
a 1cm3 y las muestras deben tomarse en frio para evitar procesos de degradacin.
2) Fijacin: Una vez que tenemos la muestra, para evitar la degradacin y para
mantener la muestra en su forma, fijamos la muestra manteniendo la estructura de
nuestro material lo ms parecido posible a como es en realidad. Podemos hacer la
fijacin de distinto modo, si lo que hay es un fragmento se hace un inmersin, en la
que la muestra se sumerge en el liquido fijador o se le inyecta al animal o se hace
una perfusin, sustituyendo la sangre por liquido fijador. Los fijadores deben
actuar con rapidez evitando degeneracin y autolisis, adems deben tener un buen
poder de penetracin limitando el tamao de la muestra (cuanto mayor poder mayor
tamao puede tener la muestra). Debemos tener en cuenta la velocidad de fijacin,
es decir, cunto tarda en fijar la muestra. Estos fijadores deben conservar todos los
detalles estructurales, deben permitir los procedimientos posteriores, deben impedir
la desaparicin de los elementos durante la fijacin o despus y no deben retraer
excesivamente los tejidos ni volverlos quebradizos.

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Hay distintos tipos de fijadores:

- Fsicos:
Por calor: Muy malo para histologa. En microbiologa.
Por frio y congelacin: en estos se sumerge el rgano en N2
lquido o CO2 lquido. Se fija instantneamente y el rgano se
endurece. Se usa mucho para el estudio de enzimas pues
conserva la funcin de las enzimas y mantienen los epitopos.
Qumicos: Se trata de sustancias qumicas que actan formando una
red entre protenas y material celular de manera que no altera las
propiedades de los componentes, o bien desnaturalizando los
componentes. En funcin de su naturaleza tenemos:
Aldehdos: Son muy buenos fijadores para protenas, forman
redes y por tanto no desnaturalizan, por lo que se usan para
detectar la presencia de un antgeno o enzimas en algunos
casos, pero penetran muy lento, los ms usados son la
formalina y el glutaraldehido.
Alcoholes: Son fijadores muy rpidos pero no penetran bien y
se usan para teir clulas en suspensin o frotis o en cultivos
celulares y su fijacin es prcticamente inmediata, pero
contraen mucho a las clulas. Desnaturalizan, endurecen,
disuelven lpidos. Se usan el metanol y el etanol al 96%.
cidos: Son muy buenos pero desnaturalizan las protenas, se
usa el pcrico que fija el citoplasma, el actico que estabiliza y
fija el material gentico y el smico que fija los lpidos.
Sales: Como el dicromato, permanganato potsico. Estos fijan
bien protenas pero desnaturalizan.
Lo que se usa ms que fijadores simples son mezclas de fijadores, normalmente se utiliza:
Bouin: Se trata de formaldehido-picrico-actico, que estabiliza material gentico y
gran variedad de protenas.
Carnoy: Es otro que se usa para material gentico. Est constituido por etanol,
cloroformo y actico en relacin 60:30:10.
- Zenker: Que est constituido por bicromato de potasio bicloruro de mercurio y actico.
Los fijadores adems de fijar, retraen en cierta medida el material y lo vuelven
quebradizo por lo que no se puede extender durante mucho tiempo la fijacin pues se
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dificulta el procesado por lo que se elimina tras su accin y para ello lo sumergimos en
etanol de 70.
3)

Inclusin: Una vez fijada se inicia la

inclusin que sirve para hacer un bloque que
permita hacer cortes de la muestra. Se utiliza
para hacer el bloque materiales no
hidrosolubles, como parafina o resinas, por lo
que la muestra se queda sin agua.
Primero se deshidrata con pasos progresivos
de etanol al 70% (50-70-90-96-absoluto) 12h cada uno. Tras la eliminacin del agua se
hace el aclaramiento pues la sustancia para
realizar el bloque no es miscible en la
muestra, por lo que se usa Xilol que si lo es.
Tras ello se hace la impregnacin, se
impregna todo con parafina liquida (60oC) y
una vez que lo tenemos impregnado se
incorpora en un molde, se le aade parafina y
queda la muestra secuestrada en el molde,
quedndonos un bloque de parafina.
4) Corte: Este corte puede hacerse de distinta
forma, puede ser a mano alzada si se tiene
una estructura ya endurecida como se hace en
histologa vegetal. En el caso de tejido con el
que se usa microtomo, primero hacemos un
devastado del bloque (se dibuja como un
trapecio alrededor de la muestra que ser lo
que se corta) y mediante un microtomo de
parafina cortaremos la muestra en tamaos de
3 a 10 m y una vez que tenemos los cortes
estos van saliendo en fila y se van colocando
en un portaobjetos.
Para ello nos ayudamos de poli-L-lisina o albumina. Se pueden hacer cortes individuales o
bien seriadas (se usa mucho para localizar en la misma clula dos reacciones o dos
componentes, etc.). Tambin hay criomicrotomos que se usan para hacer cortes por
congelacin, se hacen cortes de 5 a 30 m y funcionan los microtomos igual que los
anteriores.
5) Tincin: Una vez que el colorante ha reaccionado con el material biolgico, el resultado es
que ese colorante quede fijado en el material biolgico. Los colorantes son soluciones
acuosas de modo que no se puede impregnar con el material hasta que no se produzca la
desparafinacion, se hidrate la muestra y ya por ltimo se realice la tincin. Tras esto se
realiza el montaje mediante el uso de un material hidrosoluble como la glicerina pero es
hidrosoluble por lo que no se conserva por mucho tiempo, tambin se puede mantener por
material no hidrosoluble, como es el DPX que nos lo puede mantener por ms tiempo, pero
para este caso se debe deshidratar de nuevo. Este montaje se realiza para mantener la
muestra (en el caso de DPX) y adems como su ndice de refraccin es mayor que el del
aire nos permite ver imgenes con mayor ndice de refraccin.
- Tincin de rutina
Tie todas las estructuras en funcin de las tcnicas acido-base entre las estructuras y el
colorante. Segn la naturaleza del colorante puede ser:
Acido: Tie estructuras con carga positiva o acidofilas (como citoplasma,
citoesqueleto, etc.). Estos colorantes son las eosinas.
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Bsicos: Tien estructuras con carga negativa o basofilas (como ncleo, matriz
extracelular, nucleolo). Este tipo de colorante es la hematoxilina. La
hematoxilina da un color violceo-rosa intenso.
Colorantes mixtos: Se trata de la mezcla de estos dos colorantes por ejemplo.
Giemsa: Usada para muestra de sangre. Este tipo de tincin mezcla distintos
colorantes y tie de manera igual que la hematoxilina-eosina.

Tinciones especiales
Nos permiten identificar un grupo de componentes. Estas tinciones pueden ser:
- Tinciones para el ADN: Como el reactivo de Feulgen, que se hace un
tratamiento enzimtico con HCl a 60o y lo que hace es que los grupos de las
bases purinicas se transforman de grupos alcohol a aldehdos que reaccionan
especficamente con el reactivo de Schiff, que se basa en la fucsina bsica
decolorada, dando un color purpura que est siempre en el ncleo, que es
donde est el ADN. Tambin hay tincin doble para distinguir el ADN del
ARN con el verde metilo-pironina. El metilo tie de verde el ADN y la
pironina el ARN de rojo.
- Tincin para carbohidratos y mucopolisacridos: Tenemos la reaccin de
PAS (acido peryodico de Schiff) que acta sobre la gran cantidad de
carbohidratos de las mucinas, donde hace que los OH sean transformados a
aldehdos que reacciona con Schiff dando un color rojo intenso. El azul alcian
tie los glucosaminoglucanos cidos y en funcin de la acidez del medio,
podemos ver mucinas con distinto grado de acidez. La tincin sale de color
azul plido. Con estas tinciones tambin se observan los ncleos mediante una
tincin de contraste (hematoxilina o eosina, siempre y cuando no enmascare la
tincin de PAS). Se usan sobre todo para tejidos mucosos. Para saber si una
clula presenta mucinas neutras o acidas se hacen las dos tinciones para ver el
resultado.
- Tinciones para grasas: Debemos mantener para ello grasas en su lugar por lo
que no se usan disolventes orgnicos como el alcohol. Para el estudio de grasas
se utilizan cortes por congelacin. El colorante se unir a estructuras con la
misma afinidad. Estas muestras se podrn lavar con agua. Se utilizan
principalmente tinciones de Sudan que forman precipitados negros o rojos.
Tambin se usa tetraxido de osmio que produce una coloracin de los
fosfolpidos de color negro y se usa para MET (microscopio electrnico de
transmisin) principalmente ya que adems de fijar contrasta. Tambin se usa
el rojo-o al aceite.
- Tincin para fibras de tejido conjuntivo:
En fibras colgenos: Se usa el tricrmico de Von Gieson (color rojo)
tricrmico de Gomori (color rojo) y el de Masson (color azul).
En fibras elsticas: Se usa mtodo de Gomori (tien de color purpura
oscuro), orceina (purpura) o Verhoeff (color negro).
En fibras reticulares: Se usa el mtodo de Gomori para la
impregnacin argentica de la reticulina (color negro).

- Tinciones especificas
Nos identifican de forma concreta una protena, gen, etc.
- Enzimohistoqumica: Nos pone de manifiesto una enzima. Para ello se
mantiene la integridad, estructura y funcin de esta protena por lo que se usara
la congelacin o fijacin dbil. A esta enzima se le pone un sustrato incoloro
que nos forma un producto enzimtico coloreado e insoluble (que precipite).
Tambin hay reacciones donde el producto sea fluorescente o electrondenso. Es
fundamental mantener las condiciones ptimas de pH, temperatura,
concentracin, etc. Se usan controles negativos mediantes inhibidores
especficos para asegurarnos de que hay una reaccin especfica. Las enzimas
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mas tpicas que se ponen de manifiesto son esterasas, fosfatasas, peroxidasas y

diaforasas. Nos debemos asegurar de que la reaccin es especfica. Se usara
contraste de fondos para identificar el fondo de nuestra muestra. Muchas de las
enzimas que identifica solo presentan una localizacin, por lo que no solo se
usa para poner de manifiesto una enzima, sino que se utiliza para localizar una
estructura como son los lisosomas porque la mayora de las enzimas estudiadas
con esta tcnica estn all. Hay otras enzimas que estn solo en el Golgi, otras
en el RE, etc.
Lectinohistoqumica: Se basa en el uso de lectinas para el marcaje de una
estructura. La lectina son glicoprotenas que se unen de forma especfica a
determinados enlaces de azucares de manera que nos permite estudiar la
presencia de glicoprotenas y se puede as estudiar la presencia de
determinados residuos sacarinicos de las protenas. En algunas casos hay
protenas que solo tienen un tipo de residuo de manera que de forma indirecta
nos permite identificar protenas o grupo de protenas. En funcin del
carbohidrato que reconozca se dividen en 5 grupos. Lo que se hace es que al
tener una seccin histolgica se desaparafina, se hidrata e incubamos la
preparacin con la lectina que va marcada con distintos tipos de marcaje. Una
vez que se incuba se retira la muestra y se sigue el procesado histolgico (se
hace un contraste, se deshidrata, se monta y se observa al microscopio). Para el
revelado se usa peroxidasa, de manera que se pone la lectina con peroxidasa
unida y se pone un sustrato de la peroxidasa (diaminobencidina) que al entrar
en contacto con la peroxidasa forma un precipitado de color marrn oscuro
insoluble que se visualiza por microscopia. Existen lectinas que son especificas
y otras que no. Al estudiar las glucoprotenas se usan distintos tipos de lectinas
para determinar cules son los enlaces y as podemos localizar en que clula
esta cada una de estas uniones o dentro de la misma clula. Esta tcnica se
puede conjugar con otras tcnicas para ampliar la informacin que se obtiene
del estudio.
Inmunocitoqumica: Se basa en la reaccin inmunolgica de los anticuerpos
que reconocen de forma especfica a un antgeno. Se puede utilizar esta tcnica
para microscopia ptica, de fluorescencia, confocal, o MET. Se debe tener una
consideracin y es que a la hora de tratar el material se debe conservar la
antigenicidad (que el epitopo sea reconocible por el anticuerpo) por lo que se
prefiere tcnicas de congelacin, la fijacin es dbil, cada anticuerpo tiene
preferencia por un tipo de fijacin. Los anticuerpos pueden ser o monos o
policlonales. Los monoclonales son anticuerpos idnticos porque son
producidos por un solo tipo de clula del sistema inmune., en cambio los
policlonales son una mezcla de inmunoglobulina, secretados en contra de un
antgeno especifico, cada uno reconociendo diferentes epitopos. Adems se
deben hacer controles de especificidad, para que un epitopo se reconozca por
un determinado anticuerpo y no por otro, por ello se usan distintos controles,
como el bloqueo, que antes del uso del anticuerpo se pone una fuente alta de
protenas, de manera que tenemos una protena que dificulta el acceso del
anticuerpo al antgeno, seleccionando los anticuerpos que se unen muy bien al
epitopo. Tambin se puede hacer mediante el uso de un suero que sea de la
misma especie de donde se obtiene el anticuerpo, o el uso de leche en polvo
que tambin tiene gran cantidad de protenas como el suero. Tambin se puede
hacer una preabsorcion que para ello se debe tener el antgeno purificado, para
ello preincubamos el anticuerpo con el antgeno, de manera que esta mezcla se
pone sobre el tejido, y como el anticuerpo esta unido al antgeno no se une a la
muestra por lo que no se detecta nada. Una vez hechos los controles
presentando gran cantidad de controles negativos, comprobando que funciona
bien. Los anticuerpos se pueden marcar para poder visualizarlos, para ello se
usan enzimas, fluorocromo, biotina, oro coloidal, bolas magnticas, etc. unidas
19

al anticuerpo. La inmunocitoqumica puede ser directa cuando se une el

anticuerpo con el marcador o bien indirecta cuando se usa primero un
anticuerpo frente al antgeno y despus un anticuerpo secundario frente al
anticuerpo primario y este secundario es el que va marcado, amplificando as la
seal. Como marcador se suele usar:
Una enzima, para MO, como puede ser:
Peroxidasa: La peroxidasa usa un sustrato que produce un
precipitado de color marrn oscuro pero el problema que
presenta es que no se sabe si la reaccin es debida a la que va
unida al anticuerpo o bien a la peroxidasa de dentro de la
clula. La peroxidasa tiene un punto dbil y es que se inhibe de
forma irreversible por el sustrato, por lo que si la peroxidasa,
una vez que se desparafina y se hidrata, se somete a alta
concentracin de perxido de hidrogeno se inhibe, para as
eliminar el exceso de peroxidasa quedando solo el que est
unida al sustrato. Adems hay que tener en cuenta que existe
otro inhibidor de la peroxidasa que es la azida sdica.
Fosfatasa alcalina: No se inhibe por sustrato, pero se hace
una inhibicin de la fosfatasa endgena. Se puede aadir
sustrato de forma continuada con la fosfatasa alcalina no como
en la peroxidasa.
La seal se puede amplificar con mtodos como:
PAP: Donde tenemos un anticuerpo primario que reconoce al
anticuerpo secundario, y despus esta la estructura PAP que presenta
un anticuerpo terciario que presenta peroxidasa, revelndose al igual
que antes.
ABC: En este caso el anticuerpo secundario va marcado con biotina,
despus se pone avidina en el sistema ABC, unindose protenas de
forma especfica a biotina que lleva unida peroxidasa.
Se pueden utilizar bien con peroxidasas o bien con fluorocromos, de manera que se puede
visualizar mediante microscopia de fluorescencia o de barrido o citometra de flujo. Si se
quiere usar MET lo que se usara para marcar al anticuerpo partculas de oro coloidal.
Tambin se puede realizar una inmunocitoqumica simple o bien mltiple (detectar varios
antgenos al mismo tiempo). Para ello debemos tener una precaucin, se deben tener
anticuerpos generados en especies distintas para que no haya reaccin cruzada. Para
identificar varios antgenos de una misma especie usando diferentes sistemas de revelado,
pero el antgeno debe expresarse en amplia cantidad.
- Hibridacin in situ: Se utiliza para detectar ADN o ARN especficos. Se
hacen sondas mediante PCR de ADN o ARN que presentan bases marcadas
con biotina o digoxigenina, de manera que se pone a incubar a unas
condiciones adecuadas la sonda y la muestra y las regiones complementarias se
unirn con la sonda. Despus se quita el exceso de sonda y se revela la
presencia de la sonda marcada. Para ello se usan anticuerpos y se localiza el
ADN o expresin de ARN. Adems se puede hacer una tcnica que es la PCR
in situ. Lo que se hace es aadir a ese tejido una mezcla que lleve los
nucletidos, algunos marcados y se aade retrotranscriptasa inversa y se
aaden cebadores, de manera que se hace una reaccin de retrotranscripcion
del ARNm con unos primers especficos as se pasa el ARNm a cDNA, de
manera que solo el gen que se estudia se transcribe generando este cDNA.
Adems hay ADN polimerasa, por lo que se somete a PCR y se amplifica,
amplificando la expresin de un ARNm de forma especfica. Una vez
terminada la PCR se somete al revelado del marcador con las tcnicas que se
precise, se hace un contraste y as localizamos las clulas que se estn
expresando.
20

- Autoradiografa
Se basa en el uso de elementos marcados radiactivamente. Estas tcnicas se han ido
dejando de usar. En este caso al animal o clula se expone a un isotopo radiactivo y se
estudia al cabo de un tiempo la muestra y se realiza un procesado para MO o MET y se
observa usando un film fotogrfico con emulsin de plata y se observa la presencia de
depsitos de plata.

9. TECNICAS PARA MICROSCOPIO DE

FLUORESCENCIA O DE BARRIDO CONFOCAL
Estas tcnicas se han desarrollado mucho pues han aparecido muchos fluorocromos tanto
naturales como artificiales y son muy especficos. Estos fluorocromos pueden unirse de
forma especfica a protenas, otros a ARN, a ADN, orgnulos celulares, cidos nucleicos,
etc. Hay otros que se usan como trazadores inicos.
Sus aplicaciones ms importantes son:
- Photobleaching donde tenemos:
- Tcnicas FRAP: Donde se elimina la fluorescencia de un punto y se
estudia cmo va apareciendo la fluorescencia, de manera que se puede
estudiar la movilidad de protenas o lpidos en una zona.
- Tcnicas FLIP: Donde se utiliza para estudiar el caso contrario.
- Tcnica TRET: De manera que lo que hay es una protena con dos dominios
que interacta, cada dominio esta unido a una protena fluorescente. Se excita
un solo fluorocromo que produce una excitacin mayor y hace que se excite la
otra protena del otro dominio, haciendo que los fluorocromos se acerquen,
pudiendo estudiar interaccin entre protenas distintas o entre dominios de la
misma protena.
Estas tcnicas se utilizan para estudios de viabilidad, ya que existen colorantes vitales que
permiten generar fluorescencia en clulas vivas, mientras que otros solo actan en clulas
muertas y se van a unir al ADN pudiendo distinguir entre clulas vivas o muertas. Tambin
se puede estudiar proliferacin, viabilidad, muerte celular, etc. Tambin tcnicas
Inmunofluorescencia, actividades enzimticas, movilizacin de sustancias, se pueden
estudiar sondas fotoactivadas, que presentan grupos nitrofenilo que bloquean la
fluorescencia y se activan por radiacin ultravioleta, viendo la movilizacin de calcio, IP3,
cGMP, etc.
Las ventajas del uso de esta microscopia es la obtencin de imgenes de secciones virtuales
y al incidir poco tiempo en la muestra, puede obtener imgenes con mayor sensibilidad
mucho ms rpido. Tambin se pueden obtener imgenes en 2D, 3D e incluso en
4D. Adems se pueden realizar secciones longitudinales y se reconstruye las imgenes
pudiendo estudiar formas que no se puede ver a microscopio

21

10.

TECNICAS PARA MET

Para el MET es necesario aumentar el contraste de la muestra con materiales
electronodensos. El procesado se debe realizar teniendo mucho cuidado porque se estudia
la ultraestructura. Si se altera la muestra se puede llegar a conclusiones errneas. Se toman
muestras de tamao muy pequeo y se debe trabajar siempre en frio. Al ser ms pequeas
hace que los fijadores lleguen de forma mucho mas rpida. La fijacin es mediante el uso
de glutaraldehido del 2-4% que fija protenas y queda un fijador que forma redes. Este
fijador no va en agua sino que va a ir preparado en un tampn para que no haya diferencias
en la presin osmtica. Tras la fijacin se hace una post-fijacin con OsO4 que lo que hace
es fijar lpidos y adems ofrece contraste por lo que se comienza a contrastar la muestra.
Tras esto la muestra se deshidrata (alcohol de 50-70-80) despus hay un proceso de
aclaramiento y posteriormente se forma la inclusin formando bloques de resinas epoxi.
Una vez que se tiene el bloque se hacen secciones. Primero se hace un corte semifino, de
05 hasta 1 m de grosor y se tie con azul de toluidina y se observa al microscopio ptico
para acotar la zona que queremos observar al MET, por lo que despus se realiza un corte
ultrafino, de 25 a 100 nm mediante un ultramicrotomo con cuchillas de vidrio o diamante y
se disponen las secciones sobre unas rejillas de niquel o cobre. Esta rejilla es el equivalente
al portaobjetos, de manera que se realiza el proceso de tincin, para as aumentar el
contraste, mediante citrato de plomo y acetato de uranilo, de manera que se disponen de
forma especfica sobre el material biolgico.

Estas tcnicas se usan para realizar reacciones de enzimohistoqumica (detectar enzimas),

lectinohistoqumica (detectar azucares), inmunocitoqumica (detectar anticuerpos marcados
con oro coloidal. Nos permite definir la localizacin exacta del antgeno. Se realiza antes
una tincin inmune para poder observar estos anticuerpos, es decir, sera un tratamiento de
pre-inclusin o bien post-inclusin en funcin del momento en que se realice. Se usa la
protena A-oro).
Tambin se pueden hacer tcnicas autoradiograficas, hibridacin in situ, etc. Tambin se
realizan tinciones negativas, para ello se pone la suspensin del material a estudiar sobre la
que se dispone una gota de carbono y despus se trata con acido fosfotngstico que se une y
da contraste a toda la muestra y es muy electronodensa.
Una de las aplicaciones ms importantes que se realiza es la tcnica de criofractura para
estudiar membrana. Cuando la muestra se congela y se somete a alto vacio se le hace incidir
una cuchilla, que debido a la congelacin y al vacio, el punto de ruptura es entre la bicapa
lipdica. Una vez separada la membrana, las protenas de membrana, especialmente las
transmembrana nos quedaran o en una cara o en otra y lo que se hace, es que cada una de las
partes, se metalizan a una cierta inclinacin. De este modo se observara las protenas
transmembrana en forma de relieve.

22

Otra forma de crear relieve para estudiar cualquier orgnulo consiste en el uso de un
sombreado metlico, haciendo que la muestra tenga un aspecto tridimensional, pudiendo
estudiar a MET esta estructura 3D.

11.

TECNICAS PARA MEB

La MEB (electrnico de barrido) tiene un procesado distinto, ya que se hace la fijacin y la

deshidratacin igual pero como lo que se estudia la estructura tridimensional, no se realiza
ningn corte, solo se metaliza con metales como oro o platino pudiendo estudiar toda la
estructura celular, cavidades, etc.

Citometra de flujo
Esta tecnologa se usa para medir clulas que estn en suspensin. Se medir tanto el
tamao, como la complejidad estructural y la fluorescencia (hay hasta 3 fluorescencias). Se
har de todas y cada una de las clulas. La ventaja que presenta es que tiene un alto valor
estadstico, pues nos permite obtener informacin de todas las clulas a una velocidad de
5000 o 6000 clulas por segundo. El nico problema que presenta es que no nos permite
localizar en la clula donde est.
El citmetro se compone de 3 partes:
1. Un sistema fludico: Se trata de un sistema de fluidos que hace que la muestra pase
a travs de los conductos del sistema del citmetro.
2. Un sistema ptico: Sobre la muestra incide un rayo laser de 480 nm que bombardea
y excita la muestra para excitar los fluorocromos, tambin tiene una serie de
detectores para los distintos ngulos y longitud de onda y tiene unos
fotomultiplicadores que hacen que esta seal elctrica la amplifique o bien reducir
en funcin de la seal que llega.
3. Un sistema elctrico: Transforma las seales luminosas en digitales y se guarda en
un ordenador.
23

En cuanto al funcionamiento tenemos las clulas en suspensin en un tubo y gracias

a un sistema de presin, hace que ese medio se pase por un canal muy fino de
manera que las clulas se alinean y pasan en fila india. En perpendicular a estas
clulas incide el laser, que por cada clula que pase el laser se dispersa al chocar
contra la clula. Todo el haz del laser que no choque contra la clula llega a un
detector que nos da informacin sobre el tamao de la clula. A este detector se le
conoce como FSC. Los que inciden sobre la clula se dispersan en funcin de la
densidad de las estructuras que haya dentro de la clula. El aparato tiene una serie
de lentes que recogen aquellas ondas que salen a 90o, que son los que pasan a travs
de los filtros, que son cada uno de un color que determina la longitud de onda que
capta. Lo primero que se recoge es la SSC que nos da informacin de la
complejidad de la clula. Estas clulas se podrn clasificar mediante el uso de
histogramas o bien de Dot-plot mediante la informacin obtenida por FSC y SSC
que juntos nos permiten diferenciar los distintos tipos celulares en una poblacin
celular heterognea.

Los factores fundamentales a tener en cuenta son:

Las clulas estn en suspensin, pues si no lo estn no se puede trabajar con esta
tcnica.
Los valores son siempre relativos.
Establece el background o valores de fondo.
Se requiere de la calibracin de fotodetectores y fotomultiplicadores para comparar
las muestras entre experimentos.
Se requiere de una compensacin de fluorescencia.
Este tipo de tcnica no permite localizar una molcula en la clula.

24

Aplicaciones de la citometra de flujo

Son todas aquellas que presenten un fluorocromo:
Marcaje con anticuerpos (fenotipado): Se puede marcar con uno o varios
anticuerpos. Es muy usado en diagnostico e investigacin, por ejemplo para el
cncer.
Podemos hacer una pequea localizacin, es decir, localizando el antgeno o el
fenmeno que queremos estudiar, pudiendo estar:
o En la superficie externa de la clula: Si se trabaja con la clula viva y se
pone el anticuerpo marcado que ira hacia el antgeno que est en la cara
externa de la membrana.
o Para protenas intracelulares: Se debe fijar la clula permitiendo la entrada
de los anticuerpos a la clula.
Estudio de permeabilidad de membrana: Usaremos colorantes vitales, que penetran
en clulas vivas y metabolizan, quedando retenidos en la clula.
Estudio de necrosis (IP), apoptosis (se hace por FDA, que las negativas son las que
tienen su membrana integra, por lo que estn en apoptosis. Tambin se puede
estudiar por TNEL), proliferacin del ciclo celular (CFSE-vivas, IP-muertas), etc.
Estudio del potencial del membrana, pH intracelular.
Cuantificacin y movilizacin de iones, como calcio, magnesio, zinc, etc.
Actividades biolgicas: Como reacciones enzimticas, estudios de inmunolgica,
etc. Estudio de fagocitosis, citotoxicidad, produccin de radicales libres, reacciones
enzimticas, etc.
Nos permite separar poblaciones celulares mediante el FACS (Flow Activated Cell
Sorting): Al pasar clulas por este citmetro, si cumplen las condiciones que se
ponen que se desea detectar, se detectan y en funcin de su carga se van a desviar y
se recogen las distintas poblaciones de clulas que se originan.

25

4. CULTIVOS CELULARES
Son los cultivos de laboratorio in vitro de clulas o tejidos independientes. Es una
alternativa al uso de animales de laboratorio y permite estudios de fenmenos in vivo.

Tipos de cultivo:
-

Primarios: Se coge una clula, tejido u rgano de un animal y se pone

en un cultivo y se mantiene in vitro. Estas clulas tienen una vida
finita, por lo que al ponerlo in vitro llega un momento en el que
mueren. Por lo que se est sacando continuamente clulas, tejidos u
rganos de un animal.
Secundarios: Donde a partir de subcultivos sucesivos de un cultivo
primario y los cuales han logrado sobrevivir a muchos subcultivos.
Estas clulas se estn dividiendo de forma infinita (lneas celulares).

Usos habituales
-

Investigacin: Para fisiologa celular, toxicologa, virologa, desarrollo,

cncer, inmunologa, clulas madre, etc.
Ingeniera: Regeneracin de tejidos, como hueso, cartlago, piel, etc.
Industria: Produccin de anticuerpos, hormonas, enzimas, vacunas
virales, etc.

Ventajas de su uso
Estudio de clulas aisladas, purificadas, pudiendo saber su funcin concreta. Son
fciles de manipular y se puede controlar las condiciones del medio. Permite el
estudio con lneas comerciales, pudiendo trabajar con el mismo material en todo
el mundo si se desea. Se puede trabajar a pequea escala (con microvolumenes)

26

o a gran escala (Grandes volmenes). Permite la posibilidad de mantenerlas

indefinidamente congelada.

Desventajas
A veces su comportamiento no es extrapolable al tejido u rgano por tener
distinto entorno, crecimiento, etc.

Equipamiento laboratorio de cultivos

Un laboratorio de cultivos debe tener:
- Un equipamiento estril: Cabinas de flujo laminar (habitculos que
mantiene todo el aire del interior estril), autoclave, sistemas de
filtracin, etc.
- Incubadoras: Controlan temperatura, humedad y CO2.
- Centrifugas, frigorficos, congeladores, etc.
- Depsito de nitrgeno liquido para congelacin.
- Microscopio de contraste de fases invertido.

27

 Soporte de cultivo
Frascos, botellas, tubos, placas, bien sea de vidrio o de plstico, en funcin del
cultivo.

Medios de cultivo
Es especfico para cada tipo celular. Es un medio base que contiene hidratos de
carbono, cidos grasos esenciales y otros lpidos, es decir, contiene todo lo
necesario pero adems contiene aditivos como:
- Suero fetal: Contiene factores de crecimiento, hormonas, protenas
transportadores, etc.
- Antibiticos: Como la penicilina, estreptomicina que actan inhibiendo
el crecimiento de bacterias, y anfotericina para evitar el crecimiento de
hongos y levaduras.
- Reguladores de pH o indicadores de pH.
- Aditivos adicionales como: Piruvato, glucosa, glutamina, etc.
Hay tambin distintos tipos de medio, el definido, que no presenta suero o el
indefinido que presenta suero.

Condiciones fisico-quimicas del cultivo

-

Fase gaseosa: Debido al metabolismo celular se forma CO2 que es

toxico para la clula, de modo que este CO2 al reaccionar con agua
forma acido carbnico, establecindose un equilibrio acido-base
carbonato-bicarbonato, de modo que este CO2 se inyecta para regular el
pH del medio de cultivo.
Existen diferencias entre lotes de suero: Muchas clulas por cambiar el
lote de suero pueden no crecer.
Se debe controlar la temperatura, trabajando a temperaturas distintas en
funcin de la especie animal (37C mamferos, 39C aves, 15-25C
peces, 28C insectos).
El pH se debe regular estando entre 7 y 77 mantenindose por el
CO2.
Se debe mantener la osmolaridad del medio (entre 290 y 320
mOsm/kg).

Tipos de crecimiento
Existen 2 tipos de crecimiento. La clula puede crecer:
- En suspensin.
- Monocapa: Adheridas al sustrato. Cuando estn creciendo, al tocarse
una clula con otra se inhibe el crecimiento.
- Una variante de esta es el crecimiento tridimensional: Se puede crear
en un frasco una red natural o sinttica formando una red
tridimensional de clulas.

Morfologa celular
Puede ser:
- Fibroblstica: Son clulas adheridas al sustrato, son muy alargadas,
suelen ser unipolares o multipolares y tienen inhibicin por contacto.
- Epiteliales: Crecen en monocapa, son poligonales y tienen
prolongacin finas y cortas y tambin tienen inhibicin por contacto.
- Linfoblsticas: Crecen en suspensin y son redondeadas.

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 Curva de crecimiento
-

Fase de latencia: Donde el cultivo no crece y en ella se produce la

fijacin al sustrato y el inicio del ciclo celular.
Fase exponencial: Donde se duplica el nmero de clulas cada 24 horas
(unas mas y otras menos
Fase de confluencia: Todo el frasco est lleno de clulas o todos los
nutrientes se est agotando y las clulas dejan de crecer. Si se mantiene
el cultivo sin hacer nada se acaban los nutrientes y las clulas empiezan
a morir.
Fase de muerte: Solo se da si el cultivo es primario donde al cabo de un
tiempo empieza a producirse la desaparicin el cultivo.

29

 Obtencin de cultivo primario

Se puede obtener a partir del rgano completo o fragmentado. Se fragmenta para
que todas las clulas del extracto tengan una buena difusin de nutrientes.
Estos trozos se pueden poner directamente en el cultivo, haciendo que las clulas
salgan de los rganos adhirindose al sustrato del tubo de cultivo (explante).
Pasado un tiempo se puede extraer el fragmento inicial o bien se puede obtener y
purificar clulas asiladas (se usan rganos blandos), se realiza esta obtencin
mediante:
- Procesos mecnicos: Mediante un tamizado o bien.
- Procesos enzimticos: Se administran proteasas que rompan la
estructura del rgano, saliendo las clulas de forma directa o bien se
realiza un tamiz, de manera que se consiguen celular para poder
trabajar.
El aislamiento de poblaciones celulares del rgano o tejido se puede producir
teniendo en cuenta las caractersticas de la clula, como por:
- La adherencia al sustrato o frasco de cultivo.
- Por centrifugacin isopicnica en gradiente continuo o discontinuo:
Como el uso de tcnicas con Percoll, Ficoll, etc. Se basa en la densidad
de la clula o del medio de cultivo para separar las clulas. Las clulas
en un medio de baja densidad, estas tienen alta densidad y bajan al
fondo pero si se pone sobre una solucin con distintas densidades o
mayor de alguna de las poblaciones celulares, cuando las clulas
lleguen a una capa con una densidad mayor se depositaran all. El
Percoll o Ficoll son los medios que se usan, para permitir el paso por
densidad de algunas clulas.
- Mtodos inmunolgicos: Como Panning, MACS, FACS. Siempre que
se tiene un anticuerpo que reconozca de forma especfica a un antgeno
de una poblacin celular se puede usar para aislar esa poblacin. El
30

panning usa un soporte plstico en la que se crea una fase solida donde
se une un anticuerpo y se aade la suspensin celular, dejamos que la
clula se una al anticuerpo, tras ello se retira el sobrenadante y se hacen
varios lavados quedndonos con un grupo de clulas positivas y otras
negativas.
Microdiseccin de captura por laser: En este caso lo que se hace es
aplicar a un corte en una regin identificada mediante un laser se
recorta esa zona y todo el material se recoge en un tubo. Si la seccin
es material vivo se estudia con barrido confocal.

Subcultivo o pase
Una vez que todo el sustrato est cubierto por la subcapa de clulas, antes de que
llegue la senescencia se hace un pase o subcultivo. Para ello se cortan las clulas,
se suspenden y se diluye en medio lquido.
- Si las clulas crecen en monocapa, se debe separar para ello se realiza:
Un tratamiento mecnico.
Si est muy unido se usa un tratamiento enzimtico: Como
tripsina ms un quemante de grasa como el EDTA.
Una vez que tenemos las clulas se lavan, se limpian y se cuenta y se observa su
viabilidad, para ello usamos una cmara de Neubauer. Adems lo que se suele
hacer es que al mismo tiempo que se cuentan se puede saber cuantas estn vivas
y cuantas muertas, para ello se marca con un colorante, que es azul tripano que
nos seala las clulas vivas, viendo cuantas estn vivas y cuantas muertas.
Una de las cosas que se deben conocer es la curva de crecimiento (se debe saber
cunto tarda en crecer la muestra) pudiendo programar los experimentos. Para
ello se pone varias diluciones de una suspensin celular, se ponen en cultivo y
cada da se observa el nmero de clulas por conteo con el microscopio o bien
usando contadores automticos o se puede hacer un ensayo colorimtrico, de
modo que marquen las clulas vivas.
31

 Aplicaciones
Se usan para el estudio de:
- Funcin celular: Muerte celular (Apoptosis vs. necrosis), curva de
crecimiento, proliferacin, parmetros celulares (enzimas, pH,
potencial membrana), movilizacin de calcio, fagocitosis, produccin
de radicales libres, clulas madre, cncer.
- Toxicidad celular: Contaminantes en muestras de campo, cosmtica,
compuestos antitumorales y compuestos estrognicos.
- Estudio de cultivo y diagnostico viral: Cultivo de virus, recuento viral,
diagnostico viral y produccin de vacunas virales.
- Anticuerpos monoclonales: Produccin o identificacin y purificacin.
- Transfeccin: Funcin y localizacin de protenas o silenciamiento
gnico.
- Terapia gnica.

5. TRANSFECCION
Es la produccin de un gen (o varios genes) en una clula para que exprese una
protena. Este gen puede ir en un plsmido o en un virus (que no exprese una
enfermedad).

Tipos de transfeccin:
Puede ser in vivo o in vitro (hacerlo en un cultivo in vitro o que se produzca en
un animal esta transfeccin) y esta puede ser transitoria o permanente.

Usos o aplicaciones
-

Expresin de protenas para su purificacin.

Estudiar su efecto sobre el fenotipo celular.
Estudio de promotores y elementos regulatorios.
Estudio de procesamiento del ARN, postraduccionales, etc.
Localizacin, distribucin e interaccin de protenas.
Terapia gnica.
Generacin de vacunas, anticuerpos, etc.

Factores que afectan a la eficacia de transfeccin

-

Tipo celular (lneas mejor que cultivos primarios, etc.).

Estado del cultivo (fase exponencial al 60-70%).
Medio de cultivos o aditivos: Algunos aditivos o medios pueden
impedir la transfeccin.
Tipo de plsmido o virus: En funcin de que sea permanente, que sea
ms grande, ms pequeo, la cantidad, la calidad del plsmido, etc.
Cantidad de ADN y transfectante.
Calidad del ADN transfectante.
Mtodos de transfeccin.

Mtodos de transfeccin
-

Liposomas: Son de alta eficiencia y no es toxico.

Fosfato de calcio: Es ms simple y ms econmico pero peores.
DEAE-dextrano: Igual que fosfato de calcio.
Electroporacion: Se genera un pulso elctrico que abre canales y entra
el material gentico, es alta su eficiencia pero tiene baja supervivencia
por lo que no se usa mucho.
Microinyeccion: Es muy laboriosa y muy cara pero muy efectiva.
32

Biobalistica: Partculas de oro muy pequeas que se recubren con el

material gentico y se disparan desde una pistola al organismo o clula
penetrando en la clula pero sin romperla, tambin es muy caro pero
presenta alta eficiencia.
Uso de virus: Se usan virus atenuados pero sin embargo conseguir el
virus recombinante y atenuado, pero como actan infectando muy
fcilmente la transfectancia es muy alta.

Elementos de un plsmido
Cuando se genera el plsmido presentara:
- Elementos que permitan su replicacin tanto en eucariotas como en
procariotas.
- Un promotor de eucariotas para que el gen se transcriba y el promotor
puede ser constitutivo o inducible (por la induccin de la formacin de
algn compuesto, aumento de temperatura, etc.).
- Seales de poliadenilacion.
- Codones de inicio y stop.
- Protenas nativas o bien protenas marcadas por un tag.
- Marcadores de seleccin.
Una vez que se est creando el plsmido, se puede introducir los tag tanto en el
extremo carboxilo como el amino. Si se quiere estudiar la interaccin entre 2
protenas se puede transfectar con dos plsmidos distintos o bien con un
plsmido que genere las dos protenas. Se utilizaran genes chivatos que nos
permiten evaluar la capacidad de transfixion o que nos permite visualizar la
protena recombinante. Estos genes chivatos son:
- CAT: Nos permite clonar clulas que deriven todas de una positiva y
por tanto sean todas positivas.
- GAL: Se pone un sustrato que nos produce un producto que es un
precipitado de color azul.
- LUC: Usa la luciferina que emite fotones que se miden en un
luminmetro. Esto se usa mucho pues nos permite obtener un dato
estadstico directamente.
- GFP: Que nos permite estudiar la clula in vivo y sin ninguna
manipulacin, por lo que mediante un microscopio de fluorescencia o
barrido confocal o citometra seguir estas clulas.
Deteccin de las protenas expresadas.
El tag lo bueno que tiene es que hay anticuerpos contra todos los tag, de modo
que nos permite distinguir dentro de una clula que protena es producida por la
clulas de forma endgena o bien producida por le plsmido. Este tag se puede:
- Poner en cualquier extremo.
- Se puede quitar tras la purificacin.
- La deteccin necesita la muerte celular. GFP permite el seguimiento in
vivo.
- Pueden producir toxicidad celular.
- Pueden alterar la funcin de la protena recombinante.
Permite favorecer la solubilidad de la protena recombinante (para poder
posteriormente purificarla) tambin se puede usar para silenciar genes.

33

Silenciamiento o interferencia gnica

Introduccin de ARN interferente solo o en plsmidos de modo que la
transfeccin impide la traduccin del mRNA a protena, por lo que no se forma
protena y por tanto no hay funcin, por lo que esta transfeccin se puede usar
como terapia gnica. Se puede usar un virus atenuado o un plsmido que nos
exprese un gen que contrarresta una deficiencia enzimtica, hormona. Se puede
hacer un silenciamiento para un gen relacionado con un tumor disminuyendo la
produccin del tumor, etc.

6. CENTRIFUGACIN DIFERENCIAL
Se obtiene un homogenado, se lisan las clulas en un tapn y se somete de forma
secuencia a distintas velocidades y tiempos de centrifugacin. Obteniendo en la primera
centrifugacin los ncleos y sobrenadante, que se vuelve a centrifugar y se obtiene
mitocondrias, cloroplastos, lisosomas y peroxisomas, despus se vuelve a centrifugar el
sobrenadante y se obtiene membrana plasmtica, fraccin microsomal, etc. Tras ello se
vuelve a centrifugar el sobrenadante obtenindose las subunidades ribosomales y
pequeos poliribosomas y un sobrenadante que se vuelve a centrifugar y nos da la parte
soluble del citoplasma. Para cada fraccin se hace una reaccin especifica de ese
orgnulo de manera que sabemos as si la fraccin es pura o no o cuando esta de
contaminada con otras fracciones pues tenemos marcadores especficos de cada
estructura.

34

7. ELISA/EIA/RIA
Nos permite la deteccin de un antgeno o anticuerpo en una muestra. Se puede tener en
la fase solida, pegado al soporte o bien el anticuerpo o el antgeno. El revelado puede
ser colorimtrico, luminimtrico, fluorimtrico o radiactivo (se llama RIA). Hay
distintos tipos, el directo, el indirecto, sandwich o competitivo (se tiene en la fase solida
el anticuerpo y se aade la muestra con el antgeno a determinar y una fraccin
conocida del mismo antgeno marcado, por lo que compiten por unirse al anticuerpo,
una vez unido se lava y se mide para ver la cantidad de antgeno, si la muestra tiene
poco antgeno, la muestra tiene mucho antgeno marcado, por lo que emite mucha seal.
En este tipo de Elisa a mayor cantidad de antgeno mayor cantidad intensidad). No se
puede localizar el antgeno

8. WESTERN BLOT
Se hace una electroforesis de protenas, se transfieren todas a una membrana de
nitrocelulosa y se hace una inmunodeteccin en esa membrana. Nos permite ver una
banda que es nuestra protena de estudio, mediante un anticuerpo. Nos permite detectar
la presencia de una protena, en cierta medida si secretaba o no la protena, determinar
el tamao pero no nos permite localizarla. Tambin se puede modificar esta tcnica para
ver si nuestra protena de estudio est libre o interacta con otra protena (se hace un gel
nativo, de modo que si la protena interacta con otra protena, al hacer electroforesis
correr menos, viendo que tiene un tamao mayor, o que nos indica que interacciona
con otra protena.

35

TEMA 2: LA SUPERFICIE CELULAR

1. LA MEMBRANA PLASMTICA
INTRODUCCION
La membrana plasmtica es la envoltura que limita los orgnulos y permite el
contacto con el exterior. Fue observada por primera vez por por Robertson mediante
MET. Se evidenci que todos los organismos tienen una membrana muy similar.
Entre las principales funciones encontramos que se encarga de compartimentalizar
la clula u rganos, y que es un lugar de reacciones.

ESTRUCTURA
Es una bicapa lipdica. Cuando se tie con tetraxido de osmio (OsO4) aparecen dos
capas electrodensas de 10nm. Est formada por protenas.

HISTORIA
Overton, en la dcada de 1890, descubri que los solutos que atraviesan la capa
limitante tenan una solubilidad similar a la de los c. Grasos. Grasos.
Grendel y Gorter en 1925 vieron que los lpidos del eritrocito cubran 1,8-2,2 la
superficie del mismo. Bicapa lipdica con cabezas polares hacia afuera (exterior y
citoplasma).
Davson y Danielli, 1925-decada 1950. Bicapa lipdica recubierta por protenas y
con poros proteicos que explican el paso de sustancias.
Singer y Nicolson, 1972. Modelo mosaico fluido. Los lpidos y protenas se
encuentran en un estado fluido que les permite el movimiento dentro de la
membrana.

COMPOSICION QUIMICA
- Lpidos
1. Fosfolpidos
Fosfatidil-etanolamina/colina/serina/inositol/glicerol
- Esfingolpidos
Esfingomielina
Glucolpidos (cerebrsidos y ganglisidos)
- Esteroides. Colesterol
- Protenas
1. Perifricas
2. Integrales
3. Unidas a lpidos
- Carbohidratos
1. Formando glucolpidos o glucoprotenas. Glucoclix

36

 PROPIEDADES
Integridad: Viabilidad. Colorantes vitales. Poros en la membrana. MO, MF, MBC,
MET, MEB, citrometra de flujo.
Asimetra: fosfolpidos que sufren movimientos de rotacin, difusin lateral y flipflop. La fosfatidilserina se transloca a la cara externa durante la apostosis (anexina
V). Los esfingolpidos se sintetizan en la membrana externa y mediante translocasas
viajarn a la membrana interna. Los esfingolpidos solamente se encuentran en la
hemimembrana plasmtica. Balsas lipdicas, donde aparecen altos niveles de
esfingolpidos
La fluidez de la membrana aumenta con la temperatura (se licuan las grasas) y con
la insaturacin.

Distribucin de protenas (cara e o p): Digestin con detergentes para separar las
protenas transmembrana. Uso de proteasas (tripsina) las protenas estn
parcialmente expuestas a la tripsina. Se fija la clula de manera que la tripsina
puede entrar y degradar desde fuera y desde dentro. Se hace una electroforesis y
aparecen 3 bandas, dos de las bandas corresponden a protenas perifricas e
internas, la otra protena se ha acortado, lo q indica que tiene dominios expuestos
tanto al exterior como al interior. Uso de anticuerpos. Ensayos de fusin celular y
redistribucin proteica

METODOS DE ESTUDIO
-

Centrifugacin diferencial
Determinacin de la conductividad, potencial de membrana, etc.
MET (Ultraestructura)
Criofractura (Protenas integrales, presencia de poros, etc.)
Colorantes vitales. Permeabilidad y poros.
FRAP/FLIP. Movimiento y regeneracin de protenas y lpidos.
37

 FUNCIONES
- Transporte de molculas de bajo peso molecular: Mediante transporte
pasivo bien sea por difusin simple o facilitada y transporte activo, bien sea
por accin de la bomba sodio-potasio o por otras bombas.
- Transporte de molculas de elevado peso molecular: Mediante endocitosis,
como fagocitosis, pinocitosis o mediada por un receptor, o bien por
exocitosis o transcitosis.

- Adhesin celular: Con clulas o matriz extracelular.

- Comunicacin celular: Neurotransmisores, hormonas o mediadores locales.

2. ADHESION CELULAR
Las uniones celulas-celula o clula-matriz pueden ser estables o transitorias en funcin del
tejido que presente. En tejidos extracelulares, las uniones son muy fuertes y estables. En clulas
que se movilizan no son muy fuertes, son uniones transitorias. Hay molculas de adhesin
celular (CAM) o a la matriz (SAM).
Segn los criterios que se sigan se pueden clasificar de distinta forma a los distintos tipos de
interacciones celulares.
En funcin de la distancia entre membranas:
- Occludens o unin estrecha: Si esta unin es completa, es decir, no hay separacin
visible. Sin embargo, se ha visto que la separacin es de unos 2nm.
- Unin adherens o desmosoma: Se da cuando con tcnicas convencionales podemos
observar que estas membranas estn separadas por unos 20-25 nm.
- Uniones gap o hendidura o nexo: Se trata de una unin que es muy similar a la
occludens, pero la membrana no est al lado de la
otra sino que hay canales que atraviesan las 2
membranas.
En funcin de la superficie que ocupa esta unin
tenemos:
- Znula: si rodea toda la clula. Se trata de una
unin estrecha o desmosoma en banda. Se conoce
como zonula adherens.
- Macula: Si la unin es estrecha pero puntual. Se
conoce como desmosoma puntual.
- Fascia: Se trata de una macula que es irregular
Todas estas suelen presentarse en unin entre clulas vecinas.
En la zona basal de la clula tenemos hemidesmosomas (unin
clula con la matriz). Tambien hay contacto focal que son
similares a los hemidesmosomas pero son transitorios.

38

La adhesin se lleva a cabo por molculas de adhesin celular y se representa por 4 tipos de
molculas principalmente.
Cadherinas: Realizan uniones homogneas, es decir, unin entre cadherinas. Existen
ms de 100 clasificadas en 6 subclases y su unin es calcio dependiente.
CAM con dominios inmunoglobulina (Ig): Uniones a otras protenas con dominios de
inmunoglobulina. Su unin no es calcio dependiente.
Integrinas: Presentan 18 unidades y 8 , y se pueden unir a clulas o matriz.
Selectinas: Se unen a azucares, es decir, son lectinas y son calcio dependientes.
Estas molculas son las responsables de las uniones estables o transitorias. Hay protenas como
las ocludinas o claudinas (uniones estrechas como zonula ocludens) o las protenas JAM que
son protenas de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Las uniones GAP estn mediadas por
las conexinas.
Los dominios citoplasmticos unen protena anclaje a las que se une el citoesqueleto.

ZONULA OCCLUDENS/TIGHT JUNCTION/UNIN

ESTRECHA
Esta siempre en posicin apical. Es un cinturn que rodea toda la clula y sella el
epitelio. Es una unin covalente, por lo que es muy fuerte. Lo que hace es que el
agua y todos los solutos del medio externo no penetren en los tejidos subyacentes.
Las sustancias del exterior deben atravesar la clula para pasar a la zona basal. Si
esta unin se rompe o desaparece, se infiltra agua y sales, aumentando la presin
osmtica, se produce una dilatacin, una respuesta inflamatoria o incluso la muerte.
Las molculas implicadas son ocludina, claudina y molculas JAM. En todas las
uniones hay un elemento extracelular (molcula en superficie que en dominios
extracelulares se une a la molcula de superficie de la clula vecina), un complejo
de protenas de anclaje que se unen a los dominios citoplasmticos que por el otro
extremo se unen elementos del citoesqueleto. Las protenas de anclaje de zonula
occludens son ZO-1 o ZO-2 y son calcio dependientes. Una de las enfermedades
que afecta a este tipo de uniones es la que produce la toxina del clera.

39

 ZONULA ADHERENS Y DESMOSOMAS

Se sitan bajo occludens. Dejan espacio entre las dos clulas y esta mediado por
cadherinas. Se relaciona con filamentos de actina (en el caso de adherens) o
queratina (en el caso de desmosoma). En funcin del tejido tenemos:
- E-cadherinas: En tejidos epiteliales.
- N-cadherinas: En el caso de si tejidos nerviosos, musculares cardiacos y
del cristalino.
- P-cadherinas: En el caso de epidermis, placenta y algunas embrionarias.
- VE-cadherinas: En el caso de endotelios.
En adherens se ve un espacio entre las clulas y en desmosoma es una zona
electronodensa que se debe a una serie de protenas, donde hay una placa de
anclaje y filamentos muy gruesos. Las cadherinas pueden ser desmogleina,
desmocolina, etc. Estos desmosomas los podemos ver mediante microscopia
ptica, pero en el caso de hemidesmosoma, pues presentan
una placa donde llegan muchos filamentos de queratina. Son
calcio-dependientes.

UNIONES GAP/UNIN DE HENDIDURA/NEXO

Son muy abundantes sobretodo en tejidos no epiteliales (como en neuronas), ya
que gracias a estos canales, el impulso electrnico se intercambia muy fcilmente.
Si se observan estas uniones se puede confundir con una zonula adherens al ver
con poca precisin, pero se puede diferenciar, ya que las gap son uniones mas
basales. Las membranas estn muy prximas y estn atravesadas por un complejo
proteico haciendo que no se vea espacio entre las dos membranas, de manera que la
zona entre las dos membranas se ve electrondensa por esos poros, mientras que en
zonula adherens se ve poco electronodensa.
Lo que tenemos son una familia de protenas que son las conexinas que se
ensambla en un complejo proteico y se inserta en la membrana y lo mismo pasa
con otro complejo de otra clula establecindose un canal entre dos clulas. Si
inyectamos un material marcado en una clula se puede ver que en un tiempo
aparece en la clula vecina determinando que pasan a travs de estos poros. De este
modo podemos determinar que todas las clulas de un tejido pueden actuar como
40

una nica clula pero no todas las sustancias pueden pasar de una clula a la otra.
Pueden pasar sustancias de hasta 2 kilodalton.

UNIONES MEDIANTE INTEGRINAS EN TEJIDOS

EPITELIALES
Tenemos interacciones clula-matriz o sustrato, estn en posicin basal en los
epitelios y son los hemidesmosomas.
Estn mediados por integrinas, que hay de varios tipos, unas que unen fibronectinas
(mediante motivos RGD), otras que unen laminina y otras que unen colgeno.
Los hemidesmosomas presentan uniones muy fuertes y estables pero que no solo
ocurren en tejidos epiteliales sino que tambien ocurre en tejidos no epiteliales
donde las integrinas actan. Son calcio-dependientes.

41

 UNIONES MEDIANTE INTEGRINAS EN TEJIDOS NO

EPITELIALES
En este caso se hablan de uniones focales, podosomas o uniones 3D. Si tenemos
una clula en cultivo, la clula establece contacto con el sustrato, de modo que
estos contactos se pueden hacer y deshacer de modo que la clula pueda moverse.
Si se tiene un tejido real dentro de una matriz de colgeno, estas uniones no son
solo superficiales sino que se dan por toda la clula (uniones 3D).
Estas integrinas bien por alteraciones de los dominios que sean mediados por
factores externos o internos, van a tener mayor o menor afinidad, haciendo que se
una con mayor o menor afinidad, permitiendo que se hagan fuertes o se deshagan
con facilidad las uniones. Estn muy implicadas en clulas que estn en
quimiotaxis, en coagulacin plaquetaria, remodelacin sea, desarrollo, etc.
Tambien pueden interaccionar con CAMs celulares con dominios inmunoglobulina
como por ejemplo tenemos las ICAM (presentes en leucocitos), VCAM (en
endotelios), NCAM (en neuronas) o JAM (en uniones estrechas u occludens).

UNIONES CLULA-CLULA MEDIANTE SELECTINAS

Son lectinas que unen de forma calcio dependiente a carbohidratos de la superficie
celular, hay distintos tipos de lectinas:
- L-selectinas: En leucocitos.
- P-selectinas: Presentes en plaquetas y endotelios activadas
inmunolgicamente.
- E-selectinas: En endoteliales.
Estn relacionadas con la quimiotaxis. Hay una unin de selectinas entre leucocito
y endotelio y una vez unida la selectina, se produce la interaccin de otros
receptores de superficie. La clula endotelial expresa una factor activador de
plaquetas con su receptor que hace que la integrina presente en el leucocito y una
protena de superficie de tipo Ig interaccionen, de modo que la interaccin de la
integrina leucocitaria con la molcula de superficie de Ig del endotelio hace que se
une y desaparezca las uniones fuertes entre las clulas endoteliales y pueda
atravesar el endotelio.

MTODOS DE ESTUDIO
- MET o criofractura: Pues son protenas transmembrana que se pueden
estudiar muy bien con esta tcnica.
- Tcnicas inmunocitoquimicas.
- Cultivos celulares: Permiten ver como se hacen y deshacen estas uniones.
Si se quiere estudiar uniones clula-sustrato se tiene una lnea celular y un
42

soporte de plstico de vidrio a donde se unen distintas sustancias. As se

puede estudiar cmo se adhiere una clula y como varia con el tiempo
variando las condiciones del medio, como quitando el calcio del medio para
ver que no son calcio dependientes, o usar anticuerpos de bloqueo.
Para clulas epiteliales se usa un pocillo en el que se pone medio de cultivo y se
mete un inserto que se comunica por la parte basal con el medio de cultivo y tiene
una membrana que permite el paso de nutrientes pero no de clulas y se aaden las
clulas en medio de cultivo. Si todas las clulas estn bien adheridas unas con
otras, ambos medios de cultivo no se comunican, pero si se alteran las uniones si se
puede producir el cambio de un medio y otro.

3. SEALIZACION CELULAR
Respuesta frente a estmulos. Unin receptor-ligando.
Molculas de sealizacin:
- Sealizacin sinptica. Neurotransmisores.
- Hormonas (endocrinas).
- Mediadores qumicos locales (paracrinos y autocrinos):
1. Citoquinas (factores de crecimiento, interferones, quimioquinas,
interleucinas.).
2. Eicosanoides.
3. Uniones gap.
- Tipos de receptores:
1. Nucleares. Unen a hormonas esteroideas y tiroideas, vitamina D,
retinoides, eicosanoides, NO, CO
2. Superficiales. Unen a neurotransmisores, hormonas proteicas y mayora
mediadores qumicos. 2 mensajeros
a. Asociados a canales
b. Ligados a protenas G. Adenilato ciclasa, fosfolipasa C,
c. Ligados a enzimas catalticos. Tirosin quinasa, guanilato ciclasa.

43

TEMA 3: MATRIZ EXTRACELULAR EN

TEJIDOS EPITELIALES Y NO
EPITELIALES
-

GENERALIDADES
Es un conjunto de protenas fibrosas que dan resistencia y estn embebidas en una
sustancia amorfa gelatinosa compuesta por polisacridos que rodean a las clulas. En el
caso de animales es la matriz extracelular y en el caso de plantas, hongos y algas se habla
de pared vegetal.
La matriz extracelular esta sintetizada por los fibroblastos casi exclusivamente. Estos
fibroblastos van a ser los encargados de sintetizar la matriz.
La COMPOSICIN es por un lado fibras colgenas y de elastina que dan elasticidad y
resistencia elstica al tejido. Tendremos proteoglucanos que forman el gen amorfo que hay
entre las fibras y sirve para anclar protenas y nos va a ofrecer resistencia a al compactacin
debido a su naturaleza de gel, tendremos protenas multiadhesivas (fibronectina y laminina)
que unen estos componentes anteriores a la clula. Existe una continuidad entre el
esqueleto externo e interno de la clula.
Las FUNCIONES van a ser principalmente proporcionar soporte estructural y dar forma,
elasticidad y resistencia. En funcin de los tipos y localizacin de la matriz tendremos:
- Lmina basal: Capa delgada que se encuentra bajo todos los epitelios y que es el
soporte para las clulas epiteliales.
- Tejido conectivo: En funcin de la compactacin de esta matriz extracelular de la
composicin y del nmero de clulas tendremos:
- Tejido conectivo laxo: Los tejidos de mucosas formado por pocas fibras
colgenas, pocos fibroblastos y que nos va a unir el epitelio con el
muscular y por el circula gran cantidad de vasos sanguneos, glndulas,
etc.
- Tejido conectivo compacto: La organizacin de las fibras y fibroblastos
estn muy compacto, forma el hueso, cartlago, tendones, estroma de la
cornea.
La matriz est implicada en muchos PROCESOS CELULARES como:
- Divisin celular: Las clulas que hay dentro de una matriz compacta si se quiere
dividir debe desintegrarse parte de esta matriz.
- Movilidad: Si una clula quiere atravesar un tejido conjuntivo compacto, si no
elimina estas fibras no puede avanzar.
- Diferenciacin y desarrollo embrionario.
- Adhesin celular: Si las clulas no tienen la matriz adecuada no pueden adherirse.
- Filtro para el paso de macromolculas: Para evitar el paso de parsitos o clulas
que puedan afectar a un tejido.

44

2. PROTEINAS DEL COLAGENO

El colgeno es una glucoprotena que presenta alta resistencia a la tensin. Es una protena
muy importante y representa el 25% del total de la protena del cuerpo humano. Se forma
como cadenas . Es una cadena de aminocidos que presenta mltiples repeticiones de una
secuencia, tiene repeticiones de 3 aminocidos donde uno es glicina siempre mientras que
los otros dos son hidroxiprolina o hidroxilisina y el otro prolina.
Estas cadenas forman una triple helice que se enrolla y se une por las secuencias de glicina
y aminocidos hidroxilados. Estas fibrillas tienen de 10 a 300 nm de grosor y una vez que
estn formadas se autoensamblan interaccionando por las hidroxilisinas con otras fibrillas,
formando una fibra de mayor grosor de hasta 3 micras y el ensamblado suele ser
escalonado entre una fibrilla y otra permitindole que pueda resistir la tensin (puede
estirarse y recogerse).
Este escalonamiento hace que cuando se ve a MET no todas las zonas tienen el mismo
numero de fibrillas de manera que nos aparecen bandeados indicndonos que existen zonas
con mayor o menor nmero de cadenas. Existe un bandeado cada 65 nm, por lo que entre
fibrilla y fibrilla hay 300 nm de longitud. Estas se pueden organizar las fibras de distinta
forma, se puede alinear de forma paralela de forma ms o menos compacta o bien
formando redes.

Sntesis de colgeno
Un vez que se detecta el pptido seal de la protena de colgeno en el ribosoma es enviada
al RER. Se sintetiza un pptido inmaduro o propptido que tiene unas regiones que
protegen los extremos de las cadenas del colgeno y despus se produce hidroxilaciones
en la prolina y lisina. Estas hidroxilaciones se produce por enzimas que usan un cofactor
que es la vitamina C (su falta produce escorbuto, por lo que no hidroxila las molculas de
colgeno, haciendo que estos enfermos tengan problemas de debilidad sea y de cartlago
entre otras alteraciones).
Dentro del RER se producen las primeras glucosilaciones de las protenas. Una vez que la
protena est formada, estas cadenas debido a los tripletes, entre los que esta glicina,
interactan con otras cadenas y forma la triple cadena a la que se une las chaperonas
reconociendo la protena viendo si est bien formada o no la protena.
Tras esto las molculas pasan por el complejo de Golgi sufriendo los procesos de
glucosilacin y mediante vesculas de secrecin se liberan al medio. Una vez en el medio
actan las peptidasas que eliminan los extremos impidiendo que una molcula interaccione
con otra, y una vez activas comienzan a autoensamblarse de forma automtica formndose
las fibrillas y las fibras.

Tipos de colgeno
Dependiendo de cul sea la combinacin de la cadena que se forma en la triple hlice
tendremos distintos tipos de colgeno.
1. Colgenos fibrilares: Son aquellos que forman fibras. Dentro de estos tenemos:

Colgeno fibrilar tipo 1: Est en piel, tendones y huesos.

Colgeno fibrilar tipo 2: Presente en cartlago.
Colgeno fibrilar tipo 3 y 5: Estn menos representado.

Las fibras siempre tienen una longitud de unos 300 nm y estas fibras se disponen
paralelas y ms o menos compactas dependiendo del tejido.
Colgeno asociado a fibrillas: Hay dos tipos
a. Colgeno tipo 6: Presente en tejidos intersticiales.
b. Colgeno tipo 9: Presente en el cartlago.
Colgeno de anclaje: Este tipo de colgeno forma redes.
a. Colgeno tipo 4: Esta en lmina basal. En el extremo tienen una cabeza
globular que permite unirse a otras molculas de colgeno y van
45

fusionndose con los extremos formando redes ms o menos simtricas

permitiendo que el tejido se estire o encoja.
b. Colgeno tipo 7: Bajo la lmina basal de la piel
c. Colgeno tipo 15: Extendido, cerca de la lamina basal en el musculo.
Colgeno transmembrana: Sirve tambien de anclaje.
a. Colgeno tipo 13: Este forma hemidesmosoma en la piel, unindose las
clulas epiteliales a la membrana basal.
b. Colgeno tipo 17: Igual que el colgeno tipo 13.
Colgenos implicados a la respuesta inmunitaria:
a. Colectinas: Estn presentes en la sangre.
b. C1q: Es un componente implicado en el complemento de la sangre. Existe
una familia de protenas que desencadenan la ruta de este colgeno. Esta
protenas estn formadas por 6 o 4 cadenas que tienen un dominio colgeno
(un extremo con un dominio glicina, prolina y hidroxiprolina o bien
hidroxilisina) y en el otro extremo un dominio de un ion a carbohidratos.
Estas protenas se ensamblan en tetrmeros o hexmeros unidos por la
regin de colgeno, dejando las cabezas de unin a azucares libres.
c. Clase A scavenger receptor: Est presente en macrfagos.

En los tendones tenemos el colgeno fibrilar de tipo 1 y nos encontramos siempre

asociados dos tipos de colgeno, uno fibrilar y otro no fibrilar (enlace fibras colgenas). El
fibrilar es el 1 y el no fibrilar es el 6. En cartlago tenemos el fibrilar de tipo 2 y el colgeno
no fibrilar de tipo 9.

3. ELASTINA
Est presente en tejidos muy elsticos como piel, pulmones o vasos. Esta protena a
diferencia del colgeno no presenta hidroxilisina y no esta glicosilada pero tiene glicina y
prolina y algo de hidroxiprolina.
Sus rutas de sntesis no pasan por el Golgi ya que no se glicosila. Esta elastina se
sintetiza como proelastina y una vez secretada se proteoliza la parte inactiva
volvindose activa. Una vez activa se une de forma covalente en el exterior por accin de
las lisinas, por lo que ofrece resistencia elstica pues se puede plegar mucho y estirarse.
Sus fibras se organizan en fibras elsticas que tiene una zona central con elastina y
rodeado por una protena conocida como fibrilina.

4. ACIDO HIALURONICO. PROTEOGLUCANOS

Presentan una parte central proteica y cadenas laterales de glucosaminoglucanos (GAG)
que confieren la funcin. Estos GAG son repeticiones de 2 carbohidratos, que el primero es
glucurnico o galactosa y el segundo es N-acetil-glucosamina o N-acetil-galactosamina.
Son muy aninicos ya que tiene muchos residuos carboxilo o sulfato. Estos captan gran
cantidades de cationes por lo que atraen y retienen agua por ello forman un gel hidratado y
debido a ello permite que el tejido ofrezca resistencia a la compresin.
Hay distintos tipos de GAG:
Acido hialurnico: Formado por acido glucurnico y N-acetil-glucosamina y no
esta sulfatado. Tiene menor cantidad de cargas negativas. Est formado por 25.000
residuos.
Condroitin sulfato: Est formado por acido glucurnico, con menos de 250
repeticiones, y N-acetil-galactosamina.
Heparan sulfato: Est formado por glucurnico y N-acetil-glucosamina. Presenta
casi las mismas repeticiones que el condroitin sulfato.
Queratan sulfato: Est formado por galactosa y N-acetil-glucosamina y es el mas
pequeo, presentando entre unas 20 o 40 repeticiones.

46

La sntesis proteica ocurre en el RER, donde se finaliza con una pequea glicosilacin
sirviendo de anclaje en el Golgi para la unin de los GAG y modificaciones como la
sulfatacin.
A diferencia de lo que ocurre con el ADN y protenas, la secuencia est escrita en el
genoma y los componentes solo tiene que leerlo pero sin embargo en glucosilaciones esta
informacin no est escrita o no se sabe porque no se sabe que es lo que determina que la
protena se glicosile con un azcar u otro, de un tamao u otro, etc.
Su funcin es que actan proporcionando soporte mecnico, tambien pueden unir y
modificar la vida media de los factores de crecimiento retenindolos cerca de la celula.
Estn implicados en la migracin celular y en la creacin de cavidades o cmaras durante
la morfognesis (en el desarrollo embrionario hay una gran sntesis de GAG que son
excretados al exterior de la celula quedando inaccesibles para la celula y rodean estas zonas
ricas en GAG degradando esta matriz que forman, generando una cmara. As es como se
forman las cavidades del corazn). Tambien es importante en el cierre de heridas y
regeneracin tisular.

Tipos de proteoglicanos
Dependen del tipo de GAG que se tiene. De manera que tenemos:
Agrecano: Es el ms grande y esta principalmente en cartlago, tenemos una protena
central a la que se le une queratan sulfato y condroitin sulfato. Est formado por unas
130 molculas como esta que se unen a un eje y se unen a un GAG como es el acido
hialurnico) observando una estructura como una escobilla.
Decorina.
Perlecan: Presente en membrana basal.
Sindecano: Captan y reclutan factores de crecimientos.

Fibronectina
Es una glucoprotena que une tanto a matriz extracelular como clulas y es muy importante
en la adhesin celular. Es un gen que codifica para distintas fibronectinas. Tiene varios
dominios, dominios de unin a colgeno y a proteoglicanos de manera que interacta
uniendo todos los componentes de la matriz y si este dominio es RGD une a las integrinas
celulares.
Es muy importante para crear vas para la movilizacin celular y es fundamental para el
desarrollo. Tambien participa en la coagulacin sangunea ya que aparte de unir por el
dominio RGD y por integrinas en las plaquetas, une fibrina, colgeno, plaquetas y atrae
clulas inmunes al lugar. Los frmacos que inhiben la formacin de cogulos estn basados
en el bloqueo de la unin plaqueta fibringeno mediante los dominios RGD, que es el
mecanismo que emplea el mecanismo de algunas serpientes, que presentan protenas con
dominios RGD compitiendo con las protenas plaquetarias, impidiendo la formacin de
cogulos.

Laminina
Es la principal protena multiadhesiva en la lmina basal. Es un heterodimero formado por
cadenas , y (gamma) y tiene forma de cruz. Tiene distintos dominios, unos de unin a
GAG, a integrinas, a colgeno o nidogeno o entactina (Estos ltimos son componentes en
la matriz extracelular de la lamina basal). Tambien acta con los GAG uniendo lpidos y
esteroides, actuando modulando al a vida y concentracin de esteroides como hormonas
esteroideas.
Su funcin va a ser la formacin de redes e intervienen en procesos de morfognesis,
movilizacin y diferenciacin celular.

Lamina basal
Una de las matrices ms estudiadas es la que forma parte de la lmina basal. La lmina
basal es una red que sustenta a todos los tejidos epiteliales y adems rodea a clulas
47

musculares y adiposas. Se trata de una capa muy delgada, de 50 a 200 nm, y visible a MO.
La lamina basal separa muy bien el epitelio del tejido conjuntivo subyacente, ya que su
funcin principal es separar tejidos. Adems tambien sirve de barrera para el paso de
macromolculas y da polaridad a clulas epiteliales (las clulas epiteliales se unen a la
lamina basal mediante integrinas formando hemidesmosomas. Este anclaje, como zonula
occludens, dan polaridad a la celula estableciendo cuales son las partes apicales y las
basales, influyendo en la distribucin fisiolgica de la celula). La composicin de esta
lmina basal es colgeno tipo IV, perlecano, usado como proteoglicano principal, laminina
usada como protena de unin a las integrinas y el nidogeno o entactina.

Degradacin de la matriz extracelular

La matriz extracelular presenta algunas funciones y una de ellas es que esta muy implicada
en los procesos de movilizacin celular (paso de clulas). Unas de estas clulas que tienen
una gran movilidad son los neutrfilos y los monocitos (o macrfagos), que deben
atravesar la pared celular por lo que deben presentar algunos componentes que tengan la
peculiaridad que pueden digerir la pared. La matriz por ello debe tener un equilibrio entre
degradacin y creacin, de modo que al pasar estas clulas, la matriz debe cerrarse de
nuevo, bien por accin de la celula que ha pasado que libera factores que la crean o bien
por clulas de la propia matriz.
Estas clulas implicadas en el cierre producen dos tipos de proteasas:
Metaloproteasas: Requieren de zinc o calcio para actuar. Entre ellas la ms
comn es la colagenasa.
Serin-proteasas: Actan sobre los residuos de serina.

Modo de accin de la degradacin

La degradacin pueden ser que estas metaloproteasas se secretan de forma inactiva de
manera que un vez que estn en el lugar adecuado se activan por accin de otras
protenas. En el caso de neutrfilos o macrfagos que tienen cierta polaridad, se
establece una parte anterior donde se expresan en la cara externa de la membrana
receptores de la metaloproteasa, de modo que esta queda activa unida a los receptores
celulares, haciendo que conforme se va destruyendo la matriz se va reconstruyendo.
Aparte de la liberacin y activacin de estas proteasas se encuentra en equilibrio con la
produccin de inhibidores de dichas proteasas, teniendo:
Inhibidores de la metaloproteasas o TIMPs.
Serpinas que son inhibidores de serin-proteasas.
La adecuada regulacin entre sntesis, degradacin y reparacin de la matriz hace que se
produzca un correcto funcionamiento o bien puede provocar enfermedades como
artritis, defectos en coagulacin, aterosclerosis, gingivitis, etc.
Para poner de manifiesto estas metaloproteasas se debe saber que parte del tejido
presentan actividad metaloproteasa para poder actuar. Se puede usar gelatina que
degrada el colgeno, presentando unido una molcula que produce fluorescencia de
modo que donde halla actividad hay metaloproteasa. Para hacer esta tcnica debemos
fijar la muestra por congelacin y se hacen cortes por congelacin con criomicrotomo.
Otra forma de saber cules son las metaloproteasas implicadas y cul es su actividad y
tamao se pueden usar geles (zimografia). Lo que se hace es una electroforesis de
protenas y cuando se hace el gel se aade una protena que nos forma una red de
manera que toda la superficie tiene una protena que puede hacer un marcaje de
protenas de todo el gel. Una vez que se tiene el gel, se pone la muestra en las
condiciones adecuadas para que la metaloproteasa acte. Una vez que actan se hace
una tincin del gel, de manera que en las zonas donde estn las metaloproteasas actu el
gel no hay marcaje y se ver blanco al revelar la muestra. De este modo se pueden
48

observar en que muestra hay mayor o menor cantidad de metaloproteasa y se puede ver
el tamao de la metaloproteasa.

Matriz extracelular. Estudio

Diversas microscopias:
ptica:
a. Tricrmico de van Gieson, Masson, tcnicas Gomori, orceina, etc. Para el
estudio de fibras.
b. Hematoxilina-eosina: Usada para el estudio de colgeno que se tie de rosa
mientras que otras fibras tienen leve apetencia por la hematoxilina.
c. Azul de toluidina: Para el estudio de GAGs se tien con azul de toluidina
mediante metacromasia (se da cuando un colorante da una tincin que no se
ve del mismo color, por ejemplo el azul de toluidina puede dar una tincin
purpura en el colgeno). Los GAGs tambien se tien con azul alcian debido
a los residuos cidos. Tambien se caracterizan por ser PAS-.
MET con la que se puede estudiar la ultraestructura.
MEB viendo la estructura tridimensional.
Tcnicas mediante anticuerpos.
Cultivos celulares: Se pueden hacer estudios de adherencia, movilizacin, etc.
Supresin gnica. Haciendo transgnicos Knock-out o tcnicas de silenciamiento

5. PARED VEGETAL
Se trata de una matriz extracelular muy elaborada en vegetales que envuelve a la celula o
protoplasto.

Funciones
Confiere la forma a la clula, da soporte a la celula y toda la planta, protege a la celula de
fenmenos osmticos y patgenos, media la interaccin clula-clula, regula el paso de
sustancias, solo permitiendo el paso a protenas menores de 20 kDa. Esto explica porque
las hormonas vegetales son pequeas e hidrosolubles.

Composicin
Es diferente a la de la matriz, pero todos los elementos cumplen la misma funcin.
Celulosa: Es el componente principal. Se trata de un polmero de glucosa, unido por
enlaces -1,4, y que presentan menos de 500 residuos. La unin de 40 a 60 polmeros
de celulosa van a formar microfibrillas de hasta 10 nm de grosor que le proporciona
resistencia a la celula a la tensin.
Hemicelulosa: Son cadenas de celulosa con ramificaciones, que presentan xilosa, y
permiten la unin a las microfibrillas de celulosa (es el equivalente a colgenos no
fibrilares).
Pectinas: Es un polisacrido rico en acido galacturonico por lo que tiene gran carga
negativa atrayendo agua formando un gel hidratado entre los elementos fibrosos (es
como los GAGs). La funcin principal de las pectinas es dotar a la celula de
resistencia a la comprensin. Estas forman la laminilla media que une y da rigidez a
las paredes de 2 clulas adyacentes. Junto con la hemicelulosa formara la pared
primaria.
Lignina: Es un polmero de residuos fenlicos muy insolubles presente en la pared
secundaria.

49

 Protenas y glicoprotenas: Como la extensina (que supone el 15% del peso de la

pared). Estas protenas suelen ser ricas en hidroxiprolina y estn implicadas en
sntesis y remodelacin de la pared. Adems tienen un papel importante en la unin y
eliminacin de patgenos.
Componentes especficos: Como ceras, suberina, cutina, etc.

Capas de la pared

Lamina media: Esta formada por pectina y es la primera en sintetizarse y es la

ms externa de la celula.
Pared primaria: Presenta fibras de celulosa laxa, hemicelulosa, pectinas y
glicoprotenas. Esta pared es delgada y extensible y a MET se puede observar una
estructura reticular de fibras de celulosa.
Pared secundaria: Es la ultima capa que se sintetiza y es ms gruesa y rgida. Est
formada por celulosa muy compactada y le da gran rigidez y resistencia al tejido.

Formacin de la pared
La celulosa se forma en la cara externa de la membrana. La celulosa sintetasa forma un
complejo de membrana por donde va tomando la glucosa citoplasmtica y cuando llega al
exterior se va uniendo y polimerizando, formando el polmero de celulosa que se va
autoensamblando de forma automtica formando las fibras. Estas fibras de celulosa se
disponen paralelas y sobre un eje de microtbulos citoplasmticos. En la parte interna
tendremos una red de microtbulos y en la parte externa forma una red que dar lugar a la
pared primaria. El resto de componentes, como hemicelulosa o pectinas se forma en el
interior celular y se secreta ya formadas. Una vez fuera se ensamblan y se unen a la
celulosa.

50

Plasmodesmos
La pared vegetal presenta estructuras que permiten la comunicacin entre clulas. Una de
las estructuras ms comunes son los plasmodesmos que permiten una unin entre las dos
clulas vecinas y un intercambio de citoplasma. Estas uniones se parecen a las uniones
GAP pero en los plasmodesmos se forman unos poros que en su interior presentan tbulos
del REL que unen el REL de una celula con la vecina. Estos plasmodesmos permiten el
paso de sustancias de hasta 1 kDa.
Esta permeabilidad es alterada por algunos virus como el del mosaico del tabaco que
aumenta la permeabilidad facilitando su propia dispersin. Adems se suelen disponer de
forma agrupada formando los campos de poro, apareciendo zonas de la pared primaria
deprimidas que presentan muchos poros.

Poros o punteaduras
Los poros o punteaduras es otro tipo de comunicacin, que se caracteriza porque adems
de pared primaria y lmina media, tambien tiene pared secundaria.
Los poros son adelgazamientos donde desaparece la pared secundaria y permiten el
intercambio de sustancias. La pared secundaria puede ser una zona donde desaparece y
formar el poro con punteaduras simple o bien puede aparecer unas aureolas que van a
facilitar o regular el intercambio de sustancias. En algunos casos la parte central del poro
puede estar engrosada formando el toro, que lo que hace es permitir la regulacin osmtica
y puede moverse de un lado hacia a otro sellando el poro y evitando el paso de sustancias.

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Tcnicas de tincin
En el caso de vegetales se pueden hacer una deteccin de los distintos componentes con
tcnicas microscpicas, mediante el uso de tinciones especificas.
Si queremos detectar celulosa se usa azul de toluidina, rojo Congo, etc. Para la lignina se
usa safranina. Tambien se usa microscopia de contraste de fases para estudiar las hojas.
Tambien tcnicas inmunocitoquimicas, etc.

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TEMA 4. COMPONENTES Y
FUNCIONES ESTRUCTURALES DEL
CITOESQUELETO
1. INTRODUCCIN
El citoesqueleto forma el esqueleto de la celula, pero no es un esqueleto esttico, ya que
est continuamente formndose y desapareciendo, es decir, sus componentes se van
formando y desorganizando al mismo tiempo, por lo que son componentes muy dinmicos.
Esta formacin nueva y desaparicin de la parte antigua permite a la otra funcin del
citoesqueleto que es permitir la motilidad tanto de sus estructuras internas como el
movimiento de la propia celula. Esto va a permitir que un orgnulo del complejo del Golgi
u otra estructura pueda llegar hasta la membrana celular. Sern imprescindibles tanto en la
estructura y soporte de la celula y en el transporte.
El citoesqueleto est formado por tres tipos de estructuras, los microfilamentos (de 5 a 9
nm de grosor y est formado por actina), despus tenemos microtbulos que estn
formados por la tubulina (de 22 a 24 nm) y entre medio de estas tenemos los filamentos
intermedios (de 8 a 12 nm) y presenta gran variedad de protenas estructurales.
En general podemos tener que los microfilamentos se localizan bajo la membrana celular,
los microtbulos desde el ncleo con prolongaciones a toda la celula y los filamentos
intermedios tambien estarn formando parte de las uniones celula-celula o celula-matriz
extracelular. Como estructura general de todos los filamentos estn la protena estructural
que forma el filamento en s, tendremos protenas asociadas que se encargan de formar,
degradar y regular a estos filamentos y otras protenas que se encargan del movimiento de
estos filamentos.

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2. MICROFILAMENTOS DE ACTINA
La actina es la protena celular ms abundante, del 1 al 5% del peso seco de una celula y en
clulas especializadas en la contraccin representan hasta el 10%. Tambien se puede ver
que en un hepatocito hay 2x104 receptores de insulina cuya funcin principal est
relacionada con la insulina y de actina hay hasta 5x108.
El gen que codifica esta protena est muy conservado a lo largo de toda la filogenia,
tenemos en organismos inferiores como bacterias o levaduras, hay uno o dos genes, en
humanos hay 6 genes y en clulas vegetales hasta 60 genes y muchos de ellos son
pseudogenes. En humanos hay 4 isoformas que se expresan en clulas musculares y las
que forman las fibras de tensin o de estrs y las que forman parte del contorno celular.
Estas ltimas formas se dan en las clulas no musculares. Una vez expresadas la fibras se
pueden organizar formando haces o bien formando redes. Dependiendo de su funcin se
formaran redes o haces.

La actina puede aparecer en dos formas, o bien libre (actina G o globular) o formando
parte de un filamento (actina F o fibrilar). La formacin de los filamentos requiere la
presencia de iones como magnesio, potasio o sodio. La actina segn tenga unido ATP o
ADP nos va a aparecer en 4 formas distintas, pudiendo tener:
Actina G-ADP: Es una forma libre que no se puede unir a fibras.
Actina G-ATP: Es la forma inactiva que se puede unir a fibras.
Actina F-ATP: Al unirse la Actina G-ATP este se hidroliza
Actina F-ADP.
Una vez que se forma el filamento la actina adquiere actividad ATPasa y esta hidroliza el
ATP que se libera del fosfato quedando como actina ADP. Cuando se va formando el
microfilamento se establece un polo positivo y uno negativo, de manera que en el extremo
positivo siempre hay actinas unidas a ATP mientras que en el negativo hay actinas unidas a
ADP y este filamento est continuamente formndose y rompindose por lo que tiene un
equilibrio dinmico y gran inestabilidad, de modo que permite el desplazamiento. A esta
inestabilidad se le denomina rueda de molino.
En el extremo positivo se van uniendo las actinas G con ATP que se hidroliza y forma
ADP. La afinidad por la actina unidas a ATP es muy grande y la actividad ATP-asa es muy
lenta de modo que se acumulan actinas con ATP sin que se digieran formando una cadena
con bastantes ATP unido, esto facilita que las molculas de actina con ATP se vayan
uniendo de manera que crecen los filamentos por el extremo positivo ya que hay ms unin
de actinas con ATP. En el extremo negativo pasa lo contrario, ya que tienen menor
actividad con actina ATP, por lo que la formacin es muy lenta por este extremo.
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La despolimerizacin o eliminacin de molculas de actina ocurre de forma inversa, en la

zona positiva es muy lenta, ya que el equilibrio esta desplazado hacia la unin y en el
negativo es muy rpida.

Formacin de los filamentos de actina in vitro

La formacin de estos filamentos de actina in vitro se pueden observar. La formacin del
filamento tiene 3 etapas, empieza con una etapa de nucleacion que es muy lenta y en ella
las molculas de actina libres deben chocar unas con otras y esta interaccin es arbitraria
para conseguir unirse unas pocas molculas. Una vez que se unen varias molculas el
establecimiento de los extremos positivo y negativo debido a la unin de ATP o ADP en
sus extremos hace que el termodinmicamente el proceso se acelere hasta que se establece
un equilibrio en el que la polimerizacin y la despolimerizacin estn compensadas, de
modo que se alcanza la concentracin critica que corresponde con la mitad de la
concentracin de actina en forma soluble y la otra mitad en forma fibrilar. Esto se forma en
el tubo de ensayo que forma filamentos pero no estructuras.

Protenas implicadas en la formacin y elongacin de microfilamentos

Hay protenas y factores que regulan la sntesis, polimerizacin y despolimerizacin.
Tenemos dos complejos proteicos como son:
Complejo organizador de microfilamentos: Est formado por las protenas Arp2 y
Arp3 que se unen al filamento por la parte negativa y aade actina G-ATP de
manera que se une a un filamento ya existente y sirve de anclaje de nucleacion para
otro filamento, de manera que el filamento existente y el nuevo quedan en una
inclinacin de 70o permitiendo la formacin de redes. Este proceso est regulado
por una familia de GTPasas de la familia Ras que activan este complejo y la
formacin de redes.
Complejo de formina: Si lo que se forma son fibras tenemos el complejo de
forminas. El anillo de formina es complejo dimerico que se une al extremo positivo
uniendo 2 molculas de Actina G-ATP activadas.

55

Estos dos complejos hacen que se forme o vaya creciendo el filamento. Hay otras protenas
que favorecen esta funcin como es la profilina que es una protena de 15 KDa que pasa la
actina G-ADP a Actina G-ATP que se une al extremo positivo. Tambien esta las faloidinas
que se unen a filamentos e impiden la despolimerizacin pudiendo identificar los
filamentos de actinas y favorece que el filamento vaya creciendo.

Protenas que impiden la polimerizacin

Hay tambien protenas que impiden la polimerizacin, de modo que permitiendo la
despolimerizacin acortando los microfilamentos. Tenemos la cofilina que tiene la funcin
contraria a la profilina, es decir, se unen a la actina G-ADP e impiden que se fosforile. Hay
otras como la latrunculina y la timusina 4 que tienen una accin similar a la cofilina.

Protenas que favorecen la despolimerizacin

Tambien hay protenas que favorecen la despolimerizacin, como la cofilina, que se unen
al extremo y rompe el filamento de manera que lo acorta. Tambien hay citocalasina D,
gelsolina o fragmina que se unen al extremo + y evita que siga creciendo por lo que el
filamento se acorta.

Protenas que estabilizan los filamentos

Tambien hay otras protenas que estabilizan los filamentos cuando el filamento esta ya
formado. Estas son las protenas de coronacin (cap-Z) que se unen al extremo +
protegiendo el crecimiento y la tropomodulina que se une al extremo e impide la
despolimerizacin.

Organizacin de microfilamentos. Formacin de redes.

En el caso de la formacin de redes, estas estn en la periferia celular, son las responsables
de lamelipodios y pseudpodos es decir formaciones que permite que las clulas se
desplacen lo que es muy importante en fibroblastos, neutrofilos y macrfagos. Las
ramificaciones que forman estas redes estn estabilizadas por la filamina que unen
filamentos de actina y forman una red en tipo gel. Sin ella estas redes no serian capaces de
formar un esqueleto suficientemente rgido. Si se elimina esta filamina las clulas
adquieren una disposicin globular con pequeas vesculas que no permiten la formacin
de lamelipodios ni pseudpodos. La formacin de redes esta inducida por factores de
crecimiento, quimiotacticos, fagocitosis, etc. mediante Rac. Las redes se anclan a la
membrana a travs de zonas de anclaje o nucleacion mediada por receptores clulas, entre
ellos integrinas.

56

Organizacin de microfilamentos. Formacin de haces no contrctiles

En el caso de la formacin de haces no contrctiles. Son fibras largas dispuestas de forma
paralela que aparecen en microvellosidades, filopodios, conos axnicos, placas de
adhesin. Estos haces tiene una tropomiosina que se une al filamento de actina sirviendo de
coronacin, es decir, lo protege.
Estas fibras quedan unidas unas con otras mediante fimbrina quedando muy empaquetado o
-actinina quedando los filamentos ms laxos. Existen otras protenas que pueden formar o
estabilizar estos haces como la espectrina en eritrocitos, fodrina en microvellosidades,
fascina en erizo de mar, villina a bajas concentraciones de calcio, etc.
En microvellosidades hay grandes filamentos de actinas estabilizados por fimbrina, villina
y fodrina que une en las bases un filamento de una microvellosidad con el filamento de
otra.
FILAMENTOS DE ACTINA Y ACTININA

FILAMENTOS DE ACTINA
CON FIMBRINA

Los filamentos de estos haces tienen molculas accesorias que son las protenas motoras.
Los motores moleculares estn formados por miosinas no convencionales en este caso
denominadas miosina I o minimiosina que une el filamento de actina a la membrana
plasmtica facilitando el movimiento. Esta miosina I se encuentra en los lugares de
prolongaciones largas y muy delgadas que son por las que se moviliza esta celula. Tambien
hay miosina I, V, VII y XV que estn implicadas en el desplazamiento de orgnulos a
travs de las fibras.
La miosina V est implicada en el transporte de melanosomas a travs de las clulas
mediante un movimiento como si andase. Cada avance de esta vescula hace que se
desplace de 30 a 40 nm, mientras que en la miosina I solo es de 10 nm en el mejor de los
casos. La unin de la miosina V y la vescula no es directa, sino que es mediante unas
protenas de unin que une la vescula a la miosina, que son protenas Rab. Cuando esta
protena est alterada no se puede hacer este transporte de vesculas y produce albinismo.
Tambien pueden ocurrir mutaciones en miosina VI y VIIa que produce sordera por mal
trfico vesicular y de impulsos elctricos de los estereocilios.
Estos movimientos se pueden estudiar in vitro mediante establecimiento de filamentos y
para ello se usan bolas que asemejan a vesculas y que emiten fluorescencia de manera que
podemos tener en un porta unida actina e incubar con protenas motoras y vesculas
sintticas fluorescentes y se puede estudiar cmo se movilizan a travs de las fibras.

Organizacin de microfilamentos. Formacin de haces contrctiles

La miosina convencional es la II que junto con los filamentos de actina forman haces
contrctiles presentes en clulas musculares. Esta miosina tiene sus cabezas globulares que
generan el golpe de fuerza para la contraccin y una cola. Estas cadenas se alinean de
forma antiparalela. Estas cadenas de miosina II se asocian entre 2 filamentos de actina
unidos formando una estructura repetitiva que es el sarcmero. Esta contraccin de la
miosina con respecto a la actina hace que el musculo se contraiga o se estire.
Existen otros haces contrctiles que tienen una funcin y organizacin diferente. En
57

clulas no musculares hay haces de actina unidos a miosina II que van a tener la funcin
de contraerse. La funcin principal en la que estn implicados es:
Divisin celular: En ella se forma un anillo contrctil que separa las 2 clulas en el
final de la mitosis, es decir, da lugar a la citocinesis. Si se inyecta en un clula
sustancias que inhiben las sustancias de miosina II, las clulas cada vez que se
divida, el proceso final de citocinesis no ocurre por lo que la celula divide el
material gentico formando una celula 4n y si se mantiene el bloqueo dar clulas
8n, etc., generando un celula multinucleada.

Adhesiones focales: La miosina II permite que se contraiga la celula y se mueve.

Las protenas Rho van a facilitar la interaccin actina-miosina. Tambien intervienen

protenas Rab que mueven el equilibrio hacia la polimerizacion-despolimerizacion en
funcin de su actividad y el complejo Arp2/Arp3 que est implicado en la nucleacion
favoreciendo la formacin de filamentos de actina

Funciones

Movimiento ameboide: Las clulas se desplazan generando prolongaciones

citoplasmticas. En el interior celular pueden estar organizados de distinta forma,
pudiendo estar microfilamentos libres o haces o redes. En la zona interna del
citoplasma tenemos muy poca cantidad de actina y hay principalmente filamentos
cortos y libres y estas asociaciones de haces y redes estn en la periferia celular.
Estas organizaciones en haces o redes forman las estructuras de tipo gel que
permiten el movimiento celular. El movimiento celular es el que ocurre en clulas
fagocitarias.
Formacin de lamelipodios: Son prolongaciones gruesas y cortas que permiten a la
celula desplazarse y estn presentes en fibroblastos y queratinocitos. En este caso
las fibras contrctiles de actina y miosina II se forman en un gel, en redes.
Crecimiento de los filopodios: Son
prolongaciones ms finas y largas, en este caso
los filopodios presentan miosina I. Estos
filopodios tienen una red de actina en la
periferia celular pero tiene solo un haz y no una
red. En el caso de la formacin de
lamelipodios, la celula tiene un contacto con la
superficie grande por lo que tenemos una
distribucin de actina por toda la celula pero
sobre todo en la parte perifrica formando una
red y la miosina forma en la parte posterior un
anillo contrctil que es el que impulsa el
desplazamiento de esta red. Para detectar actina
se suele usar paluidinas que van unidas a un
fluorocromo.

58

Forman parte de las microvellosidades intestinales: Los haces de actina estn

formados por filamentos paralelos de actina unidos de forma transversal con
fimbrina y villina. Una vez que estos haces se introducen en el citoplasma celular
quedan enlazados mediante fodrina y ms abajo enlazan de forma perpendicular
con los otros elementos del citoesqueleto que forman parte de las uniones celulacelula como los filamentos de actina de zonula occludens o adherens. En el caso de
zonula occludens son solo de actina y en adherens tambien presentan miosina.
Forman parte del anillo contrctil en la citocinesis animal.
Intervienen en la localizacin de organelas: Se marca el citoesqueleto y mediante
un anticuerpo especfico se marcan los sacos del Golgi que tiene una distribucin
concreta y definida alrededor del ncleo, y si se trata la celula con un agente que
despolimerice los filamentos de actina vemos que el Golgi se redistribuye por la
celula.
Transporte de vesculas y de ARNm: La miosina 5 puede unir un ARNm y lo
dirige a una zona concreta para que se exprese.
Usado por determinados patgenos: Para escapar de mecanismos de lisis celular.
Hay bacterias que utilizan la polimerizacin de la actina para desplazarse por la
celula y evitar ser capturada por un lisosoma, de manera que esta bacteria
presentan el polo opuesto de la direccin del movimiento una protena que recluta
las protenas del complejo Arp celular.
Desplazamiento de receptores superficiales: Las protenas de membrana pueden
moverse por la membrana y estn relacionados o ligados a filamentos de actina que
van a permitir que este desplazamiento ocurra o no. La citocalasina D que
despolimeriza los filamentos, las clulas dejan de activarse con el mitogeno ConA.

Tambien estn implicados en las uniones celula-celula (en las znulas adherens hay
cadeninas que se unen a haces de actina por -actinina y se unen a travs de lignina y
caderina). En el caso de las uniones clulas matriz tenemos contactos focales y
hemidesmosomas. A estas estructuras de filamentos hay una regulacin con complejos
proteicos con GTPasas.

3. MICROTBULOS
Tienen un tamao de 22 a 24 nm de grosor. Estn formados por un heterodimero con tubulina y -tubulina, cada subunidad de 55 KDa de peso. La siempre tiene unido GTP y
la tiene unida GTP pero tiene actividad GTPasa, de manera que la siempre tiene unido
GTP y la tiene unido GTP o GDP en funcin de si acta o no la fosfatasa. Forman una
estructura de manera que los heterodimeros forman una espiral. Cuando se corta de forma
transversal vemos que se forman un anillo de 13 subunidades de tubulina. Si se hace el
corte longitudinal se ve que en su interior hay varias lneas ms electronodensas que son las
fibras de tubulina.
Estos estn implicados en la motilidad celular, divisin y transporte.
Los microtbulos tienen la misma propiedad que los filamentos de actina, es decir, son
muy dinmicos inestables, presentan un polo + y otro -. A partir de un heterodimero se
unen mas heterodimeros y donde hay una unidad con GTP y una con GTP se produce
la degradacin del GTP de la y queda siempre una con GTP y la con GDP. Esto
determina la polaridad de manera que en el extremo hay siempre una -tubulina con GTP
y en el extremo + siempre hay una -tubulina con GTP o GDP en funcin si a hidrolizado o
no. Estos filamentos vemos que si protegemos un microtbulo inicial vemos que el extremo
+ crece ms que el negativo. Este microtbulo se forma en primer lugar un protofilamento,
que es una nica cadena de dmero, que se va fusionando 13 protofilamentos formando una
hoja y luego esta hoja se cierra quedando los 13 protofilamentos unidos formando una
estructura cilndrica.
59

In vitro se observa una cintica de polimerizacion-despolimerizacion descompensada. Un

microfilamento tarda mucho en crecer pero la despolimerizacin ocurre de forma muy
rpida, adems se puede ver que la polimerizacin es temperatura dependiente, por lo que
si se baja la temperatura 4o se produce la despolimerizacin salvo si aumenta la
temperatura. Para estudiar los microtbulos se usan colchicina, colcemida, nocodazil y
taxol, es decir compuestos naturales o sintticos que favorecen la despolimerizacin.

Protenas asociadas a los microtbulos (MAP)

En este caso estn las protenas MAP. Tenemos un grupo de protenas estabilizadoras.
Estas protenas se asocian lateralmente al microtbulo y tienen una estructura como de L
dejando un brazo unido al microtbulo y otro que sale perpendicular al otro microtbulo.
Adems de estabilizar estos microtbulos tambien impiden que los microtbulos se unan
unos a otros y se acerquen demasiados. Como el microtbulo siempre tiene el mismo
tipo de protenas asociadas tienen una distribucin muy simtrica.
En funcin de la protena asociada al microtbulo depende del tamao
depende la cercana o lejana de los microtbulos. Las MAP4 y CLIP170 estn en todas las
clulas mientras que MAP1, MAP2 y TAU estn en neuronas y alguna se puede usar como
marcadores de estructuras concretas. MAP2 se caracteriza porque se encuentra en
dendritas. Tambien tenemos protenas desestabilizadoras, como son las cataninas y
estafmina, que estn en casi todas las clulas.

Centros organizadores de microtbulos (MTOC). Centrosoma

Los microtbulos tienen un centro organizador de microtbulos o MTOC o centrosoma.
Hay uno por celula y se localiza de forma perinuclear. Cuando la celula se va a dividir
este centrosoma se divide para que uno se distribuya en cada celula. Existen clulas como
clulas embrionarias o polarizadas y vegetales que tienen numerosos centrosomas.
Estos centros organizan la motilidad y polaridad celular, ya que a partir de l irradian todos
los microtbulos de la celula, de manera que en esa zona encontramos el polo y el polo +.
Est formado por 2 centriolos perpendiculares formados por 9 tripletes de microtbulos.
Hay un triplete de microtbulos que est completo y los otros 3 no estn completos. Los
centriolos se organizan 2 y se disponen de forma perpendicular y rodendolos esta el
material pericentriolar que es electronodenso y de composicin amorfa y rico en -tubulina
que es el complejo proteico que sirve de nucleacion y formacin para los microtbulos.
Esta forma un anillo con 8 subunidades -tubulina y es el que se encarga de generar estos
microtbulos. Las clulas que carecen de centriolos aparece una zona de material amorfo y
electronodenso a partir de la cual irradian y se generan los microtbulos y es rica en tubulina.

60

Protenas motoras de los microtbulos

Hay dos grupos de protenas, las protenas de la familia de las quinesinas que se desplazan
siempre hacia el polo + teniendo movimiento anterogrado. Por otro lado tenemos las
dineinas que se desplazan hacia el extremo teniendo un movimiento retrogrado.
En ambos casos el movimiento depende de ATP. Hay dineinas y quinesinas que se pueden
clasificar en funcin de si estn implicados en el desplazamiento citosolico, desplazamiento
mittico y del axonema.
Estas protenas tienen una estructura y funcionamiento similar al de miosina en ambos
casos, de modo que tenemos un complejo proteico donde hay una zona globular que
presenta actividad ATPasa y por la que se une al microtbulo y por el otro extremo se une a
lo que se vaya a transportar, de manera que las quinesinas unen distintas estructuras y las
desplazan hacia el extremo + mientras que las dineinas dirigen esos orgnulos hacia el
centro del centrosoma.
Estos microtbulos no llegan a la membrana citoplasmtica y por tanto no pueden dirigir
una vescula desde el Golgi hasta la membrana donde se debe fusionar por lo que lo lleva a
medio camino donde existe una serie de haces o redes de actina de manera que la quinesina
desplaza la organela y se la pasa a una miosina que la dirige hasta la membrana.

Organizacin y funcin en neuronas

Una funcin de los microtbulos es la direccin y transporte axonal. En los axones los
microtbulos forman haces paralelos, mientras que en las dendritas estos microtbulos
forman haces agitados. Todas las vesculas de secrecin viajan por los microtbulos gracias
a quinesinas hasta el extremo donde la red de actina los lleva hasta la membrana. Las
vesculas que no se utilicen o se vayan a regenerar se van al soma a travs de dineina.

Cilios y flagelos
Los microtbulos forman parte de cilios y flagelos. Los cilios suelen aparecer en
agrupaciones de prolongaciones celulares cortas y delgadas. Su movimiento facilita el
movimiento de los fluidos que estn en el conducto o superficie donde se localizan. El
movimiento es siempre perpendicular, por lo que solo se pueden mover hacia los lados. Los
flagelos suelen ser largos y aparecen aislados y permiten el desplazamiento de la celula.
Estos tienen un movimiento ondulatorio por lo que en funcin del sentido del giro que
produce la celula se desplazara hacia delante o hacia atrs.
La estructura que presenta es una prolongacin citoplasmtica que su interior est ocupado
por microtbulos. Estos microtbulos tienen una estructura de 9+2 dobletes, formando
el axonema. Los microtbulos no aparecen aislados sino que aparecen mucha cantidad de
material electronodenso entre los microtbulos contiguos y centrales. Los microtbulos
perifricos estn unidos a la pareja de microtbulos adyacente mediante dos tipos de
uniones, uno es mediante la protena dineina y nexina que tambien une los centrales. La
parte basal del cilio o flagelo presenta solo los 9 dobletes perifricos. La zona que se
introduce de estos cilios y flagelos en la celula es el cuerpo basal y tambien presente 9
tripletes.

61

El movimiento es gracias a la protena motora dineina y este movimiento est regulado

por el calcio y AMPc de manera que en un cilio o flagelo se desplaza curvndose de
manera que en el lado por el que se curva, las dineinas atraen a los dobletes y en el lado
que se estira las dineinas separan los dobletes, de manera que la unin desunin y la
contraccin de estas dineinas va a permitir que el cilio y flagelo se mueva.

Divisin celular
Tambien los microtbulos influyen en la divisin celular pues forman el huso mittico que
dirige y facilita la separacin de los cromosomas. Se puede realizar el estudio de esto
mediante tincin con fluorocromo verde y tiendo de azul el material gentico, pudiendo
ver que al principio de la mitosis se condensa el material gentico y aparecen 2
centrosomas que forman el huso mittico y se concentraran los cromosomas en el centro
formando una placa ecuatorial que divide cada cromatida y van cada uno a cada celula.
Los microtbulos suelen aparecer organizados alrededor de un centrosoma que suele ser
nico en las clulas. Este centrosoma se divide para que cada celula reciba un centrosoma.
Justo antes de empezar la sntesis del material gentico empieza el proceso de modo que
los centriolos se alejan, cada uno llevndose parte del material amorfo pericentriolar
formado por tubulina originando la sntesis de microtbulos. A partir de cada centriolo se
forma de forma perpendicular otro centriolo de modo que hay 2 parejas de centriolos
comenzando la reorganizacin de los microtbulos celulares y comienza la nueva sntesis
de microtbulos alrededor de estos centros.
En un estadio inicial tenemos 2 centrosomas, y los microtbulos se alinean alrededor de
cada uno de ellos y comienza la polimerizacin de estos, de manera que los microtbulos
que crecen la extremo + se alinean y quedan unidos por protenas del tipo quinesina. Las
quinesinas uniendo distintos microtbulos, cada una se va a desplazar hacia el extremo +
de manera que los microtbulos se van separando y se va polimerizando mas en el extremo
+ haciendo que las quinesinas se vayan moviendo de modo que los centrosomas se van
separando. De forma contraria en los otros microtbulos que estn unidos a la actina
perifrica estn las dineinas que se desplazan hacia el polo arrastrando hacia si al
centrosoma de manera que de esta forma coordinada se separan los 2 centrosomas.
Una vez que se forma el huso mittico y los cromosomas forman la placa ecuatorial,
dispondremos de microtbulos astrales que van hacia el exterior y otros microtbulos que
son los polares que estn implicados en la unin al microtbulo polar del otro centrosoma y
favoreciendo la separacin de centrosomas, y microtbulos de cinetocoro que unen a los
cromosomas de manera que un cromosoma con sus dos copias va a quedar unido por un
lado a un centrosoma y por el otro extremo al otro centrosoma.
En el cinetocoro hay un complejo multiproteico que enlaza la cromatida al microtbulo. La
formacin de la placa ecuatorial se forma gracias a la quinesina. El microtbulo crece hacia
el extremo + moviendo el cromosoma hacia el centro y la quinesina va desplazando al
cromosoma hacia el centro tambien de modo que todas las cromatidas dispersas se
disponen en el centro. Una vez que estn los cromosomas en el centro alineados se separan
las cromatidas y cada cromatida viaja a un extremo para permitir la separacin del material
gentico. El acercamiento hacia el centrosoma ocurre por dos procesos, uno la implicacin
de la dineina que se desplaza al extremo arrastrando al cromosoma y tambien puede ser
que se produzca una despolimerizacin de los microtbulos en el extremo +. Las protenas
protegen el extremo de la formacin y destruccin y el extremo + solo sufre procesos de
despolimerizacin. La despolimerizacin como el cromosoma esta unido mediante
protenas del cinetocoro como las dineinas se van a desplazar hacia el extremo -.Cuando se
acorta la longitud del microtbulo y se desplaza hacia el extremo -, el cromosoma no se
desplazara en la direccin incorrecta. Esto se descubri gracias a la microscopia confocal
tiendo los microtbulos de verde y el material gentico de azul.

62

4. FILAMENTOS INTERMEDIOS
Son filamentos de 8 a 12 nm. Estn implicados en funciones estructurales y no en la
motilidad. Existen unos 6 o 7 tipos de filamentos intermedios pero bsicamente tenemos las
laminas formadas por 3 protenas que le dan consistencia y estructura al ncleo, queratinas,
neurofilamentos, gliofilamentos, desmina y vimentina.
Todos tienen la misma estructura formando tetrmeros con una zona lineal que permite la
interaccin entre los distintos monmeros y las cabezas globulares en los extremos. Los
tetrmeros forman protofilamentos y filamentos intermedios. Suelen aparecer en clulas
animales solamente y presenta un tipo de filamento intermedio o varios y algunas clulas
pueden expresar en un momento un tipo de filamento y en otro momento otro tipo de
filamento. Son estructurales que suelen interaccionar con filamentos de actina y
microtbulos mediante uniones dbiles o por plectina.
La polimerizacin y despolimerizacin de estos se conoce muy poco. Este proceso de
formacin no requiere de energa y no hay ningn centro organizador que forme estos
filamentos. Los tetrmeros se van incorporando en la zona central, creciendo del centro a
los extremos y su polimerizacin y despolimerizacin est regulada por fosforilacion y
desfosforilacion, de modo que la fosforilacion induce la desagregacin y la desfosforilacion
induce la agregacin.

Queratinas
Estn en la mayora de epitelios sobre todo los que estn queratinizados. Hay ms de 20
protenas de queratina codificadas por unos 38 genes aunque cada celula presenta una sola
queratina. En la piel, las clulas de cada estrato presentan una queratina distinta. Se suelen
ubicar alrededor del ncleo unidas por desmosomas y hemidesmosomas. La plectina hace
de puente entre las protenas de adhesin y filamentos en hemidesmosomas.

Neurofilamentos
Estn formados por 3 protenas distintas NF-L, NF-M y NF-H. Los filamentos forman
haces bastante laxos unidos por la protena plectina. En algunas enfermedades est
asociada su acumulacin con el desarrollo esta enfermedad.

Gliofilamentos
Son similares a neurofilamentos pero ms delgados y presentes en astrocitos y clulas de
Schwann. Estn formados por la protena acida fibrilar glial.

Desmina
Es una protena que forma parte de los filamentos intermedios. Esta protena est presente
en clulas musculares. Forma una red que une los haces contrctiles de actina y
miosina mediante la lnea Z. Son muy similares a los gliofilamentos.

Vimentina
Presenta una protena similar a los gliofilamentos y est en clulas gliales, clulas de
Schwann, endoteliales, melanocitos, fibroblastos, condrocitos, osteocitos y musculares.
Suelen coexistir con la desmina y en las clulas suele aparecer alrededor del ncleo,
asociados a la lnea Z o unida a cromosomas durante la mitosis. No se han detectado
alteraciones genticas.

63

TEMA 5. COMPARTIMENTOS
RELACIONADOS CON LA CONVERSION
ENERGETICA
-

MITOCONDRIAS Y CLOROPLASTOS.
Son los principales orgnulos celulares para obtener energa. Se cree que se
introdujeron en una clula eucariota por endosimbiosis y esta teora fue descrita por
Lynn Margullis. Se cree que a partir de un organismo primitivo sin pared (archaea)
se introdujeron en la celula organismos y estuvieron viviendo por simbiosis
formando cloroplastos (cianobacteria) o mitocondrias (bacteria purpura no
sulfurosa).
En la evolucin se dio primero la unin bacteria purpura con la archaea formando
mitocondria y despus la simbiosis cianobacteria con archaea. Las pruebas que
apoyan esta hiptesis son que ambas organelas presentan un tamao similar al de
bacterias, adems tienen membrana doble y su membrana externa es muy similar a la
de las clulas eucariticas apoyando la hiptesis de que hubo una incorporacin por
endocitosis del microorganismo. Por otro lado, la membrana interna no se parece en
nada a cualquier otra membrana de la celula eucaritica pero si a la membrana de
bacterias, por ejemplo en cuanto al ratio de protenas y lpidos. Adems en esta
membrana se presentan ATPasas.
Adems tienen ADN bicatenario cerrado al igual que bacterias. El mecanismo de
divisin es por fisin al igual que bacterias y aun quedan organismos que siguen
realizando esta endosimbiosis pero de forma muy puntual.
Hay teoras que van en contra de esta teora, por ejemplo que el ADN bicatenario
presenta nitrgeno presente solo en eucariotas.

MITOCONDRIA.
Tienen forma de bastn, teniendo un tamao de hasta 1m de anchura por 7m de
longitud. Son visibles en algunos tipos de microscopia. Existe hasta 1000
mitocondrias en hepatocitos por clula y su distribucin depende del tipo celular y de
la funcin que realice.
En cuanto a su estructura se caracteriza por la presencia de repliegues en la
membrana interna formando las crestas mitocondriales. Estas crestas pueden
presentar distinta estructura y en su interior hay un material poco electronodenso que
es la matriz mitocondrial donde hay enzimas, lpidos, etc.

64

Estructura
La membrana externa es similar al retculo presentando un 60% de protenas y 40%
de lpidos. Tiene distintas protenas transportadoras de electrones como Cit b5,
reductasa de b5-NADH. Tambien presenta protenas que intervienen en la
degradacin oxidativa de lpidos, monoaminooxidasa, nucleosido difosfatasa
quinasa, protenas de apoptosis (Bcl- 2) y presenta poros y canales. Presenta la
protena porina que forman poros que permite el paso libre de molculas de ms de
10 KDa.
La membrana interna es similar a la de bacterias, presentando un 80% protenas y un
20% lpidos. Presenta un alto contenido de cardiolipina teniendo impermeabilidad a
iones.
Presenta un complejo de incorporacin de protenas, enzimas de oxidacin de cidos
grasos, transferasas, cadena de transporte de electrones y ATP sintetasa.
Ambas membranas tienen un espacio membranoso de 8 nm de grosor, tiene poco
contenido en cuanto a protenas (presenta adenilato ciclasa) y presenta protenas
similares a la actina que forma la estructura reticular de la mitocondria y permite el
cambio de forma y volumen, pero no se ha demostrado.
En cuanto a la matriz presenta distintas enzimas implicadas en la oxidacin de cidos
grasos, piruvato, ciclo de Krebs. Presenta el ADN bicatenario con intrones y codifica
algunas protenas de la membrana. Para traducir el ADN necesita ribosomas que son
similares a los bacterianos, siendo de 35S y 25S y su actividad se inhibe por
cloranfenicol y se inicia la traduccin de las protenas en la N-formilmetionina, al
igual que en bacterias. Adems presenta inclusiones lipdicas debido a sntesis de
hormonas esteroideas.
Su mayor funcin est relacionada con el metabolismo energtico. Lo que hacen es
completar la oxidacin de compuestos energticos para obtener energa, de modo
que en condiciones normales en una celula sin mitocondrias o en situaciones donde
las mitocondrias no funcionan se produce la glucolisis anaerobia, es decir, en el
citosol se oxida la glucosa obteniendo dos molculas de ATP. Sin embargo si el
intermediario de la glucolisis, que es el piruvato, viaja a la mitocondria y se realiza
una glucolisis aerbica, este piruvato se oxida totalmente y forma mayor cantidad de
energa de manera que se obtiene a partir de una glucosa hasta 38 molculas de ATP.
El piruvato entra en la celula, entrando en la mitocondria por transportadores y en la
matriz es transformado en acetil-CoA que es oxidado hasta formar CO2. Esta
oxidacin sigue el ciclo de Krebs descrito en 1930 y que es un ciclo fundamental en
el metabolismo mitocondrial y oxidacin de compuestos energticos. El ciclo
produce coenzimas reducidos a partir del piruvato, en una primera fase primero se
produce el acetil-CoA formando NADH y este acetil formara 3 molculas de NADH
y otra de FADH. Los cidos grasos se enlazan con la acetil-CoA formando acil-CoA
que ingresan en la mitocondria donde pasan a acetil-CoA entrando de nuevo en el
ciclo de Krebs obteniendo coenzimas reducidos y GTP.
Esta es la primera fase de la oxidacin.
En el segundo paso que es la cadena de transporte, toda la energa acumulada en las
coenzimas reducidas formadas en el ciclo o en el citosol van acumulando electrones
que van a reducir al oxigeno que es muy oxidante, por lo que tiene mucha afinidad
por los electrones. El oxigeno capta los electrones del NADH que es una molcula
muy reductora de manera que el oxigeno se reduce formando agua y las coenzimas
reducidas se oxidan y entran de nuevo en el ciclo siendo oxidantes.
Estos electrones van a viajar por una cadena de protenas donde ocurren reacciones
de oxidacion-reduccion de manera que los electrones van a ser captados desde el
65

NADH por el complejo NADH-CoQ reductasa (Complejo I) y lo que ocurre

mientras se pierde electrones se pierden tambien protones pasando de la matriz al
espacio intermembranoso de manera que se vuelve a tener NAD oxidado y s
acumulan protones en el espacio intermembranoso. La coenzima Q le cede los
electrones al complejo III (Citocromo C reductasa) y existe un nuevo bombeo de
protones al espacio intermembranoso.
Estos electrones son captados por el citocromo C que los pasa al ltimo complejo, el
IV (Citocromo C oxidasa) que usa la energa y los electrones para reducir al oxigeno
y formar agua. En todo este ciclo se produce una cada de energa que se usa por los
canales de protones para translocar los protones desde la matriz hasta el espacio
intermembranoso.
El FADH2 utiliza el complejo II(succinato-CoQ reductasa) provocando la
translocacion de menos protones que son usados para la obtencin de ATP, de
manera que este intercambio de protones hace que la matriz que tiene un pH de 8
aproximadamente hace que el espacio intermembranoso tenga ms protones
generando un pH mas acido, siendo de unos 7.
Existen distintos inhibidores de cada uno de los complejos de manera que el
complejo I esta inhibido por la rotenona, el III por la antimicina A y el IV por
cianuro y azida sdica.
En funcin de que pasa inhibamos se pueden obtener mayor o menor cantidad de
energa.

La acumulacin de protones en el espacio genera un gradiente de protones y un

proceso de quimiosmosis de manera que los protones son usados por un complejo
multiproteico que es la ATPasa que est en la membrana mitocondrial interna y en
las crestas y se puede dividir en 2 partculas, una insertada en la membrana que es la
F0 y permite el paso de protones y una cabeza globular dispuesta hacia la matriz que
es la partcula F1 que es donde est la actividad ATPasa de manera que cada vez que
pasan 3 protones por la partcula F0 se libera la suficiente energa como para genera
un ATP.
Adems se demostr la funcin de cada parte con una tcnica, que al romper las
mitocondrias se obtenan fracciones de mitocondrias, se vio que las esferas
completas tenan actividad ATPasa pero al tratar con algn detergente suave o
tratamientos mecnicos haba algo en la molcula que haca que estas esferas
perdieran alguna de las actividades, de manera que si precipitaban los microsomas
66

haba cadena de transporte pero no actividad ATPasa mientras que en la fraccin

soluble no haba transporte pero si actividad ATPasa y cuando las fracciones se
fusionaban se unin las dos funciones por lo que se comprob que haba una parte
del complejo que permita el paso de electrones y otra parte que tenia actividad
ATPasa. Todas estas molculas deben entrar o salir a la mitocondria y lo hacen por
transportadores de modo que el ADP y fosfato lo hacen por transportadores del
citosol. Los OH- y ATP salen al espacio intermembranoso. El OH- gasta parte de los
protones para formar agua y otra parte formara ATP. El ATP formado a travs de la
ATPasa sale al citosol.
Adems la fosforilacion esta acoplada a la cadena de transporte de electrones. Los
dos procesos deben estar muy coordinados. Se usan sustancias como oligomicina
que permeabilizan la membrana interna favoreciendo que los protones al mismo
tiempo que son bombeados vuelvan a entrar rompiendo el gradiente e impidiendo la
formacin de ATP. La cardiolipina le confiere a la membrana interna permeabilidad
a los iones por lo que gracias a ella se produce el gradiente de protones.
La termogenina es una protena mitocondrial en tejido graso pardo que permite que
el gradiente de protones se rompa sin obtener ATP pero si se obtiene calor, de
manera que oxidamos los carbohidratos pero no se obtiene energa, que es lo que
ocurre en animales que hibernan. En lo humanos tambien hay termogenina al nacer
pero se va perdiendo con el tiempo por lo que dificulta que obtengamos calor de
forma natural.

Incorporacin de protenas
La incorporacin se produce en la sntesis de protenas de ribosomas libres que se
forman precursores con secuencia seal en el extremo amino que las dirigen hacia
la mitocondria. Cuando la protena se sintetiza en los ribosomas se une a factores
estimuladores de mitocondrias o al HSP70 que unen en un proceso ADP dependiente
a las protenas y mantiene su configuracin, la protena es reconocida por receptores
que forman un canal de transporte en la membrana externa mitocondrial que es el
TOM y tenemos distintas protenas como TOM70 y 37 que transfiere y se van
agregando formando complejos multiproticos llegando al final donde est la
TOM40 que forma el poro fsico por donde la protena se introduce de manera que
esa protena que est atravesando la membrana externa tiene que tener continuidad
con la membrana interna.
En la membrana interna existen otros complejos proteicos como son TIM que los
alineamientos entre TOM 40 y TIM 44 forman complejos que permite el paso de la
protena. Conforme la protena entra, el pptido es reconocido y se le une chaperonas
que estabilizan a dicha protena. La protena entra y se libera de la chaperona y
permite que la estructura lineal que tenia para poder atravesar el complejo TOM y
TIM se pierde y adquiere su conformacin tpica. El pptido seal ser eliminada de
manera que se tiene la protena internalizada en la matriz.
Tenemos tambien la situacin en la que la protena tenga de destino el espacio
intermembranoso, tendremos la secuencia que la dirige a la matriz y una secuencia
interna que la direcciona al espacio intermembranoso de manera que se produce el
acoplamiento, por lo que tiene la protena HSP70 unida y el alineamiento de TOM y
TIM hace que la protena entre en la matriz. Cuando la seal de reconocimiento
atraviesa TIM44 en lugar de seguir entrando se transloca hacia la membrana
quedando unida a ella, de manera que queda unida a la membrana interna pero en el
espacio intermembranoso y despus acta una proteasa que rompe y libera la
protena activa dentro del espacio. Hay otras protenas que al atravesar TOM40
quedan en el espacio intermembranoso porque no aparece TIM44.
Si lo que queremos es tener protenas de membrana, una opcin es que una vez que
la protena ha entrado en el espacio intermembranoso es reconocido por distintas
67

chaperonas y por la presencia de secuencias internas de transmembrana es

reconocida por el complejo SAM presente en la membrana externa y la incorpora a
la membrana externa quedando como protena de membrana.

Para el caso de la membrana interna tenemos distintas opciones, la anteriormente

vista, pero no acta la proteasas por lo que la protena queda anclada a la membrana.
Si la protena tiene varias secuencias de direccionamiento puede ser que la protena
entre completamente en la matriz pero una vez dentro las secuencias hace que se
anclaje a un complejo que es Oxa quedando anclada con sus dominios
transmembrana en la membrana interna.
Hay otro caso que es cuando la protena pasa al espacio intermembranoso, el canal
queda bloqueado y debido a la presencia de otros complejos proteicos y que la
protena presenta numerosas secuencias transmembrana directamente se anclan
desde el espacio a la membrana interna. Hay secuencias seal en cada protena que
indica a donde va cada protena, quedando en la matriz, membrana interna, externa o
espacio.

Incorporacin de lpidos
Los lpidos se incorporan mediante la lanzadera de carnitina. Y en la oxidacin del
ciclo de Krebs. Casi todos los lpidos de la membrana son importados desde el
citosol. La fosfatidilcolina y la fosfatidilserina son sintetizados en el REL e
intercambiados con la membrana mitocondrial (MAM, mitochondria-associated RE
membrane). La fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol y cardiolipina se transforman
a partir de ellos. Estos se intercambian a la membrana interna por puntos de contacto
entre ambas.

Metabolismo de esteroides
Citocromo P450 o CYP11A. Formacin pregenenoloma.
11 -hidroxilasa y aldosteronsintetasa. Forman cortisol, corticosterona y
aldosterona.

68

Apoptosis
El Citocromo C se encuentra localizado en la membrana externa. Es liberado en
apoptosis al citoplasma en la ruta intrnseca. Bcl-2 bloquea, y Bax induce su
liberacin.

Reproduccin mitocondrial
En 1963 se demuestra la divisin de las mitocondrias mediante radioactividad. Se
produce por un mecanismo similar al bacteriano: biparticin, estrangulacin o
gemacin. Las mismas protenas se encuentran en algunos protozoarios. En animales
superiores est mediado por dinamina. En humanos todas las mitocondrias proceden
de la madre. La replicacin del DNA mitocondrial es independiente del nuclear.

CLOROPLASTO.
Los primeros organismos eran hetertrofos, compuestos de carbono, complejos y
realizaban la fermentacin, y posteriormente la respiracin aerbica mitocondrial.
Uso de CO2, auttrofos. La energa proviene de:
-Compuestos inorgnicos (NH3, H2S): Quimioauttrofos.
-Luz. Fotoauttrofos. Plantas, algas, algunas bacterias. Organismos
fotosintticos.

Tipos de plastos o plastidios (todos igual genoma y doble

membrana)
-Proplastos: indiferenciados. Pueden dar lugar a cualquier tipo
-Etioplastos: proplastos que se diferencian en oscuridad, tienen estructuras tubulares
y precursores de clorofila (protoclorofila)
-Cloroplastos: tienen pigmentos (clorofila) y realizan la fotosntesis
-Cromoplastos: tienen pigmentos, no realizan la fotosntesis
-Leucoplastos: incoloros, almacenan sustancias:
Amiloplastos Almidn.
Oleoplastos (elaioplastos) Aceites.
Proteinoplastos Protenas.
69

OLEOPLASTOS

AMILOPLASTOS

Caractersticas y estructura
Los cloroplastos tienen hasta 10m de longitud. Se dividen como las mitocondrias
por fisin.
Estn formados por una membrana externa con porinas para el paso de molculas
hasta 10kDa. Hay un espacio intermembranoso. La membrana interna es
impermeable a iones. La membrana tilacoidal es la encargada de la fotosntesis. Est
formada por los tilacoides de los grana, los tilacoides del estroma y lumen o espacio
tilacoidal. En el estroma se encuentran enzimas, DNA y ribosomas.

Fotosntesis: cesin de electrones de baja energa del agua y conversin en alta

energa por accin de la luz, se forman NADPH y ATP para la sntesis de
compuestos orgnicos.
-Fotosntesis anoxignica: CO2+ H2S (CH2O) + H2O + 2 S
-Fotosntesis oxignica (cianobacterias): CO2+ H2O (CH2O) + O2. Hace
2700 millones de aos.
La fotosntesis es un proceso que necesita energa: la luz. Los cloroplastos oxidan el
agua para dar oxgeno. Es inverso a la mitocondria. En 1930 Van Niel propuso la
frmula general: CO2+ H2A (CH2O) + H2O + 2 A. Posteriormente se comprob
que el O2 provena del agua.
La fotosntesis tiene dos fases:
-La fase dependiente de luz en la que la energa lumnica se usa para formar ATP
y NADPH.
-Independiente de luz en la que se sintetizan azcares a partir de CO2.

70

Las hojas verdes contienen clorofila, el pigmento fotosinttico. La clorofila tiene un

anillo de porfirina con Mg2+, el cual capta la luz azul. Tambin tiene una cola de fitol
que le sirve de anclaje a la membrana tilacoidal.
Hay distinto tipos de clorofila:
- Clorofila a: En organismos fotosintticos. En sulfobacterias no.
- Clorofila b: En plantas y algas verdes.
- Clorofila c: En algas marrones, diatomeas y algunos protozoarios.
- Bacterioclorofila: En bacterias verdes y prpuras.
Los carotenos son pigmentos accesorios que recogen el exceso de electrones y
energa protegiendo las hojas del dao oxidante.
La luz excita los electrones de la clorofila aislada y la vuelta al estado basal emite
fluorescencia. Esto no ocurre con tilacoides o cloroplastos completos.

Unidades fotosintticas o fotosistemas:

- Complejo antena: Complejo de protenas, clorofila y carotenoides. La
clorofila capta la luz (fotones) y transfieren la energa, pero no e-, al centro
de reaccin mediante transferencia de energa por resonancia. Los
carotenoides protegen a las clorofilas de la oxidacin.
- Centro de reaccin: Pareja especial de clorofilas que recibe gran cantidad de
energa y emiten un e- de alta energa (queda con carga positiva) a una
molcula aceptora y recupera un e- de baja energa (del agua).
71

Fotofosforilacin:
- Flujo de electrones en Z descrito por Hill y Bendall
- La energa se transfiere en 2 etapas. P680 y P700
- Gradiente de protones usado para generar ATP

Fotofosforilacin no cclica
- Citocromo b6-f es parecido al de las mitocondrias. Sirve como bomba de
protones.
- Es inhibida por algunos insecticidas.
Derivados de urea y triazinas bloquean las pastoquinonas.
Diquat y Paraquat (gramaxone) inhiben la ferredoxina-NADP
reductasa.

Fotofosforilacin cclica
- No forma NADPH.
- Los e- pasan del FSI al complejo citocromo b6-f que bombea protones.
- Mayor obtencin de ATP.

72

Fijacin de CO2
- Ciclo de Calvin. 6 CO2 + 18 ATP + 12 NADPH. Requiere mucha energa.
- Se le llama fase oscura por no necesitar luz.
- Fases:
Fijacin de carbono. Rubisco. Enzima ms abundante de la Tierra.
Condensa un CO2 con la ribulosa-1,5-difosfato (RuBP) para generar 2
molculas de 3-fosfoglicerato (PGA) (plantas C3).
Reduccin del PGA mediante el NAPH y formacin de gliceraldehdo
3-fosfato (sale al citosol para forma sacarosa o se guarda como almidn
en cloroplasto).
Regeneracin de RuBP. Necesita ATP.

Fotorrespiracin
La Rubisco no solo se encarga de la fijacin de CO2 sino que puede usar otro
sustrato como es el O2. En el caso de que use O2, transforma la RuBP en
fosfoglicolato y este en glicolato, de modo que en el cloroplasto el glicolato no sigue
una va normal sino que para ser transformado tiene que translocarse al peroxisoma
donde formara glioxilato, que viaja a la mitocondria formando glicinas que formaran
CO2 liberando amonio formando serina que sigue el camino opuesto llegando al
peroxisoma donde se modifica formando glicerato que se transloca al cloroplasto que
forma fosfoglicerato. La Rubisco genera fosfoglicerato si une CO2 y si une O2
tambien lo forma pero tambien sigue la ruta del glioxilato, desprendindose CO2 en
el balance completo de esta reaccin.
La afinidad de la Rubisco por un sustrato u otro depende de los niveles internos de
CO2 y de O2, de manera que si hay exceso de iluminacin se producen muchas
molculas energticas acelerndose el ciclo de Calvin que fija CO2, por lo que
descenso la concentracin de CO2 aumentando por tanto la de O2, activndose la
enzima Rubisco que fija mayor cantidad de O2. En este caso se consume energa y
se produce por tanto una prdida de energa, pero se consigue generar CO2. Adems
tambien se utiliza como proteccin de la celula, de modo que si la celula est muy
activa se est formando en el interior celular mas oxigeno y se elimina por esta va.

73

Plantas C4
Hay plantas que se han especializado en la forma que realiza esta fotorrespiracin,
que es lo que ocurre en plantas C4.
En estas plantas lo que ocurre es que tienen concentraciones de CO2 muy bajas por
lo que los estomas estn cerrados para evitar la prdida de agua, evitando la entrada
y salida de gases por lo que la cantidad de O2 aumenta.
En este caso el CO2 es controlado en las clulas del mesfilo que hay justo el
epitelio, es fijado y transformado en acido mlico que viaja a travs de poros
celulares a las clulas de la vaina y libera CO2 el cual se incorpora en el ciclo de
Calvin formando pirvico que va a las clulas mesfilo formando el
fosfoenolpiruvato.
Estas plantas fijan todo en forma de un compuesto orgnico que se libera en la celula
adyacente, por lo que en la celula de la vaina aumenta la concentracin de CO2.

Plantas MAC (metabolismo acido de las crasulceas)

Las plantas MAC lo que hacen es lo mismo que en C4 pero no lo realizan en dos
clulas diferentes sino en una misma celula. Lo que hacen es diferenciar una fase
liberadora de CO2 y otra de O2. Durante la noche, cuando la temperatura es ms
baja se abren los estomas y se realiza el intercambio. El CO2 es fijado durante la
noche formando el mlico. Cuando los estomas se cierran por el da se libera el CO2
que es fijado en el ciclo de Calvin.

Incorporacin de protenas
Las protenas de los cloroplastos al igual que en la mitocondria, estas se sintetizan en
ribosomas libres y tienen que ser incorporadas a su destino dentro del cloroplasto.
Las protenas que van a la membrana interna externa o matriz siguen un proceso
similar al mitocondria. Es un proceso de baja energa donde se le une a la protena
una chaperona que es reconocida por un complejo proteico que la transloca al
interior del cloroplasto.
Hay un complejo proteico que forma un canal y se conoce como TOC, que se abre y
justo debajo hay otro canal que es TIC, por lo que si queremos que la protena pase
al interior debe haber un alineamiento entre TOC y TIC pero si no se quiere que se
introduzca, el alineamiento no se produce, por lo que la protena queda en el espacio
intermembranoso quedando la protena en la membrana interna o en la externa. En
esta incorporacin se puede requerir de ATP o GTP.
A diferencia de mitocondria, hay un compartimento membranoso adicional donde
hay una serie de protenas. Cuando la protena llega a la matriz por una secuencia
seal que hay en el extremo carboxilo, cuando se escinde, hay una secuencia externa
de marcaje que hace que esa protena vaya al tilacoide, de manera que la protena va
a formar parte de la membrana tilacoidal o del lumen.
La protena si forma parte del lumen va a tener un complejo proteico que le permite
translocarse por la existencia de un poro. De modo que hay dos rutas, una que
implica a una familia de protenas conocidas como SEC en un proceso que depende
de ATP y otras protenas siguen otro translocador denominado TAT que su energa
es generada por un gradiente de protones.
En el caso de la protena de membrana, esta se incorpora a la misma membrana por
dos mecanismos, bien sea por insercin espontanea (por la existencia de dominios
hidrofobicos que le permite incorporarse a la membrana, sin requerir energa) o bien
un proceso dependiente de energa que ser mediado por una receptor de membrana
que va a reconocer a una protena que se le una a esta protena inserta en la
membrana (sistema SRP, que es similar al sistema que hay en el RER).

74

Metabolismo lipdico
Los cloroplastos estn implicados en el metabolismo lipdico, al igual que en
mitocondrias. Los fosfolpidos de la membrana externa e interna son intercambiados
por translocasas desde el REL y en el cloroplasto se sintetizan casi todos los cidos
grasos de la celula, por lo que son importantes en el metabolismo de cidos grasos de
modo que hay una serie de reacciones de sntesis a partir del piruvato formando
acetil-CoA y van a ir ciclndose aumentando el nmero de carbonos y formando
cidos grasos. Estos cidos grasos salen del cloroplasto y van a formar los distintos
fosfolpidos gracias a las enzimas sintetizadoras de fosfolpidos presentes en la
membrana externa de RE. El acido graso libre se forma en el cloroplasto y los
fosfolpidos se sintetizan en el REL.
-

PEROXISOMA
Son orgnulos membranosos de 02 hasta 1 de dimetro, y suelen ser esfricos.
Pueden presentar un contenido muy electronodenso o poco electronodenso con
cristales de distinto tamao en su interior. Son similares a los lisosomas pero su
sntesis es muy distinta ya que los lisosomas se forman siguiendo la ruta del RER,
complejo de Golgi y formacin de lisosomas y todas sus protenas provienen de
ribosomas libres.
Los fosfolpidos del REL mediante translocasas forman los fosfolpidos de la
membrana. Estn implicados en el metabolismo oxidativo y se conocen as porque su
primera actividad era la sntesis y degradacin de perxido. Estn tanto en clulas
animales como vegetales y su origen es compartido con mitocondrias y cloroplastos
en cierta medida, ya que existen crecimiento y divisin por fisin, pero algunas se
forman como vesculas del RE y por incorporacin de protenas van creciendo y se
dividen formando ms peroxisomas
Estn implicados en mltiples funciones como la oxidacin de cidos grasos de
cadena larga pero en estas etapas no se forma energa, por ejemplo si son cidos
grasos de 22 carbonos no pueden ser oxidados por las mitocondrias directamente de
modo que estos ingresan en el peroxisoma y por una serie de reacciones se van
retirando carbonos hasta generar molculas mas pequeas, que si que pueden viajar
hasta la mitocondria y ser oxidadas por estas. Tambien son importantes en la sntesis
heptica de colesterol y cidos grasos. Tambien estn implicados en el metabolismo
de compuestos nitrogenados, de modo que a partir de compuestos nitrogenados
como en la oxidacin de aminocidos se van degradando los aminocidos de forma
que no sean txicos y se va formando perxido de hidrogeno que ser eliminado por
accin de la catalasa. Tambien se eliminan algunos compuestos txicos que van a ser
oxidados dentro del peroxisoma permitiendo que sean o no solubles o bien que
pueda sacarse o recuperarse parte de ellos. Tambin estn implicados en la sntesis
de plasmalogenos (fosfolpidos que tienen un acido graso unido al glicerol y sin
importantes en vainas de mielina).

Peroxisomas y glioxisomas vegetales

Los peroxisomas vegetales aparecen generalmente asociados a mitocondrias y
cloroplastos ya que intervienen en el metabolismo de la fijacin de CO2
implicndose en la fotorrespiracin. Tambien aparecen unos peroxisomas especiales
conocidos como glioxisomas que abundan en semillas y lo que usan es la glucosa
que se genera a partir de cidos grasos por rutas de glioxilacion, es decir, utilizan los
productos de la degradacin de cidos grasos para obtener energa rpidamente.

75

Incorporacin de protenas
Las protenas de peroxisomas se incorporan de forma similar a mitocondrias y
cloroplastos, es decir, son sintetizadas por ribosomas libres y se interiorizan por
poros y canales. La mayora de protenas tienen un extremo carboxilo con una
secuencia serinalisina- leucina. En este caso hay una familia de protenas conocidas
como peroxi-peroxinas. Hay un receptor de peroxina que reconoce la secuencia seal
que es reconocida por una peroxina de la membrana que interacciona con un
complejo de peroxina que se abre y forma un poro por donde entra la protena. Esto
es lo que pasa con la catalasa, que es reconocida por un receptor y va al peroxisoma.

76

TEMA 6. EL NUCLEO CELULAR

1. INTRODUCCION
El ncleo es el orgnulo ms grande y fue el primero en observarse por primera vez
con microscopia ptica, en 1700 por Leeuwenhoek estudiando eritrocitos de salmn.
Suele existir un ncleo por celula pero hay clulas que tienen varios como los
osteoclastos o msculos esquelticos, etc. Se vio que el volumen del ncleo y de la
celula guardaba una relacin muy estrecha, y en cada celula, este volumen
independientemente del estado de la celula sola estar aumentado.
Se puede calcular el volumen celular que depende del volumen celular y del ncleo.
Si el volumen del ncleo aumentaba por duplicacin del ADN y el de la celula no lo
hace siempre se produca una divisin. El volumen del ncleo aumenta en funcin de
la cantidad de ADN, numero de cromosomas, duplicaciones del material gentico, si
este material esta mas o menos condensado etc. Su forma varia con la celula
pudiendo ser esfrico, alargado, cubico, etc. y su posicin vara en funcin de la
funcin y forma de la celula, pudiendo aparecer en el centro, en la base, en la parte
apical, etc. Es la principal o la primera evidencia que pudo separar las clulas
eucariticas y procariotas y permite que el material gentico est
compartimentalizado y permite una zonalizacion y regulacin de la expresin gnica.
En cuanto a la estructura, el ncleo est rodeado por una envoltura nuclear formado
por una doble membrana que contina con el RE pudiendo tener ribosomas en su
cara externa y forma parte del sistema de endomembranas ya que hay una
continuidad entre envoltura y retculo. Hay nucleolo que son estructuras amorfas
electronodensas donde ocurre la sntesis de ARN ribosomal y ensamblaje de
protenas. Tambien est la cromatina que es el ADN asociado a nucleoprotenas, que
en interfase se diferenciaran dos tipos de cromatina, la heterocromatina que son
masas densas generalmente perifricas y la eucromatina que son finas fibrillas
dispersas. Tambien est el nucleoplasma que es la fase acuosa que contiene todos
estos componentes y sales, enzimas, factores, etc.

2. ENVOLTURA NUCLEAR
Es una doble membrana en forma de cisterna que separa el ncleo del citoplasma,
hay una envoltura externa y otra interna. Se formo a partir de una vescula del RE
que engloba al material gentico.
Tenemos una membrana externa que tiene, al igual que el RER, ribosomas adosados
a una membrana que presenta un espacio de 25 a 40 nm y la membrana interna tiene
unida una serie de protenas que son las lminas donde tenemos la lamina A, B1 B2
y C que son filamentos intermedios. Estas lminas forman una red. Estas lminas no
interaccionan directamente con la envoltura interna sino que lo hacen por una serie
de protenas como LAN, LBR, MAN1, emerina, otefina, nesprina, etc. Son una serie
de protenas que unen la red con la envoltura interna de la membrana y van a unir el
material gentico (cromatina), es decir, se va a formar una red que va a unir todas las
estructuras.

77

Funciones
La lmina nuclear se est formando y destruyendo continuamente, permitiendo
regular el tamao del ncleo (si la red est ms laxa o sus laminas estn ms
prximas o lejanas permiten que la red sea moldeable, por lo que el ncleo puede
aumentar o disminuir de tamao).
Sirven para anclar la cromatina a la envoltura.
Adems cuando se produce la muerte celular por apoptosis, estas lminas son
degradadas por las caspasas.
Tambien estn implicadas en la divisin celular, de manera que en clulas en
interfase aparecen las lminas y todo el material gentico disperso en el ncleo.
En una celula que se est dividiendo vemos que no aparecen las lminas. En profase
las lminas son fosforiladas y quedan toda la envoltura nuclear desorganizada y el
material gentico que se va condensando y la fosforilacion se produce por el factor
activador de mitosis, las laminas una vez desorganizadas forman dmeros y
tetrmeros de lamina A y C y fragmentos de lamina B que constituyen la primera
fase de nucleacion. En telofase son desfosforiladas las laminas y empiezan a
organizarse fragmentos de laminas A y C y fragmentos de lamina B junto con
fragmentos dispersos por el citoplasma de la envoltura nuclear empezando a rodear
los cromosomas y se fusionan englobndolos.

Poros nucleares o complejo del poro

Existen una serie de complejos proteicos que forman un poro que permite la entrada
y salida de material al ncleo, de manera que va a ser fundamental en la
comunicacin ncleo-citoplasma. Hay entre 3000-4000 poros por celula pero su
nmero va a depender de la actividad transcripcional. Estos poros tienen un dimetro
de unos 120 nm, es decir, 30 veces ms grande que un ribosoma, pero presenta solo
un poro funcional de unos 9 nm de dimetro, el resto es el complejo proteico. Los
poros tienen mltiples protenas, se organizando formando un octamero y tenemos
una serie de protenas que se unen a la membrana nuclear donde hay una protena de
anclaje que se integra en el espacio entre las 2 membranas, una protena columnar y
una radial unida a esta columnar.
Adems tenemos distintos tipos de protenas en la membrana interna como en la
externa. Existen adems otras protenas que forman un anillo interno y otro externo.
En las protenas del anillo interno y externo cuelgan unas protenas filamentosas
hacia el interior y exterior. Las que van al interior forman gracias a la unin de
nucleoporinas forman una especie de bolsa de manera que la apertura e interaccin
de la molcula al interactuar con las protenas radiales y las filamentosas de una cara
y de otra van a permitir que la molcula se transporte correctamente.
A la hora de visualizar estos poros se usa ME mediante diversas tcnicas como:

- MET:

- Criofractura (se permite separar las 2

membranas del ncleo y se usa sombreado
metlico):

78

- Tinciones negativas (pudiendo observar los octameros):

- ME de barrido:

Los poros son fundamentales para el transporte de partculas que ser un transporte
bidireccional permitiendo la entrada de protenas principalmente, como protenas
nucleares, factores de crecimiento, hormonas, etc. Y permite la salida de ARNm,
ARNr y las subunidades ribosomales.
Este transporte va a ser pasivo o activo.
- Pasivo: Permite el paso de protenas de hasta 50 KDa, de manera que
dependiendo del tamao el paso por el poro va a ser ms o menos rpido, una
molcula pequea pasa rpidamente y una grande llegara a tardar hasta 30
minutos.
- Activo: Mediado por receptores y se consume energa.
Las protenas entran y salen al ncleo porque parte de su secuencia presenta una
secuencia seal que la direcciona, las que entran presentan una secuencia de entrada
(Pro-pro-lys-lys-lys-arg-lys-val) y otra de salida (Leu-ala-ley-lys-leu-ala-gly-leu-aspleu).
Esta seal se ha visto que se localiza en el ncleo pero si se delecciona el extremo
carboxilo esta protena esta en el citoplasma y si se delecciona el amino esta seal
permanece en el ncleo por lo que se ve que la secuencia de la protena esta en el
extremo carboxilo. La protena presenta componentes en el citoplasma necesarios
para el transporte.

Poros nucleares. Transporte protenas

Estos componentes o receptores pueden ser de dos tipos, las importinas y las
exportinas. Adems, las fibrillas en jaula, son ricas en fenilalanina y glicina y gracias
a estos dominios interaccionan con los receptores. Es necesaria una GTPasa que se
va a unir al complejo protena-receptor, de manera que siempre hay un gradiente de
estas protenas GTPasa en forma GTP o GDP y de las protenas accesorias que
intercambia el GTP por GDP. RAN-GDP y la protena activadora estar siempre en
una concentracin mucho mayor en el citoplasma, mientras que Ran-GTP y la
protena GEF estar en el ncleo.
Para transportar una protena se une el receptor con la protena atravesando el poro
con la protena Ran-GDP, antes de atravesar el poro, el GDP es hidrolizado y
cambiado por GTP de manera que si no hay intercambio, la protena no termina de
atravesar el poro, por lo que se libera el receptor de la protena al unirse el GTP a la
protena. Para la importacin ocurre lo mismo pero al revs.

Poros nucleares. Factores de transcripcin

Tambien ocurre con los factores nucleares como por ejemplo ocurre con la
translocacion del factor NF-AT que es el factor de linfocitos T activados que al
activarse los linfocitos, hay un factor citosolico fosforilado es desfoforilado y unido
a la calcineurina y al desfosforilarse se separa y hace que la protena se pueda
translocar pudiendo ser importada al ncleo, de manera que una vez en el ncleo se
79

une al ADN e induce la transcripcin. Cuando la celula deja de ser activada, este
factor nuclear se vuelve a fosforilar por lo que la regin de importacin queda
inactiva y la protena calcineurina se desprende quedando libre el dominio con una
regin NF que es una seal de importacin, pudiendo ser importada la protena.

Poros nucleares. Hormonas esteroideas

Las hormonas esteroideas pueden encontrarse libres o bien unidas a una protena de
unin. Si estn libres pueden atravesar libremente la membrana o gracias a un
translocador. Una vez la hormona en el citoplasma, en el caso de glucocorticoides, el
receptor esta en el citosol que va a unir a la hormona y se activa.
Estos receptores se encuentran acomplejados con protenas de choque trmico y se
mantienen en el citoplasma, de manera que una vez que se une la hormona, sufre el
receptor un cambio conformacional haciendo que no interaccione con las protenas
de choque trmico, que al separarse, una de las zonas que est unida a HSP90 queda
libre y una de estas regiones presenta un regin de importacin.
El resto de hormonas pueden atravesar mediante los poros o por la membrana
libremente y llegar al ncleo. En el ncleo hay un receptor de esta hormona de
manera que una vez dentro reconocen al receptor y se activan desempeando su
funcin, por lo que solo en los glucocorticoides existe un complejo hormona
receptor.

Poros nucleares. Salida de ARN

En cuanto a la salida de ARN, se tienen distintos tipos.
- ARN transferente y el interferente (mini ARN): Utilizan un mecanismo de
salida igual al de protenas, con exportinas y Ran-GTP.
- ARNm: Tiene un mecanismo para salir independiente de exportina de manera
que simplemente sale por la interaccin de un complejo proteico que se une
con el ARNm y unas protenas puente que interaccionan con las protenas
fibrilares y conducen la exportacin del ARNm sin necesidad de energa.
- ARNr: Se procesa y se le une todas las protenas ribosomales formndose las
subunidades 40S y 60S en el ncleo y estos complejos son los que salen fuera.
En este caso tambien se usa importacin con gasto de energa y es
fundamental la unin de la protena al complejo CRN1

3. CROMATINA Y CROMOSOMAS
El material gentico no est aislado sino que est formado por ADN en forma lineal.
Esta estabilizado por una serie de protenas estabilizadoras que estn implicadas en
el empaquetamiento del ADN y que son las histonas.
El ADN se puede teir con distintos tipos de colorantes como bsicos ya que es una
estructura acida, o con tincin Feulgen, verde metilo o ioduro propidio, etc.
El ADN est asociado con distintas protenas como son las histonas donde hay 4, la
H2A, H2b, H3 y H4 que estn muy conservadas a lo largo de la filogenia y se unen
formando una unidad estructural junto a la ADN que son los nucleosomas. Los
nucleosomas es la unidad mnima a la que se asocia el ADN y las protenas.
Hay otras histonas como son la H1 que forma parte de la cromatina pero esta histona
esta menos conservada que la anterior y no forma parte del nucleosoma pero es
necesaria para el ensamblaje. Estas histonas son protenas muy bsicas y se
sintetizan en la fase S o de sntesis de ADN.
En algunas clulas estas histonas son sustituidas por unas protenas que cumplen la
misma funcin y son las protominas. Adems existen otras protenas que son casi
todas ellas acidas y son sintetizadas durante toda la vida celular. Estas protenas son
las nucleoplasmina que se une a H2A y H2B, las protenas N1 que se unen a H3 y
H4, el antgeno nuclear de proliferacin, implicado en reparacin y replicacin de
80

ADN, la ADN sintetasa y la histona acetilasa, entre otras. Estas protenas estn
implicadas tambien en el empaquetamiento de la cromatina.

Eucromatina/Heterocromatina
Originariamente era para distinguir el bandeado de cromosomas metafsicos.
Microscopa electrnica transmisin:
- Eucromatina es la cromatina laxa, generalmente central. Constituye las fibras
de DNA activas (10 y 30 nm). 10% del DNA
- Heterocromatina forma masas densas y generalmente perifrica. Inactiva
Facultativa. A veces se expresa y otras se condensa. Segn el tipo celular
Constitutiva. Nunca se expresa
- Clasificacin segn el nmero de repeticiones
DNA secuencia nicas. 70%, transcrito a RNAm (es eucromatina en
clulas que lo expresan y heterocromatina en las que no)
DNA moderadamente repetitivo. 20%, corresponden con secuencias de
genes en tndem como las histonas, RNAr, RNAt, etc. Forman
eucromatina o heterocromatina facultativa
DNA altamente repetitivo (satlite). 10%. Forma heterocromatina
constitutiva:
DNA satlite: Hasta 100 pb repetidas 1 milln veces. En los
centrmeros
DNA minisatlite: 15 pb repetidas hasta 1000 veces
DNA microsatlite: 2-5 pb repetidas hasta 100 veces

Cromatina interfsica
- Nucleosoma. Octmero de histonas que interacciona mediante Lys y Arg (Aa
positivos) con el DNA. 1 de vuelta (140 pb) y 60 pb internucleosmicas.
- Fibra 10 nm, cromatina en estado funcional de replicacin o transcripcin.
- Fibra 30 nm. Se forma espiral de 6 octmeros gracias a fosforilacin de H1 e
interaccin de H4 internucleosmicas.

Cromatina metafsica. Cromosomas

- La fibra de 30 nm se pliega formando dominios de bucles, espirales y el
cromosoma.
- Condensinas son importantes en este plegamiento.
- Eliminadas las histonas queda un armazn proteico en cada cromtida que se
une por el centrmero formado por protenas de alta mobilidad (HMG).

Regulacin del empaquetamiento

Modificaciones de las histonas nucleosomales afecta a la estructura, replicacin y
transcripcin (epigentica).
- Acetilacin. Evita interaccin con el DNA, protege accin Dnasas y favorece
la expresin gnica
- Fosforilacin. Evitan la interaccin con el DNA
- Metilacin. Induce desacetilacin e inhibe la expresin
- Ubiquitinacin. Degradacin de las histonas y liberacin del DNA
81

Regiones del cromosoma metafsico

- Crommeros: Zonas de la cromtida con mayor condensacin del DNA,
generan un bandeado al teirlos con Giemsa
- Centrmero. Constriccin primaria vista la microscopio ptico, contiene
heterocromatina constitutiva con histonas desacetiladas y metiladas (no
expresin). Se le asocia un complejo multiproteico denominado cinetocoro por
el que se unen los microtbulos
- Organizador nucleolar. Constriccin secundaria, no visible al MO, consta de
fibrillas
- poco densas con empaquetamiento diferente al resto del cromosoma. En
interfase dar lugar a la formacin del nuclolo
- Telmeros. Extremo del cromosoma, permite la correcta replicacin de TODO
el DNA y el espacio fsico para que se una la DNA polimerasa y replique en
direccin 5-3. Consta se secuencias repetitivas cortas que sirven de anclaje a
los RNA cebadores, se replica gracias a la telomerasa (actividad RNA
polimerasa) que evita el acortamiento del tamao de los cromosomas en las
divisiones. Presenta actividad en clulas madre y no en las que presentan vida
limitada y no se dividen.

4. EL NUCLEOLO
Lugar de transcripcin y procesamiento de RNAr y ensamblaje de ribosomas
Su tamao y nmero depende de la actividad y necesidad de ribosomas.

Tincin:
- Principalmente acidfilo por tener RNA y protenas cidas, pero a veces las
protenas bsicas las enmascaran y aparecen eosinfilas.
- Se tien con pironina y no con verde de metilo ni tincin de Feulgen.

Estructura
- Centro fibrilar (FC). Estructura globular muy poco densa, nmero depende
necesidad de ribosomas, formado por fibrillas de 7-9 nm, contiene DNA y
RNA. Forma el centro organizador nucleolar aunque a veces no aparece.
- Componente fibrilar denso (DFC). Fibrillas de ribonucleoprotenas de 8-10
nm.
- Componente granular (G). Acumulaciones ribonucleoprotenas de 25 nm.
El 80% del RNA celular es de tipo ribosmico.
Complejo organizador nucleolar (centro fibrilar).
- Un gen multicopia (hasta 800 copias) en tndem que forma fibras con
zonas mudas (sin transcripcin) y zonas con transcripcin. Forma de rbol
de navidad.
- Cada copia se transcribe simultneamente hasta por 100 RNA polimerasa.
- Se origina un pre-RNAr mediante RNA polimerasa I. Se le unen
ribonucleoprotenas conforme se sintetizan. 45S en aves y mamferos, 40S
en anfibios, 34S en Drosophila.
RNAr 5S. Origen extranucleolar, transcrito por RNA polimerasa III.

82

Procesamiento de pre-RNAr 45S

Excisin y formacin de RNAr 58S, 18S y 28S. Inhibido por actinomicina D,
bromuro de etidio, tiocetamida, toyocamicina.
Proceso mediado por RNPsno (1 RNAsno y unas 8 ribonucleoprotenas)
- Implicadas ms de 300 ribonucleoprotenas.
- Unos 200 RNAsno. Pequeos RNA (10-20 nt), muchos vienen de
intrones del RNAm. Se unen al RNAr y dirigen a las enzimas
modificadoras. Funciones:
- Excisin de pre-RNA. Implicacin de U3, U8 y U22 RNPsno
- Dirigir las metilaciones (C/D box snoRNA) y formacin de
deoxiuridina (H/ACA box snoRNA).

Ensamblado de subunidades ribosomales

- Entrada de protenas ribosomales desde el citosol.
- Unin a los RNAr para formar las subunidades.
- Subunidad 60S. RNAr 5S, 58S y 28S y 50 protenas.
- Subunidad 40S. RNAr 18S y 33 protenas.
- Salida de subunidades por complejo de poros y ensamblado en el citosol.

Ciclo del nuclolo

- En interfase suelen crecer e incluso fusionarse los muy prximos.
- Desorganizacin. Profase. Disminuye tamao, se vuelve irregular y
aparecen pequeos fragmentos entre los cromosomas.
- Transporte. Metafase y anafase. Totalmente fragmentado entre los
cromosomas.
- Reorganizacin. Telofase. Fusin de pequeos fragmentos y aparicin de
pequeas regiones fibrilares (cuerpos prenucleares) los cuales se van
fusionando y organizando para dar los nuclolos.

83

TEMA 7. SISTEMA DE
ENDOMEMBRANAS
El sistema de endomembranas son los compartimentos intracelulares relacionados con
las vas biosinteticas, secretorias y endociticas. Se trata de un sistema cerrado
delimitado por membranas encargado de la sntesis (de lpidos y protenas), procesado,
distribucin y transporte de macromolculas o materiales ingresados.
Este sistema est formado por:
1- Retculo endoplasmatico.
2- Complejo de Golgi.
3- Lisosomas/vesculas.
4- Endosomas.
Se trata de compartimentos dinmicos con un flujo coordinado continuo. Cada parte
est conectada entre s por vesculas de transporte que se desplazan por el
citoesqueleto. Al llegar a su destino, las vesculas fusionan sus membranas con el
compartimento receptor. Estas vesculas llevan un marcador que son unas GTPasas
RAB que determinan la zona a la que tienen que ir cada vescula. Las protenas
SNAIL son las que determinan la fusin de la vescula y la membrana receptora.
Las vesculas que salen del RE son vesculas cubiertas y se conocen como vesculas de
transicin que se fusionan a nivel de la cara CIS del Golgi, constituyendo la red CIS
del Golgi. Despus de la cisterna CIS estn las mediales y despus la cisterna trans a
donde llegan las sustancias ya empaquetadas y bien formadas que se aaden a una
vescula saliendo fuera.
Las envueltas proteicas de las vesculas son la envuelta de clatrina o las molculas
COP, que determinan el destino de los materiales.

Flujo de vesculas
Todas aquellas vesculas que salen del RE que van al Golgi van recubiertas y
protegidas por las protenas COP2. El material que sale en vesculas desde la cara
trans del Golgi va recubierto por la cubierta de clatrina. El COP1 se encarga del trafico
retrogrado, es decir, dentro del sistema de endomembranas, no todo el sistema lleva
una misma direccin, sino que dentro del mismo sistema hay un reciclado de
componentes de membrana.

84

1. TRANSPORTE SELECTIVO A LOS LISOSOMAS

En los lisosomas convergen muchas diferentes rutas del trfico intracelular. Segn la
procedencia del material tenemos:
- Si procede del Complejo de Golgi participa los endosomas
- Si procede de digestin intracelular podemos tener:
Heterofagia: Si se digiere material incorporado por proceso de
endocitosis. La heterofagia participa en la defensa, procesamiento de
hormonas o reabsorcin. En este proceso participaran los fagosomas
(heterofagosomas), vesculas de pinocitosis y endosomas.
Autofagia: Se produce la eliminacin de partes obsoletas de la propia
celula (para renovacin o proteccin), y participa en la regulacin de la
secrecin. En este proceso participan los autofagosomas, lisosomas y
los endosomas.
El resultado ser la formacin de un cuerpo residual de un dimetro de unos 3 m y la
formacin de grnulos de lipofucsina (en el envejecimiento celular).

Marcaje de las enzimas lisosomales

En el RER se produce la sntesis del precursor de la hidrolasa lisosmica, que se
trata de una protena glucosilada. Este marcaje se realizara en el compartimento cis
del Golgi.
Se va a producir la transferencia de una N-acetil glucosamina fosforilada de un
donador azcar nucletido a residuos de manosa de un N-oligosacarido. El marcador
en esta reaccin es la manosa-6-fosfato.
En el proceso intervienen la N-acetil-glucosamina fosfotransferasa, la Nacetilglucosamina P-P-U (es el portador) que adiciona fosfatos a una manosa y
fosfoglucosidasa que libera la NacGlc.

2. BIOGNESIS DE LISOSOMAS
Las hidrolasas cidas, que deben ir a los lisosomas, van marcadas segn el lugar donde
vayan. En este caso el marcador es la manosa-6-fosfato. Una vez que se ha producido
el marcaje con la manosa, en la membrana del Golgi se encuentra el receptor
especfico para esa parte de la manosa marcada.
Una vez que se produce la unin lisosoma receptor se desencadena el sistema de
reconocimiento de esa porcin de la membrana, de forma que para poder segregar esta
porcin se realiza por la cubierta proteica de clatrina alrededor de esa zona.
Posteriormente se produce el estrangulamiento (fusin y fisin de membrana) y tras
ello se desprende de la cubierta de clatrina y llevada sobre los rieles del citoesqueleto
se dirige al compartimento endosomal para producir la separacin del receptor del
ligando (enzima lisosomal) de manera que precisamente en este receptculo
(endosomas) y debido al pH bajo pero intermedio que poseen el compartimento de los
endosomas temprano (pH de 34) es donde se produce la disociacin de endosoma.
Producindose la via retrograda al Golgi.
Cuando se produce la envoltura de la vescula en el PGN (receptor), para que se
puedan formar las envueltas proteicas alrededor de las vesculas de transporte hace
falta una protena adaptadora y un transformador energtico. En el caso de la cubierta
de clatrina en PGN, la protena adaptadora es la protena GGA que es un polmero con
varios dominios que por un lado se unen a las unidades de clatrina y por otro se unen
al receptor de membrana y por otro lado se unen a esa protena molculas de ARF1-

85

GTP, que cede la energa para que se pueda producir el complejo. En el caso de la
formacin de cubierta clatrina el que acta como molcula de energa es el ARF1.

Estructura de la cubierta de clatrina

La vescula de clatrina presenta varias subunidades proteicas que son los
trisqueliones que presentan 3 cadenas ligeras y 3 pesadas que tienen una disposicin
espacial formando una especie de gancho que se dirige hacia abajo. 36 de estas
unidades se unen de esta manera, de manera que siempre hay 2 brazos de los
trisqueliones que coinciden con dos brazos del vecino. Esto forma una estructura que
es la envoltura que presenta 6 hexgonos y 12 pentgonos.

Ensamblaje de los trisqueliones de clatrina

El ensamblaje de los trisqueliones a la clatrina se produce por la accin de protenas
accesorias. Para que se pueda producir el ensamblaje se requieren de las protenas
adaptadoras.
El extremo de cada cadena pesada forma un gancho que sobresale hacia la superficie
de la membrana, donde se une con una protena adaptadora. Los adaptadores son
complejos formados por 4 subunidades. Estos adaptadores se van a unir con diversas
protenas accesorias. Se va a producir una invaginacin de la membrana y se va a
producir la actuacin de la dinamina.
La dinamina est en forma de monmeros en el citosol y polimeriza organizndose
en forma de helice, por lo que se coloca alrededor de la base del cuello de la vescula
86

polimerizando y formando un anillo helicoidal que cada vez cierra ms de manera

que provoca que las membranas queden contiguas y en una distancia menor de 1 nm,
la bicapa lipdica se fusiona.
Esto se sabe porque se ha usado un homologo que no hidroliza ATP, de manera que
este homologo se va polimerizando pudiendo verse en el microscopio como una
vescula que no consigue la fusin formando un anillo alrededor. Una vez que se ha
separada la vescula se produce el desensamblado y para ello se requiere de una
auxilina y de una chaperona (HSC70) que por la hidrolisis del ATP desensambla este
sistema.

Fosfoinositoles: marcadores de membrana

Todas estas funciones celulares que estn ubicadas en membrana requieren de
marcajes para determinar la ubicacin y el destino. Los fosfolpidos de membrana
pueden actuar como marcador y estos son los fosfoinositoles (PIP).
El fosfatidilinositol (PI) puede sufrir ciclos rpidos de fosforilacion estando en
posicin 3 4 y 5, constituyndose marcadores que pueden ser reconocidos por
estructuras proteicas con dominios especficos para estos. De esta manera se generan
los fosfoinositoles.
Estos PIP en funcin de la posicin donde se una el grupo fosfato van a variar. Los
dominios de membrana que forman vesculas de transporte o son membranas dianas
tenemos:
- Membrana plasmtica: Tenemos PI (4,5) P2 y produce endocitosis y hay
clatrina, AP2 y dinamina.
- TGN, grnulos de secrecin y vesculas sinpticas: Tenemos PI (4) P.
- Endosomas temprano: PI (3) P.
- Endosomas tardos: PI (3,5) P2.
Una vez separada la vescula del TGN esta se va a dirigir al compartimento
endosomal. Para ello, para que la vescula pueda interaccionar con la membrana del
compartimento diana (endosomas temprano), necesitamos primero el reconocimiento
y fijacin.
Para que se de este reconocimiento, tanto en membrana de vescula y membrana
diana, se requieren de unas protenas integrales de membrana que son las protenas
adaptadoras. Estas protenas son las pequeas protenas GTP-Rab y adems se
requieren de factores de anclaje que junto con las protenas Rab reconocen la vescula
en la superficie de la membrana diana.
Para que se produzca el acoplamiento de la vescula con la membrana se requiere de
unas protenas que son complementarias entre s de manera que una familia de esta
familia est en la membrana de la vescula y otra familia est en la membrana diana,
estas son las llamadas protenas SNARE. El SNARE que hay en la vescula de
transporte es el V-SNARE y el que est en la protena diana es la T-SNARE. Estas son
protenas complementarias que hacen una interaccin especfica.
Una vez producida la interaccin, los SNARE se une establecindose de forma
helicoidal aproximando la vescula a la membrana del compartimento diana. Una vez
producido esto se produce la fusin de membranas y para ello se necesita un factor el
NSF que proporciona la energa y un vez fusionada las membranas se vierte el
contenido de la vescula en el compartimento diana.

87

Para que se produzca la fusin se debe disociar el acoplamiento SNARE para lo que se
usa protenas accesorias como el complejo NSF con ATP. El compartimento donde se
ha vertido todo es el compartimento endosomal.

3. ENDOSOMAS
Los endosomas son estructuras de forma curiosidad, con un cuerpo con forma esfrica
que tiene en la superficie extensiones tubulares de unos 60 nm de dimetro y hacia su
interior forman evaginaciones formando vesculas intraluminares que tienen un
tamao de unos 50 u 80 nm.
Las membranas contienen muchas de las protenas y lpidos que se usan como
marcadores de dominios de transporte presentando los fosfoinositoles, protenas RAB,
bombas de protones, de manera que dentro de este sistema endosomal tenemos:
- Endosomas tempranos: Son ms perifricos, su pH es de 62, son donde se
forman las invaginaciones para formar los cuerpos multivesiculares y es
donde se produce la clasificacin.
- Endosomas de reciclaje: Estos se forman como consecuencia de la fusin de
los tbulos de los endosomas tempranos que finalmente se segregan y se
fusionan y se renen posteriormente para formar los endosomas. Estos tienen
un pH de 62.
- Endosomas tardos: Son ms centrales en el citosol y ms prximos al
ncleo. Su interior es mucho mas acido, presentando un pH de 5.
El compartimento endosomal est relacionado con el trnsito de todas las molculas
en el sistema de endomembranas (endocitosis o autofagia). Se produce por tanto la
clasificacin del material que entra por endocitosis, se produce la disociacin de
complejos receptor-ligando dirigindose las molculas al TGN del Golgi por
transporte retrogrado, enviando material a la membrana por reciclaje o enviando
material a los lisosomas por degradacin. Los sistemas endosomales participan
activamente en la sealizacin celular.
Los compartimentos membranosos que forman todo este sistema se pudieron observar
mediante el marcaje de enzimas usando compuestos que se sabe que atraviesan de
forma especfica algn compartimento usando las tcnicas histoqumicas. Para ello se
usa la peroxidasa que permite caracterizar el compartimento de endosomas tempranos.
Tambien se puede hacer el marcaje de una forma parecida usando el marcaje en
tcnicas histoqumicas usando lectinas que reconocen glicoprotenas en la superficie
de la vescula pudiendo observar los cuerpos multivesiculares. Para ver como recorre
el receptor de la manosa 6 fosfato todo su recorrido desde la salida del TGN del Golgi
hasta el endosoma se usaron tambien marcaje.
La composicin membranosa de los endosomas es una estructura altamente dinmica
de modo que lo que es la membrana de endosomas se pueden marcar dominios que
son lipoproteicos de manera que en esos dominios tenemos protenas marcadoras,
protenas RAB y junto con esto una gran diversidad y complejidad bioqumica.
Los endosomas tempranos son el primero compartimento en recibir el material
transportado. Estos presenta un pH de 63 a 68 y producen la disociacin ligandoreceptor. Los ligandos son solubles y se van acumulando en las vesculas. Estos
endosomas tienen una elevada tendencia a realizar fusin homotipica con sus iguales.
En la superficie endosomal, los componentes diferenciadores Rab aparecen y
desaparecen dinmicamente formando subdominios que constituyen las unidades
funcionales del sistema endosomal y responsables del transporte preciso y controlado.

88

Dinmica
Las partculas/molculas/receptores transportados en vesculas llegan al endosoma
temprano en un proceso regulado por la GTPasa Rab5. El destino posterior de esta
sern los lisosomas, el TGN o la membrana plasmtica.
Durante la clasificacin se produce una remodelacin de la membrana ya que se va a
producir la formacin de tbulos (material para reciclar), formacin de los endosomas
de reciclaje y biognesis de los endosomas tardos por la via de la formacin de los
cuerpos multivesiculares (por vesculas intraluminales) para el material a degradar.
Adems se va a producir la liberacin de Rab5 y la unin de Rab11 y Rab7
respectivamente.
Tambien se van a producir cambios en el pH, siendo en endosomas tempranos un pH
de 63, en los cuerpos multivesiculares de 55 y en los tbulos de 67.

4. DIGESTIN INTRACELULAR
Desde la superficie celular y a travs de procesos de endocitosis se introduce
materiales en el interior de las molculas con un objetivo muy variado. En este
proceso se incorporan nutrientes pero adems se sabe que dentro de la interiorizacin
interviene tambien en fenmenos de defensa, procesamiento de hormonas o
reabsorcin. Todo esto entra dentro de la heterofagia.
Cuando se produce la interiorizacin por via de endocitosis se producen dos tipos de
entidades intracitoplasmaticas, por un lado los fagosomas y por otro las vesculas de
endocitosis.

5. VAS ENDOCITICAS
Esto se observa en clulas animales, ya que en vegetales su pared no permite este tipo
de comunicaciones. Las vas endociticas se observaron mediante el uso de
microscopios y una serie de tcnicas que se usan marcadores fluorescente o se ponen
en sistemas de cultivos estudiando la sensibilidad a las drogas y la dependencia de este
transporte a quinasas. La endocitosis tiene lugar en la superficie celular y en ella est
implicada la membrana y el citoesqueleto
Tiene lugar distintos procesos por la via endocitica como:
o Interiorizacin de la membrana: La entrada de porciones de la membrana le
sirve a la celula para el mantenimiento de la homeostasis de la membrana.
o Captura del medio extracelular: De forma bsica se obtienen nutrientes.
o Regulacin de procesos iniciados en la superficie celular: Es el proceso de
sealizacin celular, de manera que por la via endocitica, algunas de las seales
que llegan a la superficie celular y que contacta y reacciona con sus receptores
especficos son incorporados en el interior celular para que contine su accin.
o Las caractersticas fsicas y qumicas de la molcula de carga son las que
determina el tipo de vescula endocitica (tamao, forma y propiedades qumica).
Los factores que se necesitan para que se produzca la endocitosis son la modificacin
estructura en la membrana. Adems la dinmica de membrana basada en las balsas
lipdicas (rafts) y tambien los diferentes tipos de endocitosis puede ser dependiente o
independiente de una cubierta proteica. Por ltimo en estos factores tambien hay que
tener en cuenta el mecanismo de escisin (se tiene en cuenta que intervenga o no la
dinamina).
El mecanismo que tiene lugar en esta via se produce por la captura de fluidos,
macromolculas, partculas u otras clulas del medio extracelular mediante la
formacin de una vescula de endocitosis.
89

A la hora de clasificar las vas de endocitosis podemos usar la clasificacin clsica, es

decir se clasifica en funcin de la entrada de grandes partculas o de pequeas
partculas.
En funcin de esto tenemos:
- Fagocitosis: Es la ingestin de partculas grandes, de tamao superior a 500 nm.
Las clulas que hacen esta factura son los fagocitos (macrfagos, monocitos,
neutrofilos, osteoclastos, etc.). El proceso de la fagocitosis es un proceso
regulado de manera que estas partculas deben ser reconocidas a travs de
ligandos que tienen en la superficie que son reconocidos por receptores
activados presentes en la membrana plasmtica. Para que se produzca la
fagocitosis, los receptores modifican la superficie de la clula generando
pseudpodos que rodea a la partcula y se produce en funcin de la presencia de
actina.
- Pinocitosis: Es la entrada de fluidos y macromolculas de bajo peso molecular.
En este caso la superficie se modifica de forma diferente, la celula forma
repliegues que va capturando grandes cantidades de fluido extracelular o a
travs de pequeas vesculas que son de pequeo tamao y contorno uniforme y
se produce pro invaginacin de la membrana. Este proceso lo realizan todos los
tipos celulares hacindolo algunos de ellos con mayor intensidad.
La via endocitica se clasifica en dos:
- Macroescala:
o Fagocitosis: Consiste en la ingesta de grandes partculas reconocidas
por receptores y modifica la superficie celular.
o Macropinocitosis: Se produce interiorizacin masiva de membrana
capturando gran parte del medio extracelular. En ambos casos la
superficie celular necesita un aporte extra de membrana.
- Microescala:
o Endocitosis mediada por clatrina.
o Sistema de caveolas.
o Compartimento endosomal enriquecido desencadenado por protenas
que se unen a los glucofosfatidilinositol.
o Vas dependientes de Arf6.

Dinmica de la endocitosis
Para comprenderla es necesario saber que en esos puntos de la superficie celular, en la
membrana plasmtica, la presencia o no de determinados componentes son los que
determina que se pueda producir las invaginaciones de la membrana ya que en esas
zonas estn las protenas que lo permiten, por lo que es interesante conocer la
topologia de la membrana.
Las vas de endocitosis son lugares de la membrana caracterizados por los dominios
Raft (balsas lipdicas). Estas balsas contienen glicoesfingolipidos unidos a colesterol
formando una estructura muy compacta de manera que estos glicoesfingolipidos se
encuentran solo en la hemimembrana externa.
Los fosfolpidos que forman parte de las balsas contienen las cadenas de cidos grasos
largas y muy saturadas lo que hace que en comparacin con el resto de la membrana
hace que estas zonas sean muy estables, que adems por ser ricas en colesterol,
determinando que la membrana deje de tener fluidez convirtindose en una zona
estable con todo lo que hay en ella fijado a la membrana. Adems en estas zonas raft
se caracteriza por atraer y permitir que se incorporen protenas especficas de manera
que en las rafts hay protenas relacionadas con las vas de endocitosis, por lo que en
rafts se instalan protenas que atraen a la cara exoplasmatica son mayoritariamente con
anclajes con GIP.
90

Las protenas unidas a la cara citoplasmtica se unen a grupos miristico y palmtico

(como son las flotilinas y caveolinas). Tambien otras protenas se unen por acilacion
(como la Src-tirosina quinasa). Adems algunas de estas protenas que caracterizan a
estas vas de entrada se unen muy intensamente con el colesterol como las caveolinas
(esta unin forma una especie de horquilla), otras se unen a los fosfolpidos como las
anexinas.
Dentro de las balsas siempre hay protenas G quinasas. Estas protenas G son
especificas de cada tipo de via de endocitosis. Lo que caracteriza a una balsa lipdica
es que es un compartimento de membrana que est destinado a que en el sucedan la
mayora de las ms importantes acciones de las clulas eucariticas y lo hace a travs
del cambio de composicin proteica, de manera que el tipo de unin que se pueden dar
en las rafts es una interaccin proteina-lipido o lipido-lipido, a diferencia de la
interaccin que ocurre en el resto de la bicapa que es proteina-proteina.

Fagocitosis (inmunidad innata y adquirida)

Para estudiar la fagocitosis ligado a la inmunidad innata y adquirida se puede hacer del
siguiente modo.
En la inmunidad adquirida la APC reconoce antgenos por sus anticuerpos, y en su
membrana plasmtica se colocan los receptores FC de modo que el reconocimiento del
microorganismo se hace por receptores activados y se produce de tipo de cremallera,
es decir, toda la superficie del microorganismo va a ser reconocido por los receptores.
En este tipo de fagocitosis intervienen las protenas G como es la Src tirosina quinasa.
El complejo formado por la Arp2, 3 y N-WASP son los que desencadenan el cambio
del citoesqueleto pues polimerizan actina formando microfilamentos de actina y hace
que los que existen se ramifican ya que el citoesqueleto a travs de la polimerizacin
mueve la membrana plasmtica para que rodee a la partcula suponiendo un gasto de
membrana plasmtica para que la celula no modifique ni su forma ni su funcin
necesita aporte de membrana y para ello se incorpora membrana procedente del
interior del citoplasma y se hace por la utilizacin de la ARF1 o AP1. Esto hace que
gran parte del rea de membrana sea desplazado hasta que se termine de cerrar
producindose la incorporacin.
Hay otra via dentro de la inmunidad adquirida como es que ser mediada la
endocitosis por el factor Cr3b del complemento que presenta receptores C3R siendo la
unin una unin focal de la partcula opsonizada. La protena G que interviene es la
PAK1.
La protena G que hace que se puedan polimerizar los microfilamentos son efectores
de protenas Rho (Rho GTP-asas).
FALTA UNA PARTE

6. AUTOFAGIA
Es la eliminacin, por parte de la celula, de sus propios componentes. El proceso de la
autofagia tiene distintas vertientes, por un lado es un aparato que permite renovar la
celula y nos sirve para protegernos por la formacin de protenas mutadas por ejemplo
que pueden ocasionar enfermedades. Los componentes morfolgicos que intervienen
en la autofagia son los autofagosomas, el lisosoma y el endosoma.
La autofagia tiene mucha importancia para la supervivencia celular, sobre todo en los
tejidos cuyas clulas han alcanzado el mximo crecimiento celular y que estas no se
dividen. Es tambien importante durante las enfermedades, ya que la autofagia muestra
a las clulas los componentes antignicos para que pueda reconocer la celula lo que es
propio de lo que no es propio. Tambien la autofagia es una buena colaboradora del
cuerpo en la defensa contra los tumores, ya que las protenas que estimulan la
91

autofagia tienen la propiedad de inhibir los canceres. En relacin con las

enfermedades neurodegenerativas, se produce por fallos en los degradados de
protenas, por lo que la autofagia se encarga de eliminar los agregados de protenas
que provocan estas enfermedades. En el envejecimiento tambien participan ya que las
clulas envejecidas acumulan protenas, orgnulos daados, etc. Y la autofagia lo que
hace es eliminar este material sobrante.
Las situaciones que generan esta autofagia se puede dar por el desarrollo (cuando se
produce el desarrollo embrionario se generan muchos tipos celulares con muchos
componentes que actan en solo un momento concreto por lo que se elimina y se
ponen otros), tambien en los periodos de ausencia de nutrientes, o en situaciones como
cuando se da un estrs en el retculo endoplasmatico, ya que se forman muchas
protenas que no se excretan por lo que se deben retirar ese exceso de protenas. Con
infecciones microbianas, estrs metablico, o enfermedades por acumulacin de
protenas.
Los requerimientos de la autofagia requieren de una regulacin precisa y fina del
proceso y se hace en base a la expresin de unos genes, los genes relacionados con la
autofagia que sintetiza unas protenas, la Atg.

Tipos de autofagia
El proceso de autofagia se encarga de la degradacin de protenas y orgnulos
celulares deteriorados o productos elaborados en exceso. El destino de este material
son los lisosomas pero la forma de llegar a este puede ser de dos maneras:
- Macroautofagia: El material va englobado en grandes vesculas de doble
membrana, pudiendo capturarse de forma no selectiva.
- Microautofagia: De forma selectiva
Hay distintos tipos de macroautofagia en funcin del material que se ha captado. Otra
modalidad de incorporar el material al lisosoma por la invaginacin de la propia
superficie del lisosoma formando vesculas que incorpora de forma directa el material,
pudiendo incorporar protenas de forma especfica o bien incorporar protenas a
granel. Este tipo de autofagia es la microautofagia.
El tercer tipo de autofagia es la autofagia mediada por chaperonas (CMA) que se trata
de la retirada selectiva de protenas, que deben ser reconocidas por chaperonas. Las
chaperonas que funcionan en esta autofagia es la HSC70. Es un proceso mucho ms
controlado y selectivo.
Los tres tipos de autofagia se pueden dar en un mismo tipo celular, de modo que estos
tres tipos solo se diferencian en el modo en el que el material es reconocido para
realizar su descarga en los lisosomas para ser degradado.

Macroautofagia
La macroautofagia ocurre en todas la clulas de forma constitutiva, es decir, no
requiere seal. El material que queda capturado su destino es dirigirse al lisosoma para
degradarlo y los componentes que se obtienen del lisosoma, salen de la superficie del
lisosoma por transportadores para que la celula vuelva a utilizarlo.
La macroautofagia necesita para que se pueda producir de una serie de factores que a
la misma vez actan como marcadores. En principio se necesitan:
- Protenas: Pertenecen al sistema de protenas asociadas a autofagia (Atg9) y una
protena de membrana vacuolar (VMP1).
- Complejo PI3 quinasa: Necesario para que produzca PI (3) P que se requiere para
que se forme la macroautofagia.
92

- Serina-treonina quinasa ATP1: Tambien llamada ULK1 y 2. Es un complejo

proteico.
- Protenas asociadas a la autofagia: En conjunto la asociacin de estas forman el
complejo Atg16L.
El material con toda esta maquinaria se recoge en grandes vesculas de doble
membrana que son los autofagosomas que tienen un dimetro de hasta 700 nm. Estas
vesculas se fusionan con el endosoma tardo para degradarse.

Biognesis de los autofagosomas

La biognesis tiene 5 etapas. Va a comenzar con la induccin. Esta etapa supone la
formacin inicial de una bicapa lipdica. El aporte de membrana hasta este momento
no tiene protenas, solo es una bicapa lipdica. En esta induccin a la bicapa se la
conoce como membrana de aislamiento que formara el fagoforo por que la membrana
acta como centro de nucleacion de material membranoso. Aun se desconoce el origen
de la membrana.

Para la formacin y ensamblaje de la membrana que forma el fagoforo actan factores

como el complejo ULK1/2 que se une a la membrana de aislamiento y es necesario
porque debe funcionar para que la PI3 quinasa forme y una el PI (3) P a la membrana
para el reclutamiento de las protenas Atg9 y VMP1 que son transmembrana. Todo
esto es necesario para que pueda crecer el aporte de membrana para formar el
autofagosoma.

El complejo Atg12, 5 y 16L es el que provoca que se unan mas trozos de membrana y
provocando la curvatura de la vescula al mismo tiempo que engloba material del
citosol que queda en su interior.
Por ltimo se produce el cierre hasta que entran en contacto la membrana
producindose la fusin y cierre, quedando formado el autofagosoma con una doble
membrana que se fusiona con los endosomas y lisosomas formando un
autofagolisosoma degradando el material del interior.

Ultraestructura de la macroautofagia
Los orgnulos se rodean de una doble membrana formando el fagoforo que se cierra y
forma el autofagosoma que se fusiona con lisosomas primarios generando un
autofagolisosoma degradando el material y produciendo la salida de los materiales
generados al citosol y cuando el contenido el hidrolasas acidas de autofagolisosomas
93

no d para seguir degradando mas material se constituyen los cuerpos residuales. La

mayora de cuerpos contienen material lipdico que no puede ser degradado generando
cuerpos residuales como grnulos de lipofucsina por ejemplo.

Microautofagia
Consiste en la captura y degradacin de porciones de citoplasma, incluido protenas
solubles del citosol. Lo que hace es formar vesculas invaginadas en la membrana del
lisosoma o del endosoma tardo de forma semejante a la formacin de los cuerpos
multivesiculares. La captura puede ser de forma selectiva por ayuda de chaperonas
citosolicas que reconocen en las protenas secuencias seal especfica. Esta
microautofagia est muy bien caracterizada en levaduras ya que en mamferos se
desconoce.

Autofagia mediada por chaperonas

En este caso es un mecanismo realiza la captura del citosol de protenas de forma
selectiva con ayuda de las chaperonas. La forma de reconocer las protenas, que deben
ser reconocidas para la autofagia, deben presentar un pptido seal. Aproximadamente
el 30% de las protenas solubles del citosol llevan esta pptido seal, como enzimas
glucoliticas, factores de transcripcin y sus inhibidores y protenas unidas al calcio.
El mecanismo mediante el cual se realiza este tipo de autofagia es primero el
reconocimiento de la chaperona por el pptido seal. Este pptido seal es un
pentapeptido con lys-phe-glu-arg-gln conocido como KFERQ, que es reconocido por
la chaperona HSC70 que va unido a cochaperonas formando un complejo que se unen
al pptido por la secuencia de la protena. Tras ello se une a la superficie del lisosoma,
al unirse a una protena LAMP (LAMP 2A), que se polimeriza formando un complejo
de translocacion.
El complejo de translocacion para que se mantenga estable queda estabilizado por otra
chaperona, la HSP90 que es intralisosomal. Una vez formando el complejo de
translocacion se produce el despliegue de la protena para que pase a travs del
complejo LAMP. La HSP70, que est dentro del lisosoma, se asegura de que pase
correctamente la protena al interior del lisosoma, y una vez dentro se produce la
desagregacin del complejo de translocacion, consumiendo ATP y lo realiza la
HSC70.
En la membrana de los lisosomas hay un dominio lipdico RAFT donde van los
monmeros de la protena que produce la interiorizacin de la protena (HSC70)
degradada donde son separados de la membrana por la catepsina A para ser
degradados.

94

Microautofagia por los endosomas tardos

Dentro del compartimiento endosomal se hace un proceso similar a autofagia y se
produce en la biognesis de los cuerpos multivesiculares, pudiendo verse que se
produce una incorporacin de protenas solubles en las vesculas de los endosomas
tardos.
El sistema de microautofagia de los endosomas tardos comprende la maquinaria
molecular que es comn a la via endocitica y autofagia, por lo que es un proceso
mediado por chaperonas debido a la accin de la HSC70 y a la accin del complejo
ESCRT del I al III que es necesario para la formacin de la vescula donde se
incorpora la protena.
A estas conclusiones se llega por una serie de experimentos. Primero se vio si se
producan distintos tipos de autofagia en lisosomas y endosomas tardos, para ello
marcaron protenas con isotopos radioactivos siguiendo como se transportan.
Inhibieron la protelisis en ambos orgnulos. Se observa que los lisosomas en clulas
que no tenia inhibida la via de la autofagia mediada por chaperonas, se produca
protelisis elevada y adems, cuando se hace el estudio sobre la poblacin de
lisosomas por separado se comportaba como las clulas que tenan inhibida la captura
mediada por chaperonas. En los lisosomas la captura se hace a travs de
microautofagia mediada por chaperonas y en el endosoma tardo hay tambien mucha
captura y protelisis.
Se vio que en los endosomas tardos hay degradacin cuando la protena esta ya dentro
del orgnulo. Se bloqueo la macroautofagia mediante el bloqueo de sus protenas
relacionadas viendo que en las clulas no se formaban las dobles membranas que
caracterizan a los fagosomas, vindose que no afectaba a la habilidad del endosoma
tardo para interiorizar y degradar protenas marcadas en los MVBs, por lo que se
determino que se produca por microautofagia. La entrada de protenas al endosoma
tardo se desconoca si era dependiente de la protena LAMP por lo que para ver como
ocurra se inhiba su accin y se vio que se reduca el cuerpo multivesicular,
disminuyendo la degradacin de protenas en los lisosomas y no afecta a los tardos.
En cuanto a la incorporacin de las protenas en el cuerpo multivesicular, se vio que al
eliminar la VPS4-ATPasa se impide que se pueda disociar el complejo ESCRT por lo
que no se secretan pequeas vesculas, por lo que afecta a la protelisis de protenas,
no afectando a lisosomas pero si afecta al cuerpo multivesicular que descendi su
cantidad por celula.
En cuanto a la demostracin de la presencia de HSC70 en endosomas tardos se
utilizaron dos tipos de protenas, las protenas que tuvieran la pptida seal y las que
no lo tuvieran.
Se usaron como protenas que si tenan el pptido, la GAPGH, que se comprob que a
nivel de membrana con tcnicas inmunocitoquimicas con oro se comprob que estaba
la protena en el interior de cuerpos vesiculares, realizndose un estudio de
tomografa. Con esto se vio que para que la protena pueda entrar a travs de la
membrana con esta seal requiere de la chaperona. Para comprobar con exactitud se
incubo las clulas con el anti-HSC70 quedando bloqueada la chaperona, de modo que
se inhibi la eficiencia de la translocacion y degradacin de protenas con la seal en
el endosoma tardo.
Lo que ocurre es que se puede producir una incorporacin de protenas que tienen el
pptido seal con el uso de chaperonas o sin la necesidad de que la protena sea
reconducida por la chaperona. Debido a que no existe la LAMP debe existir algn
95

translocon para introducir la protena, por lo que para determinar la existencia se usa
la protena DHFR que es una protena que cuando se une el sistema dentro de los
endosomas, la protena contiene el pptido seal y se estabiliza su estructura para que
la chaperona la pueda desplegar y se usa el MTX.
Cuando se mide la incorporacin de la protena, cuando no lleva MTX pasaba a travs
del complejo de la LAMP pero cuando se usa el MTX no se puede introducir en el
lisosoma. Pero cuando se hizo el experimento con endosomas se vio que puede entrar
con MTX y sin MTX ya que en endosomas tardos las protenas entran sin la presencia
de LAMP.

96

TEMA 8. CICLO CELULAR

Las clulas pueden tener distintos destinos como:
- Proliferacin: Las clulas entran en proceso de proliferacin, es decir,
produccin de clulas nuevas por divisin. Es un proceso que es mayoritario
cuando se produce el desarrollo embrionario, pero tambien cuando el individuo
ya est formado, para que las clulas se puedan reponer debido a perdidas por
lesiones por ejemplo.
- Crecimiento: Otra de las actividades vitales de la celula es el crecimiento, que
puede producirse cuando viene de haberse realizado una duplicacin del
contenido para dividirse para que as las clulas que generen tengan el
contenido adecuado. Las clulas presentan coordinados dos sistemas en la
divisin, debe coordinar la sntesis de materiales e inhibir los procesos de
degradacin.
- Diferenciacin: provocando el aumento de complejidad y diversidad de la
celula, haciendo la celula una especializacin de su funcin en el tejido. Cuando
se especializa la proliferacin de la celula disminuye. Otra actividad es el
envejecimiento.
- Envejecimiento: Con el paso del tiempo se van acumulando materiales y
alteraciones de material gentico de la celula provocando su muerte programada
(apoptosis) que es la ltima actividad de la celula.

1. PROLIFERACIN
Es la multiplicacin celular por divisin de clulas preexistentes para producir una
poblacin celular. Es necesaria para la reproduccin y desarrollo del organismo, as
como remplazar las clulas perdidas por envejecimiento, mal funcionamiento o
celular. La proliferacin ocurre mediante un conjunto de procesos temporalmente
ordenados (ciclo celular).
La celula antes de dividirse debe retirar todos sus orgnulos y macromolculas. Dentro
de este fenmeno de duplicar los orgnulos y material se produce la copia de toda la
informacin gentica para repartirlo (replicacin), despus se produce una separacin
y distribucin del material de forma cuantitativa y cualitativamente de forma correcta
(divisin celular). Para que todo esto funcione bien hace falta una regulacin.
El proceso por el cual las clulas duplican su contenido se conoce como biognesis,
por el que se divide por mitosis. Ambos procesos deben regularse y coordinarse.

2. CICLO CELULAR
El ciclo celular presenta dos periodos
- Interfase: Periodo ms largo del ciclo celular, de hasta el 95% y dinmico. En
este periodo se duplica el ADN de forma exacta por replicacin y se incrementa
la masa celular por crecimiento. Esto est dividido en tres fases, la G1 que es la
de crecimiento, la S y la G2.
o Fase G1: Se produce el crecimiento, duplicacin del tamao,
orgnulos, enzimas, etc.
o Fase S: Se produce la duplicacin del ADN y protenas asociadas,
formndose nuevos nucleosomas
o Fase G2: Se produce el crecimiento y los cromosomas son sometidos a
condensacin. Se produce adems la formacin del huso.
- Fase de divisin: Consta de la fase M que es la fase de divisin y que se
produce por mitosis en clulas somticas y por meiosis en gametos. Se produce
primero la divisin nuclear que es la cariocinesis y despus del citoplasma.
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Control del ciclo celular

El ciclo es una sucesin de eventos temporalmente ordenada. Una fase no comienza
hasta que no se ha verificado que la fase anterior ha terminado satisfactoriamente. El
ciclo se debe asegurar que los cromosomas no estn incompletos o daados para que
no sean replicados y transmitidos a las clulas hijas. Tambien se debe asegurar de que
el genoma se replica una vez por ciclo celular y que las condiciones ambientales
extracelulares e intracelular sean adecuadas.
Todos estos procesos han de ser verificados y definen los puntos de control. Los
puntos de control estn regulados y estn regulados por genes:
- Regulacin positiva: Son los protocongoenes que codifican protenas como las
quinasas y ciclinas dependiente. Estos van a facilitar el ciclo celular.
- Regulacin negativa: Son genes supresores tumorales. Estos hacen que si se
detecta un problema en algunas de las verificaciones hacen que no se produzca
la progresin del ciclo.
Si no se superan los puntos de control la celula entra en stand-by que es la senescencia
o directamente muere (apoptosis).

Puntos de control
En cuanto a los puntos de control basndonos en las premisas anteriores, la celula a lo
largo del ciclo, en distintos momentos se pregunta as misma. En interfase comprueba
si hace suficiente factores de crecimiento en el medio, que a nivel tanto intracelular
como extracelular si hay suficientes nutrientes y si el tamao de la celula es adecuado
as como si el material gentico ha sido daado de alguna manera. Si detecta alguna de
estas cosas se para, de manera que tenemos el primer punto de control que es el punto
G1/S (no se debe replicar un ADN daado). El siguiente punto de control est en la
fase S donde la celula comprueba que el ADN daado no sea replicado para ello antes
debe repararlo.
Otro punto de control se da cuando estamos en la fase G2/M que la celula sigue
viendo si el tamao celular es el adecuado, si existe aun dao en el ADN y si la
replicacin del ADN no se ha completado.
Por ltimo est el punto de control M, que en este caso, la celula se asegura si la
mitosis o meiosis se ha producido de forma correcta, es decir, si se forma bien el huso
mittico, si los cromosomas se unen de forma correcta o si la alineacin es incorrecta.

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Regulacin del ciclo celular

La regulacin de los puntos de control del ciclo estn realizadas por diversas protenas
que actan como interruptores
bioqumicos para encender o apagar el
ciclo.
La clula para su funcionamiento
reacciona frente a seales. Estas seales
pueden ser estimuladoras o inhibidoras y
dependen de la expresin de genes que
acten sobre factores de transcripcin.
1. Estimuladoras: Si son estimuladores
las molculas van hasta el receptor de
membrana pasando a la clula
produciendo la activacin de factores de
transcripcin haciendo que aumente la
accin del ciclo celular.
2. Inhibidoras: En el caso de los factores
inhibidores ocurre el proceso inverso,
generan protenas que bloquean el ciclo
celular.

Las seales tambien pueden ser externas o internas.

1. Seales externas: Suelen ser factores de crecimiento, nutrientes o las condiciones
ambientales.
2. Seales internas: Se produce por la accin de protenas quinasas que son activadas
cclicamente en momentos del ciclo celular. El aumento de actividad quinasa era
dependiente de ciclinas (durante la interfase desciende la cantidad de ciclina y
conforme avanza la interfase aumenta la cantidad de ciclinas produciendo el
aumento de protenas quinasas).

Seales intracelulares
El complejo quinasa-ciclina (Cdk) est formado por dos subunidades, la que presenta
actividad quinasa que consolida protenas diana y por otro lado la subunidad
reguladora que es la ciclina.
Estos complejos para poder funcionar lo hacen en base a que la quinasa este
fosforilada. Para que se pueda unir la quinasa y ciclina se debe producir fosforilacion
en el tirosina 161, que es activadora, o en la posicin de tirosina 15, es inactivadora.
Para regular la concentracin de los complejos, se produce por degradacin por
protelisis controlada uniendo la ciclina a ubiquitina degradndose por proteosomas.
Otro tipo de control se hace por regulacin transcripcional inhibiendo o activando las
ciclinas.
El complejo quinasa/ciclina por la regulacin transcripcional se forman las ciclinas y
las quinasas dando el complejo, a donde se puede unir una molcula activadora o
inhibidora produciendo su actividad.
La regulacin de este complejo en el ciclo celular se produce del siguiente modo:
1. Para entrar en la fase S: El complejo ciclina/quinasa es necesario para entrar en
la fase S. Las ciclinas G1 son las que actan junto con las Cdk 4 o Cdk 6. Su
actuacin depende de condiciones ambientales, es decir, que haya suficiente
factores de crecimiento. Este complejo acta sobre la protena Rb producindose la
expresin de genes que permiten la entrada en la fase S.
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2. Para la replicacin del ADN: En este caso la ciclina E aparece combinada con la
Cdk 2 y es imprescindible para el inicio de replicacin de ADN. Adems actan las
ciclinas A con la Cdk 2, que permite la duplicacin del ADN ya que facilita la
fosforilacion de la ciclina quinasa.
3. Para entrar en mitosis: En esta parte interviene la ciclina B junto con las Cdk 1.
A este complejo se le denomina factor promotor de mitosis. Controla el paso de G2
a M.

3. FASE G1
La fase G1 est controlada por aquellos factores ambientales, como los de
crecimiento, que controla la progresin del ciclo.
Los factores de crecimiento desencadenan la activacin del factor de transcripcin
E2F que activan la sntesis de ciclinas de las fases G1/S y S. El factor de crecimiento
est bloqueado por la protena Rb (procede de un gen supresor de tumores que si se
encuentra mutado su inactivacin conduce al desarrollo de tumores). Cuando el factor
esta unido a la protena no acta, pero al fosforilar las quinasas se libera el factor que
se traduce a ARNm y sintetiza las enzimas y protenas necesarias para la fase S.
Es un sistema que se retroalimenta. Las condiciones que impiden que el ciclo se
produzca son mediante las condiciones ambientales adversas.

4. REGULACIN NEGATIVA DEL CICLO: GENES

SUPRESORES
Si en el ncleo aparece una alteracin del ADN los genes supresores inducen la
sntesis de protenas que impiden que el ciclo progrese o altera la supervivencia de la
celula.
Los genes codifican protenas que previenen mutaciones de genes reguladores de
ciclo, que inactivan las quinasas por fosforilacion en el punto de inactivacin. A travs
de la sntesis de protenas inhibidoras como las CKI tambien actan, por accin del Rb
por el p53 y por las protenas proapoptoticas (favorecen la muerte celular
programada).
100

La prdida de la actividad de los genes supresores para hacer la sntesis de todas estas
protenas supone una mutacin tan grave que desencadena una neoplasia.
Las protenas inhibidoras que se unen a los complejos ciclinas quinasas. Hay de dos
familias, las Cip/kip y las lnk4. Cada una de estas familias presenta un complejo
ciclina quinasa y afecta a una fase del ciclo celular.

5. GEN RB: CROMOSOMA 13 HUMANO

El gen Rb esta en el cromosoma 13 humano y codifica una fosfoprotena (la protena
Rb) que inactiva al factor de transcripcin E2F. Si se fosforila esta Rb se libera E2f.
La Cdk4, 6/clnD es la que fosforila Rb.
La protena Rb unida al factor de transcripcin reprime la actuacin para la traduccin
a ARNm y la aparicin de protenas imprescindibles para la replicacin. Cuando la
ciclina D es unida a quinasa 4, la protena queda libre, actuando el E2F como factor de
transcripcin formando toda la protena necesaria para la transcripcin.
Los inhibidores inhiben la fosforilacion, por lo que se inactiva el complejo ciclina
quinasa por lo que el ciclo celular no progresa y se detiene en el punto G1
reprimindose la transcripcin de genes.

6. PUNTOS DE CONTROL
La celula se debe asegurar de que su genoma ser transmitido a sus hijas de forma
correcta. Si la celula no es capaz de superar los puntos de control puede provocar la
senescencia o la apoptosis. Una de las decisiones drsticas que el sistema de control
puede adoptar es que la celula se retire completamente del ciclo y se interrumpa la
divisin celular indefinidamente. A esta decisin es lo que se conoce como
senescencia.

Senescencia celular
La senescencia celular es un programa que la celula activa en respuesta a diferentes
situaciones de estrs, y cuyo objetivo es prevenir la proliferacin celular, deteniendo el
ciclo celular en la fase G1, ingresando indefinidamente en G0. En G0, el sistema de
control del ciclo se encuentra en gran medida desmantelado, por desaparicin de
muchas Cdk y ciclinas.
Hay distintos tipos de senescencia:
- Senescencia replicativa: Por la erosin de los telomeros.
- Senescencia por ambiente desfavorable.
- Senescencia por daos en la cromatina.
- Senescencia inducida por oncogenes.
- Senescencia prematura inducida: Que puede ser:
o Por estrs oxidativo
o Por radiaciones.
En general las seales desencadenantes de la senescencia es el acortamiento de
telomeros, daos en al cromatina, estrs oxidativo, expresin de oncoproteinas
activadas, falta de nutrientes o factores de crecimiento o bien por contactos celulares
inapropiados.

Senescencia replicativa
Es un fenmeno que se da en las clulas en el momento que alcanzan el lmite
Hayflick y dejan de dividirse. Tras unas 50-60 duplicaciones poblacionales las clulas
dejan de dividirse pero no mueren. Estas clulas permanecen vivas metablicamente
alteradas y su ciclo celular se interrumpe de forma indefinida quedando detenido en la
fase G0/G1 debido al acortamiento de los telomeros. Las clulas no responden a
estmulos proliferativos y las clulas no se receptivas a estimulas apoptoticos.
101

Los telomeros son reas especializadas que previenen la degradacin del cromosoma.
El ADN de los telomeros no se transcribe y contiene secuencias TTAGGG repetidas
en tndem 100-1500 copias (3-15 kb). Hacen un bucle, formando una estructura
circular y est asociado a varias protenas (casquete) que protegen los extremos.
Durante la replicacin, en ADN lineal, desde el punto de origen de transcripcin se
realiza la transcripcin de una cadena de forma correcta y el otro de forma inversa
mediante el uso de fragmentos de Okazaki. Cuando se termina la copia, la cadena
copiada va a perder un fragmento de su cadena, que si se repite en sucesivas
divisiones, las clulas hijas van a presentar un ADN ms corto cada vez, haciendo que
cuando llegue a un tamao predeterminado la celula lo percibe como un dao en la
estructura del ADN provocando la lisis.
Se conocen tipos celulares que son inmortales como las clulas germinales, las clulas
stem cells y las tumorales. Todas expresan telomerasa, que es un transcriptasa inversa
que usando un molde de ARN es capaz de crear e insertar fragmentos telomericos.
Las clulas somticas NO expresan telomerasa. Su potencial de proliferacin va a
estar relacionada con el nmero de veces que se han dividido. Eventualmente, el
acortamiento de los cromosomas, en las sucesivas divisiones conlleva la senescencia
celular, cesando las divisiones celulares al detener el ciclo celular en G0/G1. Las
clulas tumorales sobre expresan telomerasa. Estas clulas poseen telomeros cortos y
estables que las hacen inmortales pudiendo replicarse indefinidamente.
Los telomeros son el factor limitante que determina la duracin de la vida.

P53: Cromosoma 17 humano

El p53 se expresa en el cromosoma 17 humano. Este codifica la p53 que es un
factor de transcripcin actuando sobre ADN daado. En las clulas sanas los niveles
de p53 estn en proporcin muy baja. El que haya una alta concentracin induce a
genes que detienen el ciclo celular o bien produce la muerte celular (apoptosis).
El p53 es precioso a la hora de valorar el dao que existe en el material gentico. Este
es capaz de discernir entre daos leves que sean reparables (por accin del gen Mdm2
que forma la protena Mdm2 que elimina el p53 mediante la ubiquitina. El p53, si la
situacin no se revierte, se debe fosforilar de manera que regula la sntesis de p21
provocando la detencin del ciclo celular en G1.
Si el dao es grande y no es reparable, se produce apoptosis para que el organismo no
pierda el control del ciclo. La retirada de esta celula/material gentico se produce por
inhibicin de Bcl-2 o por estimulacin de Bax.
En el caso de que el dao sea grave y no reparable la celula no puede responder ante
esto por lo que se produce neoplasia.
Las mutaciones del gen que codifica p53 conllevan la prdida de su funcin, no se
produce la paralizacin del ciclo G1 aunque el ADN haya sido daado y no hay
eliminacin de la celula del tejido por muerte celular. La herencia del ADN daado
causa inestabilidad en el genoma contribuyendo en el desarrollo de cncer en
humanos.

102

Sistema de control del ADN daado

Hay distintas situaciones que alteran el
ADN, como la radiacin ionizante/
ultravioleta.
Existen complejos que activan una
cadena de transmisin de protenas
quinasas que por accin de la quinasa 2
fosforila el p53 para retenerlo dentro del
ncleo. Cuando se detecta el error en el
ADN se bloquea la liberacin de p53 ya
que si no acta como factor de
transcripcin produciendo dos tipos de
transcripcin: Una que acta inhibiendo a
Cdk, que inhibe la Cdk-ciclina no
pudiendo fosforilar a Rb que detiene el
ciclo celular. Por otro lado se produce la
inhibicin de Bcl 2 por lo que no se
puede inhibir la apoptosis producindose.
La P53 e INK4 son dos vas que integran
la seal de estrs y la procesan mediante
el modo lineal (P53-P21-Rb) o a modo
paralelo (P16-Rb) que ambos convergen.

Senescencia celular y cncer

La senescencia se postula como un mecanismo supresor del cncer, pero es un factor
contribuyente al envejecimiento de los organismos por prdida del potencial
regenerativo, y por tanto, de la funcionalidad de los tejidos. Ante un estimulo
neoplasico las clulas pueden entrar en un proceso de envejecimiento o apoptosis para
evitar esta neoplasia.

Fenotipo de las clulas senescentes. Biomarcadores

Las clulas senescentes:
- Son visibles y metablicamente activas.
- Son ms grandes y ms granuladas y vacuoladas, con ncleo ms
heterocromatinico por tanto silencia la trascripcin de genes promotores del
crecimiento.
- Estas clulas muestran un acortamiento gradual de los telomeros.
- Se produce un incremento de la actividad -galactosidasa a pH 6 debido a que
en las clulas senescentes se produce un aumento del contenido lisosomal.
- Se produce un aumento del nivel de protenas marcadoras de la senescencia
(ATM/ATP).
- Las clulas tienen la incapacidad para proliferar en respuesta a estmulos
mitogenicos quedando detenidas irreversiblemente en la fase G0/G1.
- Estas clulas son resistentes a estmulos que inducen la muerte celular por
apoptosis.
- Estas clulas muestran cambios en el perfil de expresin gnica y en el
procesado de protenas (disminucin de protenas del choque trmico, aumento
de osteonectina, fibronectina, etc.).
- Disminuye la capacidad defensiva intracelular.
- Presencia de mutaciones en el ADN mitocondrial.
103

Las clulas senescentes son buenas ciudadanas pero malas vecinas en los tejidos. Las
teoras evolucionistas del envejecimiento proponen la existencia de un antagonismo
pleiotropico. Esto dice que la senescencia pudo haber sido seleccionada para proteger
al organismo contra la neoplasia en etapas tempranas de la vida, antes y durante la
etapa reproductiva.
Sin embargo, la acumulacin de clulas senescentes que tiene un fenotipo disfuncional
y enrarecen el micro-ambiente circundante, no solo hace que la integridad y funcin
del tejido en el que se encuentran decaiga, sino que fomentan una desregulacin
metablica en las clulas vecinas que las lleva a incrementar las posibilidades de
iniciar un proceso neoplasico.

7. APOPTOSIS
Existe un control en la proliferacin celular a lo largo de la vida. De manera que a
partir de una sola celula, el ovocito fertilizado, todos los humanos llegamos a
desarrollar 1014 clulas de 200 tipos diferenciados, para organizar tejidos y estos a su
vez rganos. En el embrin, el complejo proceso de desarrollo implica proliferacin,
diferenciacin celular, morfognesis y muerte celular. Las clulas puede morir por
sucesos traumticos impredecibles, pero la mayora de las muertes son consecuencia
de una proceso fisiolgico normal ordenado denominado muerte celular programada o
apoptosis. Las anomalas de la muerte celular est asociado con patologas como
cncer, patologas autoinmunes, trastornos neurodegenerativos.
La importancia de los mecanismos que regulan la muerte celular debe estar combinada
con la capacidad de las clulas madre de proliferar y diferenciarse para remplazar
tejidos daados.
En cada segundo unas 100.000 clulas son producidas por mitosis y otras tantas
retiradas por apoptosis. Por tanto esta apoptosis es un proceso fisiolgico de muerte
para:
1. Mantenimiento de los tejidos adultos: Aquellos tejidos que estn sometidos a
intensa renovacin (clulas sanguneas) para equilibrar su continua produccin
2. En el desarrollo embrionario eliminado clulas innecesarias: Hay tejidos larvales
durante la metamorfosis que tras terminar por apoptosis se eliminan las clulas
innecesarias. Tambien el desarrollo del sistema nervioso de mamferos, ya que se
elimina el 50% de las neuronas formadas en exceso en el desarrollo, solo
sobreviven las que establecen conexiones correctas. Adems tambien se eliminan
de nuestro sistema inmune los linfocitos T para evitar que respondan contra
nuestras propias protenas.
3. Mecanismo de defensa: Las clulas daadas y potencialmente peligrosas son
eliminadas para la supervivencia del organismo como clulas infectadas por virus
(evitando que se generen nuevos virus y se extiendan) y para lesiones en el ADN
(se eliminan las clulas portadoras de mutaciones potencialmente dainas, sobre
todo las que son cancerosas).
La apoptosis se define como un suicidio celular inducido establecido por Kerr,
Wyllie & Curie. La apoptosis afecta a clulas aisladas y adems en este proceso las
clulas sufren cambios observables. Se produce:
1) Disminucin de tamao.
2) Condensacin de cromatina.
3) Fragmentacin del ADN cromosmico: Mediante exonucleasas separando
paquetes de nucleosomas.
4) Se produce ruptura de la lmina nuclear: Se rompe por proteasas de modo que la
lmina nuclear queda desensamblada.
104

5) Fragmentacin del ncleo: Se separan fragmentos.

6) Colapso del citoesqueleto: La celula pierde la forma y adhesin con clulas
vecinas.
7) Fragmentacin de la celula
Al final se generan cuerpos apoptoticos que es material nuclear y citoplasmtico
rodeado de membrana. El resto de orgnulos celulares quedan intactos. Adems se
produce cambios en la composicin del fosfolpidos de la membrana que induce a la
fagocitosis de las clulas o fragmentos apoptoticos. Se trata por tanto de un proceso
rpido y limpio, sin liberacin al exterior de material celular.

Fases de la apoptosis
1. Induccin: Se deben expresar genes para
que se sintetizan enzimas que provoquen la
ruptura de elementos de citoesqueleto de la
lmina y del material gentico
2. Ejecucin: Se produce la prdida de
uniones celulares, reduccin del tamao,
condensacin de la cromatina y
fragmentacin de cromatina
3. Degradacin: Rotura nuclear en
fragmentos rodeados de porciones del
citoplasma y envueltos por membrana y
formacin de los cuerpos apoptoticos
4. Fagocitosis: De los cuerpos apoptoticos
por fagocitosis adyacentes. Se degradan en
los lisosomas
Las clulas que estn en apoptosis se pueden
distinguir por microscopia ptica con el uso de
H-E, la cromatina se ve condensada, el citoplasma es eosinofilo y se observa el ncleo
fragmentado (cariorrexis). Adems se produce la fragmentacin celular.
A MET se observa la celula redondeada con superficie celular irregular, masas de
cromatina hipercondensadas en la periferia y el citoplasma es granular y vesicular. Las
mitocondrias estn integras y las membranas clulas intactas, comienza un proceso,
tras la particin del material gentico, de segmentacin alrededor de las porciones de
ncleo formando los cuerpos apoptoticos.

Regulacin de la apoptosis
La apoptosis es un proceso regulado por:
1) Seales inductoras: Son seales de muerte
a. Extracelulares (protenas mensajeras): La apoptosis se desencadena como
respuesta a un estimulo del entorno. Puede ser TNF (factor de necrosis
tumoral). Es producido por las clulas T del sistema inmunitario en respuesta
a factores adversos.
b. Intracelulares (genticos). Es un estrs provocado por dao en el genoma
irreparable (a travs de radiaciones), presencia de calcio, etc. Los efectores
son las protenas de la familia Bcl2, que las hay activadores (proapoptoticas) e
inhibidoras (antiapoptoticas).
En ambos casos la respuesta esta mediada por una cascada de transduccin de
seales desde la superficie celular hasta el ncleo.

105

2) Seales efectoras: Son enzimas, como las caspasas que son proteasas que
producen una cadena de protelisis sintetizndose en forma de procaspasas y por
escisin proteoltica se forman las caspasas. Adems actan endonucleasas.

Genes reguladores
Codifican elementos para controlar el proceso.
- FIA (factor indiciador de la apoptosis): Es el activador de las caspasas.
- Familia de protenas IAP: Inhiben la actividad de las caspasas o las unen
ubiquitina para su degradacin en el proteosoma
- Apaf-1: Es el factor activador de las proteasas apoptoticas. Forma un complejo
multiproteico que se encarga de activar las caspasas
- Citocromo C: Presente en el espacio intermembranoso de la mitocondria. Activa
conjuntamente con Apaf-1 a las caspasas
- Smac/Diablo: Es el segundo activador de las caspasas y sale de mitocondrias
con el citocromo C. Inhibe a las IAP.
- Familias de las protenas Bcl-2: Estos pueden ser:
o Proapoptoticos: Son las protenas Bax y Bak que se dirigen desde el
citosol a la mitocondria y se caracterizan por permeabilizar la membrana
mitocondrial externa formando poros con protenas Bid, Bad, Puma y
Noxa, inactivando a los antiapoptoticos y activando a Bax y Bak
o Antiapoptoticos: Impiden la apertura de los canales formados por Bax y
Bak por lo que bloquean la liberacin de citocromo c mitocondrial. Estos
secuestran protenas vitales
Presentan en comn el dominio BH3 por donde contactan.

Genes efectores
Codifican protenas que desarrollan el proceso.
Los efectores son las caspasas que son protesasas que hidrolizan a sus protenas
sustrato en residuos de acido aspartico. Hay dos tipos de caspasas, las iniciadoras
(caspasa 8 9 y 10) y las efectoras (caspasas 3,6 y 7). Su funcin es la inactivar la
quinasa de adhesin focal y separa la celula de las vecinas. Adems activa la
endonucleasa responsable de la rotura del ADN. Adems rompe las lminas nucleares,
produciendo la fragmentacin del ncleo, rompe tambien las protenas del
citoesqueleto produciendo la desorganizacin, deformacin de la membrana y
fragmentacin de la celula.
Su modo de accin es primero su sntesis como precursores inactivos, despus se
activan por excision proteoltica catalizada por otras caspasas formando una estructura
de heterodimeros formando por 4 subunidades, dos subunidades pequeas y dos
grandes en el centro. Cuando se activa las caspasas provocan una cadena de protelisis
de caspasas efectoras y una vez producido el fenmeno se produce la muerte celular y
se fagocita la celula.

Via extrinseca
En esta via el factor tumoral (TNF) es un ligando de tipo FAS. La celula apoptotica en
la superficie de la membrana tiene su receptor de muerte FAS. El FAS tiene dominios
intracitoplasmaticos que son dominios de muerte que se unen a unas protenas
adapatoras, las FADD, que se une a la caspasa 8 de forma inactiva, producindose la
excision de la caspasa 8 formando el heterodimero formando
la caspasa 8 activada. Esta caspasa acta sobre la caspasa 3 produciendo la excision de
molcula formando caspasa 3 ejecutora, actuando sobre sus elementos.

106

Via intrnseca
Al ser un dao interno se activa el Bax o Bak generando un poro en la mitocondria,
saliendo el citocromo C.
En el citoplasma hay Apaf-1, que junto con la caspasa 9 y Bax o Bak forma el
apostosoma que es el complejo de iniciacin que acta sobre la caspasa 3 activndola
para producir los distintos fenmenos de apoptosis.
Adems a travs de la sntesis de protena puma inhibe la BCL2 o BCX (que inhiben
la formacin del canal de la mitocondria), por lo que Bax forma el canal, haciendo que
se libere citocromo y se produzca apoptosis. Tambien se forma Smac/diablo que hacen
que IAP se inhiba. Ambas vas pueden aparecer ligadas, ya que la caspasa 8 puede
inactivar el Bid que hace que el Bax acte de modo que se libera el citocromo C que
forma el apoptosoma y activa la caspasa 3.

Apoptosis y mitocondria
En la membrana mitocondrial externa se produce la formacin del canal de protena
Bax por donde sale el citocromo C al espacio intermembranoso. Adems actan
segundos activadores de caspasas, como FIA y Smac/diablo por inhibicin de las
IAPs. La permeabilidad de la membrana se incrementa con el calcio liberado desde el
RE.

Fagocitosis de las clulas apoptoticas y cuerpos apoptoticos

Las clulas fagocitarias son los macrfagos. Estos macrfagos reconocen las clulas
apoptoticas basndose en el reconocimiento de una seal como es la fosfatidilserina
que cambia su posicin desde la cara citosolica a la superficie externa de la membrana
plasmtica. Se produce la fagocitosis, digestin y reciclado de materiales.

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