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Lineas Celulares: concepto,

utilidad y estudios
Julia Serrano Masa

Curs o: Cultivo de Clulas Animales y Humanas : Aplicaciones en M edicina Regenerativa


Es cuela Complutens e de Verano
M artes 9 de julio 2013

Cultivos celulares
Conjunto de tcnicas que permiten el
mantenimiento de las clulas in vitro,
conservando al mximo sus propiedades
fisiolgicas, bioqumicas, genticas y
metablicas de una manera semejante a
las que tenan en el rgano que las
origino

They are culture cells

Caractersticas (I)


Las clulas fuera del organismo no estn


reguladas por el sistema nervioso ni
endocrino,
comportndose totalmente
independientes

Caractersticas (II)


En condiciones nutritivas y ambientales


adecuadas se convierten en unidades
autnomas ideales para el es tudio de la
estru ctura y comportamiento de las
clulas vivientes

Caractersticas (III)
 El cultivo de clulas y rganos aislados del
organismo constituye una va para resolver
problemas biolgicos:
-- ciclo celular
-- control del crecimiento celular
-- modulacin de expresin gnica
-- generacin de animales transgnicos
-- ensayos citotoxicidad

Condiciones del cultivo (I)


 Naturaleza del sustrato
Las clulas van a proliferar y parte de su comportamiento
depende del sustrato en el que vayan a crecer

Condiciones del cultivo (II)


 Naturaleza y composicin de la fase gaseosa
La supervivencia de las clulas depende de la presencia
de oxgeno y dixido de carbono disuelto en el medio de
cultivo

Condiciones del cultivo (III)


 Condiciones fsico-qumicas y fisiolgicas
-- Temperatura
-- pH
-- Osmolaridad
-- Viscosidad
-- Tensin superficial

Condiciones del cultivo (III)


 Condiciones fsico-qumicas y fisiolgicas
-- Sales inorgnicas (mantener medio isotnico)
-- Glucosa (fuente de energa)
-- Aminocidos (balance nitrgeno, precursores de la
sntesis de protenas)
-- Vitaminas (cofactores)
-- Agua (deionizada, destilada y esterilizada)

Condiciones del cultivo (III)


 Condiciones fsico-qumicas y fisiolgicas
-- Suero (biosntesis celular, promueve el crecimiento,
estimula la sntesis de ADN, ARN y protenas, y facilita la
adhesin al sustrato por medio de las globulinas)
-- Antibiticos/antifungicos (evita el desarrollo de
contaminantes microbianos en el cultivo)
Medios de cultivo ms empleados: DMEM, RPMI, M119 etc
Siempre elegir elms adecuado para el crecimiento de nuestra lnea
celular

Condiciones del cultivo (IV)


 Estrictas condiciones de asepsia
-- Uso de laboratorios adecuados
-- Control de esterilidad
-- Esterilizacin de medios de cultivo, reactivos y
soluciones

Evolucin (I)
 F. D. Von Recklinhausen (1.866) mantuvo vivas clulas
sanguneas de anfibios durante 35 das
 Wilhelm Roux (1.885) realiz cultivos de clulas de
embrin de pollo en solucin salina
 Ross Harrison (1.907) cultiv tejido nervioso de rana y
obtuvo crecimiento y diferenciacin de los axones
 Burrows (1.910) emple plasma de pollo para nutrir los
explantes de tejidos embrionarios de pollo

Evolucin (II)


Alexis Carrell (1.912) demostr que la vida del cultivo se


puede prolongar mediante subcultivos aplicando tcnicas
aspticas

Eagle (1.955) desarroll medios de cultivo

Hayflick y Moorhead (1.961) implementaron el uso de


antibiticos

Moscona (1.952) utiliz tcnicas de tripsinizacin para


disociar clulas

Clulas Hela: 1 lnea celular

12 Lugar Autor: Thomas Deerinck, EE.UU. Espcimen: clulas HeLa (cncer) (300X)
Cortesa de Nikon Small World

Clulas Hela:
desde 1954

VENTAJAS (I)


Control de factores fisicoqumicos y fisiolgicos del


medio en el que se cultivan las clulas

Las clulas en cultivo asumen una constitucin


homognea, evitando el problema inherente a la
heterogeneidad de las muestras asociado al uso de
animales de experimentacin

Economa en ensayos de reactivos o drogas a estudiar

Disponer de gran nmero de clulas idnticas que se


multiplican simultneamente durante varios o infinitos
ciclos celulares

VENTAJAS (II)


Pueden expresar cambios fenotpicos y/o genotpicos al


tratarlos con distintos txicos, fr macos, drogas, factores
de crecimiento

Modifican sus procesos de sntesis y secrecin por


alteraciones enzimticas, proteicas, etc

Se pueden analizar usando diferentes tcnicas para


estudios morfolgicos, bioqumicos, electrofisolgicos
etc

VENTAJAS (III)


Herramienta muy til para analizar diferentes aspectos o


modificaciones celulares a nivel biolgico, gentico,
oncolgico, medicina regenerativa, biotecnologa

Su utilizacin masiva est permitiendo la aparicin de


nuevas lneas celulares transformadas altamente
especficas

Motivaciones ticas: reduce el nmero de animales


empleados en cualquier experimentacin

DESVENTAJAS (I)


La multiplicacin indefinida y permanente de las clulas


de las lneas celulares transformadas puede generar
alteraciones genotpicas y/o fenotpicas

Es indispensable caracterizar la lnea celular y definir las


condiciones prioritarias que debe tener el clon para
construir una lnea

Los procesos esenciales de caracterizacin de cualquier


tipo de lnea celular deben mantenerse invariables
mientras se utilicen las clulas en cualquier estudio in
vitro
Altos costes para conseguir una pequea cantidad de
clulas

DESVENTAJAS (II)


El uso de lneas celulares no excluye el uso de animales


de experimentacin para comparar y contrastar los
resultados obtenidos in vitro

Tcnica muy sensible: necesario trabajar en estrictas


condiciones de asepsia

P erdida irreversible de las propiedades funcionales de


las clulas

Difcil relacionar las clulas cultivadas con las clulas


funcionales del tejido original

Validez del modelo in vitro

Tipos de Cultivos Celulares


Cultivos Primarios

Lnea celular

Cultivos Primarios
Cultivo de clulas, tejidos u rganos tomados
directamente del organismo y puestos a
crecer en un medio artificial

Imagenes representativas del cultivo primario de neuronas del hipocampo


obtenidas por contraste de interferencia diferencial. A) 24 horas. B) 72 horas. C) 15
dias. D) 21 dias. Escala = 30 m. (Giselle Correa and Marines Longart)

Lnea Celular
Cultivo celular que tiene alta capacidad de
multiplicarse in vitro, establecido a partir
del primer subcultivo de un cultivo
primario y que tiene las mismas
caractersticas que el tejido de origen

Lnea Celular
Una lnea celular es un conjunto de clulas
todas idnticas que provienen de la
multiplicacin in vitro de un clon

Un clon es una clula obtenida de un cultivo


primario,
con
propiedades
metablicas,
inmunolgicas y morfolgicas especficas y def inidas
La seleccin del clon, as como todos los procesos
necesarios para determinar las propiedades
especficas que van a dar lugar a la lnea celular, se
denomina clonaje

Caractersticas celulares a
tener en cuenta (I)


En condiciones normales, las clulas somticas son


diploides (2n)

Las clulas haploides poseen una representacin de


cada cromosoma

Las clulas hibridas se f orman por la fusin celular


de dos clulas distintas

la
 Todas las clulas animales en fase lag son esf ricas
perdiendo sus morfologa de in vivo

Caractersticas celulares a
tener en cuenta (II)


Si clulas se reproducen indefinidamente in vitro


tienden a reducir u omitir f ases del ciclo celular:
inestabilidad genotpica (alteraciones cromosmicas)
y f enotipica

Cmo se adapta la clula a las condiciones in


vitro?: depende de la dif erenciacin celular
 -- dif erenciacin reversible
 -- dif erenciacin irreversible

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Caractersticas celulares a
tener en cuenta (III)


Dif erenciacin irreversible:


-- protocolos ms sencillos y menos costosos
-- mayor produccin celular
--transforma
las clulas perdiendo
caractersticas del implante
-- transf ormacin espontanea
-- transf ormacin dirigida

las

la

Caractersticas de un clon
(I)
Un clon es una clula obtenida de un cultivo
primario,
con
propiedades
metablicas,
inmunolgicas y morfolgicas especficas y def inidas
Caractersticas del clon con el que se inicia la lnea
celular deben def inirse y preservarse tras
multiplicaciones finitas o infinitas de las clulas

Caractersticas de un clon
(II)


Variaciones genotpicas y f enotpicas mnimas

Seleccionar y estandarizar las condiciones ptimas


del cultivo
-- sustrato adecuado
--medio de cultivo, suplementos, f actores de
mitognicos
-- condiciones fisico-qumicas (ph, temperatura,
viscosidad, osmolaridad, tensin superficial)

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Caractersticas de un clon
(III)


Preservar las clulas para construir un stock y


mantenerlo
-- el clon debe multiplicarse masivamente
--almacenar cortos periodos de tiempo (10-20 d)
--almacenar largos periodos de tiempo (aos)

No variacin en condiciones y requerimientos del


cultivo antes y despus de almacenarlos

Tipos de lneas celulares


Segn el tipo de diferenciacin que prevalezca
en el clon
Lnea celular finita
Lnea celular infinita o continua

Tipos de lneas celulares


Lnea celular finita
-- constituidas por clulas no transformadas
-- aquella que tiene un nmero limitado de posibles
subcultivos (alrededor de 50)

Lnea celular infinita o continua


--aquella que tiene posibilidad de ser subcultivada
in vitro por lo menos 70 veces (70 subcultivos).
Indefinidamente
-- constituidas por clulas transformadas

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Tipos de lneas celulares


Lnea celular finita

Lnea celular infinita

Tipos de lneas celulares


infinitas
Segn el tipo de transformacin se dividen en:
Lneas infinitas transformadas espontneamente:
-- lneas no tumorales
-- lneas tumorales

Lneas infinitas transformadas dirigidas:


-- lneas hbridas
-- lneas tumorales

Tipos de lneas celulares


infinitas
Lneas infinitas transformadas espontneamente:
Lneas no tumorales

Lneas tumorales

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Caracterizacin de una
Lnea Celular (I)


Permite conocer las caractersticas especficas que la


def inen y dif erencian de cualquier otra lnea celular

Debe realizarse a cualquier tipo de lnea celular

Caracterizacin de una
Lnea Celular (II)


Permite conocer las caractersticas especficas que la


def inen y dif erencian de cualquier otra lnea celular

Debe realizarse a cualquier tipo de lnea celular

Debe realizarse con asiduidad para tener un control


exhaustivo de las clulas en condiciones in vitro

Lneas celulares inf initas transformadas con mayor


posibilidad de alteraciones f enotpicas y genotpicas
en proceso continuo de multiplicacin celular in
vitro

Que caractersticas debe


mantener una Lnea Celular (I)?


Ausencia de contaminacin en el cultivo

Confirmar el origen de las clulas


determinando la especie y el sexo del animal

Procedencia de las clulas de la lnea celular

Conservacin de las lnea celular a corto o


largo plazo

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Que caractersticas debe


mantener una Lnea Celular (II)?


Correlacin de la lnea celular con el tejido


de origen para:
-- identif icar el linaje al que la clula pertenece
-- determinar la posicin de las clulas dentro de
ese linaje
-- si son clulas transformadas o no

Que caractersticas debe


mantener una Lnea Celular (III)?


Confirmar las fases que forman la curva de


crecimiento

Curva de Crecimiento


Fase de latencia (lag): fijacin al sustrato e


inicio del ciclo celular

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Curva de Crecimiento


Fase de crecimiento exponencial (log): el nmero


de clulas se duplica aproximadamente cada 24
horas

Curva de Crecimiento


Fase de conf luencia, meseta o crecimiento


estacionario: las clulas del cultivo, que se ha
saturado, dejan de dividirse (monocapa:
inhibicin por contacto; suspensin: consumo del
medio)

Curva de Crecimiento


Fase de muerte: si el cultivo se prolonga


demasiado tiempo, las clulas entran en f ase de
senescencia que termina con la muerte de las
clulas en cultivo

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Curva de Crecimiento

Que caractersticas debe


mantener una Lnea Celular (IV)?


Confirmar las fases que forman la curva de


crecimiento


Lneas f initas:
-- fase lag , f ase log y
f ase meseta
-- f ase log (>50 ciclos
celulares)
-- las clulas maduran y
se dif erencian en f ase
meseta

Que caractersticas debe


mantener una Lnea Celular (V)?


Confirmar las fases que forman la curva de


crecimiento


Lneas inf initas:


-- fase lag , f ase log y
f ase meseta
-- fase log continua (
ciclos celulares)
-- ausencia de f ase
meseta
si
hubiera
propagacin infinita

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Mantenimiento de una Lnea


Celular (I)


Subcultivo

Confluencia

Tiempo de duplicacin

Criogenizacin

Mantenimiento de una Lnea


Celular (II)


Objetivos
-- propagacin de la lnea celular
-produccin
de
clulas
experimentacin

para

la

Usualmente se realizan al llegar a confluencia


Evitar que el medio de cultivo este agotado

Mantenimiento de una Lnea


Celular (II)


Protocolo de un subcultivo: depende de las


caracters ticas de la lnea celular con la que se
este trabajando
-- clulas en suspensin
-- clulas adheridas al sustrato

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Mantenimiento de una Lnea


Celular (IV)

Mantenimiento de una Lnea


Celular (VI)


Criopreservacin
-- congelacin lenta (1-3C/min)
-- descongelacin rpida (bao a 37C)
Importante el uso de crioprotectores: DMSO,
glicerol en suero f etal
Clulas en f ase logartmica de crecimiento
Viabilidad superior a 80%
Congelar nmero de clulas 4 x 10 6

Bancos de Lneas Celulares (I)




Seleccin del clon y la caracteri zacin de la


lnea celular procesos complejos y costosos

Imposible mantener
indefinidamente

una

lnea

celular

Imposibilidad de mantener todas las lneas


celulares en un laboratorio
 Homogenizacin en la caracterizacin y uso
de las lneas celulares


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Bancos de Lneas Celulares (II)




Bancos
de
lneas
representacin:

celulares

con

mayor

-- ICC Interlab Cell Line Collection


-- ECACC European Collection of Animal Cell Cultures
-- DSMZ-The German Collection of Cell Cultures
-- The National Laboratory for the Genetics of Israeli
Populations
-- CABRI Common Access to Biological Resources
-- ATCC American Type Culture Collection
-- The University of Michigan Breast Cell Line/Tissue Bank
and DataBase

Aplicaciones (I)


El uso de las lneas celulares se ha


diversificado en diferentes ramas de la
Ciencia:
Biologa
Ingeniera Gentica

Medicina

Neurobiologa
Farmacologa
Ecotoxicologa

Inmunologa

Toxicologa

Oncologa Experimental y Diagnostica


etc

Aplicaciones (II)


Actividad intracelular relacionada con: ADN,


replicacin, transcripcin, sntesis proteica, ciclo
celular, apoptosis

Estudios bioqumicos, metablicos, de biologa


molecular

Estudios genticos: citogentica, gentica molecular

G enes y oncogenes. Limitar el ciclo celular. Modificar


protenas de membrana

Clulas tumorales: alteraciones del citoplasma. La


capacidad de invasin

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Aplicaciones (III)


Flujo
intracelular:
hormonas,
f luctuaciones metablicas

receptores,

Interacciones celulares: induccin embrionaria,


contacto/inhibicin
celular,
limitacin
del
crecimiento

Ecotoxicologa: analizar el ef ecto de drogas,


f ertilizantes, nitratos, f osf atos, contaminantes
ambientales

Farmacologa: analizar el efecto de drogas y f rmacos


miscibles con el medio de cultivo

Estudios (I)


High sensitivity to carcinogens in the brain of a


mouse model of Alzheimers disease
(Oncogene 2010; 29 (2165-71)

Generacin de una lnea celular doble transgnica


para APP PS1

Implantacin carcingeno en ratn doble


transgnico APP-PS1

Pellet
location

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Clulas tumorales
So x 9
GFAP

GFAP

Vim

Clulas tumorales
GFAP

So x 9

GFAP

Vim

Lnea Celular Infinita


Vimentin

Vimentin+DAPI

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Lnea Celular Infinita


Sox9

Sox9+DAPI

Lnea Celular

Una lnea celular es un conjunto de clulas


todas idnticas que provienen de la
multiplicacin in vitro de un clon

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