INMOVILIZACIN DE ALCALASE EN SOPORTES ACTIVADOS CON GRUPOS

EPOXI Y en soportes de glioxil-AGAROSA PARA SU USO EN LA HIDRLISIS

DE PROTENAS DE SUERO DE LECHE
Felipe Cisternas, Franz Aravena, Pedro Valencia
Departamento de Ingeniera Civil Qumica, Universidad Tcnica Federico Santa Mara
Valparaso, Chile
Resumen
El suero de leche es un subproducto de la industria lctea que durante mucho tiempo ha sido
considerado un residuo sin atractivo comercial. Hoy en da, en base a estudios, se sabe que la
hidrlisis en protenas de suero de leche mejoran sus propiedades funcionales y
organolpticas. La implementacin de enzimas para hidrlisis ha demostrado tener varias
ventajas sobre otros mtodos sin embargo poseen un elevado costo y difcil recuperacin.
Avances en la biotecnologa han evidenciado que el uso de soportes para inmovilizar
enzimas mejora sustentablemente la estabilidad y el rendimiento de los biocatalizadores. Este
estudio tiene la finalidad de evaluar la estabilidad y el rendimiento de Alcalasa inmovilizada
en soportes activados con grupos epoxi y en soportes de Glioxil-Agarosa sobre las protenas
del suero de la leche. Mejores resultados fueron obtenidos sobre el soporte de agarosa con
493,8 [UI/g soporte] de actividad y con mayor estabilidad en comparacin al soporte epoxi
con 99,9 [UI/g soporte] de actividad.
Palabras claves: Alcalasa, estabilidad, suero de leche, inmovilizacin de enzimas, soporte de
glioxil-agarosa, soportes activados con grupos epoxi.

1. Introduccin
Durante mucho tiempo el suero de leche
ha sido considerado como un residuo en la
industria lctea. Sin embargo su elevada
DBO (3500 mg/L), en conjunto con las
nuevas normativas medioambientales que
cada vez son ms rigurosas respecto a la
eliminacin de desechos, han gatillado la
bsqueda de nuevas alternativas de
tratamientos de este subproducto [1]. La
hidrlisis parcial de las protenas del suero
de leche pueden evidenciar o cambiar las
propiedades funcionales de los pptidos en
este residuo industrial, aumentando as sus
aplicaciones.
Los procesos catalizados por enzimas en
la industria son cada da ms numerosos,
ya que presentan una serie de ventajas
frente a los catalizadores convencionales
no biolgicos. A pesar de esto, el empleo
de enzimas no se ha generalizado en los
procesos qumicos industriales debido a
que la mayora de las enzimas no son
estables en las variadas condiciones de

trabajo. Por otra parte al ser solubles en

agua, su separacin de los sustratos y
productos es difcil, y por lo tanto, no se
pueden reutilizar con facilidad.
Con la inmovilizacin de enzimas se
han podido superar estos ltimos
inconvenientes, permitiendo tener acceso a
procesos biotecnolgicos econmicamente
ms rentables, ya que permiten la
reutilizacin del catalizador biolgico,
presentan una mayor estabilidad de la
enzima y brindan la posibilidad de disear
reactores enzimticos de fcil manejo y
control.
Es por esto, que la presente
investigacin plantea conseguir un
aumento de la estabilidad y rendimiento de
la enzima Alcalase mediante la tcnica
de inmovilizacin, a travs de enlaces
covalente multipuntual para generar un
biocatalizador con una mayor capacidad
operacional
y
mayor
resistencia
acondiciones
de
temperatura
no
operacionales.

Para este fin se realizarn dos

inmovilizaciones de enzima Alcalase,
una en soporte de Glioxil-Agarosa y otra
en grupos Epoxi. En donde a cada soporte
se le realizar una caracterizacin a travs
de ensayos de grado de hidrlisis y
actividad enzimtica para medir la
estabilidad operacional y no operacional
respectivamente. Estos ensayos se harn
haciendo uso de la tcnica pHestato, donde
ser posible observar y cuantificar el
progreso de cada reaccin en el tiempo.
2. Materiales y mtodos
A. Materiales
La enzima que se inmoviliz en ambos
soportes fue Alcalase 2,4 L, Proteasa de
Bacillus licheniformis de Blumos SA. Los
soportes utilizados corresponden a un
soporte de resina Epoxy Sepabeads ECEP (Resindion SRL, Miln Italia) tamao
M. Para el soporte con agarosa se us 6%
BCL Agarose Beads tamao estandart (50150 ). La preparacin del sustrato se
realiz con WPI (Whey Protein Isolate)
proveniente
de
Davisco
Foods
International, Minnesota, USA, el cual
contiene un 85,7% de masa seca, un 70,6%
de protena, un 11,3% de nitrgeno y 8,06
[mmol] de enlaces peptdicos por g de
protena.

temperatura de 40 [C] por un periodo de 5

[min] para los ensayos de enzima libre,
sobrenadante y estabilidad no operacional.
Los ensayos de actividad de enzima libre
se realizaron con solucin de enzima
Alcalase y agua destilada en relacin
1:10. Se hicieron cuatro ensayos con 0,2,
0,15; 0,1 y 0,125 [mL] de solucin de
enzima respectivamente. Se us solucin al
1% (p/p de protena) de suero de leche
como sustrato, del cual se agregaron 40 [g]
al recipiente de reaccin. Este recipiente se
puso en un bao termostatizado Julabo ED
y se llev a la temperatura y pH de
reaccin. Una vez homogeneizado la
solucin de protena, se agreg la solucin
enzimtica y se control el pH de la
reaccin mediante solucin NaOH 1,003
N. El producto generado se calcul como
se muestra a continuacin.

En donde V es el volumen de NaOH

agregado por el equipo en [mL] y N es su
normalidad y es el volumen de solucin
de sustrato agregada al en el recipiente de
reaccin. Para el parmetro alpha en base a
las condiciones experimentales y de
sustrato se us un valor de 0,7 para todos
los ensayos. Para la enzima libre se report
una actividad de 2399,81 [UI/ml].

B. Ensayo de actividad de enzima

C. Inmovilizacin de enzimas

La actividad se determin en base a la

tasa inicial de generacin de producto
usando la tcnica de pH-estato para
cuantificar la cantidad de producto
generado a partir de la hidrlisis de los
enlaces peptdicos [7]. Para esto se ocup
el G20 compac titrator de Mettler-Toledo.
La reaccin de hidrolisis se llev a cabo
en condiciones controladas a pH 8 y una

Para el soporte de agarosa se activ 1[g]

de soporte con NaOH 1,7 [M], borohidruro
de sodio y glicidol. La inmovilizacin se
realiz segn el protocolo descrito en
Guisn et al. [8]. El soporte se contact
con 1 [mL] de enzima Alcalase diluida
en 10 [ml] de agua destilada. La incuba-

cin realizada fue de 211 [hrs] con

agitacin suave y 25 [C]. Durante este
periodo se realizaron ensayos de actividad
enzimtica al sobrenadante de la
suspensin. Los ensayos efectuados se
realizaron tomando muestras de 100 [L]
de sobrenadante tomadas a distintos
tiempos durante el transcurso de
inmovilizacin. Estos fueron realizados a
ph 8 y 40 [C]. Terminada la
inmovilizacin se almaceno la suspensin
enzimtica en solucin 0,1 [M] de fosfato
de sodio en relacin 1:10 (p/vol), pH 7 y
40 [C].
Para la inmovilizacin en Epoxi se
utiliz el protocolo descrito en Guisn et.
al. [9] . Se lava 1 [g] de soporte Epoxi para
la inmovilizacin. El soporte lavado se
contacto con 1 [ml] de enzima
Alcalase diluida en 10 [ml] de solucin
buffer fosfato de sodio 1 [M], pH 7. La
suspensin se mantuvo en incubacin por
un periodo de 190 [hrs] en agitacin suave
a 25 [C]. Los ensayos efectuados se
realizaron tomando muestras de 100 [L]
de sobrenadante en distintos tiempos
durante el transcurso de la inmovilizacin,
a ph 8 y 40 [C]. Al terminar el proceso de
inmovilizacin el soporte se almacen en
solucin 0,1 [M] de fosfato de sodio a pH
7 y 40 [C].
D. Ensayo de estabilidad no operacional
Se realizaron ensayos de actividad
enzimtica para cuantificar la inactivacin
trmica de la enzima inmovilizada en
ambos soportes. Se tom un volumen
homogeneizado de suspensin de 2 [mL]
de ambos soportes (agarosa y epoxi). Las
muestras se sumergieron en un bao
termostatizado memmert WNB a 60 [C]
por un periodo de 2 horas, retirando
muestras de 200 [L] a los 10, 20, 40, 60,
90 y 120[min]. A cada se muestra retirada
se le realiz un ensayo de actividad
enzimtica a 40 [C] y pH 8 por cinco
minutos, usando solucin de sustrato al 1%

(p/p) de protena. El pH de la solucin de

reaccin fue controlado por medio de
NaOH 0,4457 N.
E. Ensayo de estabilidad operacional
La estabilidad operacional, se cuantifico
mediante el grado de hidrlisis logrado por
la enzima inmovilizada en cada soporte.
Para esto se uso la tcnica de pH-estato
realizada en el G20 compac titrator de
Mettler-Toledo. Cada experimento se
realiz durante un tiempo de veinte
minutos. Las condiciones de reaccin
fueron a 60 [C] y pH 8. Para cada
reaccin se prepar una solucin
homogeneizada de sustrato de suero de
leche al 4 % (p/p) de protena. 40 [g] de
esta solucin se agreg al recipiente de
reaccin. Una vez llegado a las
condiciones de reaccin se agregaron 500
[L] de solucin de enzima inmovilizada y
se control el pH de la solucin mediante
NaOH 0,1 N. El grado de hidrlisis
definido como DH [%] se calcul como se
detalla a continuacin.

Donde B es el volumen de base

consumida [ml],
es la normalidad de
esta misma [meq/ml], y es el grado de
disociacin de los grupos -amino y MP es
la masa total de protenas [g].

3. Resultados y discusin
A. Inmovilizacin de Enzimas.

Actividad sobrenadante, %

Para 1 [mL] de Alcalase inmovilizada

en 1 [g] de soporte epoxi y agarosa, se
puede observar como fue evolucionando la
inmovilizacin a travs del tiempo
100%
soporte Epoxy

80%

trminos del factor de estabilizacin para

ambos soportes. El ensayo de estabilidad
no operacional realizado para Alcalase
libre, si report un decaimiento
exponencial, para el cual se obtuvo una
vida media de 35,6 [min].
En la siguiente tabla se aprecian los
resultados obtenidos, para ambos soportes,
los cuales se fueron comparados y
cuantificados en trminos de sus
actividades relativas al cabo de 2 horas.

soporte Agarosa

60%
40%
20%
0%
0

48

96

144

192

240

Tabla 2
Actividad relativa final en ensayo no operacional al
cabo de 120 minutos.
Soporte
Actividad relativa
Epoxi
0,577
Agarosa
0,652
Enzima libre
0,097

tiempo, horas

Una vez estabilizado el proceso de

inmovilizacin se cuantific la cantidad de
enzima unida al soporte. Los resultados se
presentan en la tabla a continuacin.
Tabla 1
Actividad porcentual final sobrenadante sobre
ambos soportes.
Actividad
Soporte
Tiempo(h)
Sobrenadante (%)
Epoxi
38%
190
Agarosa
41%
211

En este ensayo se puede ver que el

decaimiento de la actividad relativa se
condice con los comportamientos de las
curvas del proceso de inmovilizacin. Se
ve que a partir del minuto 40 aprox. ambas
curvas cambian su velocidad de
decaimiento.
1

Actividad relativa

Fig. 1. Actividad sobrenadante durante proceso de

inmovilizacin. El apego de la enzima en ambos
soportes se realiza bajo agitacin suave a 25 C

soporte Epoxy
soporte Agarosa
Enzima libre

0.8
0.6
0.4
0.2
0

Se observa que la inmovilizacin decae

su velocidad a partir de 96 horas
aproximadamente, siendo el proceso un
poco ms rpido y con mayor rendimiento
en el soporte epoxi.

20

40

60

80

100 120 140

tiempo, minutos
Fig. 2. Ensayo de estabilidad no operacional. Las
condiciones experimentales de este ensayo fueron a
60 C con 1% (p/p) de protena de suero de leche y
200 [L] solucin de soporte.

B. Ensayo de Estabilidad No Operacional.

C. Ensayo de Estabilidad Operacional.
Como se aprecia en la Fig. 2. ambos
soportes reportaron un comportamiento
que no obedece a un comportamiento de
decaimiento exponencial sino que a un tipo
de decaimiento ms complejo. Por lo que
no fue posible realizar comparaciones en

Para la estabilidad operacional se

aument la concentracin del sustrato para
poder obtener una mejor curva de
hidrolisis y cuantificar mejor los
resultados. Despus de la realizacin de 10

Grado de hidrlisis, %

ciclos de operacin para cada soporte se

obtuvieron grados de hidrolisis de 1,5 y 4,1
% para los soportes de Epoxi y Agarosa
respectivamente.
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0

soporte Epoxy
soporte Agarosa

3 4 5 6 7 8 9 10
Nmero de lote, ciclos

Fig. 3. Ensayo de estabilidad operacional. Las

condiciones experimentales de este ensayo fueron a
60 C con 4% (p/p) de protena de suero de leche y
500 [L] solucin de soporte.

Un problema que se present en este

ensayo, fue la dificultad para poder
recuperar el soporte una vez filtrado
despus de cada ciclo, sobre todo en el
soporte de agarosa. Es por esto que las
disminuciones de los grados de hidrolisis
entre cada ciclo no son atribuibles en un
cien por ciento a perdida de actividad
operacional por lo que tampoco esta
perdida
puede
cuantificarse
adecuadamente.
4. Conclusiones y recomendaciones
A pesar de observar una disminucin en
la actividad especfica de ambos
inmovilizados (UI/g de soporte) en
comparacin a la actividad especfica de la
enzima libre (UI/ml de enzima), se puede
apreciar una mayor resistencia a la
desactivacin por efecto de la temperatura
en ambos soportes mostrando resultados
muy similares entre ellos. Por otro lado, el
soporte epoxi muestra que si es posible
llevar a cabo varios ciclos de trabajo con el
mismo biocatalizador lo que podra
mejorar sustentablemente el proceso de
hidrlisis
en
suero
de
leche.
Eventualmente, al no poder comparar este

ltimo ensayo con la enzima inmovilizada

en agarosa debido a los problemas
presentados en los resultados, habra que
repetir el ensayo con un equipo ms
adaptado al experimento para poder
concluir que soporte presenta un mejor
comportamiento respecto al ciclo de
trabajo (lotes). Para esta investigacin en
particular se obtuvo que la enzima
inmovilizada en agarosa present una
mayor actividad especfica en comparacin
a la inmovilizacin en epoxi. Desde luego
no se puede llegar a discriminacin entre
un soporte u otro sin hacer una
optimizacin en la caracterizacin del
proceso de inmovilizacin en ambos
soportes.
5. Referencias
[1] SouzaR. Sousa Jr, G. P. Lopes, P. W. Tardioli,
R. L. C. Giordano, P. I. F. Almeida and R.C.
Giordano, Kinetic model for whey protein
hydrolysis by immobilized Alcalase. 2004;
[2] Valencia et al. Identification of the key
mechanisms involved in the fish protein
hydrolysis by Alcalase 2014; 49: 258-264.
[3] Jose M. Guisan. 2006. Immobilization of
Enzymes and Cells. 2Edicinn. New Jersey:
Humana Press. Cap 15.
[4] Jose M. Guisan. 2006. Immobilization of
Enzymes and Cells. 2Edicinn. New Jersey:
Humana Press. Cap 4.