Universidad de Santiago de Chile

Departamento de Ciencias del Ambiente

Ing. en Biotecnologa: Laboratorio de Qumica Orgnica I
Dra. Leonor Contreras / Dra (c) Fabiola Carvajal
Segundo Semestre de 2014

Experiencia N 1:
Espectroscopia y Polarimetra
Objetivo general:
Familiarizar al alumno con la determinacin e interpretacin de espectros de infrarrojo, de
resonancia magntica nuclear protnica (RMN- 1H), y de carbono-13 (RMN- 13C), y con
Polarimetra.

Teora:
Hoy en da la espectroscopia molecular, es considerada como una herramienta fundamental
para la identificacin de compuestos orgnicos. Estas tcnicas se han convertido en el instrumento
ms rpido y preciso para la determinacin estructural de compuestos orgnicos, disminuyendo los
tiempos de anlisis tradicional y en algunos casos, simplificando los procesos de preparacin de
muestras provenientes de matrices complejas (purificacin y aislamiento). Sus principales
limitaciones son el elevado costo del instrumental y la necesidad de conocimiento especializado en
la interpretacin de los datos obtenidos. Dos de las tcnicas ms utilizadas son la Espectroscopia
Infrarroja (IR) y la de Resonancia Magntica Nuclear (RMN).

Espectroscopia infrarroja (IR)

La espectroscopia infrarroja mide la radiacin absorbida por un compuesto en funcin de
la frecuencia de la radiacin infrarroja. La regin del espectro electromagntico ms interesante
para los compuestos orgnicos est comprendida entre las frecuencias (en nmero de onda) de 4000
y 650 cm-1 que equivale a longitudes de onda entre 2,5 y 15 m (micrmetros). La longitud de onda
y la frecuencia se relacionan en forma inversa segn la ecuacin:
hc
E h

Donde E es energa, h es la constante de Plank, es la frecuencia, c la velocidad de la

luz, y es la longitud de onda.
La espectroscopia infrarroja permite analizar los grupos funcionales presentes en la
muestra, para lo cual se har uso de Tablas de Espectroscopia.
Es conveniente tener presente que la muestra a ser analizada debe estar libre de humedad o
de restos de solventes de cristalizacin o de otras impurezas que dificultan la interpretacin de los
espectros y que al mismo tiempo pueden daar las celdas (construidas por ejemplo de NaCl).

Espectroscopia ultravioleta y visible (UV-VIS)

Esta tcnica est asociada con las transiciones entre los niveles de energa electrnica de
los compuestos orgnicos.
Una cantidad apropiada del compuesto(s), a menudo alrededor de 1 mg (cuando el
compuesto tiene un peso molecular de 100 a 200), se disuelve en el solvente de eleccin y se lleva a
100 ml. Una porcin de la solucin de la muestra as preparada se coloca en una celda de cuarzo.
Tambin se coloca una celda de referencia que contiene slo el solvente, en paralelo a los haces que
pasan por las celdas en el espectrofotmetro. Los espectrofotmetros UV-visible tienen dos fuentes
de luz, una de UV y una de luz visible las cuales son activadas secuencialmente cuando se requiere
un anlisis del espectro completo.

Original: Dra. Leonor Contreras. Adaptacin: Dra (c) Fabiola Carvajal.

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Resonancia magntica nuclear (RMN)

Comnmente, se trabaja con RMN- 1H (basada en los tomos de H) y RMN- 13C (basada en
los tomos de C)
Los experimentos de RMN-1H proveen informacin detallada sobre:
i)
Tipo y posicin de los tomos de hidrgeno (desplazamiento qumico en ppm con
respecto al tetrametilsilano (TMS) usado como referencia).
ii)
Nmero y tipo de tomos de hidrgeno vecinos a los tomos de hidrgeno considerados
en i) (acoplamiento spin-spin; multiplicidad).
iii)
Nmero relativo de tomos de hidrgeno a cada valor de desplazamiento qumico
(integracin; relacin de reas).
La informacin que se obtiene de un espectro de RMN es complementaria a la de otras
espectroscopias y es fundamental para la determinacin de estructuras. En el caso de protones
intercambiables como en los alcoholes (ROH) se recomienda hacer un intercambio isotpico,
agregando unas gotas de agua deuterada (D 2O) a la muestra y tomando de nuevo el espectro: la
seal que ha desaparecido es la que corresponda al protn de un grupo hidroxilo (OH) ya que ahora
est como ROD que no resuena.
Preferentemente se usa CCl4 (que no tiene protones que interfieran con el espectro) o
cloroformo deuterado (CDCl3) como solvente. En este caso, es normal que aparezca una seal a
7,24 ppm correspondiente al CHCl 3 que existe como impureza en el CDCl3. Se recomienda filtrar
siempre la solucin con la muestra (pipeta Pasteur con una motita de algodn) para evitar impurezas
ferromagnticas y obtener un buen espectro de RMN.

Polarimetra
Es usada para medir la actividad ptica o quiralidad en molculas. Un gran porcentaje de
molculas con importancia bioqumica presentan quiralidad. Esta tcnica es particularmente til en
el anlisis de hidratos de carbono.
Esta tcnica se basa en la propiedad de la luz de ser tratada como un movimiento
ondulatorio de campos elctricos y magnticos oscilantes que forman ngulos rectos entre s. En la
luz natural, los vectores del campo elctrico se orientan en todos los planos posibles. Si la luz pasa a
travs de un lente Polaroid o un prisma Nicol, slo uno de los vectores del campo elctrico es
transmitido, Figura 1. La luz transmitida se denomina luz polarizada plana, ya que slo tiene un
nico plano de polarizacin en el vector E.

Figura 1: Esquema de obtencin de luz polarizada.

La luz polarizada plana interacta de una manera nica y reproducible con molculas
asimtricas (aquellas que no pueden ser sobrepuestas con sus imgenes especulares). Tales
molculas son llamadas: pticamente activas, porque sus soluciones cambian la orientacin de la
luz polarizada plana. La mayora de las molculas que presentan esta caracterstica, poseen un
centro quiral (carbono enlazado a cuatro grupos diferentes). En la Figura 2 se muestran dos
molculas quirales: el aminocido fenilalanina, en sus formas L y D, y el hidrato de carbono
glucosa, en sus formas L y D. Slo una forma, de cada uno de estos compuestos, se encuentra en la
naturaleza (L-fenilalanina y D-glucosa). Por lo tanto presentan actividad ptica cuando son
extrados desde algn material biolgico.

Original: Dra. Leonor Contreras. Adaptacin: Dra (c) Fabiola Carvajal.

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a)

b)

Figura 2: molculas quirales. a) D y L fenilalanina. b) D y L glucosa.

Cuando la luz polarizada plana es transmitida a travs de una solucin de una sustancia
quiral, el plano de la luz que sale de la muestra, es rotado o cambiado.
En polarimetra se mide la direccin y el valor de la rotacin. La direccin (+ o -) de la
rotacin depende de la estructura de la molcula quiral. El valor de la rotacin es expresado en
trminos del ngulo () y es identificado mediante [] , que se define en la siguiente ecuacin:

Donde:
es la rotacin especfica de una sustancia asimtrica a la temperatura T, con una longitud de
onda .
es la medida experimental de la rotacin en grados. l es la longitud de la celda
utilizada, en dm. c es la concentracin en gramos/100 mL
La magnitud y signo de obs dependen de la naturaleza y concentracin del compuesto
asimtrico, la temperatura de la solucin, el largo de la celda por la cual atraviesa la luz polarizada
plana y la longitud de onda de la luz polarizada plana. La mayora de los polarmetros utilizan como
fuente de luz, la lnea D de una lmpara de sodio, denominando la rotacin especfica como
.
Algunos instrumentos permiten medir la obs a distintas longitudes de onda.
El tamao y signo de la rotacin especfica pueden ser usados para identificar una molcula
asimtrica desconocida, debido a que cada componente posee un valor caracterstico de
. Esta
corresponde a una propiedad fsica de una sustancia, tal como lo son el punto de ebullicin, el
ndice de refraccin y la densidad.
Instrumentacin para Medir
.
Los componentes esenciales de un polarmetro se muestran en la Figura 3. La luz emitida
desde una lmpara de sodio es transmitida a travs de un lente Polaroid o un prisma Nicol. La luz
plana polarizada es dirigida a travs de una celda de vidrio que contiene una solucin del compuesto
estudiado. Un segundo polarizador (llamado analizador) sirve para medir el ngulo de rotacin.
En los instrumentos antiguos, el experimentador deba ajustar manualmente el analizador y
determinar visualmente el ngulo de rotacin. Los instrumentos ms modernos entregan
automticamente la medida del ngulo de rotacin con un lector digital de la magnitud y el signo de
obs.

Original: Dra. Leonor Contreras. Adaptacin: Dra (c) Fabiola Carvajal.

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Figura 3: Esquema general de un polarmetro.

Aplicaciones de la Polarimetra:
La Polarimetra es una herramienta valiosa para la identificacin y caracterizacin de
biomolculas pticamente activas tales como aminocidos, hidratos de carbono, cidos nucleicos y
lpidos. Cuando una molcula ha sido clasificada mediante otras tcnicas, su identidad puede ser
confirmada mediante determinaciones polarimtricas.
La tcnica es simple, rpida, precisa y requiere un equipamiento relativamente econmico.
Los valores estndares de
para biomolculas estn registrados en la bibliografa y pueden ser
obtenidos fcilmente. Dado que obs depende de la temperatura y la longitud de onda, estas variables
deben ser conocidas e informadas. Por esto, cuando un valor de rotacin especfica es reportado,
debe incluir la temperatura de la solucin, la longitud de onda de la luz polarizada plana, la
concentracin del compuesto pticamente activo y la identidad del solvente.

Parte experimental

El laboratorio consta de dos partes:

Parte A: Clase demostrativa para IR y Polarimetra
Parte B: Taller interactivo de visualizacin y reconocimiento de diversos espectros de
IR y RMN.

Parte A

Experimento de Polarimetra e IR
Objetivos:
a.1.- Familiarizar al alumno en la determinacin de la actividad ptica de compuestos
orgnicos.
a.2.- Conocer el manejo de un equipo de espectroscopia de infrarrojo.
a.3.- Aprender a preparar muestras para anlisis de IR y Polarimetra.
Procedimiento:
En grupos pequeos, los alumnos presenciarn una clase demostrativa para IR y
Polarimetra a cargo de la profesora Enriqueta Klein, operadora de los equipos. Luego,
prepararn las muestras a analizar y realizarn mediciones en los equipos, para determinar
el valor del poder rotatorio (ngulo de rotacin) y obtener los espectros IR
correspondientes.

Parte B

Taller interactivo y tutorial.

Objetivos.
b.1.- Adquirir destreza en la interpretacin de los espectros.
Procedimiento:
En el laboratorio de computacin, se trabajar en la visualizacin y reconocimiento de
diversos espectros.
Cada alumno recibir los espectros de una muestra problema para analizar e interpretar,
usando el tutorial de IR y de RMN del laboratorio de computacin.

Original: Dra. Leonor Contreras. Adaptacin: Dra (c) Fabiola Carvajal.

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Espectroscopia de IR: se trabajar con el tutorial computacional IR_TUTOR, de PerkinElmer. Aqu, el alumno podr comparar los distintos tipos de vibraciones y sus energas
correspondientes para compuestos orgnicos con diversos grupos funcionales, alifticos y
aromticos.
Para el anlisis e informe de los espectros se recomienda dibujar la estructura en estudio y
construir una tabla segn el siguiente esquema, ordenando las frecuencias en forma
creciente, considerando slo las de mayor importancia, de acuerdo con la frmula
molecular.
Frecuencia (cm-1) Intensidad
3300
Muy
fuerte
1650
Fuerte
1415
Dbil
700
Media

Modo de vibracin
Estiramiento N-H

Asignacin
amida

Estiramiento C-O
Deformacin NH2
Deformacin fuera del
plano

amida
amida
amida

Tabla 1: Esquema modelo para el informe de resultados de espectroscopia de IR

Espectroscopia de RMN: Se trabajar con el tutorial de RMN protnica y de 13C para

aprender a visualizar los ncleos magnticamente equivalentes y los acoplamientos
correspondientes. Para el anlisis e informe de los espectros se recomienda dibujar la
estructura posible y construir una tabla segn el siguiente esquema, ordenando y asignando
(use letras para marcar los protones magnticamente equivalentes en la estructura y en la
Tabla 2) todas las seales segn los valores de desplazamiento () decrecientes, como se
indica en el ejemplo siguiente:
(ppm) multiplicidad J (Hertz) integracin asignacin
(a) 9,7
S
1
-CHO
(b) 2,4
C
3,8
2
-CH2
(c) 1,0
T
3,8
3
-CH3
Tabla 2: Esquema modelo para el informe de resultados de espectroscopia de RMN

Cuestionario.
1. En qu consiste la polarimetra?
2. Qu se entiende por una sustancia pticamente activa?
3. A qu se le llama sustancias dextrgiras y a cules levgiras?
4. Una solucin de 2 g de (+) gliceraldehdo, HOCH2-CHOH-CHO, en 10 ml de agua, se
coloca en un tubo polarimtrico de 100 mm; con el polarmetro se encontr una rotacin de
+ 1,74 a 25C. Calcular la rotacin especifica del (+) gliceraldehdo.
5. Una solucin de 0,5 g de (-) epinefrina disueltos en 10 ml de HCl diluido se coloc en un
tubo polarimtrico de 20 cm. Con el polarmetro, se encontr que la rotacin era de - 5,0 a
25C. Calcular la rotacin especifica de la epinefrina.
6. Cmo distingue un aldehdo de una cetona en un espectro de IR?
7. Qu vibraciones caractersticas presenta un cido carboxlico para localizarlo en un
espectro de IR?
8. En RMN-1H cundo decimos que un protn est fuertemente desapantallado (o
desprotegido)?
9. Con ayuda de tablas de RMN, prediga el espectro protnico para el acetaldehdo y la
propanona.
Original: Dra. Leonor Contreras. Adaptacin: Dra (c) Fabiola Carvajal.

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10. Qu son las constantes de acoplamiento y para qu sirven?

11. A cuntos enlaces de distancia ocurren los acoplamientos H-H ms comunes?

NOTA:
Respuestas en de las preguntas 1-5 en: http://es.scribd.com/doc/113496664/EXPERIMENTO-5polarimetria

Bibliografa:
1) C.J. Pouchert y J.R. Campbell, The Aldrich Library of Infrared / NMR Spectra, Aldrich
Chem. Co. Milwaukee (1975).
2) W. Reusch, Virtual Textbook of Organic Chemistry online:
http://www.cem.msu.edu/~reusch/VirtTxtJml/Spectrpy/spectro.htm#intro

3) Libro de Clases (Soderberg), Section 3.6: Optical activity, 2013

4) R.F. Boyer, Modern Experimental Biochemistry, 2 Ed., Benjamin/ Cumming, 1993, pp.
349-352

Original: Dra. Leonor Contreras. Adaptacin: Dra (c) Fabiola Carvajal.

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