Tres padres en la fertilizacin in vitro:

sustitucin de genes para la prevencin de las enfermedades

mitocondriales heredadas

El intercambio de material gentico nuclear entre ovocitos y embriones ofrece una opcin reproductiva novedosa para la prevencin de las
enfermedades mitocondriales heredadas. La disfuncin mitocondrial ha sido reconocida como una causa significativa de un nmero de
enfermedades multiorgnicas graves. Los tejidos con una alta demanda metablica, como el cerebro, el corazn, los msculos y el sistema
nervioso central, son a menudo afectadas. La enfermedad mitocondrial puede ser debida a mutaciones en el ADN mitocondrial o en los genes
nucleares implicados en la funcin mitocondrial. No hay ningn tratamiento curativo para pacientes con enfermedad mitocondrial. Dada la
falta de tratamientos y las limitaciones de diagnstico prenatal y preimplantacional, la atencin se ha centrado en la prevencin de la
transmisin de la enfermedad mitocondrial a travs de la terapia de reemplazo de genes de la lnea germinal. Ya que el ADN mitocondrial es
estrictamente de herencia materna, se han propuesto dos enfoques. En el primero, el genoma nuclear de la etapa pronuclear cigoto de una
mujer afectada se transfiere a un cigoto enucleado donante. Una segunda tcnica consiste en la transferencia del huso metafase II del ovocito
no fecundado de una mujer afectada a un ovocito enucleado donante. Nuestro grupo inform recientemente de transferencia de husillo
exitosa entre ovocitos humanos, lo que resulta en el desarrollo de blastocisto y derivacin de clulas madre embrionarias, con muy bajos
niveles de heteroplasmia. En esta revisin, se resume estas nuevas tcnicas de reproduccin asistida y su uso para prevenir la transmisin de
enfermedades mitocondriales. Se discuten las promesas y retos, centrndose en su posible aplicacin clnica.

as
mitocondrias
son
orgnulos intracelulares
que proporcionan un
suministro esencial de la energa
celular en forma de trifosfato de
adenosina generado a travs de la
fosforilacin
oxidativa.
La
enfermedad mitocondrial puede
ser debido a la mutacin en el
ADN mitocondrial (ADNmt) o
mutaciones en el ADN nuclear
implicado
en
la
funcin
mitocondrial. Adems, cada vez
hay ms pruebas de que
mutaciones
adquiridas
de
ADNmt estn implicados en
varias enfermedades crnicas
relacionadas con la edad , como
la diabetes, las enfermedades
cardiovasculares y la enfermedad
de Parkinson (para revisin ver
referencia 1).
La verdadera prevalencia de la
enfermedad de mtADN es

desconocida. Sin embargo, se

estima que aproximadamente 1 de
cada 4.000 nios nacen en los
Estados
Unidos
con
una
enfermedad
hereditaria
mitocondrial (2). La enfermedad
mitocondrial a menudo afecta a
tejidos que requieren de alta
energa, tales como el cerebro,
msculo, hgado, corazn, rin,
y el sistema nervioso central.
Estas
enfermedades
son
clnicamente heterogneas, pero
los sntomas pueden incluir
sordera,
ceguera,
diabetes,
debilidad muscular, y el corazn,
rin e insuficiencia heptica.
Hay una serie de sndromes
clnicos bien definidas, pero
muchos
pacientes
no
se
encuentran en grupos clnicos
fcilmente definidos.
El genoma mitocondrial slo
contiene 37 genes y ADN

mitocondrial se hereda por va

materna. Cada clula contiene
miles de copias de ADNmt. Los
individuos
normales
son
homoplsmicos; es decir, todas las
copias de ADNmt son idnticos.
Sin embargo, las mutaciones
mitocondriales
pueden
ser
homoplsmicas, en la que estn
mutados todas las copias, o
heteroplsmicas, mediante el cual
el individuo contiene una mezcla
de ADN mutado y de tipo salvaje.
Los pacientes afectados por la
enfermedad de ADNmt suelen ser
heteroplsmicos. Sus tejidos y
clulas tienen una mezcla de tipo
salvaje y mutante de ADNmt. El
fenotipo clnico depende de la
relacin de mutado con el tipo
salvaje ADNmt en las clulas y
tejidos afectados. Hay un efecto de
umbral; es decir, el nivel de
ADNmt anormal que causa la

enfermedad de ADNmt. Este umbral vara por el tejido

y el tipo de mutacin, pero es por lo general en el
rango de 60% -90%.
Las opciones de tratamiento son generalmente
limitadas. Por lo tanto, las intervenciones preventivas
que eliminen la posibilidad de transmisin de la
enfermedad mitocondrial heredado de la madre a la
descendencia se estn persiguiendo activamente.

OPCIONES reproductivas para prevenir la

transmisin
del
enfermedad
mitocondrial
La transmisin de ADNmt es compleja y poco
conocida. La transmisin de ADNmt heteroplsmico
se complica por la replicacin del genoma selectiva y
cuello de botella gentico, dando como resultado
marcada variacin en los niveles de ADNmt mutado
entre la descendencia de madres heteroplsmicas (3).
Una mujer con un bajo nivel de ADNmt heteroplasmia
podra transmitir niveles mucho ms altos a sus hijos a
travs del fenmeno conocido como el cuello de
botella mitocondrial.
El asesoramiento gentico es importante para
explicar los riesgos genticos implicados en la
reproduccin espontnea o asistida y los lmites de las
pruebas prenatales y preimplantacin. El diagnstico
gentico preimplantacional (DGP) ha limitado la
eficacia para la enfermedad ADNmt debido a la
incertidumbre en la prediccin de la enfermedad
debido a heteroplasmia y el cuello de botella gentico.
El diagnstico gentico preimplantacional para la
enfermedad ADNmt se ha informado (4-7); Sin
embargo, persiste la preocupacin respecto a si las
cargas de mutaciones detectadas en blastmeros o
trofectodermo biopsia representan con precisin todo
el embrin. Tambin hay incertidumbre acerca de la
correlacin entre la carga de la mutacin y la expresin
de la enfermedad y la gravedad. Otra preocupacin es
que el DGP slo puede reducir, pero no eliminar, el
riesgo de transmisin de ADNmt anormal que puede
conducir a la enfermedad mitocondrial en las
generaciones posteriores.
Adems, el DGP no es aplicable a pacientes con
mutaciones homoplsmicas o altos niveles de

heteroplasmia. Para las mujeres con niveles

homoplsmicas o altos de mutaciones de ADNmt
heteroplsmicas, actualmente la nica opcin para
garantizar un hijo no afectado es la donacin de
ovocitos conjunto. Sin embargo, la donacin de
ovocitos tiene la limitacin de no mantener el vnculo
gentico para la madre.
Las limitaciones de la DGP y la donacin de
ovocitos conjunto han llevado a la bsqueda de
enfoques alternativos para prevenir la transmisin de
la enfermedad mitocondrial. Estos planteamientos
implican el intercambio de genoma mitocondrial entre
gametos o embriones.
La transferencia citoplsmica se propuso por
primera vez como un tratamiento para los pacientes
con infertilidad. La transferencia citoplasmtica
implica la transferencia de una pequea porcin de
ooplasma, y por lo tanto ADNmt, de un ovocito a otro.
En 1997 Cohen et al. (8) report la primera
transferencia citoplasmtica en los seres humanos que
result
en
embarazos.
Este
planteamiento
probablemente no impedira la transmisin de la
enfermedad mitocondrial, ya que no elimina el
mtDNA mutado sino que aade las mitocondrias de los
donantes, la creacin de un ovocito heteroplsmica
con las dos haplotipos mitocondriales. Por otra parte,
la cantidad de ADNmt saludable que se transfiere es
relativamente pequeo.
Otros dos enfoques prometedores han surgido ms
recientemente. Con cualquier mtodo, cualquier nio
resultante heredara material gentico nuclear de
ambos padres, mientras que el ADNmt se deriva en
gran parte o quizs exclusivamente del ovocito
proporcionada por el donante sano. Estos mtodos
podran evitar la enfermedad mitocondrial, no slo en
el nio resultante, sino tambin en las generaciones
posteriores.
Uno de estos enfoques, denominada transferencia
pronuclear, implica la eliminacin de ambos
proncleos de un cigoto que contiene mutaciones de
ADNmt y la transferencia al espacio perivitelino de un
cigoto enucleado donado. Los proncleos encerrados
en un carioplasto se fusionan con el cigoto enucleado
mediante impulsos elctricos o virus hemaglutinante
inactivada de Japn. El cigoto reconstruido podra
contener el material de ADN nuclear de un cigoto, y el

FIGURA 1

citoplasma y el ADNmt predominantemente de la otra

(Fig. 1). Esto se ha logrado con xito en el modelo de
ratn, dando como resultado el nacimiento de
descendencia normal (9).
Craven et al. (10) inform recientemente
transferencia pronuclear en cigotos humanos que se
consideraron anormalmente fertilizados. Se transfieren
proncleos de un cigoto en otro cigoto enucleado.
Estos embriones anormalmente fertilizados fueron
donados por los pacientes sometidos a fecundacin in
vitro para el tratamiento de fertilidad. De los
embriones reconstruidos, 8,3% se desarroll a la etapa
de blastocistos. El anlisis del genotipo revel una baja
tasa de arrastre de ADNmt de <2%, pero el grado de
arrastre vari entre los blastmeros.
Un enfoque alternativo, denominado transferencia
de husillo, utiliza tcnicas de micromanipulacin para
transferir el material gentico nuclear (el husillo con
los cromosomas adjuntos de origen materno) a partir
de un oocito fertilizado a otro de la que su propio
material nuclear ha sido retirado (Fig. 2). El ovocito
reconstituido es fecundado luego para permitir el
desarrollo del embrin.
Recientemente Tachibana et al. (11) demostraron
la primera generacin con xito de una descendencia
sana por transferencia husillo en el modelo no humano
de primates. Los husillos se aislaron y se transfirieron

a ovocitos maduros enucleados con mnimo arrastre de

ADNmt. Los ovocitos reconstruidos fueron
fertilizados, y cuatro hijos sanos nacieron con <1%
remanente de ADNmt. La transferencia husillo
tambin se llev a cabo con xito despus de la
criopreservacin de ovocitos, lo que resulta en el
nacimiento de las cras de mono sano (12).
Utilizando un enfoque similar, tambin informado
recientemente, la transferencia de husillo exitosa entre
ovocitos MII humanos, lo que resulta en el desarrollo
de blastocisto y clulas madre embrionarias (ESC) de
derivacin, con niveles muy bajos de heteroplasmia
(12). Aunque hubo una tasa ligeramente mayor de
fertilizacin anormal, los embriones restantes
desarrollaron a blastocisto y entregaron los CES
similares para el control de los embriones y tena
cariotipos
normales
euploides
con ADNmt
exclusivamente donante (<1% remanente de ADNmt).
Un estudio de seguimiento por Paull et al. (13)
tambin demostr la transferencia de husillo materna
con ovocitos humanos, aunque stos fueron
partenogenticamente activados ms que fertilizados.
La activacin de ovocitos anormales se impidi
utilizando enfriamiento. La tasa de arrastre de ADNmt
fue <1%. Las clulas madre embrionarias y sus
fenotipos diferenciados mostraron la funcin
mitocondrial normal.

La seguridad a largo plazo y la eficacia de estas

tcnicas en los seres humanos es desconocida, y una
mayor investigacin clnica es necesario. Sin embargo,
los resultados de estudios en animales incluidos en
primates no humanos son alentadores, y no se han
observado anomalas durante el seguimiento a largo
plazo de hasta observaciones hasta la edad adulta (12).
Los problemas de seguridad de estas tcnicas incluyen
la reduccin de la cantidad de arrastre de ADNmt
mutado, los mtodos para evitar la fertilizacin
anormal, y posibles problemas de incompatibilidad
nuclear-tomtDNA.
Como se mencion anteriormente, estas dos
tcnicas se asocian con cierto grado de arrastre de
ADNmt durante la transferencia de husillo o
transferencia pronuclear, y por lo tanto es posible la
persistencia de ADNmt mutado. En promedio, se
detect el 1% de heteroplasmia mitocondrial en
embriones y descendencia de monos y humanos por
transferencia de husillo (11-13). En los embriones de
transferencia pronuclear humanos, se observ hasta el
2% de arrastre. Adems, se observ una considerable
cantidad de heteroplasmia mitocondrial entre los
blastmeros del mismo embrin (10).
En
la
mayora
de
las
enfermedades
mitocondriales, el umbral de mutado a ADN de tipo
salvaje que se debe alcanzar antes de que se observen
caractersticas clnicas es alta. Por lo tanto, bajos
niveles de ADNmt mutante transferidos durante el
trasplante no causan enfermedad . Cualquier
segregacin temprana de un nivel muy bajo de mtDNA
mutante es poco probable que sea un problema para
los nios nacidos como resultado de transferencia de
husillo materno o de transferencia pronuclear. Hay un
ligero riesgo, sin embargo, que el genotipo mutado
puede segregar a los tejidos especficos o la lnea
germinal que afecta a las generaciones futuras. Existe
una preocupacin potencial por las generaciones
posteriores, dado que una nia nacida despus de estas
tcnicas puede tener una proporcin de ovocitos con
un nivel significativo de ADNmt mutado debido a
cuello de botella mitocondrial.
Ser importante para determinar la seguridad de
estas tcnicas en relacin con el desarrollo del
embrin. Aunque los estudios en animales son
tranquilizadores,
el
estudio
Craven
seal

aproximadamente el 50% el desarrollo del embrin

reducida despus de la transferencia pronuclear (10).
Como se ha sealado, estos estudios fueron realizados
con embriones fertilizados anormalmente. Por lo tanto,
ms estudios con embriones fertilizados normalmente
se justifica. Del mismo modo, aunque los estudios de
transferencia de husillo en el mono rhesus son
tranquilizadores, los estudios en humanos revelaron
una mayor tasa de fertilizacin anormal en los
embriones de transferencia de husillo en comparacin
con los embriones de control (11, 12). A pesar de esto,
sin embargo, el rendimiento de los blastocistos de
transferencia de husillo normales, euploides por ciclo
de estimulacin ovrica era suficiente para ser
clnicamente til.
Adems, la visualizacin del husillo requiere la
exposicin a la birrefringencia de luz polarizada, la
seguridad de la cual es desconocida. Adems, la
ocurrencia de la segregacin aberrante de cromosomas
en la metafase II durante la maduracin de los ovocitos
se incrementa en ovocitos envejecidos (14). Por lo
tanto, se deben desarrollar tcnicas para minimizar el
riesgo de aneuploida. Ambas tcnicas requieren el uso
de inhibidores reversibles del citoesqueleto y virus
hemaglutinante del Japn, la seguridad del cuales no
ha sido rigurosamente probados en los ovocitos o
embriones humanos. Tachibana et al. (11) demostraron
que ningn genoma viral es detectable en ambos CES
derivados y en el tejido de la placenta de la
transferencia de husillo de la descendencia.
Hay desafos logsticos tambin. Tanto la
transferencia pronuclear y la transferencia de husillo
requieren la sincronizacin de la estimulacin ovrica
de la mujer afectada y de los donantes, de modo que
las operaciones de recuperacin de ovocitos se
produzcan en el mismo da. Debido a la variacin
individual en la respuesta a la estimulacin ovrica,
esto puede ser un reto. Por lo tanto, tendr que ser
considerada la eficacia de las tcnicas de uso de
ovocitos y embriones criopreservados.
La vitrificacin de ovocitos puede ofrecer una
solucin. Tachibana et al. (12) demostraron que en el
modelo de transferencia de husillo rhesus, el
citoplasma es ms sensible al dao inducido por la
vitrificacin-que el husillo. Paull et al. (13)
encontraron que podran congelar carioplastos aislados

FIGURA 2
y utilizarlos en la transferencia de husillo materna

descendientes y los controles, lo que sugiere que las

despus de la descongelacin. Estos hallazgos sugieren

que citoplasma fresco es esencial para la transferencia
de husillo xito y que los oocitos vitrificados
portadores de mutaciones en el ADNmt se puede
utilizar para la transferencia de husillo en un entorno
clnico.
Tambin
se
ha
planteado
acerca
de
incompatibilidad potencial entre los genomas
nucleares y ADNmt. Los estudios en intraspecies que
cruzan en los insectos o ratones endogmicos indican
que los genotipos mitocondriales extranjeros pueden
afectar a la expresin de los genes nucleares y los
resultados de salud (15). Aunque cualquier nueva
tcnica se asocia con algn riesgo, creemos que la falta
de pruebas de desajuste mitocondrial-nuclear dentro
de las especies heterogneas como los humanos como
una causa de la enfermedad es tranquilizador. Por otra
parte, en la actualidad hay mltiples informes del
estado de salud de la descendencia nacida despus del
reemplazo mitocondrial desigual en macacos, y
ninguno ha mostrado diferencia entre estos

interacciones dainas son poco probables de ocurrir en

los seres humanos (11, 12, 16 ). Sin embargo, debido a
los efectos nocivos de la sustitucin de genes
mitocondriales pueden no ser evidentes hasta ms
tarde en la edad adulta, por lo tanto el seguimiento a
largo plazo es esencial.
Las tcnicas en la tecnologa de reproduccin
asistida se han asociado con una mayor incidencia de
anomalas epigenticas, como el sndrome de
Beckwith-Wiedemann y el sndrome de Angelman
(17). La cuestin de si las tcnicas de transferencia
nuclear aumentan el riesgo de anormalidades
epigenticas es desconocida. Los estudios en modelos
animales hasta el momento son tranquilizadores.

CUESTIONES TICAS E INVESTIGACION

FUTURA
El reemplazo gnico mitocondrial plantea una serie de
cuestiones ticas (18). Aunque los resultados con las
dos tcnicas son prometedores, se debe hacer
investigacin adicional en materia de seguridad y

eficacia antes de la aplicacin a la prctica clnica.

Es necesaria la investigacin de primates no
humanos debido a los desafos ticos de la realizacin
de la investigacin reproductiva en los seres humanos
y la preocupacin por la seguridad de las nuevas
tecnologas reproductivas y su impacto en las
generaciones futuras. Los modelos de primates no
humanos han sido valiosos sistemas experimentales
preclnicos para evaluar nuevas tcnicas de
reproduccin asistida en medicina reproductiva.
Adems, los CES de primates son importantes para la
comprensin de los mecanismos de la diferenciacin
de clulas madre y son valiosos para entender el
potencial teraputico de lneas diferenciadas ESC
humanos.
El
reemplazo
gnico
mitocondrial
es
especialmente difcil debido a que la tcnica consiste
en la modificacin de la lnea germinal, y las
modificaciones se transmite a las generaciones
posteriores. La investigacin reproductiva es nica en
que, aunque el paciente se somete a la intervencin, el
riesgo potencial es a la descendencia. Aunque los
resultados
en
primates
no
humanos
son
tranquilizadores, algunos efectos pueden no
manifestarse durante muchos aos.
La investigacin in vitro con embriones humanos
es objeto de controversia, al igual que la creacin de
embriones especficamente para la investigacin y la
compensacin financiera de los donantes de ovocitos.
Una ventaja de la transferencia de husillo sobre la
transferencia pronuclear es que los ovocitos de
donantes no necesitan ser fertilizados, lo que evitara
la creacin y destruccin de embriones con el nico
propsito de tratamiento mdico.
Es fundamental continuar estudios en modelos
animales y tejidos humanos in vitro para proporcionar
ms informacin sobre la seguridad en las tcnicas de
transferencia nuclear. Se necesita ms investigacin
para entender cmo el cuello de botella mitocondrial y
la segregacin se produce en los seres humanos.
Tambin ser necesario estudiar las lneas ESC
humanas generados por la sustitucin ADNmt (12),
para confirmar la falta de incompatibilidad entre los
genomas nucleares y de ADNmt. Adems, ser
necesario analizar la normalidad epigentica y de la
expresin gnica en blastocistos humanos y de los

CES procedentes de transferencia de ADNmt. Tambin

tendrn que llevarse a cabo ms estudios en ovocitos
humanos vitrificados.
Aunque son importantes extensos estudios
preclnicos en humanos y animales, los ensayos
clnicos son esenciales. Puede haber diferencias
importantes entre los oocitos humanas y macacos, y el
macaco puede no ser un modelo totalmente previsible
para el humano. Sin un poco de riesgo, varias
innovaciones tcnicas de reproduccin asistida, como
la
fecundacin
in
vitro,
la
inyeccin
intracitoplasmtica de espermatozoides, y PGD nunca
habran llegado a buen trmino. Estas tcnicas se
deben utilizar solamente para evitar la enfermedad
mitocondrial grave en pacientes cuidadosamente
seleccionados. Los pacientes y donantes de ovocitos
deben dar su consentimiento informado. Adems, ser
importante seguir a los nios nacidos despus del
reemplazo mitocondrial a largo plazo para controlar
los posibles efectos sobre los nios nacidos y las
generaciones futuras.
El Consejo de Biotica de Nuffield en el Reino
Unido lleg a la conclusin de que si las tcnicas de
reemplazo de genes mitocondriales demostraron ser
aceptablemente seguras, la investigacin y el uso
podra ser ticamente llevadas a cabo bajo la
supervisin
normativa
adecuada
(http://www.nuffieldbioethics.org/./Mitochondrial_DN
A_disorders_summary_web.pdf). Est absolutamente
justificada una rigurosa revisin por un comit de
investigacin institucional y los comits de
supervisin de clulas madre embrionarias. Son
esenciales el consentimiento informado adecuado, el
seguimiento a largo plazo de la descendencia
resultante, y un proceso pblico transparente.
La legislacin relativa a la investigacin con
embriones vara considerablemente entre los diferentes
pases. En el Reino Unido, el Secretario de Estado de
Salud recientemente comision la Autoridad de
Fertilizacin Humana y Embriologa para convocar a
un grupo cientfico de expertos para examinar los
mtodos para prevenir la enfermedad mitocondrial. El
informe sobre la evaluacin de la seguridad y eficacia
de reemplazo mitocondrial se puede encontrar en
www.hfea.gov.uk/6372.html. La Autoridad en
Fertilizacin Humana y Embriologa encontraron un

amplio apoyo pblico para el reemplazo mitocondrial.

El panel concluy que las tcnicas de transferencia de
husillo materna y la transferencia pronuclear son
potencialmente tiles para un grupo de pacientes cuya
descendencia tiene enfermedad ADNmt gentica grave
o letal. El panel inst a que se realizara una
investigacin adicional para proporcionar ms datos
sobre eficacia y seguridad de estas tcnicas antes de su
uso clnico. El panel tambin recomend el
seguimiento a largo plazo de los nios nacidos como
resultado de estas tcnicas. En junio de 2013, el
gobierno del Reino Unido anunci su decisin de
seguir adelante con el proyecto de reglamento, que
permitir el uso de tcnicas de reemplazo mitocondrial
para ser utilizado para el tratamiento del paciente.
Aunque ninguna ley federal prohbe la
investigacin con embriones humanos en los Estados
Unidos, existen restricciones a la financiacin. Los
fondos federales, bajo la enmienda Dickey-Wicker,
prohbe la creacin de embriones humanos con fines
de investigacin o de investigacin en el que un
embrin humano es daado o destruido. Varios
estados, como California y Nueva York, proporcionan
apoyo financiero para la investigacin con clulas
madre embrionarias. Sin embargo, algunos estados,
como California, prohben la compensacin de
donantes de ovocitos para la investigacin. La
financiacin y barreras regulatorias plantean el riesgo
de que los Estados Unidos se quedar detrs de otros
pases como el Reino Unido en esta importante rea de
investigacin y nuevas terapias.

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