UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEAR

DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGAL

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM MICROBIOLOGIA MDICA
DISCIPLINA BIOFILMES

Caracterizao de Biofilme Microbiano em Rinossinusite Crnica

Edital Universal- MCTI/CNPq N 14/2014

FORTALEZA- CEAR
2014

ANELISE MARIA COSTA VASCONCELOS ALVES

GLEILTON WEYNE PASSOS SALES

Caracterizao de Biofilme Microbiano em Rinossinusite Crnica

Projeto submetido Disciplina Biofilmes, como
requisito para obteno de nota.

FORTALEZA- CEAR
2014

RESUMO

A rinossinusite crnica (RSC) uma doena inflamatria que afeta milhes de pessoas
a cada ano no mundo. Esta patologia se caracteriza por uma inflamao do seio paranasal
quase sempre acompanhada por inflamao das vias areas e classificada como crnica se
tiver durao superior a 12 semanas ou quando ocorre mais de 4 vezes por ano com durao
dos sintomas superior a 20 dias. A etiologia desta patologia multifatorial podendo ser
causada por bactrias, fungos, vrus, alergias, superantgenos, exotoxinas e biofilmes
microbianos. Numerosos estudos sobre biofilme in vitro e in vivo mostram que eles so a
causa da maioria das infeces persistentes. Este trabalho tem como objetivo determinar a
estrutura do biofilme, sua composio e sua biodiversidade de microrganismos em mucosas
de pacientes com RSC, usando mtodos de imagem, bioqumicos e cultura convencional,
alm da determinao da composio da matriz extracelular associada aos microrganismos
isolados das RSC. O presente estudo ser do tipo prospectivo com seleo de pacientes do
seguimento do ambulatrio de otorrinolaringologia do Hospital Universitrio Walter Cantdio
UFC, que apresentarem diagnstico positivo para rinossinusite crnica (RSC). As amostras
tecido e biofilme sero coletadas da mucosa sinusal a partir dos seios etmoidais durante
cirurgia endoscpica. Os swabs contendo as amostras sero transportadas para o laboratrio
para identificao de bactrias e fungos. Os fragmentos de tecido extrados cirurgicamente
sero tratados e montados em suportes para observao microscpio eletrnico de varredura.
Ser realizado a avaliao da hidrofobicidade da superfcie celular e a quantificao de
biomassa pelo mtodo do cristal violeta no biofilme formado in vitro, tambm ser executada
a extrao e anlise de DNA extracelular (eDNA), a quantificao de protenas pelo mtodo
de Bradford e a quantificao de polissacardeos e lipdeos da matriz extracelular do biofilme
formado in vitro. Assim este trabalho se propem a esclarecer quais os tipos de
microrganismos envolvidos na rinossinusite crnica e a relao entre sintomas e dados
demogrficos com a formao do biofilme.

Palavras-chave: matriz extracelular, microbiologia, doena crnica.

ABSTRACT
The chronic rhinosinusitis (CRS) is an inflammatory disease that affects millions of
people each year worldwide. This pathology is characterized by an inflammation of the
sinuses often accompanied by inflammation of the Airways and is classified as chronic if it
has lasting more than 12 weeks or occurs more than 4 times a year with duration of symptoms
more than 20 days. The etiology of this condition is multifactorial and may be caused by
bacteria, fungi, viruses, allergies, superantgenos, exotoxins and biofilm. Several studies on
biofilm in vitro and in vivo have shown that they are the cause of most persistent infections.
This work aims to determine the structure of the biofilm, its composition and microorganisms
biodiversity in mucosa of patients with CRS, using imagem, biochemistry and conventional
culture base methods. This study will be of type selection of prospective patients of follow-up
outpatient Otolaryngology University Hospital Walter Cantdio UFC, that present positive
diagnosis for chronic rhinosinusitis (CRS). The tissue samples will be collected biofilm and
sinus mucosa from the ethmoid sinuses during endoscopic surgery. Swabs containing biofilm
samples will be transported to the lab for identification of bacteria and fungi. The tissue
fragments extracted surgically treated and assembled on supports for scanning electron
microscope observation. Will be held to evaluate the hydrophobicity of the cell surface and
the quantification of biomass by the method of Crystal Violet in the biofilm formed in vitro,
also will run the extraction and analysis of extracellular DNA (eDNA), the quantification of
protein by the method of Bradford and quantification of glycosaminoglycans and lipid of the
extracellular matrix of in vitro biofilm. So this work intend to clarify what kinds of
microorganisms involved in chronic rhinosinusitis and the relationship between symptoms
and demographic data with the formation of the biofilm.

Keywords: extracelular matrix, microbiology, chronic disease.

SUMRIO

IDENTIFICAO DA PROPOSTA

06

QUALIFICAO DO PRINCIPAL PROBLEMA A SER ABORDADO

07

OBJETIVOS E METAS A SEREM ALCANADOS

14

METODOLOGIA A SER EMPREGADA

15

ORAMENTO DETALHADO E JUSTIFICATIVA

21

PRINCIPAIS CONTRIBUIES CIENTFICAS OU TECNOLGICAS DA

PROPOSTA

25

CRONOGRAMA DE ATIVIDADES

26

IDENTIFICACAO DOS DEMAIS PARTICIPANTES DO PROJETO

27

GRAU DE INTERESSE E COMPROMETIMENTO DE EMPRESAS E DE

27

INSTITUIES COM O ESCOPO DA PROPOSTA

10 INDICAES

DE

COLABORAES

OU

PARCERIAS

ESTABELECIDAS COM OUTROS CENTROS DE PESQUISA NA REA

27

11 DISPONIBILIDADE EFETIVA DE INFRA-ESTRUTURA E DE APOIO

TCNICO PARA O DESENVOLVIMENTO DO PROJETO

28

12 ESTIMATIVA DOS RECURSOS FINANCEIROS DE OUTRAS FONTES

QUE SERO APORTADOS PELOS EVENTUAIS AGENTES PBLICOS E

28

PRIVADOS PARCEIROS
13 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

29

1. IDENTIFICAO DA PROPOSTA

TTULO DO PROJETO

Caracterizao de Biofilme Microbiano em Rinossinusite Crnica

LOCAIS DE DESENVOLVIMENTO DO PROJETO

Ambulatrio de otorrinolaringologia do Hospital Universitrio Walter Cantdio Universidade Federal do Cear.

Laboratrio de Bacteriologia do Departamento de Microbiologia Mdica, Centro de Cincias

da Sade - Universidade Federal do Cear.

EQUIPE EXECUTORA

Anelise Maria Costa Vasconcelos Alves

Gleilton Weyne Passos Sales

2. QUALIFICAO DO PRINCIPAL PROBLEMA A SER ABORDADO

A rinossinusite crnica (RSC) tida como um problema socioeconmico significativo

para a comunidade, entretanto, sua etiopatogenia permanece em grande parte desconhecida.
Vrias teorias procuram explicar a fisiopatogenia da RSC. Entende-se hoje que a RSC e uma
doena inflamatria imunolgica causada simultaneamente ou individualmente por diversos
fatores como: distrbios imunolgicos, fatores intrnsecos das vias areas superiores,
superantgenos de Staphylococcus aureus, colonizao fngica que induz e mantem uma
inflamao eosinoflica com perturbaes metablicas como a hipersensibilidade a aspirina e
agresso persistente a partir do biofilme (SLAVIN, 1991; BROOK, 2005a; CHIU, 2005;
SEIBERLING; GRAMMER; KERN, 2005; LANZA et al., 2006; BACHERT et al., 2008).
O primeiro estudo que avaliou a presena de biofilmes na otorrinolaringologia foi
realizado por Post em 2001, e identificou biofilmes em tubos de ventilao atravs da
microscopia eletrnica de varredura (MEV) e associou estas estruturas a otites mdias em um
modelo animal.
O biofilme definido como uma comunidade microbiana sssil e caracterizado por as
clulas que esto irreversivelmente ligados a uma superfcie e incorporadas em um polmero
extracelular autoproduzido (matriz extracelular) (DONLAN & COSTERTON, 2002).
Ao assumir o fentipo de biofilme, os microrganismos submetem uma programao na
expresso de genes, resultando em um estado metablico baixo e regulado, com uma taxa de
crescimento suprimida. Estas mudanas genotpicas e fenotpicas culminam em uma gama de
recursos que diferenciam as doenas causadas por biofilme das infeces agudas causadas por
clulas planctnicas (HOIBY et al., 2010).
Doenas mediadas por biofilme normalmente mostram uma reincidiva e remitncia,
alm de possurem taxas de cultura variveis e extrema resistncia aos antibiticos. H um
entendimento da expanso do papel de biofilmes em vrias patologias, inclusive nas doenas
otorrinolaringolgicas, em otite mdia, em amigdalite crnica (SHU et al., 2010; NAZAR,
2007).
Neste contexto, este trabalho se propem a determinar a estrutura do biofilme, sua
composio e sua biodiversidade de microrganismos presentes em mucosas de pacientes com
RSC, usando mtodos de imagem e cultura convencional, alm da determinao da relao

entre sintomas e dados demogrficos com a formao do biofilme associado a esta infeco
crnica.

2.1 Formao do biofilme microbiano

Uma das primeiras teorias foi descrita por Marshall em 1971, o qual sugeriu que a
formao do biofilme um processo que acontece em duas fases. A primeira, quando o
processo ainda reversvel, em virtude da adeso do microrganismo na superfcie, que ocorre
por foras de Van der Waals, atrao eletrosttica e interaes hidrofbicas. Nesse estgio, a
bactria apresenta movimento browniano, podendo simplesmente, ser removida por rinsagem.
Na segunda fase, por meio de interaes dipolo-dipolo, ligaes inicas e covalentes, pontes
de hidrognio e interaes hidrofbicas, ocorre a interao fsica da clula com a superfcie,
com a sntese de material extracelular da natureza polissacardica ou protica, produzida pelo
microrganismo. Aps este estgio, necessrio adotar foras mecnicas, como raspagens ou
lavagem para remoo do biofilme, pois aps a instalao microbiana e as fases de
crescimento e diviso celular acontecem, h a formao de material extracelular (biofilme)
fortalecendo as ligaes entre as clulas e a superfcie (COSTERTON & WILSON, 2004;
KOO, 2013).
As caractersticas do substrato so de suma importncia para o processo de adeso e
a formao de um biofilme. Como supracitado a adeso inicial entre a superfcie microbiana e
o substrato regido por interaes fsico-qumicas. Dentre estas interaes, podemos destacar
a hidrofobicidade, que representada pelo grau de capacidade de molhadura da superfcie em
meio aquoso, sendo a adeso favorecida pelas superfcies hidrofbicas, as quais possam entrar
em contato pela compresso da camada de gua e das mesmas (COSTERTON & WILSON,
2004; FLEMMING & WINGENDER, 2010).
Os diferentes graus de hidrofobicidade de uma clula so conferidos por fatores de
virulncia associados adeso, como pili, fmbrias e flagelos, bem como pela membrana
externa em gram-negativos e os diferentes graus de eletronegatividade conferidos pela
presena de grupos funcionais polares, como fosfatos, carboxilas, hidroxilas e cido teicico
(FLACH et al., 2005)
A etapa seguinte de formao do biofilme pode levar de horas a meses, e esta se d
pela adeso de outros microrganismos e liberao de novos colonizadores que se desprendem

do biofilme maduro. Os microrganismos liberados formaro biofilmes novos, caracterizando

assim, um ciclo de contaminaes (COSTERTON & WILSON, 2004; KOO, 2013).
Um modelo comum para a formao de biofilme descreve um processo que ocorre em
cinco estgios:
1) eventos pr-adeso: os microrganismos, na sua forma de vida planctnica,
recebem algum estmulo que os leva a aderir em alguma superfcie. Alguns fatores podem
influenciar esse processo, como o pH, concentrao e biodisponibilidade de nutrientes,
autoindutores do quorum sensing, presena de compostos orgnicos, inorgnicos e
temperatura. Geralmente, a superfcie slida condicionada, ou seja, pode ser modificada por
adsoro de vrios nutrientes dos alimentos e ter suas propriedades alteradas (FORSYTHE,
2002);
2) adeso reversvel: ocorre a interao clula-superfcie e sua colonizao inicial. O
processo de adeso bem sucedido depende de alguns fatores, como o aparato celular do
microrganismo e as caractersticas da superfcie da bactria e do substrato. Ainda no so
percebidas alteraes fenotpicas, assim como na transio de genes, embora os genes para a
produo de exopolissacardeos sejam ativados aps 15 minutos de contato entre clula e
superfcie. Esta adeso considerada reversvel, pois possvel observar o retorno de clulas
aderidas ao seu estado planctnico. As principais foras deste evento so as pontes de
hidrognio, Van der Waals, cido-base de Lewis e hidrofobicidade (FORSYTHE, 2002);
3) adeso irreversvel: ocorre, aproximadamente duas horas aps a adeso inicial e se
caracteriza pela presena de microcolnias, que correspondem a um amontoado de clulas
aderidas entre si e a uma superfcie. Neste instante, a motilidade cessa e genes envolvidos na
comunicao clula-clula (quorum sensing) e na produo de exopolissacardeos (EPS) esto
totalmente ativos. A principal fora de ligao clula-superfcie conferida pela matriz
tridimensional e insolvel de EPS (FORSYTHE, 2002);
4) maturao: garante uma maior estabilidade, e correspondente maturao da
estrutura que j vem sendo formada. Ocorre de trs a seis dias aps a adeso inicial, podendo
chegar a 10 dias. A maturidade acontece, por meio do aumento da densidade populacional e,
tambm, pela pronunciada produo e deposio de EPS, aumentando com isso a espessura
do biofilme e a estabilidade da colnia contra flutuaes do ambiente. O aumento da
populao de um biofilme acontece tanto pela diviso celular, quanto pela redistribuio de
clulas entre as microcolnias e pela a adeso de novas clulas planctnicas (FORSYTHE,

2002);
5) destacamento de clulas: acontece entre 9 a 12 dias depois dos processos iniciais.
As clulas se apresentam mveis e assemelham-se s clulas planctnicas, podendo
contaminar o alimento ou formar um novo biofilme na linha de produo (FORSYTHE,
2002).

2.2 Estrutura e composio do biofilme microbiano

O biofilme composto por clulas bacterianas e de fungos, fixadas as superfcies,

biticas ou abiticas, inclusas em uma complexa matriz extracelular composta de substncias
polimricas extracelulares (EPS, Extracellular Polymeric Substances), alm de partculas
retidas e substncias polimricas dissolvidas e adsorvidas (FLEMMING & WINGENDER,
2010; KOO, 2013).
Os microrganismos que se encontram aderidos a superfcies so designados de
ssseis, enquanto aqueles livres e dispersos na fase aquosa so denominados de planctnicos
(BOARI, 2008).
Na dcada de 1980, houve a suposio de que os biofilmes fossem representados por
simples estrutura plana, principalmente 2D, com espessura relativamente constante.
Entretanto, um estudo multidisciplinar originou a descrio de vrios tipos de estruturas de
biofilmes e a formulao de modelos conceituais (CAIXETA, 2008).
Atualmente, acredita-se que exista, no mnimo, trs estruturas diferentes de biofilme.
A primeira a tradicional, plana, viso homognea da estrutura do biofilme. A segunda,
denominada de Modelo do Mosaico Heterogneo, foi descoberta utilizando-se microscopia
de contraste de interferncia diferencial (DIC), para examinar amostras crescidas em
superfcies internas de sistema de distribuio de gua. Desta forma os pesquisadores,
perceberam montes constitudos de microcolnias de bactrias ligadas umas s outras por
substncia polimrica extracelular e apresentando colunas envolvidas por fase lquida em que
protozorios podiam ser notados. O terceiro tipo de biofilme representa o modelo na forma de
cogumelo ou tulipa, com estrutura porosa e canais capilares de gua, por onde ocorre a
distribuio de nutrientes e gua (CAIXETA, 2008).
Dentre os componentes do biofilme, a gua o mais abundante, representando de 70 a
97% da massa total do biofilme, ou mais, da massa total. J os microrganismos representam

10

somente uma pequena parte da massa e do volume de um biofilme (menos de 10%), embora
excretem as substncias polimricas que representam a frao dominante da matria orgnica
seca do biofilme (FLEMMING & WINGENDER, 2010; LOPEZ-RIBOT, 2014).
A estrutura unificadora e protetora dos biofilmes denominada matriz extracelular ou
EPS, a qual formada em parte pelas prprias clulas e em parte por componentes do
ambiente, como protenas, detritos e matria inorgnica, portanto de composio
heterognea e complexa. A EPS pode tambm ser constituda por polissacardeos, protenas,
cidos nuclicos, glicoprotenas e fosfolipdios (FLEMMING & WINGENDER, 2010;
LOPEZ-RIBOT, 2014). A maioria dos estudos indica que os polissacardeos so os
componentes predominantes, entretanto, estudo recente com Candida albicans demonstrou
que as protenas so predominantes com 55% da matriz produzida por esse fungo seguido por
25% de carboidratos, 15% de lipdeos e 5% de cido nucleico (ZARNOWSKI et al., 2014).
A matriz extracelular possui composio variada entre diferentes espcies
bacterianas ou at mesmo, dentro da mesma espcie, sob diferentes condies ambientais.
Apesar da heterogeneidade, o exopolissacardeo considerado componente essencial da
matriz, assim como algumas protenas de superfcie que, por sua vez, tm sido relacionadas
principalmente adeso inicial das clulas de microrganismos superfcie (LOPEZ-RIBOT,
2014).
Exopolissacardeos so considerados componentes importantes que determinam a
estrutura e a integridade funcional do biofilme microbiano, agregado pela formao
tridimensional, com aspecto de gel, alta hidratao e canais localizados na matriz do biofilme,
em que os microrganismos so imobilizados. Alm do mais, age como adesivo e barreira
defensiva, protegendo as clulas para que no sejam arrastadas pelo fluxo de substncias,
auxiliando a clula a resistir a condies de estresse mltiplo, tais como a diminuio e a
exausto de nutrientes e gua, a presena de biocidas e outros agentes antimicrobianos e
condies ambientais (CAIXETA, 2008). Em alguns casos, o EPS capaz de sequestrar
ctions, metais e toxinas, conferindo, tambm, proteo contra radiaes UV, alteraes de
pH, choques osmticos e dessecao (COSTERTON & WILSON, 2004; FLEMMING &
WINGENDER, 2010).
Outro componente importante o DNA extracelular (eDNA). Presente nas matrizes
de muitos biofilmes de bactrias e fungos diferentes, esta molcula tem demonstrado vrias
funes crticas, incluindo a estabilizao da estrutura do biofilme (DOMINIAK et al., 2011),

11

adeso inicial superfcie (VILAIN et al., 2009), troca de informao gentica (MOLIN &
TOLKER-NIELSEN, 2003), e agindo como um nutriente de armazenamento que pode ser
utilizado durante a depleo de nutrientes (FINKEL & KOLTER, 2001).

2.3 Biofilme associado a rinossinusite crnica (RSC)

A rinossinusite crnica (RSC) uma doena inflamatria que afeta milhes de pessoas
a cada ano no mundo (FOKKENS; LUND; MULLOL, 2007). Esta patologia se caracteriza
por uma inflamao do seio paranasal quase sempre acompanhada por inflamao das vias
areas e classificada como crnica se tiver durao superior a 12 semanas ou quando ocorre
mais de 4 vezes por ano, com durao dos sintomas superior a 20 dias (BENNINGER et al.,
2003). A etiologia desta patologia multifatorial podendo ser causada por bactrias, fungos,
vrus, alergias, superantgenos, exotoxinas e biofilmes microbianos. Os sintomas de RSC so
congesto nasal, descarga nasal, dor ou presso na face e/ou reduo ou perda do olfato
(HAMILOS, 2011). O tratamento pode ser realizado com anti-inflamatrios, antibiticos e,
em casos mais graves, cirurgia para remoo de plipos e mucina (HAMILOS, 2011;
KHALIL & NUNEZ, 2006).
Entretanto, alguns pacientes mesmo aps serem submetidos a cirurgia voltam a ter
reincidiva desta patologia (DESROSIERS & KILTY, 2008). Este fato vem sendo associado a
presena de biofilme na cavidade paranasal (FOREMAN et al., 2011). O biofilme definido
como uma comunidade microbiana sssil ligada a uma superfcie viva ou inerte (DONLAN &
COSTERTON, 2002). O crescimento de microrganismos em biofilmes significa uma forma
mais resistente, podendo ser at 1000 vezes mais resistente aos antibiticos do que as clulas
de vida livre da mesma espcie (GILBERT et al., 1997). Esta maior resistncia devido a
diversos fatores, incluindo a presena de uma matriz polimrica viscosa que limita a
penetrao de antimicrobianos, o lento crescimento das bactrias, fentipos resistentes, e
microambientes qumicos alterados (RAMADAN et al., 2005).
Estudos tem demonstrado que antibiticos tpicos ou sistmicos no melhoram o
quadro de infeces associadas a RSC (BIEL et al., 20013), sublinhando a necessidade de
novas abordagens teraputicas. Alm disso, foi observada uma prevalncia de 25% a 100% de
biofilmes em pacientes com RSC (SHIELDS et al., 20013).
Em um grande estudo transversal envolvendo 518 pacientes com RSC, a presena de

12

biofilmes foi significativamente correlacionada com experincia prvia de cirurgia do seio

paranasal, indicando que biofilmes podem contribuir para reincidiva de RSC (ZANG et al.,
2011).
H fortes evidncias de que a microflora dos seios do maxilar sofre alteraes durante
a sinusite aguda, em direo a uma predominncia de Streptococcus pneumoniae,
Haemophilus influenzae e, menos frequentemente, Moraxella catarrhalis (BROOK, 2005b).
Os organismos mais comuns, tanto em RSC e em pacientes saudveis incluem
Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulase-negativa, Streptococcus hemoltico,
Corynebacterium spp. e anaerbios estritos, como Prevotella spp., Peptostreptococcus spp. e
Propionibacterium spp. (ARAUJO et al., 2007). Alm desses agentes etiolgicos bacterianos,
estudos demonstram que o biofilme presente na rinossinusite seria composto por bactrias e
por fungos (FOREMAN et al., 2009).
A identificao da presena de biofilmes microbianos e a sua associao com a
etiologia da RSC vem sendo feita em estudos utilizando microscopia eletrnica de varredura,
de transmisso, anlise histopatolgica, microscopia confocal e hibridizao fluorescente in
situ (FISH) permitindo detectar a presena do biofilme e algumas espcies envolvidas
(SHIELDS et al., 2013; HONG et al., 2014). No entanto, ainda no h estudos caracterizando
a organizao do biofilme microbiano associados a RSC, bem como a composio da sua
matriz.
Os biofilmes associados com SRC so extremamente heterogneos, com muitos
organismos diferentes, e portanto, qualquer estratgia para eliminar os biofilmes teria que ter
como alvo um componente que associado a diferentes microrganismos. Novas abordagens
para o tratamento tm sido propostas, incluindo interferir na comunicao qumica entre
microrganismos ou degradar a matriz do biofilme com enzimas (KAPLAN, 2010; NJOROGE
& SPERANDIO, 2009).
Prev-se ento que o desenvolvimento de novos mtodos para interromper a produo
de matrizes ir melhorar os resultados ps-cirrgicos. Alm disso, estas abordagens podem
facilitar a cirurgia em si, se a mucina obstrutiva tambm for alvo (SHIELDS et al., 2013).
Ainda no se conhece as caractersticas deste biofilme microbiano associados a RSC,
o que permitiria otimizar o tratamento desta patologia de carter crnico. Assim, o presente
estudo tem como objetivo caracterizar os biofilmes formados por microrganismos associados
com RSC.

13

3. OBJETIVOS E METAS

OBJETIVO GERAL
Determinar a estrutura do biofilme e a biodiversidade dos microrganismos em
mucosas de pacientes com RSC, usando mtodos de imagem, bioqumicos e cultura
convencional.

OBJETIVOS ESPECFICOS

Caracterizar a estrutura do biofilme presente em pacientes acometidos de rinossinusite

crnica;

Determinar os microrganismos presentes no biofilme de pacientes acometidos de

rinossinusite crnica;

Estabelecer uma correlao entre dados demogrficos, hbitos e sintomas dos

pacientes acometidos com rinossinusite crnica e o tipo de biofilme e microrganismo
isolados;

Investigar as macromolculas que compe a matriz extracelular (cidos nuclicos,

protenas e polissacardeos) do biofilme formado in vitro por microrganismos isolados
de paciente com rinossinusite crnica;

Avaliar as caractersticas hidrofbicas do biofilme formado in vitro a partir de

microrganismos isolados de paciente com rinossinusite crnica.

METAS

Contribuir para o conhecimento acerca da estrutura e composio biofilme produzido

por microrganismos causadores de RSC;

Estimular o estudo de novas abordagens para o desenvolvimento de condutas

teraputicas para RSC;

Apresentar resultados em dois eventos cientficos anuais, totalizando quatro (04)

resumos apresentados;

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Elaborar uma dissertao de mestrado;

Obter artigos tcnicos cientficos para publicao em revista internacional;

Formar mais um mestre na rea de Microbiologia Mdica;

Formao de um estudante de Iniciao Cientifica que ir acompanhar o projeto

proposto.

4. METODOLOGIA

4.1 Tipo de estudo

Estudo do tipo prospectivo.

4.2 Locais do estudo

Ambulatrio de otorrinolaringologia do Hospital Universitrio Walter Cantdio Universidade Federal do Cear.

Laboratrio de Bacteriologia do Departamento de Microbiologia Mdica, Centro de Cincias

da Sade - Universidade Federal do Cear

4.3 Comit de tica

O estudo ser submetido ao Comit de tica de Pesquisa em Seres Humanos do

Hospital Universitrio Walter Cantdio UFC (Fortaleza CE) de acordo com a Resoluo
466/12 do CNS.

4.4 Pacientes

Sero selecionados os pacientes de seguimento do ambulatrio de otorrinolaringologia

do Hospital Universitrio Walter Cantdio UFC, que apresentarem diagnstico positivo para
rinossinusite crnica (RSC) e concordem em participar da pesquisa (termo de consentimento).

15

No sero includos na pesquisa pacientes menores de 18 anos de idade, mulheres grvidas,

imunocomprometidos, com diminuio da funo ciliar, com fibrose cstica, com sndrome de
Kartagener, com mucosa inadequada para anlise, em uso de corticosteroide ou antibitico
sistmico que antecedem em trs semanas a cirurgia de coleta do tecido. Tambm sero
coletados dados demogrficos (sexo, idade, uso de medicamentos, tabagismo, presena de
alergias e presena de asma), alm de achados da endoscopia nasal.

4.5 Coleta do material

Pacientes com RSC tero o tecido da mucosa sinusal colhido a partir dos seios
etmoidais durante cirurgia endoscpica. O tecido ser imediatamente armazenado em meio
Eagle modificado por Dulbecco (Invitrogen), sem nenhum antibitico ou antifngico e
transportado em gelo para o laboratrio para posterior anlise. Nesta etapa, tambm ser
colhido material (aspirado sinusal) para a cultura de bactrias e fungos.

4.6 Identificao das culturas bacterianas e fngicas

As amostras sero transportadas para o laboratrio em meio de transporte (Oxoid) e

semeados em gar Sangue e gar Chocolate (Himedia) para bactrias e em gar Sabouraud
(Himedia) para fungos. Os achados microbiolgicos sero identificados inicialmente por
colorao de Gram, seguida de provas bioqumicas como catalase, coagulase, DNAse, prova
da bile esculina, fator CAMP (Christie, Atkins e Munch-Petersen) , resistncia e sensibilidade
a bacitracina e optoquina, oxidase, alm do Kit Bactray 1, 2 e 3 (Laborclin) para bactrias e
provas de assimilao de carbono (Yeast Carbon Base - Himedia) e nitrognio (Yeast
Nitrogen Base - HIMEDIA), urase (gar Uria de Christensen - Himedia), zimograma e
observao do crescimento macro e microscpico para fungos.

4.7. Ensaio de anlise da cintica dos biofilmes isolados e multiespcies

A determinao da anlise da cintica dos biofilmes ser realizada segundo

modificao do mtodo de Shields et al., (2013). Para a formao de biofilmes isolados,
culturas

identificadas provenientes de amostras coletadas de pacientes com RSC sero

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repicadas em BHI (Brain Heart Infusion) suplementado com glicose 1%, e incubadas por 24 h
a 35C. Essas culturas sero utilizadas nos ensaios da anlise da formao do biofilme in
vitro, no qual 200 L da suspenso celular, ajustada a escala 3 de MacFarland (9 x 108
UFC/mL) no prprio meio de cultura sero inoculados em poos da placa de poliestireno de
96 poos de fundo chato. As placas sero embaladas em filme plstico e incubadas com
agitao a 35C. Aps 6h, as clulas planctnicas no aderentes sero retiradas atravs da
troca total de meio de cultivo. Para quantificar a biomassa, 100 L de metanol sero
adicionados aos poos para fixao dos microrganismos por 15 min, aps sero adicionados
100 L de Cristal Violeta 0,5% (p/v) a cada poo da placa e a mesma ser incubada durante
20 min. Os poos sero ento lavados trs vezes com 200 L de PBS. Ento, ser adicionado
100 L de cido actico a 7% para dissolver o Cristal Violeta aderido ao biofilme,
posteriormente, o sobrenadante ser transferido para novos poos na placa e estes sero lidos
em leitor de microplacas a 540 nm nos intervalos de tempo de 6, 12, 24 e 48h de cultivo. Cada
ensaio ser realizado trs vezes, independentemente.
Para os biofilmes multiespcies, culturas isoladas provenientes de amostras coletadas
de pacientes com RSC sero repicadas em BHI suplementado com glicose 1%, e incubadas
por 24 h a 35C. Essas culturas sero utilizadas nos ensaios da anlise da formao de
biofilme multiespcie in vitro, onde sero adicionados 200 L de cada suspenso celular, de
acordo com os isolados de cada paciente, ajustadas a escala 3 de MacFarland (9 x 108
UFC/mL) no prprio meio de cultura, em poos da placa de poliestireno de 24 poos de fundo
chato. As placas sero embaladas em filme plstico e incubadas com agitao a 35C. Aps
6h, as clulas planctnicas no aderentes sero retiradas atravs da troca total de meio de
cultivo. Para quantificar a biomassa, 100 L de metanol sero adicionados aos poos para
fixao dos microrganismos por 15 min, aps sero adicionados 100 L de Cristal Violeta
0,5% (p/v) a cada poo da placa e a mesma ser incubada durante 20 min. Os poos sero
ento lavados trs vezes com 200 L de PBS. Ento, ser adicionado 100 L de cido actico
a 7% para dissolver o Cristal Violeta aderido ao biofilme, posteriormente, o sobrenadante ser
transferido para novos poos na placa e estes sero lidos em leitor de microplacas a 540 nm
nos intervalos de tempo de 6, 12, 24 e 48h de cultivo. Cada ensaio ser realizado trs vezes,
independentemente.

17

4.8 Anlise do biofilme por MEV

Os fragmentos de tecido extrados cirurgicamente sero fixados por 2 horas com

glutaraldedo a 2% em tampo fosfato 0,15M (pH 7,2), a temperatura ambiente. As amostras
sero lavadas trs vezes com soluo de lavagem contendo NaCl, sacarose e gua destilada e
aps sero ps-fixadas em OsO4 a 1% por 1 hora. As amostras ento, sero desidratadas em
concentraes crescentes de lcool etlico a partir de 70% at 100% e secadas ao ponto crtico
em CO2 e montadas em suportes para MEV. A metalizao com ouro e observao ser feita
na Central Analtica da Universidade Federal do Cear usando o microscpio eletrnico de
varredura Quanta 600 FEG, com uma voltagem de acelerao de 10kV. Fotomicrografias
sero capturadas no formato TIFF com a magnificao de 1000x a 12000x (BEZERRA et al.,
2009).

4.9 Ensaio de avaliao da hidrofobicidade da superfcie celular

Os biofilmes sero formados a partir de culturas isoladas de pacientes com RSC,

conforme descrito na anlise da cintica dos biofilmes (Item 4.7). Aps os diferentes tempos
de cultivo 6, 12, 24 e 48h, sero lavados com PBS e suspensos no mesmo tampo, a
densidade ptica ser determinada espectrofotometricamente a 660 nm. Ento, ser
adicionado a cada poo xileno na proporo 2,5:1 (v/v), seguido de agitao durante 2
minutos. O material transferido para tubo eppendorf ser deixado durante 20 minutos em
temperatura ambiente. A turbidez da soluo aquosa ser lida a 660 nm. O ndice de
hidrofobicidade ser calculada como HI = (OD controle OD teste) x 100/OD controle, onde
OD controle = densidade ptica a 660 nm, antes do tratamento xileno e OD teste = densidade
ptica a 660 nm aps tratamento xileno. Os ensaios sero realizados em triplicado e repetidas
trs vezes (FELDMAN et al., 2012).

4.10. Extrao e anlise de DNA extracelular (eDNA) no biofilme formado

Aps o perodo de incubao do biofilme formado (Vide Item 4.7), o meio de cultura
ser removido e 200 L de PBS ser adicionado aos poos da placa. O biofilme formado ser
removido gentilmente dos poos da placa com auxlio de uma esptula de plstico. Ento, ser

18

feito um pool das clulas coletadas, em seguida, o pool ser homogeneizado com auxlio de
vrtex por 20s e incubadas a 37C por 1h na presena de Proteinase K (5mg/mL).
Posteriormente, ser realizada a centrifugao a 16000g por 2 min e o sobrenadante ser
removido. O eDNA presente no sobrenadante ser extrado com a soluo fenol: clorofrmio:
lcool (25:24:1). As amostras sero novamente centrifugadas em 16000g por 5 min para
separao das fases, onde ser coletada a fase aquosa. O DNA ser precipitado pela adio de
isoproprano, formando um pellet de DNA, aps uma centrifugao a 16000g por 10 min. O
pellet ser seco e ressuspendido em 50 mL de Tris (10 mM) e pH de 8,5. Aps a extrao,
sero determinadas a concentrao e a pureza do DNA usando o NanoDrop espectrofotmetro
(SHIELDS et al., 2013).

4.11 Ensaio de quantificao de polissacardeos no biofilme formado

A tcnica para a extrao dos polissacardeos modificada da metodologia descrita por

Nader et al. (1984). Brevemente, o biofilme formado ser coletado das placas de cultivo aps
diluio em PBS com auxlio de uma esptula de plstico conforme descrito no Item 4.10.
Posteriormente, ser realizada a centrifugao a 16000g por 2 min e o sobrenadante ser
removido, liofilizado e pesado individualmente para mensurao da massa total dos
componentes da matriz. O p obtido ser submetido a protelise usando Prolav 750 (Prozyn).
Posteriormente, as amostras sero precipitadas em etanol, e ento, ressuspensas em gua
destilada. O material resultante ser separado por em lminas de gel de agarose (0,60%). A
corrida eletrofortica ser efetuada em caixa refrigerada a 4C, com diferena de potencial
eltrico de 100 mV, durante cerca de uma hora ou at obter a migrao apropriada, indicada
pelo corante vermelho de cresol. Aps a corrida eletrofortica, os polissacardeos sero
precipitados no gel com cetavlon (brometo de cetiltrimetilamnia) a 0,1%, por um perodo
mnimo de duas horas. Aps secagem sob calor e ventilao, o gel ser corado com soluo
de azul de toluidina a 0,1% em cido actico a 1% e etanol a 50%. Sendo realizada a
determinao quantitativa dos compostos, por meio de densitometria a 525 nm.

4.12 Ensaio de quantificao de protenas totais na matriz no biofilme formado

A anlise de protenas ser realizada de acordo com o mtodo colorimtrico de
Bradford (BRADFORD, 1976). Para tal, o biofilme formado aps o perodo de incubao (6,
19

12, 24 e 48h) conforme descrito no Item 4.10. Em resumo, o meio de cultura ser removido e
200 L de PBS ser adicionado. O biofilme ser removido gentilmente dos poos da placa
com auxlio de uma esptula de plstico. Posteriormente, ser realizada a centrifugao a
16000g por 2 min e o sobrenadante removido. Este sobrenadante ser liofilizado e pesado
para mensurao da massa total dos componentes da matriz. As amostras liofilizadas sero
diludas em soluo salina nas diluies de 1:10, 1:20 e 1:50. Ento, ser adicionado 100 L
de cada diluio a ser testada em tubo eppendorf contendo 2mL de azul brilhante de
Coomassie (reagente de Bradford). Aps 1h em temperatura ambiente, ser feita a leitura em
espectrofotmetro a uma absorbncia de 595 nm.

4.13 Ensaio de quantificao de lipdeos totais na matriz no biofilme formado

Para essa anlise ser usado o Mtodo Sulfofosfovanilina ou mtodo de Folch et al.
(1957). Os biofilmes formados a partir de culturas isoladas de pacientes com RSC sero
coletados das placas e sonicadas em gua destilada. Esta soluo ser separada em alquotas
de e congeladas a aproximadamente -20C. Ento, uma alquota ser descongelada,
homogeneizada e diluda a uma proporo de 3 partes de amostra para 1 parte da soluo de
extrao, composta por clorofrmio e etanol (2:1). A soluo ser homogeneizada e
centrifugada por 5 minutos a 1000g. Sero retirados 20L do sobrenadante. A amostra
homogeneizada ser colocada em Banho-Maria a 100C por 10 minutos. E, ento, ser
resfriada em gua corrente para adio de 5ml de reagente de cor, vanilina. Aps
homogeneizar a soluo, esta ser lida em espectrofotmetro a 540nm.

4.14. Anlises estatstica

Os resultados deste estudo sero analisados utilizando o programa GraphPad Prism 5.0
(GraphPad Software, San Diego, CA). Ser realizada estatstica descritiva dos dados
individuais dos pacientes participantes da pesquisa, atravs de medidas de frequncia para as
variveis qualitativas, e medidas de posio e de variabilidade para as variveis quantitativas.
A anlise bivariada (Teste do Qui-Quadrado, Exato de Fisher e Teste de Mann-Whitney) ser
utilizada para comparar as caractersticas do biofilme microbiano associado a RSC com
fatores scio demogrficos dos pacientes (sexo, idade, uso de medicamentos, tabagismo,

20

presena de alergias e presena de asma), e variveis clnicas relacionadas RSC. A anlise

de regresso logstica ser realizada para avaliar o efeito das variveis independentes. O nvel
de significncia adotado ser de 5% de p<0,05.

5. ORAMENTO DETALHADO E JUSTIFICATIVA

5.1 Oramento detalhado
Custeio

Material de Consumo
Item
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19

Descrio
Meio Eagle modificado por Dulbecco
(Invitrogen) com 10 saches de 1 litro
Swabs em tubo pacote com 100
unidades
gar Sangue Base 500g (Himedia)
gar Sabouraud Dextrose 500 g
(Himedia)
Placa de Petri estril descartvel 90 x
15 mm (Prolab) pacote com 10
unidades.
Sangue de carneiro desfribinado,
frasco 50 mL
Kit Bactray 1 (Laborclin)
Kit Bactray 2 (Laborclin)
Kit Bactray 3 (Laborclin)
Yeast Carbon Base 100g (Himedia)
Yeast Nitrogen Base 250g (Himedia)
gar Uria de Christensen 500g
(Himedia)
Lactose 500g (Synth)
Glicose 500g (Synth)
Sacarose 500g (Synth)
Maltose 500g (Sigma)
Tubo de Durhan 7 x 30 mm, vidro
Borosilicato
Tubo de ensaio sem orla, 18 x 180mm,
vidro borosilicato
Ala de inoculao de nquel-cromo 5

Quant.

Valor (R$)
Unitrio Total

501,00

501,00

72,00

72,00

1
1

280,00
180,00

280,00
180,00

30

7,00

210,00

90,00

450,00

5
5
5
2
1

180,00
180,00
180,00
302,00
435,00

900,00
900,00
900,00
604,00
435,00

340,00

340,00

1
1
1
1

24,45
17,07
11,80
341,00

25,45
17,07
11,80
341,00

50

0,65

32,50

80

0,87

69,60

16,10

64,40

21

cm calibradra 0,1 ml
Lamnula p/ microscopia - lisa
20
lapidada - 24 x 24 x 0,17mm, caixa
com 100unid (Kasvi)
Lmina p/ microscopia 26 x 76 mm
21
ponta caixa com 50 unidades (Kasvi)
22
Azul de algodo 100 mL (Newprov)
23
Kit de colorao de Gram (Laborclin)
Perxido de hidrognio 3% 1L
24
(Vetec)
25
Kit Coagu-plasma lb (Laborclin)
26
Glutaraldeido 25% 100 mL (Sigma)
27
Cloreto de sdio 500g (Vetec)
gar DNAse com azul de
28
toluidina500g (Fluka)
Reagente de Kovacks 10mL
29
(Newprov)
Vermelho de metila 10 mL
30
(Cromoline)
Tiras de oxidase com 10 unidades
31
(Newprov)
32
Discos de Bacitracina (Cecon)
33
Discos de Optoquina (Cecon)
gar Bile Esculina Kit 10 tubos
34
(Newprov)
35
lcool etlico PA 1L (Quimibras)
36
Xileno PA 1L (Quimibras)
37
Proteinase K 100 mg (Sigma)
38
Fenol PA 1L (Quimibras)
39
Clorofrmio PA 1L (Quimibras)
Placa de poliestireno com 96 poos de
40
fundo chato (Kasvi)
Placa de poliestireno com 24 poos de
41
fundo chato (Kasvi)
42
Caldo BHI 500g (Himedia)
Ponteira 1-200l sem filtro amarela
43
pacote com 1000 unidades
Ponteira 100-1000l sem filtro azul
44
pacote com 1000 unidades
45
Azul de Coomassie Brilhante 25g
46
Tetrxido de smio
47
Valinina 100g
Total material de consumo

2,63

5,26

3,90

11,70

2
2

25,00
41,00

50,00
82,00

18,00

18,00

1
1
1

150,00
646,00
9,00

150,00
646,00
9,00

957,00

957,00

19,00

19,00

19,80

19,80

19,00

76,00

3
3

14,00
12,85

42,00
38,55

32,00

96,00

2
1
1
1
1

9,00
7,00
931,00
89,88
17,18

18,00
7,00
931,00
89,88
17,18

300

6,50

1.950,00

300

6,50

1.950,00

248,24

284,24

14

9,15

128,10

25,08

175,56

1
1
1

110,00
290,00
25,80

110,00
290,00
25,80
14.540,90

22

Servios de terceiros
Descrio
47 Publicaes em revistas cientficas
Total de servios de terceiros

Quant.
2

Valor (R$)
Unitrio
400,00

Total
800,00
800,00

Passagens e Dirias
Descrio
48
Passagens nacionais
49
Dirias de viagem
Total dirias e viagens

Quant.
4
14

Total custeio

Valor (R$)
Unitrio
Total
1.000,00
4.000,00
320,00
4.480,00
8.480,00
24.770,90

5.2 Justificativa do oramento solicitado

Custeio

Material de consumo
N Item
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19

Justificativa
Meio de transporte de amostras
Coleta de amostras de biofilme
Cultivo de bactrias
Cultivo de fungos
Cultivo microbiano
Cultivo microbiano
Identificao de bactrias
Identificao de bactrias
Identificao de bactrias
Identificao de bactrias
Identificao de bactrias
Identificao de bactrias
Identificao de bactrias
Identificao de bactrias
Identificao de bactrias
Identificao de bactrias
Identificao de bactrias
Cultivo microbiano
Cultivo microbiano

23

20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47

Anlise dos microrganismos

Anlise dos microrganismos
Identificao de fungos
Identificao de bactrias
Identificao de bactrias
Identificao de bactrias
Fixador de microscopia eletrnica de varredura
Diluente para meio de cultivo e reagentes.
Identificao de bactrias
Identificao de bactrias
Identificao de bactrias
Identificao de bactrias
Identificao de bactrias
Identificao de bactrias
Identificao de bactrias
Usado na desidrtao de clulas
Solvente de lipideos
Extrao de DNA
Extrao de DNA
Extrao de DNA
Culltura e anlise de biofilme formado in vitro
Culltura de biofilme microbiano
Culltura de biofilme microbiano
Coleta e distribuio de solues com auxlio de pipeta automtica
Coleta e distribuio de solues com auxlio de pipeta automtica
Quantificao de proteinas
Ps-fixador para microscopia eletrnica de varredura
Quantificao de lipideos

Servios de terceiros
N Item
47

Justificativa
Publicaes de artigos referente aos resultados obtidos na pesquisa

Dirias
N Item
48 - 49

Justificativa
Despesas com hospedagem/alimentao durante as viagens a congressos
para divulgao dos resultados

24

6. PRINCIPAIS CONTRIBUIES CIENTFICAS OU TECNOLGICAS DA

PROPOSTA
Com a execuo deste projeto, espera-se aumentar o conhecimento acerca da estrutura
do biofilme e assim levar a um melhor direcionamento das estratgias de controle microbiano
da RSC.
Com relao s contribuies cientficas para a pesquisa bsica, a execuo deste
projeto poder fornecer importantes subsdios para a elucidao da estrutura e composio do
biofilme microbiano, presente no trato respiratrio superior de paciente com RSC.
Atualmente, o tratamento desta patologia um grande desafio para os pesquisadores
envolvidos com Microbiologia Mdica. Assim, o presente trabalho poder fornecer dados
importantes para o desenvolvimento de novas drogas e tratamentos para combater esse tipo de
infeco crnica.
J as contribuies para a produo cientfica e gerao de conhecimentos, os
resultados deste projeto sero utilizados para elaborao de artigos tcnicos cientficos em
revistas internacionais. Alm disso, os resultados sero apresentados em eventos cientficos
como a Semana Universitria da UFC. Para a formao de recursos humanos, ser formado
mais um mestre na rea de Microbiologia Mdica, bem como ser dada continuidade ao
processo de formao de um estudante de iniciao cientfica envolvido no desenvolvimento
do estudo.

25

7. CRONOGRAMA DE ATIVIDADES

ATIVIDADES

2015

2016

Coleta de Amostras

Isolamento e
Identificao

MEV

SEMESTRE
Reviso de Literatura

Avaliao da cintica
do biofilme

Estudo dos
componentes da
matriz extracelular
Interpretao e anlise
dos resultados
Elaborao e
submisso de artigos

26

8. IDENTIFICAO DOS DEMAIS PARTICIPANTES DO PROJETO

NOME
ANELISE
MARIA COSTA
VASCONCELOS
ALVES

INSTITUIO

ATIVIDADES
Coordenadora

UFC

Mdica Veterinria, Mestre em Medicina Veterinri;,

Doutoranda do Programa de Ps Graduao em
Microbiologia Mdica da UFC.
Responsvel pela logstica, execuo do projeto e das
tcnicas microbiolgicas.

Coordenador
GLEILTON
WEYNE
PASSOS SALES
ROSSANA DE
AGUIAR
CORDEIRO
TEREZA DE
JESUS
PINHEIRO
GOMES
BANDEIRA
CIBELE
BARRETO
MANO DE
CARVALHO

UFC

Farmacutico; Mestre em Cincias Farmacuticas;

Doutorando do Programa de Ps Graduao em Cincias
Farmacuticas da UFC.
Responsvel pela execuo do projeto e das tcnicas
microbiolgicas e de imagem.

Pesquisadora
UFC

Profa. Adjunta da UFC.

Responsvel pela anlise dos dados sobre composio do
biofilme.

Pesquisadora
UFC

Profa. do Programa de Ps-graduao em Microbiologia

Mdica da UFC.
Responsvel pela interpretao das imagens microscpicas.

Apoio tcnico
UFC

Profa. Associada da UFC.

Responsvel pela interpretao dos dados microbiolgicas

9. GRAU DE INTERESSE E COMPROMETIMENTO DE EMPRESAS COM O

ESCOPO DA PROPOSTA, QUANDO FOR O CASO

No se aplica ao caso.

10. INDICAO DE COLABORAES OU PARCERIA J ESTABELECIDAS

COM OUTROS CENTROS DE PESQUISA NA REA

10. 1 Central Analtica da Universidade Federal do Cear

A Central Analtica da Universidade Federal do Cear um rgo suplementar da

UFC que tem por misso viabilizar, aprimorar e promover pesquisas cientficas e tecnolgicas

27

na UFC e outras instituies de pesquisa atravs da disponibilizao da sua infraestrutura em

tcnicas analticas e de microscopia. Os servios da central analtica so acessveis a todos,
sendo pleiteados atravs de submisso de propostas usando formulrio especfico para usurio
de universidades e institutos de pesquisa e para empresas.
11. DISPONIBILIDADE EFETIVA DE INFRAESTRUTURA E DE APOIO TCNICO
PARA O DESENVOLVIMENTO DO PROJETO
O laboratrio de pesquisa em bacteriologia do departamento de Microbiologia Mdica
dispe de todo material necessrio ao desenvolvimento deste trabalho, seja equipamentos de
proteo individual e coletiva, materiais de consumo (meios de cultura, reagentes, cepas, placas,
insumos dentre outros), materiais permanentes (equipamentos em geral) e apoio tcnico.
Adicionalmente, o ambulatrio de otorrinolaringologia do Hospital Universitrio Walter

Cantdio servir de local de coleta de amostras e dados demogrficos da pesquisa.

12. ESTIMATIVA DOS RECURSOS FINANCEIROS DE OUTRAS FONTES QUE

SERO APORTADOS PELOS EVENTUAIS AGENTES PBLICOS E PRIVADOS
PARCEIROS

No se aplica.

28

13. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

AHN, S.J.; WEN, Z.T.; BRADY, L.J.; BURNE, R.A. (2008). Characteristics of biofilm
formation by Streptococcus mutans in the presence of saliva. Infect Immun. 76, 42594268.
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Microbiology of middle meatus in chronic rhinosinusitis. Braz J Otorhinolaryngol, v.73, p.
549555, 2007.
BACHERT, C.; ZHANG, N.; PATOU, J, VAN ZELE, T.; GEVAERT, P. Role of
staphylococcal superantigens in upper airway disease. Curr Opin Allergy Clin Immunol, v.
161, n.4, p.304-14, 2013.
BOARI, Cleube Andrade. Formao de biofilme em ao inoxidvel por Aeromonas
hydrophila e Staphylococcus aureus sob diferentes condies de cultivo. 2008. 80f. Tese
(Doutorado em Cincia dos Alimentos) Universidade Federal de Lavras, Lavras.
BENNINGER, M.S.; FERGUSON, B.J.; HADLEY, J.A.; HAMILOS, D.L.; JACOBS, M., et
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Otolaryngol Head Neck Surg, v. 129, p. 2132, 2003.
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BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principles of protein-dye binding. Anal Biochem, v.72,
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p.34793480, 2005a.
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CAIXETA, Danila Soares. Sanificantes qumicos no controle de biofilmes formados por
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COSTERTON, W.J.; WILSON, M. Introducing Biofilms. Biofilms, v. 1, p.1-4, 2004.
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29

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p.710721, 2011.
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