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A

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T

DNA
recombinante

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A

A
T

T
C

Captulo

19

Alimentos transgnicos
NGEL GIL HERNNDEZ
DANIEL RAMN VIDAL

Objetivos

n Entender el concepto de DNA recombinante y las principales tcnicas moleculares

utilizadas actualmente en la ingeniera gentica.

n Adquirir los conceptos de organismos modificados genticamente y de alimentos transgnicos.
n Describir las bases de la obtencin de las plantas transgnicas y algunos ejemplos de apli-

caciones de la ingeniera gentica en agricultura.

n Conocer las bases de las modificaciones genticas de las bacterias y otros microorganismos

usados comnmente en la industria alimentaria mediante tecnologa de DNA recombinante.

n Entender los procesos y modalidades utilizados en la obtencin de los animales transg-

nicos.
n Comprender los procedimientos utilizados para la clonacin de animales.
n Conocer el protocolo que debe seguirse para solicitar la comercializacin de los nuevos

alimentos.
n Conocer las aplicaciones de las normas vigentes sobre el etiquetado y la trazabilidad de

nuevos alimentos e ingredientes en la Unin Europea.

n Comparar la legislacin vigente en Estados Unidos con la de la Unin Europea en cuanto a

Coleccin Tratado de Nutricin 2010. Editorial Mdica Panamericana

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T T
A

DNA
recombinante

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A

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C

Contenido

n INTRODUCCIN

T
T

G
T

n Produccin animal: animales transgnicos

n CONCEPTO Y CLASIFICACIN
n DNA RECOMBINANTE E INGENIERA

Obtencin de animales transgnicos

Aplicaciones de los animales transgnicos

n EVALUACIN DE ALIMENTOS Y CULTIVOS

TRANSGNICOS

GENTICA
n Clonado molecular

n COMERCIALIZACIN DE ORGANISMOS

n Enzimas de restriccin
n Ligado de fragmentos de DNA
n Otras enzimas de inters en la tecnologa del DNA
recombinante

n Vectores de clonacin
n Seleccin del DNA recombinante

MODIFICADOS GENTICAMENTE
O DE PRODUCTOS QUE LOS CONTENGAN
n Solicitud de autorizacin de comercializacin
de un alimento transgnico en el mbito comunitario
Dictamen de la Autoridad
Autorizacin

n Normas legislativas en Espaa

Informe de evaluacin
Rgimen de autorizacin

n Libreras genmicas
n Tcnicas de visualizacin y cuantificacin
de fragmentos de cidos nucleicos

n APLICACIONES DE LA INGENIERA
GENTICA EN LA PRODUCCIN
DE ALIMENTOS
n Agricultura: plantas transgnicas
Obtencin de plantas transgnicas
Aplicaciones de la ingeniera gentica
en agricultura

n Industria alimentaria: microorganismos

modificados genticamente
Obtencin de bacterias lcticas modificadas
genticamente
Aplicaciones en la industria alimentaria
de las bacterias lcticas modificadas
genticamente
Otras bacterias
Obtencin y aplicaciones de levaduras y hongos
filamentosos modificados genticamente

n Etiquetado y trazabilidad de nuevos alimentos

y de nuevos ingredientes alimentarios: legislacin
en la Unin Europea
Etiquetado
Trazabilidad

n SITUACIN LEGISLATIVA
DE LOS ALIMENTOS MODIFICADOS
GENTICAMENTE EN ESTADOS UNIDOS
Y LTIMOS AVANCES
EN LA UNIN EUROPEA

n LEGISLACIN RELEVANTE
SOBRE ORGANISMOS MODIFICADOS
GENTICAMENTE

n RESUMEN
n BIBLIOGRAFA
n SITIOS WEB DE INTERS

Coleccin Tratado de Nutricin 2010. Editorial Mdica Panamericana

Alimentos transgnicos

n INTRODUCCIN
Los organismos modificados genticamente (OMG)
pueden definirse como organismos en los cuales el material
gentico, formado por el cido desoxirribonucleico (DNA),
ha sido alterado de un modo artificial mediante el uso de la
denominada tecnologa del DNA recombinante o ingeniera
gentica. Esta tcnica permite aislar genes de cualquier organismo vivo donador, seleccionarlos y transferirlos a otro
organismo de una especie receptora que en la escala filogentica puede estar relacionada o distante de la donadora. En
los pases hispanoparlantes los OMG tambin se denominan
organismos transgnicos.
Desde hace ms de tres dcadas se han desarrollado
nuevos microorganismos, plantas y animales mediante
estas tcnicas genticas, las que han permitido crear nuevos alimentos con distintas propiedades. As, se han desarrollado nuevas variedades de plantas con resistencia a
insectos, virus o herbicidas, leguminosas con contenido
mejorado de algn aminocido o cereales con un mayor
valor biolgico de sus protenas. Tambin se han creado
plantas de cuyas semillas se obtienen aceites con composicin nutricional mejorada u otras cuyos frutos presentan
un retraso en la maduracin o tienen mejorada su textura
o color. Por otra parte, se han generado nuevos microorganismos que pueden producir aditivos alimentarios, como
colorantes y edulcorantes ms eficaces, y se han obtenido
microorganismos modificados tiles en los procesos fermentativos destinados a la produccin de alimentos. Estas
nuevas cepas de bacterias lcticas, levaduras y hongos filamentosos posibilitan el desarrollo de nuevos productos
o la prevencin de problemas industriales, al estar limitada
su infeccin por virus, especialmente en el caso de las bacterias lcticas. Aunque el desarrollo de animales modificados genticamente es ms difcil y plantea mayores
problemas ticos, tambin se han desarrollado razas transgnicas para producir peces de mayor tamao, mejorar la
composicin de la carne y de la leche en los mamferos o
aumentar la calidad de la lana, as como para producir protenas con fines teraputicos. Por otra parte, la clonacin
de animales de granja es un hecho y, aunque es un proceso an muy complejo no exento de riesgos, en el futuro
podr permitir mayores producciones de alimentos con
mejor calidad.
Todos estos alimentos transgnicos han de pasar un proceso de evaluacin complejo antes de llegar al consumidor.
Dicho proceso incluye el estudio de la mejora gentica introducida (caractersticas del organismo donante y del receptor, sitio de insercin, patrn de expresin del gen transgnico y consecuencias potenciales de la modificacin), la
seguridad alimentaria del alimento (caractersticas nutricionales, composicin e inocuidad, toxicidad y alergenicidad
posibles, cambios potenciales en la ingesta e impacto nutricional a largo plazo) y el potencial impacto en el medio ambiente. Adems, desde el 18 de abril de 2004 la nueva regulacin sobre trazabilidad y etiquetado de los OMG es de
obligado cumplimiento en todos los estados miembros de la

CAPTULO

19

Unin Europea. La normativa establece que se indique la

presencia de un OMG en un producto cuando al menos el
0,9% de uno de sus ingredientes sea OMG o proceda de un
OMG. Adems, la normativa exige conocer con exactitud el
origen y los detalles del proceso de produccin de los
nuevos OMG o de los alimentos que los contienen.
En este captulo se analiza el concepto de OMG y se describen brevemente las tcnicas ms utilizadas en la tecnologa del DNA recombinante. Asimismo, se describen las tcnicas ms comunes para la produccin de microorganismos,
plantas y animales transgnicos de utilidad en alimentacin
y se ofrecen varios ejemplos de inters. Se destina especial
atencin a la evaluacin sanitaria y medioambiental de dichos productos. Por otra parte, se abordan los aspectos legales relacionados con la produccin, la comercializacin, el
etiquetado y la trazabilidad de los OMG, as como su proteccin jurdica.

n CONCEPTO Y CLASIFICACIN
Los alimentos transgnicos, tambin llamados alimentos
modificados genticamente, son los diseados para cubrir
cualquier necesidad de mejora en los que se ha incorporado
material gentico distinto del original mediante tcnicas de
ingeniera gentica. Segn el derecho alimentario, se considera que se ha creado un nuevo alimento cuando: a) se trata
de una materia prima nueva, b) es el resultado del uso de una
nueva tecnologa de fabricacin o de tratamiento, o c) se establece un nuevo uso a un producto ya existente. Al respecto,
los alimentos obtenidos por modificacin gentica se consideran nuevos alimentos por pertenecer a una nueva tecnologa de fabricacin. De hecho, el Reglamento (CE) n. 258/97
del Parlamento Europeo y del Consejo clasifica los nuevos alimentos en seis categoras, quedando los alimentos transgnicos incluidos en dos de ellas. Por un lado, la categora que
considera nuevo alimento o nuevo ingrediente alimentario al
que contenga OMG o que consista en dichos organismos, por
ejemplo, un yogur producido con bacterias de cido lctico
modificadas genticamente o una lechuga transgnica. Por
otro, la categora que comprende a los alimentos que contengan ingredientes alimentarios producidos a partir de OMG,
por ejemplo, una galleta que contenga harina de maz proveniente de una variedad de maz transgnico.
Histricamente, en la normativa jurdica de la Unin Europea, la definicin de OMG ha tenido un tratamiento especial. As, la Recomendacin de la Comisin de 29 de julio de
1997 realizaba una clasificacin cientfica de los nuevos alimentos con miras a la evaluacin de su salubridad, en la
cual aparecan seis clases de nuevos alimentos, quedando
los alimentos modificados genticamente encuadrados en
tres de ellas, denominadas clases 3, 4 y 5, correspondientes
respectivamente a vegetales, animales y microorganismos
modificados genticamente y sus productos. En las tres
clases se incluan dos subclases relativas a organismos receptores con historial de uso como alimento en la Comunidad en condiciones de preparacin e ingesta comparables
o sin dicho historial de uso.

Coleccin Tratado de Nutricin 2010. Editorial Mdica Panamericana

TOMO

II

COMPOSICIN Y CALIDAD NUTRITIVA DE LOS ALIMENTOS

Posteriormente, la Directiva 2001/18/CE del Parlamento

Europeo y del Consejo de 12 de marzo de 2001 sobre la liberacin intencional al medio ambiente de organismos
transgnicos defina el trmino OMG como el organismo,
con excepcin de los seres humanos, cuyo material gentico haya sido modificado de una manera que no se produce
naturalmente en el apareamiento ni en la recombinacin
natural. En la Posicin Comn (CE) n. 22/2003, aprobada
por el Consejo el 17 de marzo de 2003, se defina al OMG
destinado a la alimentacin humana como aquel que
puede utilizarse como alimento o como material de partida
para la produccin de alimentos. En la misma reglamentacin se consideraban alimentos modificados genticamente
a aquellos que contienen o estn compuestos por OMG, o
han sido producidos a partir de ellos. Conviene aclarar que
la expresin producido a partir de OMG para los legisladores europeos hace referencia a un derivado total o parcial
de OMG que no contenga OMG o est compuesto por OMG.
Adems, en esta definicin, las tcnicas de modificacin gentica incluyen: a) tcnicas de recombinacin del DNA que
consideren la formacin de combinaciones nuevas de material gentico mediante la insercin de molculas de cido
nucleico, obtenidas por cualquier medio fuera de un organismo, ya sea en un virus, plsmido bacteriano u otro vector,
y su incorporacin a un organismo hospedador en el que no
se encuentren de forma natural pero puedan seguir reproducindose; b) tcnicas que supongan la incorporacin directa en el genoma de un organismo de material hereditario
preparado fuera del organismo, incluidas la microinyeccin,
la macroinyeccin y la microencapsulacin, y c) tcnicas de
fusin de clulas (incluida la fusin de protoplastos) o de hibridacin, en las que se formen clulas vivas con combinaciones nuevas de material gentico hereditario mediante la
fusin de dos o ms clulas utilizando mtodos que no se
producen naturalmente.
Por todo lo expuesto en los prrafos anteriores, resulta
evidente que antes de entrar a tratar en profundidad los alimentos modificados genticamente conviene plantear las
tcnicas destinadas a su diseo.

n DNA RECOMBINANTE E INGENIERA

GENTICA

La esencia de la tecnologa del DNA recombinante es el

aislamiento y la manipulacin del DNA, incluyendo la unin
de secuencias de nucletidos de orgenes diversos (virus,
microorganismos, plantas y animales) para generar nuevas
molculas quimricas o nuevas secuencias independientes.
Esta tecnologa implica la utilizacin de muchas metodologas distintas, que se tratarn en este apartado, cuya base
es la existencia de varios mtodos que implican cortar las
cadenas de DNA por lugares especficos mediante el uso de
las denominadas enzimas de restriccin, para posteriormente usar la enzima DNA ligasa para unir segmentos de
DNA de orgenes diferentes, generando as nuevas molculas de DNA quimricas. Por otra parte, existen tcnicas
de clonado que permiten amplificar el nuevo DNA heter-

logo. Su cuantificacin, tanto del DNA clonado como del

RNA que transcriba, es abordable gracias, entre otras tcnicas, al uso de sondas de DNA. Por otro lado, existen mtodos qumicos y enzimticos automatizados que posibilitan
la secuenciacin de largos fragmentos de DNA. Tambin es
posible la sntesis qumica de oligonucletidos con una secuencia precisa. Finalmente, la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) permite la amplificacin de una secuencia
determinada de DNA de forma muy sensible y selectiva.
Toda esta batera de mtodos es la base del trabajo en ingeniera gentica y con ellos se consiguen generar e identificar las molculas quimricas con las que generar los OMG.
Para conseguir introducir esas molculas hbridas en un
organismo receptor, en otras palabras, para generar un
OMG, existen varios mtodos, entre los que se incluyen la
transformacin por plsmidos y la transfeccin por fagos
para el caso de los microorganismos y la transformacin,
para animales y plantas. En todos ellos las clulas hospedadoras deben prepararse para poder recibir el DNA forneo.
En la transformacin microbiana, al generar un DNA recombinante se inserta en l un marcador seleccionable que
permite la identificacin de las molculas recombinantes, por
ejemplo, un gen de resistencia a un antibitico o un gen que
codifica una enzima clave en la sntesis de un aminocido
(marcador auxotrfico). Cuando se utiliza un gen marcador de
resistencia a un antibitico, la clula portadora del DNA recombinante crece en un medio de cultivo que contiene el antibitico. Cuando se utiliza un marcador auxotrfico, por
ejemplo, un aminocido, la clula hospedadora es capaz de
crecer en un medio de cultivo pobre en nutrientes que no contiene dicho aminocido. La transfeccin con fagos supone generar fagos recombinantes en los que parte de su material hereditario se sustituye por el gen transgnico que se quiere
expresar o, simplemente, se suplementa con dicho gen. La introduccin del gen transgnico se realiza siguiendo el proceso
natural de infeccin vrica. En el caso de la transformacin no
bacteriana, se transforman clulas de origen vegetal o animal
mediante diferentes procesos, como la microinyeccin del
DNA directamente en el ncleo o el bombardeo de la clula
con microproyectiles en forma de partculas de oro o tungsteno recubiertas con el DNA recombinante. En el caso de los
vegetales, tambin se puede utilizar una estrategia natural de
transformacin basada en el empleo del plsmido Ti de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que en la naturaleza transforma clulas vegetales generando tumores. Para ello, se eliminan de dicho plsmido las secuencias que codifican las
protenas implicadas en el desarrollo tumoral y se sustituyen
por un marcador de resistencia y por el gen transgnico que
se quiere expresar. Como en el caso de la transfeccin, a continuacin se sigue el proceso de transformacin que se da en
la naturaleza.
El DNA recombinante funciona cuando la clula transformada expresa la protena o las protenas correspondientes a los genes presentes en l. Las protenas recombinantes slo se expresan en cantidades apreciables si,
adems de los genes, se incluye toda una serie de seales
adicionales que permiten la transcripcin y la traduccin de
dicha informacin gentica. Estas secuencias son los pro-

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Alimentos transgnicos

motores, las secuencias gnicas que permiten la unin de

los mRNA a los ribosomas y las seales de terminacin (cap.
5, Sntesis, degradacin y recambio de las protenas, tomo
I, y cap. 6, Regulacin de la expresin gnica en organismos
eucariotas, tomo I). A veces, se generan problemas si el gen
recombinante contiene intrones o ciertas seales que actan de terminadores en el hospedador bacteriano. De esta
forma, la protena recombinante puede ser procesada o plegada incorrectamente o incluso ser degradada.
Mencin aparte merece la produccin de protenas recombinantes de uso en agroalimentacin en sistemas microbianos eucariticos, fundamentalmente levaduras y
hongos filamentosos. El uso de clulas animales es difcil,
debido al hecho de que muchas de ellas necesitan una superficie para crecer y tienen necesidades nutritivas complejas. Sin embargo, algunas protenas son demasiado complejas para poderse producir en bacterias. Sufren procesos
de modificacin qumica (acetilaciones, glucosilaciones) y
obligatoriamente tienen que utilizarse clulas eucariticas
para producirlas correctamente.

n Clonado molecular
Un clon es una poblacin de molculas, bacterias, clulas o individuos idnticos que derivan de un ancestro
comn. El clonado molecular permite la produccin de gran
nmero de molculas idnticas de DNA. Esta tcnica se
basa en la posibilidad de construir molculas de DNA hbrido
o molculas quimricas utilizando vectores de clonado,
como plsmidos, fagos, csmidos o cromosomas artificiales,
que se pueden replicar de forma autnoma en una clula
hospedadora utilizando sus propios sistemas de control. De
esta manera se puede amplificar el DNA quimrico.
Cualquier procedimiento de clonacin tiene cuatro partes
esenciales: a) un mtodo de obtencin de fragmentos de
DNA; b) la unin del DNA a un vector, con la consiguiente obtencin del DNA recombinante; c) la introduccin del DNA recombinante en un hospedador, y d) la disponibilidad de un
mtodo de seleccin del clon que ha adquirido el DNA recombinante. La figura 19-1 ilustra el procedimiento general
de obtencin de DNA recombinante y la figura 19-2, el de
clonado de DNA.
Para la obtencin de fragmentos de DNA se utiliza preferentemente la digestin con enzimas de restriccin (v. Enzimas de restriccin, ms adelante), pero tambin se pueden
obtener por rotura mecnica, sntesis de cDNA y sntesis qumica directa de oligonucletidos. La unin al vector (v. Vectores de clonacin, ms adelante) se lleva a cabo mediante la
ligacin de extremos cohesivos, la ligacin de extremos
romos, el encolado mediante homopolmeros o el empleo de
molculas espaciadoras, utilizando varias enzimas (v. Ligado
de fragmentos de DNA y Otras enzimas de inters en la tecnologa del DNA recombinante, ms adelante).
La introduccin del DNA recombinante se lleva cabo mediante procedimientos de transformacin bacteriana con
DNA plasmdico, transduccin con fagos o csmidos y, en
el caso de clulas eucariotas, mediante transformacin o

CAPTULO

19

transfeccin con vectores diversos (v. Vectores de clonacin, ms adelante). La seleccin de los clones se realiza
mediante mtodos microbiolgicos, inmunoqumicos y de
hibridacin con cidos nucleicos

n Enzimas de restriccin
Las endonucleasas son enzimas que cortan el DNA en secuencias especficas dentro de la molcula, en oposicin a
las exonucleasas, que digieren los extremos terminales de
las molculas de DNA. Un tipo de endonucleasas, denominadas genricamente enzimas de restriccin porque su presencia en una bacteria determinada restringe el crecimiento
de bacterifagos, representa una herramienta clave en la tecnologa del DNA recombinante. Estas enzimas cortan el DNA
de cualquier origen en secuencias muy especficas, al contrario que otras enzimas o mtodos qumicos o fsicos que lo
hacen al azar. En la naturaleza protegen a la bacteria hospedadora de la infeccin por fagos, impidiendo la replicacin del
DNA forneo. Actualmente se conocen miles de estas enzimas, as como la secuencia especfica de corte. Las enzimas
de restriccin estn acompaadas en las clulas de otras enzimas que metilan el DNA del hospedador, lo que impide la digestin por la propia enzima de restriccin. As, las metilasas
especficas de sitio y las enzimas de restriccin siempre estn
en las bacterias de forma apareada.
Las enzimas de restriccin se denominan mediante varias letras que hacen mencin a la bacteria de la que proceden. Las tres primeras letras sirven para nombrar el gnero
(primera letra) y la especie (segunda y tercera letras). Estas
pueden ir seguidas de una letra que designa la cepa y de un
nmero romano que indica el orden del descubrimiento. Por
ejemplo, EcoRI se ha obtenido de la cepa R de la bacteria Escherichia coli, y BamHI, de la cepa H de Bacillus amyloliquefaciens. La enzima EcoRII se obtuvo despus de la EcoRI
(tabla 19-1).
Cada enzima de restriccin corta una secuencia especfica de DNA de doble cadena de 4 a 7 pares de bases (pb),
dando lugar a la aparicin de extremos romos, como es el
caso de EcoRII o HpaI o de extremos solapantes o cohesivos,
por ejemplo BamHI. La figura 19-3 muestra el mecanismo de
accin de la enzima de restriccin EcoRI. Teniendo en cuenta
que el DNA est constituido por cuatro bases diferentes (A, C,
G y T), una enzima de restriccin que reconoce una secuencia
de 4pb corta una media de cada 4 4 pb (256pb) y una que reconoce una secuencia de 6pb corta cada 46 pb (4.096pb). Por
lo tanto, se puede elaborar en una determinada secuencia o
fragmento de DNA un mapa de restriccin utilizando varias
enzimas. Los fragmentos producidos pueden separarse y, posteriormente, aislarse por electroforesis en gel de agarosa o
poliacrilamida, siendo ste un paso esencial para la clonacin.

n Ligado de fragmentos de DNA

El ligado de fragmentos con extremos cohesivos es tericamente muy sencillo, ya que despus del apareamiento, la

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TOMO

II

COMPOSICIN Y CALIDAD NUTRITIVA DE LOS ALIMENTOS

DNA complejo portador

del fragmento de inters

DNA vector

DNA enteros

DNA digeridos

Ligacin
Productos
de la mezcla
de ambos DNA
con T4 DNA ligasa
Molcula
recombinante

Figura 19-1. Obtencin de DNA recombinante. T4 DNA ligasa: DNA ligasa procedente del bacterifago T4.
enzima DNA ligasa une los fragmentos complementarios de
los DNA heterlogos, dando lugar a la formacin de una molcula de DNA recombinante (fig. 19-4). Sin embargo, los extremos de un vector pueden reconectarse por s mismos des-

pus del tratamiento con una enzima de restriccin. Asimismo, tambin pueden aparearse formando concatmeros
heterogneos. Para solventar estos problemas se usan diluciones extremas de los fragmentos. En el caso de molculas

In vitro
Escherichia coli K12
portadora del vector

Clula que contiene

el DNA de inters

In vivo
Escherichia coli K12
para transformar

Clulas
competentes

1
Purificacin
rificaci
del DNA

4
sformac
Transformacin

2
Digestin
gestin

5
3
igacin
Ligacin

cin de clones
Seleccin
transformantes

6
n de cl
Deteccin
clones
recombinantes

Figura 19-2. Procedimiento general de clonado de DNA.

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Alimentos transgnicos

BamHI

Secuencia
de corte

AGATCT
TCTAGA

19

Sitio de reconocimiento

Tabla 19-1 Enzimas de restriccin y secuencias

de corte del DNA
Endonucleasa

CAPTULO

Fuente bacteriana

G-A-A-T-T-C

C-T-T-A-A-G

Bacillus
amyloliquefaciens H

Tratamiento con EcoRI

BgIII

C-T-T-A-A

Bacillus globigii

AGATCT
TCTAGA

EcoRI

3
5

EcoRI

Escherichia coli RY13

GAATTC
CTTAAG

EcoRII

A-A-T-T-C
Colas complementarias

Escherichia coli R245

G A A T T C

G A A T T C

C T T A A G

C T T A A G

CCTGG
GGACC

HindIII

Haemophilus influenzae Rd
Generacin de
extremos cohesivos

AAGCTT
TTCGAA

HhaI

Haemophilus haemoliticus

GCGC
CGCG

A A T T C
G

C T T A A

Extremo cohesivo

HpaI

GTTAAC
CAATTG

Haemophilus
parainfluenzae

MstII

Microcoleus strain

CCTNAGG
GGANTCC

G A A T T C

PstI

C T T A A G

Providentia stuartii 164

CTGCAG
GACGTC

TaqI

Thermus aquaticus YTI

TCGA
AGTC

A: adenina; C: citosina; G: guanina; T: timina. Las flechas muestran el

sitio de corte. Segn el sitio de corte se forman extremos romos (p.
ej., HpaI) o extremos cohesivos (p. ej., BamHI).

con extremos romos se aaden nuevas colas de polinucletidos a los extremos 3. Esta enzima se denomina transferasa
terminal. Por ejemplo, si se aade poli-dG al extremo 3 de un
vector y poli-dC al extremo 3 del DNA, se aparearn entre s.
Este procedimiento se denomina encolado homopolimrico.
Tambin se pueden unir segmentos sintticos de DNA de
doble cadena con extremos romos, que contienen uno o ms
sitios especficos para enzimas de restriccin, denominados

DNA recombinante

Figura 19-3. Mecanismo de accin de la enzima de restriccin EcoRI y su aplicacin en la generacin de molculas de DNA recombinante.
espaciadores o polilinkers, a los extremos del DNA de cualquier
fragmento utilizando la DNA ligasa procedente del bacterifago T4. Esta tcnica permite unir cualquier par de extremos,
aunque no existe control de la orientacin de la insercin o del
nmero de molculas apareadas consigo mismas.

n Otras enzimas de inters en la tecnologa

del DNA recombinante
En la tecnologa del DNA recombinante se utiliza otra serie
de enzimas cuyas funciones se detallan a continuacin.
La fosfatasa alcalina desfosforila los extremos 5 del
RNA y del DNA. Se utiliza para eliminar los grupos 5-fos-

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TOMO

II

COMPOSICIN Y CALIDAD NUTRITIVA DE LOS ALIMENTOS

G-A-A-T-T-C

G-A-A-T-T-C

C-T-T-A-A-G

C-T-T-A-A-G

Digestin con EcoRI

G

Digestin con EcoRI

C-T-T-A-A

A-A-T-T-C
Hibridacin de fragmentos
complementarios

Hueco

G A-A-T-T-C
C-T-T-A-A G
Hueco

DNA ligasa

G- A - A - T - T - C
C - T - T - A - A -G

Figura 19-4. Ligado de DNA heterlogo y formacin de DNA recombinante.

fato y prevenir as la autoligacin de fragmentos de DNA.

La nucleasa BAL-31 degrada tanto el extremo 5 como el 3
de molculas de DNA, provocando el acortamiento progresivo de los fragmentos. Se utiliza para generar subfragmentos de secuenciacin y tambin para localizar genes
concretos. La DNA polimerasa I sintetiza la formacin de
DNA de doble cadena a partir de una hebra simple de DNA
que sirve como modelo. Se utiliza para la sntesis de cDNA,
la eliminacin de mellas y la generacin de extremos
romos a partir de extremos cohesivos. La enzima DNasa I
bajo condiciones apropiadas produce mellas en el DNA y
se utiliza en el mapeado de sitios hipersensibles del DNA
y en el mapeado de lugares de interaccin del DNA con
protenas. La exonucleasa l elimina nucletidos del extremo 5 y la exonucleasa II elimina nucletidos del extremo 3. Ambas se usan en la secuenciacin del DNA. La
polinucletido quinasa transfiere fosfatos terminales en
posicin l desde el adenosintrifosfato (ATP) hasta los
grupos hidroxilo en 5 del DNA o del RNA y se utiliza en el
marcado con el istopo 32P del DNA o del RNA. La transcriptasa inversa sintetiza DNA a partir de RNA y se usa
para sintetizar cDNA a partir de RNA y para el mapeado de
regiones 5 del RNA. Finalmente, la nucleasa S1 degrada
el DNA de cadena simple y se utiliza en la eliminacin de
bucles en la sntesis de cDNA y en el mapeado de las regiones 5 y 3 del RNA.

n Vectores de clonacin
8

Los vectores de clonacin son plsmidos o fagos o variaciones de ellos. Los plsmidos son molculas de DNA de

doble cadena circulares cuya funcin natural ms importante es conferir ventajas adaptativas a las clulas que los
contienen. Los plsmidos tienen varias propiedades que
hacen que sean muy tiles como vectores de clonado. Por
ejemplo, estn presentes en las bacterias como copias nicas o mltiples que se replican independientemente del
DNA bacteriano. Actualmente se conoce la secuencia completa de numerosos plsmidos, as como la localizacin precisa de los sitios de corte para diferentes enzimas de restriccin y, por lo tanto, los lugares en los que es posible insertar
DNA de otros organismos. Adems, los plsmidos, al tener
un tamao muy distinto al del cromosoma bacteriano,
pueden aislarse con facilidad. La figura 19-5 muestra el
mapa de restriccin del plsmido pBR322 de E. coli, y la figura 19-6, la insercin de DNA extrao en un plsmido.
Los fagos son virus que atacan bacterias y estn constituidos usualmente por molculas de DNA lineal, con varios
sitios de corte para enzimas de restriccin especficas en
los cuales puede insertarse el DNA forneo, de forma que el
conjunto se empaqueta en la cabeza proteica del virus. El
DNA quimrico formado puede recogerse despus de que
se complete el ciclo de lisis celular, de modo que se produzcan numerosas partculas infectivas. La ventaja de los
fagos como vectores en el clonado molecular de DNA es
que pueden aceptar fragmentos de DNA de 10-20 kpb,
mientras que los plsmidos tan slo pueden aceptar fragmentos de 6-10kpb.
Los csmidos son plsmidos que contienen unas secuencias especficas, denominadas cos, necesarias para el empaquetamiento del DNA del fago l dentro de su cabeza. Estos
plsmidos combinan las ventajas de los propios plsmidos y
de los fagos, ya que crecen dentro de la bacteria como pls-

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Alimentos transgnicos

midos, pero pueden almacenar una cantidad mucho mayor

de DNA dentro de la cabeza del fago, ya que la mayor parte
del genoma del fago l ha sido eliminada. Usualmente los csmidos pueden llevar insertos de hasta 50kpb.
Otro tipo de vector de clonacin son los cromosomas
artificiales de levaduras (yeast artificial chromosome, YAC).
Pueden llevar insertos mucho ms grandes, ya que se trata
de segmentos cromosmicos de levaduras, por lo tanto lineales, que contienen la regin centromrica, siendo segregados de manera muy estable de acuerdo con patrones
mendelianos. Los YAC permiten clonar segmentos de DNA
de ms de 40kpb, incluso hasta cientos de kpb y, por lo
tanto, la amplificacin de grandes molculas de DNA con un
fondo gentico simple. En las levaduras, adems de los
YAAC, se utiliza para la clonacin toda una serie de plsmidos (epismicos, centromricos, etc.).
Para la insercin y expresin del cDNA en clulas de
mamferos se han desarrollado vectores especficos basados en virus animales, por ejemplo adenovirus, que tienen genomas DNA, y retrovirus, que tienen genomas RNA.
Aunque estos vectores tienen limitaciones en cuanto a la
longitud de los insertos, son capaces de infectar numerosos
tipos celulares y permiten la expresin eficiente de genes
complejos.
Un tipo especial de vector es el constituido por los denominados vectores de expresin. Permiten la expresin de
uno o varios genes introducidos con el inserto de DNA.
Estos vectores estn construidos de manera que, por un
lado, contienen promotores muy activos fcilmente inducibles y, por otro, codones adecuados que permiten el inicio
de la traduccin en fase de los RNA correspondientes. Tambin contienen seales para la terminacin de la transcripcin y de la traduccin y para el procesamiento de las protenas (cap. 5, Sntesis, degradacin y recambio de las

CAPTULO

19

protenas, tomo I, y cap. 6, Regulacin de la expresin gnica

en organismos eucariotas, tomo I).

n Seleccin del DNA recombinante

Como anteriormente se indic, todos los vectores llevan
un marcador o propiedad gentica seleccionable. Los plsmidos y los csmidos llevan marcadores nutricionales o de
resistencia a antibiticos u otros frmacos. En el caso de los
fagos, la formacin de placas de lisis representa en s misma
la propiedad seleccionada. En el caso de los DNA recombinantes que llevan un vector plasmdico con marcadores de
resistencia a antibiticos, la seleccin de las clulas clonadas
se realiza utilizando medios de cultivo que llevan aadidos
dichos antibiticos, ya que en estos medios slo crecen las
bacterias que llevan los plsmidos recombinantes.
La inactivacin por insercin del DNA forneo de un
marcador de resistencia a antibiticos o de un gen como
la b-galactosidasa son ejemplos de cmo se puede seleccionar una poblacin de clulas recombinantes. Por ejemplo, si en el conocido vector plasmdico pBR322, que tiene
como marcadores de resistencia los genes que codifican
para la resistencia a la tetraciclina (tet) y a la ampicilina
(amp), se inserta un segmento de DNA forneo en el sitio
nico de corte para la enzima de restriccin PstI (ubicado
en el locus amp), las bacterias que incorporen este DNA
recombinante sern resistentes a la tetraciclina pero sensibles a la ampicilina.
La deteccin por tcnicas inmunoqumicas de clones
que sintetizan una nueva protena es til si el gen insertado
se transcribe y traduce a protena, especialmente cuando
el gen no confiere ninguna propiedad al hospedador fcilmente seleccionable con otros mtodos. Para utilizar esta
EcoRI HindIII

Con sitios nicos

de restriccin para
poder clonar en ellos
Con un marcador
directamente
seleccionable
(seleccin)
Con un marcador
que se inactive
por la introduccin
del inserto
(deteccin)

Ampr

Tetr

PstI

SalI
Sal

pBR322
4,4 kb

Pequeas molculas
de DNA autorreplicativas
(plsmidos o genomas
fgicos)

ColE1ori

Figura 19-5. Caractersticas de los vectores de clonacin. Se representa el plsmido pBR322 de E. coli que contiene un origen
de replicacin, varios sitios de restriccin nicos (EcoRI, HindIII, SalI) y dos marcadores de resistencia a antibiticos (ampicilina y tetraciclina). Amp: ampicilina; Tet: tetraciclina.
Coleccin Tratado de Nutricin 2010. Editorial Mdica Panamericana

TOMO

II

COMPOSICIN Y CALIDAD NUTRITIVA DE LOS ALIMENTOS

EcoRI

Plsmido
EcoRI

A A T T
C
T T A A
C
G

EcoRI

G A AT T C

DNA para ser

insertado

TTC
G AA

EcoRI

CT T AA G
Extremos
cohesivos

EcoRI

CT T AA G

EcoRI

Recombinacin
y ligacin de DNA

C
T T
A

T
T

G
T

DNA
recombinante

A
A

A
T

T
C

Figura 19-6. Insercin de DNA extrao en un plsmido.

tcnica, es necesario disponer del anticuerpo especfico

para la protena codificada en el transgn.
Finalmente, es posible acudir a los mtodos de hibridacin con cidos nucleicos para la seleccin de recombinantes. El procedimiento consiste en detectar secuencias
determinadas de DNA en colonias transformadas por hibridacin in situ con sondas radiactivas o marcadas con un fluorforo de fragmentos de DNA del gen que se quiere detectar.
Este mtodo es capaz de identificar una colonia positiva
entre miles de negativas. Una gran ventaja de los mtodos de
hibridacin es que no requieren la expresin de los genes
insertados y puede aplicarse a cualquier secuencia.

n Libreras genmicas

10

La combinacin de enzimas de restriccin y de varios

vectores de clonado permite el empaquetado del genoma
completo de cualquier organismo. La coleccin de clones

recombinantes que constituyen el genoma global se denomina genoteca o librera genmica. De forma similar, una librera de cDNA comprende todos los cDNA complementarios de la poblacin de mRNA presentes en un organismo o
tejido determinado.
Las libreras genmicas se preparan por digestin parcial del DNA genmico utilizando una enzima de restriccin,
con objeto de generar fragmentos suficientemente largos
de DNA de manera que contengan genes completos intactos. Estos fragmentos se reinsertan en vectores que permiten la insercin de fragmentos largos de DNA como los
YAC o los vectores basados en el bacterifago P1 de E. coli.
Para detectar la funcin de genes presentes en el cDNA
de las libreras genmicas se utilizan vectores de expresin,
algunos de ellos con genes que codifican para inhibidores
de proteasas, con lo que la produccin de la protena final
aumenta.
Las sondas marcadas con 32P o con una molcula fluorescente se utilizan para reconocer secuencias complemen-

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