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E.T.S.L.

BREVET de TECHNICIEN SUPERIEUR de BIOPHYSICIEN


Session 2011
TECHNIQUES dANALYSES SPECTRALES & SEPARATIVES
PREUVE SUR 80 POINTS
Aucun document autoris. Machine calculer autorise.

Dure : 4 heures
10 pages

Chaque exercice est indpendant.

Exercice 1 : Chromatographie en phase gazeuse de la nicotine ( 19,5 points)


On ralise le chromatogramme dune solution
de nicotine, afin de connatre ses
caractristiques chromatographiques pour une
utilisation ultrieure en tant qutalon interne,
dans les conditions opratoires suivantes :
CPG. Colonne remplie ;
Phase stationnaire :
10 % Carbowax 20 M/2 % KOH sur 80/100
Chromosorb W AW ;
Dimension de la colonne :
183 cm (longueur) x 2 mm (diamtre
intrieur) ;
Dbit de la phase mobile : D = 20 mL/min ;
Quantit injecte : 1 L ;
Dtecteur : FID.
Four : T1 = 200 C. Temps de rtention de la
nicotine : tR1 = 3,20 min.

Figure 1 : Chromatogramme de la nicotine


pour un four programm une temprature
de 200 C
1/ Prciser le principe de la chromatographie en phase gazeuse. Dans le cas de cet exercice,
prciser quel est le mode de fonctionnement du four. (2 points)

2/ La colonne remplie utilise est remplie dun matriau de garnissage ou support solide, finement
et uniformment divis, recouvert dune couche mince de la phase stationnaire liquide.
- a - Quel est lutilit du support solide ? (1,5 points)
- b - Quelle est la nature du support utilis, et pourquoi est-ce un support de choix pour
la chromatographie en phase gazeuse ? (1,5 points)
3/ Le dtecteur utilis est un FID.
- a - Que veut dire lacronyme FID ? (1 point)
- b - Indiquer le principe de fonctionnement de ce type de dtecteur. Prciser les
avantages et les inconvnients de ce type de dtecteur. (2 points)
4/ La phase stationnaire mentionne dans les spcifications est gnralement utilise pour les
alcalodes comme la nicotine. Elle pourrait tre remplace par une phase plus conventionnelle telle
que la 5% phnyl-polydimthyl siloxane.
quel type dchantillon (en terme de polarit) rserve-t-on cette phase ?
Quelle est la signification de la valeur 5 %, indique dans le nom du polymre utilis pour la
phase stationnaire ? (1,5 points)
5/ Citer un exemple de phase mobile utilisable pour ce type de chromatographie. Quelles
doivent tre les caractristiques de la phase mobile ? (1,5 points)
6/

- a - Calculer la vitesse linaire moyenne u de la phase mobile dans la colonne en cm/s.


(On rappelle que le dbit est un volume par unit de temps) (1,5 points)
- b - En dduire le temps mort tM de cette analyse. La valeur obtenue est-elle cohrente
avec le chromatogramme prsent en figure 5 ? (1 point)
- c - On change le mode de programmation du chromatographe afin de raliser une nouvelle
chromatographie de la nicotine. Pour un four programm une temprature T2 = 180 C, on
obtient pour la nicotine un temps de rtention tR2 = 6,60 min. Ltude thermodynamique de
linfluence de la temprature sur les temps de rtention montre que ces deux grandeurs sont
lies par la relation suivante :
A
Ln(tR tM) =
+B
T
O A et B sont des constantes pour un compos donn et une colonne donne.
Calculer le temps de rtention tR3 de la nicotine une temprature T3 = 160 C.
!
(3 points)
- d - Peut-on luer la nicotine en moins dune minute, sachant que la temprature
limite dutilisation de la colonne est de 250 C ? (3 points)

7/ Conclure en prcisant sur quel(s) autre(s) facteur(s), lutilisateur pourrait agir afin de
diminuer le temps danalyse. (2 points)

Exercice 2 : Dosage direct du phosphore dans les sols par spectromtrie


dabsorption atomique et comparaison avec une mthode de spectrophotomtrie
( 31,5 points)
Le phosphore constitue lun des lments minraux ncessaires la croissance des plantes dans
lesquelles il est stock.
En excs dans les sols et les eaux de surface, il contribue une dgradation des milieux aquatiques
par un dveloppement rapide des algues et des plantes aquatiques. La bonne comprhension des
mcanismes biogochimiques du phosphore ncessite donc la quantification de cet lment.
1/ La spectromtrie dabsorption atomique est peu utilise pour le dosage direct du phosphore en
particulier lorsque la flamme, alimente par un mlange de protoxyde dazote et dactylne, est
utilise comme atomiseur.
- a - Indiquer en quoi consiste le processus datomisation (1 point).
- b - Latomiseur de flamme est constitu dun nbuliseur tubes concentriques. Lgender
le nbuliseur fourni en annexe 1 ( rendre avec la copie), et expliquer succinctement
son fonctionnement. (3 points)
- c - Indiquer quels sont le combustible, le comburant utiliss dans la flamme ainsi que
le domaine approximatif de temprature de la flamme. Pourquoi utilise-t-on un tel
mlange ? (2,5 points)
2/ Pour augmenter la sensibilit de la mthode, on utilise latomisation par four ou encore appele
lectrothermique. De plus, cette mthode permet lanalyse directe du phosphore dun chantillon
solide ou mis en solution, en ntant que peu affecte par les interfrences spectrales.
Prciser ce que sont les interfrences spectrales. (1,5 points)
3/ Pour irradier lchantillon, on utilise une lampe cathode creuse en phosphore.
- a - Complter le schma de lannexe 2 ( rendre avec la copie) et expliquer le principe
de fonctionnement dune telle lampe. (5,5 points)
- b - Le phosphore est dos la longueur donde = 213,6 nm. Dans quel domaine de
longueur donde se situe la longueur donde de dosage ? Calculer lnergie
correspondante absorbe par latome de phosphore en eV. (1,5 points)
On donne 1 eV = 1,6.10-19 J ; h = 6,62.10-34 J.s, et c = 3,00.108 m.s-1.
4/ Les conditions analytiques dcrites prcdemment ont t utilises pour le dosage du phosphore
dans un chantillon de sol certifi (SSC) et dans un chantillon de vgtal certifi (SVC). Les
concentrations en phosphore mesures ont t exprimes en poids sec et sous forme dune
concentration moyenne cart-type.
- a - Pour lchantillon SSC, on obtient 1037112 mg de phosphore par kg de sol
comparer la valeur certifie de 101065 mg.kg-1. Obtient-on une sur-valuation ou
une sous-valuation par rapport la valeur certifie ( chiffrer). (1,5 points)
- b - Pour lchantillon SVC, on obtient 2207156 mg de phosphore par kg de vgtal
comparer la valeur certifie de 220478 mg.kg-1. Obtient-on une sur-valuation ou
une sous-valuation par rapport la valeur certifie ( chiffrer). (1,5 points)
3

5/ Le phosphore assimilable de trois chantillons composites de sols agricoles a t analys par


ETAAS (Electrothermal Atomic Absorption Spectrometry) ou en franais SAAE
(Spectrophotomtrie dAbsorption Atomique lectrothermique). Les rsultats ainsi obtenus ont t
compars avec ceux issus danalyses par spectrophotomtrie (SC) ralises par le Laboratoire
dAnalyse des Sols de lINRA dArras.
Tableau 1 : Comparaison des teneurs en Phosphore obtenues par SAAE (P1) et spectrophotomtrie
(P2) de 3 chantillons de sols agricoles.
chantillons

P1 (mg.kg-1)
(par SAAE)

S1
S2
S3

513,613,5
150,56,9
153,52,3

Coefficient de
variation de P1
(%)
2,6
?
?

P2 (mg.kg-1)
(SC)
528,3
153,7
151,9

cart relatif
entre P1 et P2
(%)
- 2,8
?
?

- a - Calculer les valeurs des coefficients de variation pour les chantillons S2 et S3


(reprsents par des points dinterrogation dans le tableau). Que peut-on dire de ces
valeurs ? (2 points)
- b - Calculer les valeurs des carts relatifs pour les chantillons S2 et S3 (reprsents
par des points dinterrogation dans le tableau). Que peut-on dire de ces valeurs ? (2
points)
6/

- a - La dmarche a t complte par lanalyse du phosphore de 35 chantillons de sols


urbains, en utilisant dune part, un spectrophotomtre dabsorption molculaire, Spectronic
Genesys 5 (Thermo Fisher Scientific), et dautre part, la ETAAS. La premire mthode de
dosage sera celle de rfrence, et la seconde sera la mthode alternative : elles ont t
compares en termes de justesse.
La figure 4 reprsente les moyennes des concentrations en phosphore obtenues par la
mthode de rfrence en fonction de celles mesures en ETAAS.

Figure 2 : Corrlations entre les teneurs en Phosphore (P) mesures en ETAAS


(ou SAAE) et celles obtenues par spectrophotomtrie (SC)
4

Que permettent de dire les valeurs de R2 ? (1 point)


- b - Le tableau 4 prsente les valeurs des paramtres statistiques calculs.
Tableau 2 : Valeurs des donnes statistiques.
Ensemble des donnes
(toute teneur en
phosphore)
cart-type rsiduel
14,003
cart-type de la pente
0,015
cart-type de lordonne lorigine
2,997
La pente est-elle significativement
?
diffrente de 1 ?
Lordonne lorigine est-elle
?
significativement diffrente de 0 ?
Grandeurs statistiques

Teneur en Phosphore
faible
20 < [P] < 80 mg.kg-1
3,330
0,054
2,484
NON
NON

Dans le cas de lensemble des donnes, laide dun calcul statistique, rpondre par oui ou
par non aux deux dernires cases de la colonne correspondante.
On donne ttable = 2,04.
Que dire alors des diffrences entre les deux mthodes (rfrence et alternative) ? (4 points)
7/ Il est noter toutefois, la longueur donde = 213,6 nm, la prsence possible dinterfrences
spectrales, en particulier, avec le fer (Fe = 213,859 nm) et le zinc (Zn = 213,856 nm).
- a - Calculer en valeur absolue, les variations dnergie absorbe entre le phosphore et
le fer et entre le phosphore et le zinc. Donner les rsultats en meV. ( 2 points)
- b - Pour tester les interfrences spectrales on effectue des mesures rpertories dans le
tableau 3 :
Tableau 3 : Concentrations en phosphore (P) mesures en ETAAS ( = 213,6 nm) aprs ajout
dune quantit croissante de Fe ou de Zn.
Fe ou Zn
(mg.L-1)
1
10
100
500
Moyenne
cart-type

P seul
0,003
0,004
0,003
0,002
0,003
0,001

P (0 mg.L-1)
P + Fe
0,005
0,050
0,072
0,032
0,040
0,028

P + Zn
0,052
0,085
0,147
0,302
0,146
0,111

P seul
2,194
2,194
2,286
2,299
2,243
0,057

P (2,25 mg.L-1)
P + Fe
2,191
2,426
2,149
2,414
2,295
0,146

P + Zn
2,077
2,268
2,049
1,454
1,962
0,352

Que montrent ces rsultats ? Pour des concentrations en zinc suprieures une valeur
de 100 mg.L-1, y a-t-il une sous-valuation ou une sur-valuation de la concentration en
phosphore mesure ? (1,5 points)
- c - En conclusion, que faudrait-il faire pour rduire voire liminer les interfrences
spectrales ? (1 point)

Exercice 3 : Dialyse. ( 13 points)


La myosine du muscle squelettique du lapin (M = 545 kDa) est extraite dans un tampon T1 de force
ionique et de pH convenables. Pour purifier la fraction correspondant uniquement la myosine, on
fait une prcipitation dans de lactone - 20 C.
Le culot contenant la myosine fortement contamine est repris dans du tampon T2 et on obtient ainsi
une suspension S1. Aprs prlvement dun aliquot pour faire le dosage des protines, le volume
restant de S1 est de 15,3 mL. Dans S1, lactone est 3 % (p/v).
S1 est ensuite dialyse contre le tampon T2 afin de conserver lintgrit de la myosine.
Le dosage de la myosine dans S1 donne une concentration en protine de 1,81 mg.mL-1.
1/ Que se passe-t-il au cours de la dialyse ? Que cherche-t-on faire ? (2 points)
2/ Si on dialysait contre le tampon T2 renouvel en permanence, au bout de combien de temps (en
heure) pourrait-on considrer que la myosine est pure (au moins de 0,01 % de contaminant en
masse par rapport la masse de protine) ? (4 points)
3/ Avant de procder la dialyse, le technicien cherche savoir lequel des deux protocoles suivants
lui donnera le meilleur rsultat. Dans les deux cas, il fait les calculs en travaillant sur les 15,3 mL
de S1. chaque tape, le tampon est remplac par du tampon frais. (1 point)
(Compartiment 1 : VS1 = 15,3 mL ; compartiment 2 correspondant au bain de contre-dialyse :
Vtampon = T2)
Tableau 4 : Concentration de X en fonction de la pression osmotique.
Protocole 1
Tampon T2 (mL) Temps (min)
Etape 1
Etape 2
Etape 3

250
250
250

120
120
120

Protocole 2
Tampon T2 (mL)
Temps (min)
100
250
400

180
120
60

- a - Calculer pour le protocole 1, la concentration (p/v) finale en actone dans le


boudin de dialyse. (3 points)
- b - Idem pour le protocole 2. (3 points)
- c - Conclusion sur le protocole le plus efficace. (1 point)
Donnes : = 1,82.10-2 min-1.

Exercice 4 : tude spectroscopique UV-Visible


benzoylhydrazone (SBH) et de sa complexation ( 16 points)

du

salicylaldehyde

Les complexes mtalliques de la molcule de SBH sont trs tudis. Le SBH peut ragir avec
plusieurs cations mtalliques de transition pour former des complexes de rfrence dans lindustrie
pharmaceutique.
Par exemple, le complexe du SBH avec le cuivre prsente une activit anti-tumeur.
La comparaison des spectres du SBH dans diffrents milieux ainsi que ceux des complexes
correspondants permet didentifier les chromophores et den dduire la nature des liaisons de
coordination formes entre la molcule de SBH avec, en particulier, le Cobalt Co(II).
1/ Rappeler la dfinition dun chromophore. (1 point)
2/ Exprimentalement, on utilise des cuves en quartz. Quel est lintrt dutiliser de telles
cuves ? (0,5 point)
3/ On effectue un premier spectre du
SBH dans le mthanol. Pour cela, on
met 3 mL de mthanol dans une cuve en
quartz, dans laquelle, on rajoute 10 L
de SBH.
Lappareil
utilis
tant
un
spectrophotomtre
monofaisceau
informatis, indiquer, en pratique, les
diffrentes tapes dobtention dun
spectre optimis. (4 points)
On obtient alors le spectre ci-contre :

Figure 3 : Spectre du SBH.


4/ On observe sur le spectre prcdent, principalement 4 pics dabsorption dont les caractristiques
sont les suivantes :
Tableau 5 : Caractristiques des pics composant le spectre UV-Visible du SBH dans le mthanol
(CSBH = 4,2.10-5 mol.L-1).
( ? )
234,4
286,1
297,2
329,1

A( ? )
0,253
0,535
0,186
0,444

( ? )
6,09.103
2,16.103
4,47.103
10,67.103

Indiquer le nom et lunit de chacune de ces grandeurs. Aux vues des valeurs de A, peut-on
crire une relation de linarit entre ces grandeurs ? Donner le nom de cette relation. (2,5
points)
7

5/ Lorsque lon rajoute un mtal de transition M comme le Cobalt Co(II) diffrente concentration,
et un compos X comme la molcule AcONa (Ac reprsentant le groupement actyle CH3CO), on
forme le complexe dont la structure est donne ci-dessous :

Figure 4 : Structure du complexe M-SBH.


On obtient les spectres suivants :

Figure 5 : volution du spectre dabsorption UV-Visible du SBH en prsence de 0 ; 0,5 ; 1,0 et 1,5
fois une concentration donne (1,6.10-3 mol.L-1) de cobalt (II).
On observe 4 nouveaux pics qui sont 226,7 ; 258,5 ; 300,7 et 382,5 nm.
- a - Que peut-on dire de leffet de complexation sur la molcule de SBH (utiliser les
termes batochrome, hypsochrome, hyperchrome et hypochrome, en ayant pris soin au
pralable de dfinir chacun de ces termes). (4 points)
- b - Les spectres, une concentration de 1,0 1,5 fois la concentration en cobalt Co(II),
tant quasiment confondus, que peut-on en conclure sur la raction de complexation ?
(0,5 point)
6/ Dautres facteurs peuvent modifier labsorption des chromophores, comme par exemple, le
changement de solvant, le pH ou la temprature.
- a - Indiquer ce quest la solvatochromie en prcisant le type dinteractions qui entrent
en jeu. (1 point)
8

- b - Quel effet a le pH du milieu sur labsorption des chromophores ? (1,5 points)


- c - Quel est leffet dune augmentation de temprature ? (1 point)

FIN DE LPREUVE

ANNEXES RENDRE AVEC LA COPIE

Annexe 1 (exercice 2)

Annexe 2 (exercice 2)

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