CONCEPTOS DE RELAJACIN EN RESONANCIA

MAGNTICA NUCLEAR
Miquel Pons
Laboratori de RMN de Biomolcules. Institut de Recerca Biomdica (PCB) y
Departament de Qumica Orgnica. Universitat de Barcelona
mpons@ub.edu

Un sistema en equilibrio es invisible por RMN. Cualquier experimento de RMN

requiere una perturbacin que desencadena un proceso dinmico, de cuya observacin
obtenemos la informacin deseada. Este proceso dinmico tiene dos componentes: i)
oscilaciones peridicas, que pueden caracterizarse por su frecuencia y se corresponden con
parmetros espectrales como el desplazamiento qumico o las constantes de acoplamiento y ii)
procesos disipativos que determinan el retorno del sistema al equilibrio de forma
aproximadamente exponencial. Estos procesos se denominan genricamente relajacin.
Desde el punto de vista operativo, la velocidad de relajacin determina el tiempo que
tenemos que esperar para que dos medidas consecutivas realizadas sobre el mismo sistema
sean realmente idnticas o la intensidad y la velocidad de repeticin mximas de los pulsos
que no cause saturacin. Ambos aspectos tienen una incidencia evidente sobre la sensibilidad
de la RMN ya que determinan la utilizacin ptima del tiempo disponible para acumular
espectros.
Tambin desde el punto de vista operativo, el tiempo que el sistema tarda en volver al
equilibrio proporciona la ventana durante la cual podemos medir los otros parmetros
espectrales: para poder distinguir entre dos seales de frecuencias muy parecidas, deberemos
observarlas durante un tiempo comparable con el inverso de la diferencia entre estas
frecuencias y esto solamente ser posible si el sistema no ha llegado al equilibrio antes de
terminar nuestra observacin. La relajacin determina la precisin con la que podemos medir
una frecuencia y determina la mxima resolucin que puede lograrse.
Algunos experimentos de RMN de uso comn, basados en la relajacin, no miden
explcitamente velocidades sino intensidades en estado estacionario, por lo que su origen
puede no ser evidente para el usuario poco atento. Es el caso de algunos experimentos
basados en el efecto NOE o de transferencia de saturacin (por ejemplo los experimentos
STD utilizados para el cribado de colecciones de molculas en diseo de frmacos). Slo la

Relajacin

comprensin de su origen permite optimizar dichos experimentos e interpretarlos de forma

segura.
La comprensin de los efectos de relajacin sobre los experimentos de RMN ha
permitido disear estrategias que minimicen sus efectos adversos (deuteracin exhaustiva,
TROSY) y es responsable de los avances espectaculares que se han producido en los ltimos
aos en el tamao de las molculas que pueden ser estudiadas por RMN.
La relajacin es inherente a cualquier tcnica espectroscpica. En el caso de la RMN,
sin embargo, los procesos de relajacin son especialmente ineficientes y, paradjicamente,
este es el origen de su importancia prctica. La ineficiencia de la relajacin en RMN es debida
a la inoperancia de la relajacin espontnea y a que unas pocas interacciones, en principio
identificables, son las nicas responsables del retorno al equilibrio. Esto permite hablar de
mecanismos de relajacin y relacionarlos con aspectos estructurales (distancias, ngulos,
distribuciones electrnicas) y dinmicos. De esta forma, las velocidades de relajacin pasan
a ser tambin parmetros espectrales informativos e introducen una coordenada temporal en la
imagen que obtenemos de las molculas estudiadas por RMN. La combinacin de la
resolucin atmica con informacin dinmica es la caracterstica que singulariza la RMN
respecto a otras metodologas para el estudio de estructuras.
1. Descripciones de la relajacin
1.1.

Bloch

El retorno al equilibrio de la magnetizacin macroscpica tras una perturbacin fue

descrito por Felix Bloch en 1946 mediante una ecuacin fenomenolgica (es decir que
describe el fenmeno pero no proporciona una justificacin de su origen):

dM
1
1
= ( M H) M z M zeq k [M x i + M y j]
dt
T1
T2

Esta ecuacin contiene los dos tipos de procesos mencionados en la introduccin: el

primer trmino da lugar a un movimiento de precesin cuya frecuencia se va a medir y el
segundo y tercer trmino tienen la forma de una ecuacin cintica de primer orden que
describe el retorno al equilibrio de las distintas componentes de la magnetizacin. Debe
recordarse que el valor de equilibrio de las componentes transversales es cero. Los tiempos
de relajacin dependen del sistema y toman valores que tpicamente oscilan entre 0.1 y 10
segundos para molculas que proporcionan espectros fcilmente estudiables en disolucin.
Estos valores tan elevados cuantifican la ineficiencia de la relajacin antes mencionada. Un
aspecto remarcable de esta ecuacin es la existencia de dos trminos independientes, con
constantes de tiempo potencialmente distintas, para describir el retorno al equilibrio de las
componentes longitudinal y transversal de la magnetizacin. Sin embargo, y pensando en los
trminos actuales de RMN de pulsos, la perturbacin inicial, que inicia el proceso de retorno
al equilibrio, es una rotacin que da lugar a una interconversin concertada entre estos
componentes.

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1.2. Bloembergen, Purcell, Pound

Los primeros intentos de explicar microscpicamente el fenmeno de la relajacin no
se hicieron esperar y en 1948 Bloembergen, Purcell y Pound relacionaron las velocidades de
relajacin con las probabilidades de transicin entre los niveles de energa de los espines
nucleares. De hecho, la probabilidad de que estas transiciones ocurran espontneamente es
inversamente proporcional a la diferencia de energa entre los niveles y, en el caso de la RMN
que involucra mnimas diferencias de energa, puede considerarse despreciable. Sin embargo,
las transiciones que dan lugar a la relajacin pueden ser causadas por interacciones con
campos externos que presenten fluctuaciones aleatorias.
La teora de las probabilidades de transicin captura dos aspectos esenciales de la
relajacin en RMN: el requerimiento de una interaccin entre los espines y su entorno y la
identificacin de las fluctuaciones de este entorno como las responsables de la relajacin. La
velocidad de relajacin de un ncleo en RMN constituye una sonda para conocer las
fluctuaciones de dicho entorno, que definen la dinmica del sistema molecular en el que
reside el ncleo observado. Estas fluctuaciones contienen movimientos globales (rotacin y
traslacin respecto a una referencia fija en el laboratorio) y locales (por ejemplo cambios
conformacionales).
Un resultado fundamental de la teora de las probabilidades de transicin es que
solamente las fluctuaciones con frecuencias comparables a las diferencias entre los niveles de
energa de los estados de espn (divididas por la constante de Plank) pueden inducir
transiciones y, por tanto, causar relajacin. Las diferencias entre niveles de energa de los
estados de espn determinan, pues, las ventanas de frecuencias para las fluctuaciones que
pueden ser detectadas mediante medidas de relajacin.
La teora de las probabilidades de transicin es bsicamente adecuada para describir la
evolucin de las poblaciones de los diferentes niveles de energa y su retorno al equilibrio.
Esto corresponde a la relajacin longitudinal o espn-red, caracterizada por la constante de
tiempo T1 pero no tiene en cuenta la coherencia de fase entre los distintos estados y por tanto
no explica la relajacin transversal, caracterizada por T2.
1.3. Bloch, Wangsness, Redfield
La teora de la que derivan las expresiones utilizadas actualmente para la descripcin
de la relajacin en lquidos es debida a Bloch, Wangness y Redfield y se conoce con las siglas
de sus nombres (BWR). Esta teora utiliza el formalismo de la matriz de densidad y incluye
por tanto expresiones para la relajacin de cualquier tipo de coherencia, adems de las
poblaciones.
Las expresiones, deducidas y explicadas en numerosos libros y artculos de revisin
describen la evolucin temporal de la matriz de densidad causada por la parte del
Hamiltoniano que flucta con el tiempo entorno a un valor promedio nulo.
? = H 0 + H1 ( t )
Las fluctuaciones se suponen rpidas, caracterizadas por tiempos de correlacin
cortos, y que causan una evolucin lenta de la matriz de densidad. Estas suposiciones limitan

Relajacin

la validez estricta de las ecuaciones a tiempos de evolucin relativamente cortos. Sin

embargo, en las aplicaciones prcticas en las que la relajacin se mide durante tiempos ms
largos, las expresiones todava pueden ser utilizadas simplemente dividiendo el tiempo total
en una sucesin de pequeos intervalos dentro de los cuales las ecuaciones se cumplen. Esta
restriccin se describe a veces diciendo que se trata de ecuaciones de grano grueso.
La ecuacin bsica que resulta de la aproximacin BWR tiene la forma siguiente

ds (t)
= i[H 0 , s (t) ] G(s (t) s 0 )
dt

que mantiene la divisin en dos trminos, el primero de ellos conservativo y el

segundo disipativo, proporcional a la separacin del equilibrio del operador de densidad en
cada instante. La relajacin viene marcada por un superoperador de relajacin. Los
superoperadores actan sobre operadores de forma anloga a como los operadores actan
sobre funciones. La forma de este superoperador contiene la maquinaria esencial de la
teora BWR y, en particular, el doble conmutador proviene de la expansin de segundo orden
que caracteriza esta aproximacin. A pesar de su evidente complejidad, la expresin puede
leerse de forma instructiva sin entrar en los detalles de cada uno de sus trminos.

G=

1
2

q = 2 p

( pq ) Apq , Apq , _

]]

La primera constatacin es que se trata de una suma de trminos en el que pueden

aparecer contribuciones de ncleos distinguibles, designados por el subndice p. Para cada
uno de ellos aparecen cinco trminos correspondientes a los valores de q= -2, -1, 0, 1, 2.
Estos cinco valores corresponden a la descomposicin irreducible de los tensores de
rengo dos que describen las interacciones responsables de la relajacin. Los qumicos
estamos familiarizados con este tipo de descomposiciones, aunque la nomenclatura que
utilizamos es distinta. Para describir la distribucin espacial de los electrones utilizamos unas
funciones que llamamos orbitales y las agrupamos en series: s, p, d, Existe un orbital s, 3
orbitales p, 5 orbitales d debido a que los objetos matemticos que utilizamos en los
distintos casos para repartir el espacio (los armnicos esfricos) corresponden a tensores de
rango 0 (escalar o con simetra esfrica), de rango 1 (vector con tres componentes: x, y, z) o
de rango 2 (tensor de rango 2, con 5 componentes que corresponden a los orbitales dxy,
dyz, dxz, dz2, d(x2-y2). Las interacciones importantes para describir la relajacin de ncleos
no cuadrupolares estn descritas por tensores de segundo rango.
Un componente esencial apara comprender y aplicar la descripcin de BWR de la
relajacin es la separacin de las interacciones fluctuantes que la originan en el producto de
dos trminos (que en la ecuacin anterior aparecen desglosados en sus cinco componentes
irreducibles)
H 1 (t ) = A p Fp (t )
p

Miquel Pons

El primero de ellos, A p , depende solamente de variables de espn y en su expresin

explcita podramos reconocer los operadores Iz, I, etc. El segundo, Fp (t), depende del
tiempo y captura la dependencia temporal de las funciones espaciales, por ejemplo la
orientacin del vector que une al ncleo considerado con otro vecino o la orientacin respecto
al campo magntico externo de la nube electrnica asimtrica responsable del apantallamiento
qumico.
Los trminos Ap singularizan un pequeo nmero de frecuencias discretas y
caractersticas, derivadas de los niveles de energa asociados al espn considerado. Para un
sistema de dos espines, I y S, son relevantes, como mnimo, las frecuencias de Larmor de
cada uno de los ncleos y sus combinaciones: 0, S, I-S, I, I + S. Estas son las
ventanas de frecuencia en las que las fluctuaciones, descritas mediante las funciones Fp (t),
son efectivas para dar lugar a la relajacin.
Para conocer las contribuciones a distintas frecuencias contenidas en una funcin que
varia con el tiempo como es Fp (t), la herramienta necesaria es la misma que utilizamos para
extraer las contribuciones de distintas frecuencias (el espectro) a partir de una funcin que
flucta con el tiempo (el FID): la transformacin de Fourier. El anlisis de frecuencias de la
fluctuacin descrita por Fp (t) da lugar a las funciones de densidad espectral J q ( pq ) de la
que solamente nos interesan los valores que toma a las frecuencias caractersticas
singularizadas por los trminos Ap.
1.4. Relajacin de operadores producto
Como se ha indicado en otra leccin de este curso (J.C. Paniagua), el operador de
densidad puede expresarse como una combinacin lineal de otros operadores que
proporcionan una descripcin ms cercana a las observaciones experimentales. Estos son los
operadores producto (Ix, 2IxSz) o los operadores escalera -shift operators- (I+, I- ). Si
denominamos de forma genrica como Bi a los operadores de base, podemos escribir
s (t ) = bi (t ) B i
i

En general, estamos interesados en la relajacin de cada uno de los trminos de esta

expansin. Es decir, la velocidad de cambio de los coeficientes bi(t) hasta alcanzar su valor de
equilibrio, que es cero para todos ellos excepto para Iz.
Ya sabemos, de la descripcin fenomenolgica de Bloch, que los trminos
longitudinales y transversales pueden relajar a velocidades distintas. En general, cada uno
de los operadores que describen poblaciones o coherencias tendrn su tiempo de relajacin
caracterstico. Por otro lado, no debe resultar sorprendente que haya que plantearse, en
general, la presencia de trminos cruzados.
La ecuacin master para la evolucin de los coeficientes de los operadores de base
es:
dbi (t )
= ( i i , j b j (t )) ij (b j (t ) b j 0 )
dt
j
j

Relajacin

El primer trmino refleja la interconversin conservativa entre los distintos

operadores que tiene lugar en un sistema sacado del equilibrio: por ejemplo la precesin que
convierte Ix en Iy o el acoplamiento escalar que interconvierte coherencias en fase y en
antifase Ix -> 2IySz. Estas interconversiones tienen lugar con frecuencias caractersticas
relacionadas con el desplazamiento qumico o las constantes de acoplamiento,
respectivamente.
El segundo trmino contiene las velocidades de autorelajacin (ii) asociada al
operador Bi y relajacin cruzada (ij) entre los operadores Bi y Bj. Los mecanismos de
relajacin permiten nicamente un cierto tipo de relajaciones cruzadas. No es posible
observar relajacin cruzada entre coherencias de distinto orden. As, por ejemplo, no se
observa relajacin cruzada entre coherencias de cero y doble cuanto o entre poblaciones y
coherencias en fase o antifase. Es posible, sin embargo, observar velocidades de relajacin
cruzada entre poblaciones (Iz -> Sz). Esta relajacin cruzada es la responsable del efecto NOE.
Los operadores con trminos transversales (es decir que evolucionan con el
desplazamiento qumico) no presentan, en principio, relajacin cruzada con operadores
asociados a frecuencias distintas (que difieran en frecuencia ms que la anchura de lnea).
Esta restriccin puede desaparecer en algunos casos en presencia de campos de
radiofrecuencia. En los experimentos de confinamiento o bloqueo de espines, la relajacin
entre coherencias Ix, Iy de distintos espines da lugar a relajacin cruzada en el sistema de
coordenadas giratorio. Es el llamado efecto ROE.
La aurorelajacin de la magnetizacin confinada en el plano transversal del sistema de
coordenadas giratorio tiene una constante de tiempo denominada T1. Esta contiene
contribuciones variables de la relajacin longitudinal y transversal en el sistema de
coordenadas del laboratorio. El peso relativo de las dos contribuciones depende del offset
(la diferencia entre la frecuencia de precesin del ncleo considerado y de la radiofrecuencia
utilizada para confinarlo). Si esta diferencia es nula T1 = T2. En las expresiones de T1
aparece, adems de las frecuencias propias de los espines en el sistema del laboratorio, la
frecuencia 1 = B1 que depende de la intensidad de la radiofrecuencia utilizada para
confinar los espines y puede modificarse bajo control del experimentador. Esto introduce
una nueva ventana de frecuencias de gran utilidad para estudiar fenmenos dinmicos en la
escala de los micro- milisegundos.
2. Mecanismos de relajacin
2.1. Los mecanismos bsicos
Las interacciones que dan lugar a campos magnticos fluctuantes o, en general, hacen
variar con el tiempo la energa asociada con los espines de forma que permiten el regreso del
sistema al equilibrio despus de una perturbacin se denominan mecanismos de relajacin.
Los mecanismos de relajacin pueden causar dos tipos de efectos: i) transiciones
entre estados de espn que implican transferencia de energa entre el sistema de espines y su
entorno (la red) y ii) modificaciones de las diferencias de energa entre los estados, que
afectan a las frecuencias de precesin pero no implican cambios en las poblaciones y por tanto
no suponen una transferencia neta de energa entre el sistema de espines y su entorno. Estas
contribuciones de denominan adiabticas.

Miquel Pons

Si imaginamos un campo magntico fluctuante arbitrario en la posicin del ncleo de

inters, las fluctuaciones perpendiculares al campo magntico externo son las responsables de
las transiciones entre estados, mientras que las fluctuaciones paralelas a dicho campo son las
que proporcionan la contribucin adiabtica.
Las contribuciones adiabticas dan lugar a la prdida de coherencia dentro de un
conjunto de espines y conduce a la relajacin transversal pero no contribuye a restituir la
distribucin de Boltzmann. La prdida de coherencia entre los espines tambin puede ser
causada por transiciones espordicas entre estados. As como un pulso de radiofrecuencia
sobre una muestra en equilibrio sincroniza el inicio de la precesin de todos los espines
afectados, las transiciones espordicas causadas por relajacin interrumpen la precesin de
forma aleatoria para los distintos espines de la muestra y dan lugar a la prdida de coherencia
de fase. En general, tendremos siempre que la velocidad de relajacin transversal ser
siempre mayor que la de la relajacin longitudinal.
El origen de las interacciones fluctuantes puede encontrarse en el movimiento global
de la molcula en la que se encuentre un determinado espn o en cambios en su entorno local
causados por movimientos internos. Desde una perspectiva qumica, tienen un inters especial
los movimientos de gran amplitud y baja frecuencia que cambian la conformacin o la
naturaleza de la especie qumica implicada (por ejemplo debido a una reaccin reversible o a
un fenmeno de complejacin). Estas fluctuaciones, agrupadas bajo el trmino genrico de
intercambio qumico, tienen poco efecto sobre la relajacin longitudinal pero afectan de
forma importante la relajacin transversal. El estudio del intercambio qumico es un campo
de aplicacin muy importante de las medidas de relajacin. Las pequeas diferencias de
energa asociadas a las interacciones de los espines nucleares, comparadas con las energas
asociadas al proceso qumico, permiten la medida de velocidades de reaccin en sistemas que
estn qumicamente en equilibrio.
Para sistemas rgidos, las fluctuaciones que dan lugar a relajacin provienen
esencialmente de la reorientacin de la molcula respecto al campo magntico externo.
Contribuirn a la relajacin aquellas interacciones que posean una dependencia angular. Para
ncleos con espn los mecanismos de relajacin ms importantes son la interaccin dipolodipolo y la anisotropa de apantallamiento qumico.
Las interacciones dipolo-dipolo describen el efecto del campo magntico inducido por
el momento magntico de un espn S, de magnitud proporcional a , su constante
giromagntica, sobre la posicin de otro espn I. Este campo es inversamente proporcional al
cubo de la distancia y depende de la orientacin del vector internuclear respecto al campo
magntico externo. En un sistema rgido, en el que I y S pertenecen a la misma molcula y
por tanto permanecen a una distancia constante, las fluctuaciones de la interaccin dipolar
tienen su origen en la reorientacin de la molcula. El valor medio de la fluctuacin es cero.
La amplitud de la fluctuacin se caracteriza por su varianza y depende del cuadrado de la
interaccin dipolar. Esto introduce la conocida dependencia con el inverso de la sexta
potencia de la distancia que se utiliza de forma muy extendida para interpretar las medidas de
efecto NOE que no son ms que medidas de la relajacin cruzada inducida por la interaccin
dipolar.
La anisotropa de apantallamiento qumico es el resultado de una distribucin
electrnica asimtrica alrededor del ncleo considerado. Esta distribucin es fija respecto a la

Relajacin

molcula (supuesta rgida) y da lugar a un apantallamiento qumico que depende de la

orientacin de la molcula respecto al campo magntico externo. Cuando la orientacin de la
molcula cambia, tambin lo hace el campo magntico experimentado por el espn y por
tanto, su frecuencia de precesin. El apantallamiento qumico est descrito por un tensor y el
campo magntico causado por la circulacin electrnica inducida en presencia del campo
externo puede tener componentes en todas las direcciones. As la anisotropa de
apantallamiento qumico es un mecanismo tanto para la relajacin longitudinal como
transversal. A diferencia de la interaccin dipolo-dipolo, la anisotropa de apantallamiento
qumico presenta una dependencia cuadrtica con el campo magntico externo.
Para ncleos con espn > las interacciones cuadrupolares habitualmente dominan la
relajacin. El momento cuadrupolar de un ncleo es una medida de la distorsin de la carga
elctrica nuclear de la simetra esfrica. Los ncleos con espn no poseen momento
cuadrupolar. Los ncleos cuadrupolares interaccionan con gradientes de carga elctrica. Esta
interaccin es muy importante y modifica los niveles de energa de los estados de espn. La
modulacin de esta interaccin proporciona un mecanismo de relajacin muy efectivo que da
lugar en general a seales anchas para los ncleos cuadrupolares que no se encuentren en un
entorno altamente simtrico.
2.2. Interferencia entre mecanismos de relajacin
En general las fluctuaciones que afectan a las distintas interacciones que pueden
causar relajacin son independientes entre s y el efecto de la relajacin cuando varios
mecanismos intervienen simultneamente es simplemente una suma de efectos. Sin embargo,
las fluctuaciones aleatorias de distintas interacciones estn correlacionadas. En un sistema de
dos espines I y S pertenecientes a ncleos que estn directamente enlazados, la distribucin
electrnica asociada al enlace entre ambos ncleos estar directamente relacionada con la
orientacin del vector internuclear. La reorientacin de la molcula causar en este caso la
modulacin simultnea de las interacciones dipolo-dipolo y de anisotropa de apantallamiento
qumico. En estos casos ambos mecanismos pueden interferir y hablaremos de la existencia
de correlacin cruzada (no confundir con la relajacin cruzada) o de interferencia de
relajacin.
La correlacin cruzada da lugar a fenmenos de relajacin cruzada prohibidos por
cualquiera de los mecanismos individuales. As, puede observarse relajacin cruzada entre
poblaciones (Iz) y orden de dos espines (2IzSz) o entre coherencias en fase (Ix, Iy) y antifase
(2IxSz, 2IySz). El segundo de estos efectos, denominado interferencia o correlacin cruzada
transversal introduce un trmino adicional en la relajacin transversal que puede afectar de
forma notable la anchura de las seales observadas. Sus efectos son especialmente aparentes
en presencia de acoplamiento ya que la anchura de las distintas seales de un multiplete no
son iguales.
Si consideramos el doblete esperado para un ncleo I acoplado con otro ncleo S,
podemos ver fcilmente que la combinacin (suma o resta) de los trminos en fase y en
antifase nos describe de forma separada las dos seales a frecuencias J/2.

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Miquel Pons

EN FASE

SUMA

ANTIFASE

DIFERENCIA

Si analizamos la relajacin de las dos seales encontraremos que viene descrita por la
suma y la diferencia de trminos de relajacin debidos a los mecanismos individuales y
debidos a interferencia entre los mismos:

d
I + + 2I + S z (iJ + R2 medio + xy ) I + + 2I + S z
dt
d
I + 2I + S z ( iJ + R2 medio xy ) I + 2I + S z
dt
Donde
DD
CSA
R2 medio = 12 ( R2DD
I + R2 IS ) + R2 I

es el promedio de los trminos de relajacin de las componentes en fase y antifase

debidas a la interaccin dipolar ms la contribucin de la relajacin mediada por la
anisotropa de apantallamiento qumico y xy es la constante de velocidad del proceso de
relajacin cruzada entre los trminos en fase y antifase causada por la correlacin cruzada
entre los dos mecanismos de relajacin.
El distinto signo de R2medio y xy en la segunda de las ecuaciones anteriores hace
posible, en principio, minimizar los efectos de relajacin transversal. Esto ser ms efectivo
cuando los valores de R2medio y xy tengan magnitudes comparables. Dada la dependencia de
la relajacin debida a anisotropa de apantallamiento qumico con el campo magntico
externo, la optimizacin de la cancelacin de la relajacin transversal debida a ambos
mecanismos se obtendr a campos magnticos elevados para ncleos que tengan una
anisotropa de apantallamiento suficientemente grande. La manifestacin de este efecto
solamente se observar sin embargo si se mantienen separadas las dos componentes del
doblete, es decir, en ausencia de desacoplamiento. Esta es la base de la estrategia TROSY
para el estudio de molculas de gran tamao. Es evidente que para la otra componente del
doblete los efectos debidos a los mecanismos individuales y a la correlacin cruzada se
suman, por lo que la anchura espectral aumenta. En algunos casos, este aumento de anchura
llega a hacer desaparecer la seal y solamente se observa la componente estrecha, sin
necesidad de efectuar ningn otro tipo de seleccin.

Relajacin

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2.3. Mecanismos dominantes

El conocimiento del mecanismo de relajacin no es una cuestin trivial en general, sin
embargo para ciertos casos uno o dos mecanismos dominan la relajacin. Es el caso de la
relajacin de heterotomos unidos a un protn y razonablemente aislados del resto de espines
de la molcula: en una protena marcada con 15N, el nitrgeno de los grupos NH del enlace
peptdico relaja de forma dominante a travs de la interaccin dipolar con el protn que tiene
directamente unido. La relajacin dipolar con otros protones de la molcula es generalmente
descpreciable debido a la dependencia de este mecanismo con la distancia. Los otros ncleos
unidos al nitrgeno son mayoritariamente de carbono 12 que tiene espn cero. La otra
contribucin a la relajacin del nitrgeno es debida a la anisotropa de apantallamiento
qumico y aumenta con el campo magntico utilizado. El estudio de heterotomos unidos a
dos protones implica tener en cuenta la correlacin cruzada entre la relajacin dipolar con
cada uno de ellos.
En el caso de un grupo carbonilo marcado con 13C el mecanismo dominante de
relajacin es la anisotropia de apantallamiento, a pesar de que, en general, el carbono
carbonlico estar unido a otro tomo de 13Co de 15N. La poca importancia de los
mecanismos dipolares en este caso es debida a la baja constante giromagntica () de estos
ncleos, que determina el valor del momento magntico asociado con los mismos.
Finalmente, en el caso de la relajacin de ncleos cuadrupolares, este mecanismo va a
ser el dominante. El marcaje con deuterio se utiliza a veces con este propsito, aunque a
menudo se utiliza tambin en el contexto de medidas de relajacin de otros ncleos para
eliminar la contribucin dipolar debida a los protones. La deuteracin parcial se utiliza a
veces como una estrategia para eliminar los efectos de correlacin cruzada entre interacciones
dipolares. En este caso, la medida se realiza sobre las especies NHD o CHD presentes en la
mezcla de isotopmeros y requiere, a veces, la eliminacin selectiva de las contribuciones de
las otras formas (NH2 o CH2 u ND2 o CD2). Debe recordarse, en este punto, que la
perdeuteracin de macromolculas se ha convertido en una estrategia habitual para reducir la
anchura de las seales de RMN o limitar la difusin de espn (la transmisin en cadena de
magnetizacin debida a relajacin cruzada por interaccin dipolar entre una serie de espines).
3. Descripcin de la movilidad: las funciones de densidad espectral
El inters real en las velocidades de relajacin proviene de la informacin dinmica
que proporcionan sobre el sistema molecular. En concreto, la informacin que puede
derivarse directamente de las medidas experimentales, una vez identificado o supuesto un
mecanismo de relajacin, es el valor de la funcin de densidad espectral J() a ciertas
frecuencias singulares.
A modo de ejemplo, las velocidad de relajacin longitudinal y transversal de un espn
X (=13C o 15N) , perteneciente a un sistema aislado HX y despreciando la correlacin
cruzada, son

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Miquel Pons

R1 =

d2
[J (H X ) + 3J (H ) + 6 J (H + X )] + c 2 J ( X )
4

R2 =

2
d2
[4 J (0) + J (H X ) + 3J (H ) + 6 J (H ) + 6 J (H + X )] + c [4 J (0) + 3J ( X )]
8
6

d2
[ J (H X ) + 6 J (H + X )]
4

donde
0 h X H 3
X
rHX
y c=
donde el tensor de apantallamiento se supone
2
8
3
axialmente simtrico y es el valor de la anisotropa.
d=

La ms minimalista de las interpretaciones de las medidas de relajacin consiste

simplemente en obtener los valores accesibles de la funcin de densidad espectral a partir de
los datos experimentales. Esta aproximacin se denomina Spectral density mapping que tal
vez podra traducirse por Muestreo de Densidad Espectral. Aunque cada una de las
velocidades de relajacin o relajacin cruzada (R1, R2, ) depende de los valores de densidad
espectral a distintas frecuencias, dado que el nmero de frecuencias relevantes es discreto, es
posible en general medir un nmero suficiente de parmetros de relajacin. Para obtener los
cinco valores de J() se necesitan, adems de las tres medidas antes citadas, dos medidas
adicionales: estas son en la propuesta inicial de Peng y Wagner las velocidades de relajacin
de las coherencias en antifase y de orden de dos espines. Es muy difcil tener un sistema XH
totalmente aislado ya que la relajacin del protn con otros protones de la molcula en general
no puede despreciarse debido a su alta constante giromagntica. Esto introduce la necesidad
de corregir esta contribucin mediante una medida adicional de la relajacin de protn. A
campos altos cuando X = N, J ( H + X ) J ( H ) J (H X ) y los tres trminos se
substituyen por una valor J promedio ( H ) . La funcin de densidad espectral se caracteriza
entonces solamente por los tres valores J promedio (H ) , J ( N ) y J (0) , por lo que se requiere
la medida de tres velocidades de relajacin. Esta aproximacin se denomina Muestreo de
Densidad Espectral Reducido.
La funcin de densidad espectral describe la contribucin de distintas frecuencias al
movimiento aleatorio causante de la relajacin. El proceso de reorientacin puede describirse
comparando el valor promedio del producto de dos funciones que dependen de la orientacin,
evaluadas en tiempos separados por un intervalo . Es la llamada funcin de correlacin. Si la
orientacin cambia durante el tiempo , el producto podr tomar valores positivos y negativos
y el promedio tender a cero. La funcin de correlacin decrecer con el tiempo t de forma
ms rpida si la molcula se mueve rpidamente y disminuir lentamente para molculas que
se reorienten con lentitud. Para una esfera rgida, la funcin de correlacin tiene una forma
exponencial caracterizada por un tiempo caracterstico que denominamos tiempo de
correlacin, c.
C ( ) = 15 exp[ / c ]

Relajacin

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En este caso, la funcin de densidad espectral tiene forma Lorentziana

J ( ) =

2
5

c
(1 + 2 c2 )

Para macromolculas rgidas es posible separar las contribuciones de dos tipos de

movimiento: el movimiento global y el movimiento local. Para que ello sea posible ambos
movimientos no deben estar correlacionados. Adems, para que puedan separarse sus
contribuciones, las escalas de tiempo deben ser muy distintas. La funcin de correlacin
resultante es el producto de dos trminos
C ( ) = C0 ( ) C I ( )
La reorientacin global de una molcula rgida sigue las leyes de la hidrodinmica y
puede calcularse a partir de la estructura tridimensional de la molcula utilizando el programa
HYDRONMR. A menudo se asume que la molcula es esfrica y est caracterizada por un
nico tiempo de correlacin o axialmente simtrica, y en este caso estara caracterizada por
dos tiempos de correlacin. Los tiempos de tiempos de correlacin rotacional de las
macromolculas que se estudian por RMN son del orden de los nanosegundos.
La funcin de correlacin interna estar referida a un sistema fijo sobre la molcula.
En general los procesos dinmicos internos que originan la relajacin son complejos y la
forma de la funcin de correlacin puede ser muy complicada. Pueden existir procesos
difusivos (como el descrito para una esfera) o procesos descritos mediante saltos discretos
entre diferentes situaciones (por ejemplo conformaciones discretas que difieren por el giro
alrededor de un enlace). Es tentador proponer modelos de sofisticacin creciente hasta
conseguir una concordancia perfecta entre el modelo y los datos experimentales. Es evidente,
sin embargo, que, ya que los datos experimentales slo ofrecen el valor de la densidad
espectral a unas pocas frecuencias pueden existir fcilmente modelos alternativos que
expliquen los mismos resultados.
El anlisis que se ha convertido en el ms habitual para estudiar la dinmica de
macromolculas que puedan considerarse esencialmente rgidas es debido a Lipari y Szabo.
Esta aproximacin evita referirse a un modelo microscpico concreto y por eso se denomina
model free. En este caso, en vez de proponer un modelo de movimiento se asume una
forma de la funcin de densidad espectral minimalista caracterizada por un pequeo
nmero de parmetros cuyos valores se extraen ajustando el modelo a los datos
experimentales. Una forma habitual de la funcin de densidad espectral es:
S 2 c
(1 S 2 )
J ( ) =
+

2 2
1 + 2 2
1 + c
1 1 1
= +
c i
2
5

14

Miquel Pons

Donde aparecen como parmetros c, i y S2. El primero es el tiempo de correlacin

global, el segundo el tiempo de correlacin efectivo del movimiento interno y S2 es el
cuadrado del parmetro de orden generalizado que caracteriza la amplitud del movimiento
intramolecular. Existen extensiones del formalismo de Lipari y Szabo que incorporan
trminos adicionales para movimientos internos en dos escalas de tiempo y a menudo se
adiciona una contribucin fenomenolgica de intercambio a R2.
Los valores de los parmetros se obtienen minimizando la desviacin entre los valores
calculados y experimentales, teniendo en cuenta la incertidumbre de las medidas. El protocolo
empieza con el ajuste a las formas ms simples (con menos parmetros ajustables) de la
funcin de densidad espectral y aumentando de forma progresiva la complejidad del modelo,
mientras la mejora del ajuste est justificada estadsticamente mediante una prueba F. En
general los valores de S2 y c estn bien determinados por los datos experimentales. Los
valores de i en cambio presentan a menudo fuertes incertidumbres tanto para valores bajos (i
< 30 ps) como para valores altos que se acerquen a c.
El parmetro de orden, S2, es una medida de la distribucin de las orientaciones de un
vector, definido por la interaccin considerada, en un sistema de referencia fijado sobre la
molcula y toma valores entre cero y uno. Para el caso de la relajacin de 15N del esqueleto
de regiones con estructura secundaria bien definida en protenas se obtienen valores tpicos de
0.86 que pueden ser interpretados, en funcin de los modelos considerados, como
fluctuaciones del vector NH con un ngulo cuadrtico medio de unos 12 o difusin en la
superficie de un cono con un ngulo de 18.
Si tanto i como (1-S2) son pequeos, el cociente entre las velocidades de relajacin
longitudinal y transversal es independiente de la movilidad interna y puede utilizarse para
caracterizar el movimiento global de la molcula.
La separacin entre movimientos globales y locales no se cumple para sistemas que no
son rgidos: protenas en las que hay movimientos entre dominios o en el caso de pequeas
molculas de RNA. En estos casos puede resultar til el recurso a simulaciones de dinmica
molecular para extraer informacin que permita validar la separacin de movimientos. Las
trayectorias tienen que ser largas comparadas con el tiempo de correlacin de la molcula
considerada. Para molculas pequeas esto es posible utilizando dinmica molecular
convencional con trayectorias de 10-50 ns. Para molculas de mayor tamao esto no es
computacionalmente accesible y debe recurrirse a mtodos menos precisos, como son la
dinmica Browniana.
Brschweiler ha propuesto el formalismo iRED en el que a partir de la trayectoria
calculada se analiza la matriz de covarianza de las orientaciones relativas de un conjunto de
vectores fijados en distintos puntos de la molcula. La construccin de dicha matriz es muy
sencilla y est formada por elementos de la forma
M ij = P2 (cos( i j )

donde

P2(x) = (3x2-1)/2

(i j ) es el ngulo formado por los vectores i y j en una de las instantneas de la

trayectoria y el promedio se toma sobre todo el conjunto de instantneas. La matriz de
covarianza no contiene informacin temporal pero si las correlaciones entre los distintos

Relajacin

15

vectores. Diagonalizando esta matriz se obtienen los modos de reorientacin, cada uno de
ellos con un valor propio asociado. En una molcula rgida habr cinco modos de
reorientacin que sern claramente diferenciables del resto por sus valores propios. En
molculas no rgidas los distintos modos con valores propios no despreciables proporcionan la
base para interpretar los parmetros de relajacin.

4. Intercambio qumico
La modulacin de las interacciones dipolares o de apantallamiento anisotrpico tienen lugar
en la escala de tiempo de los pico- nanosegundos. Otros procesos estocsticos tienen lugar en
la escala de tiempo de los micro- milisegundos y pueden afectar a la relajacin a travs de la
modulacin del desplazamiento qumico isotrpico debido a cambios en el entorno qumico
del espn. Las macromolculas, aun en su forma nativa, deben interpretarse como conjuntos
dinmicos de conformaciones en equilibrio. Aunque la forma de menor energa representa el
estado ms probable, otras conformaciones son accesibles y pueden ser relevantes para
entender la funcin biolgica. La baja poblacin de estos estados excitados dificulta su
estudio mediante mtodos estructurales habituales. Las medidas de relajacin de RMN en la
escala de tiempo del micro- milisegundos ofrecen una herramienta muy poderosa para su
estudio. La contribucin del intercambio qumico para el componente dominante del valor
esperado de coherencia de espines perteneciente a en un sistema en equilibrio entre dos
estados depende de las constantes de velocidad del proceso qumico en ambos sentidos
sentidos, kex = k12 + k21 , la diferencia entre las frecuencias caractersticas de la coherencia en
ambos estados, , y de las poblaciones, p1 y p2 :
k12
A1
A2
k21
k
1
Rex = ex
2
8

2
2
2
2 2
2 2
k ex + (k ex + ) 16 p1 p 2 k ex

Esta ecuacin describe la contribucin de intercambio a la seal observable (la del

componente mayoritario). A menudo, la contribucin del componente minoritario no se
observa directamente pero afecta la relajacin, y por tanto la anchura de lnea, de la seal
observada. En el caso lmite de intercambio rpido (en el que existe una nica seal a la
frecuencia promedio) la contribucin de intercambio se simplifica a
Rex = p1 p 2 2 k ex1

La extraccin de la informacin cuantitativa sobre intercambio es posible debido a que la

contribucin aparente del intercambio qumico puede modificarse por la aplicacin de campos
de radiofrecuencia, sea en la forma de una serie de pulsos de 180 en una secuencia CarrPurcell-Meiboom- Gill (CPMG) o mediante una secuencia de confinamiento de espines. Las
expresiones anteriores se refieren a una determinada coherencia y deben corregirse
experimentalmente las interconversiones entre coherencias, por ejemplo en fase y antifase
debido al acoplamiento escalar.
Las curvas que describen la dependencia de la velocidad de relajacin aparente con la
duracin del eco de espn, cp, en los experimentos CPMG se denominan curvas de dispersin

16

Miquel Pons

de relajacin (relaxation dispersion). La forma de las curvas de dispersin de relajacin ha

sido deducida analticamente. Para el lmite de intercambio rpido, una forma aproximada es
2 tanh( cp k ex / 2)
Rex (1 / cp ) = p1 p 2 2 k ex1 1

cp k ex

Las ecuaciones contienen los parmetros que definen el intercambio y la variable

experimental cp . Del ajuste de los datos experimentales pueden obtenerse los parmetros de
intercambio.
La contribucin debida al intercambio qumico no depende del peso molecular. Las otras
contribuciones de la relajacin transversal dependen del tiempo de correlacin y aumentan
para molculas de gran tamao. Para poder ser medida, la contribucin del intercambio no
debe ser despreciable respecto a la de otros mecanismos de relajacin transversal. Esto ha
hecho aparecer nuevos experimentos en los que se utilizan las aproximaciones TROSY para
minimizar la relajacin transversal y permitir el estudio de intercambio qumico para
molculas de gran tamao. En este sentido es especialmente interesante la observacin que la
correlacin cruzada entre las contribuciones dipolares CH dentro de un grupo metilo no
contribuye a la relajacin de las coherencias de cero y doble cuanto. Si se eliminan otras
contribuciones externas, mediante la deuteracin exhaustiva de la molcula, exceptuando los
grupos metilo de inters, un experimento basado en las secuencias HMQC permite la medida
de intercambio qumico en protenas de elevado peso molecular. El grupo de Kay ha
demostrado la existencia de intercambio qumico en un 20% de los grupos metilos de la
protena malato sintasa G , de 82 kDa.
Una aplicacin espectacular de las medidas de intercambio qumico ha sido presentada
por el grupo de Kern con la medida de la dinmica de sistemas enzima-sustrato durante la
catlisis. Inicialmente se estudi un enzima que causa una isomerizacin cis-trans, en un
estudio posterior se ha demostrado que la reaccin de interconversin reversible entre
ATP+AMP y dos molculas de ADP catalizada por el enzima adenilato kinasa muestra una
velocidad de reaccin determinada por el equilibrio conformacional entre una forma abierta y
cerrada del enzima, cuya velocidad pudo ser determinada por medidas de dispersin de
relajacin.
Conclusiones
Los procesos de relajacin constituyen un elemento esencial de los experimentos de
RMN tanto por las restricciones que imponen en la obtencin de espectros (sensibilidad,
resolucin) como por la informacin estructural y dinmica que proporcionan. En particular,
las medidas de relajacin en RMN proporcionan una herramienta nica para el estudio de la
dinmica a distintas escalas de tiempo. Los procesos dinmicos implicados van desde
movimientos internos ms rpidos que el movimiento Browniano de la molcula completa a
procesos lentos asociados con cambios conformacionales u otras formas de intercambio
qumico. La sensibilidad de los mtodos de relajacin permite detectar contribuciones de
especies en equilibrio con una poblacin muy pequea. Para el caso de protenas, esto ha sido
descrito como la caracterizacin de sus estados excitados. Las fluctuaciones que afectan a
estos estados, en algunos casos han sido asociadas a procesos de catlisis enzimtica,
enfatizando la relevancia de las medidas dinmicas, accesibles mediante medidas de
relajacin, para la comprensin de la funcin de las biomacromolculas.

Relajacin

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Bibliografa
Los trabajos de A.G. Palmer proporcionan descripciones rigurosas pero
extremadamente lcidas sobre los fenmenos de relajacin. Las contribuciones ms
importantes de su grupo se refieren a las medidas de intercambio qumico.
Para preparar esta contribucin me he basado en distintos trabajos de su grupo y en
notas de clases impartidas por el Profesor Palmer.
Revisiones de carcter general.
Palmer, A.G., Williams, J. Mc. Dermott J. Phys. Chem. 1996, 100, 13293-13310.
Dayie, K.T., Wagner, G., Lefvre, J.-F. Annu. Rev. Phys. Chem. 1996, 47, 243-282.
Fischer, M.W.F., Majumdar, A., Zuiderweg, E.R.P. Progress NMR Spect. 1998, 33, 207-272
Korzhnev, D.M., Billeter, M., Arseniev, A.S., Orekhov, V.Y. Progress NMR Spec. 2001, 38,
197-266.
Revisiones sobre aspectos concretos.
La aparicin del ltimo volumen de Mtodos en Enzimologa, editado por T.L.
James y publicado por Elsevier ha puesto a nuestra disposicin una serie de revisiones muy
actualizadas sobre temas tratados en este captulo.
Palmer, A.G., Grey, M.J. Wang, C. Methods in Enzymology 2005, 394, 430-465.
Kern, D., Eisenmesser, E.Z., Wolf-Watz, M. Methods in Enzymology 2005, 394, 507-524.
Garca de la Torre, J., Bernad, P., Pons, M. Methods in Enzymology 2005, 394, 419-430.
Showwalter, S.A., Hall, K.B. Methods in Enzymology 2005, 394, 465-480.
Wider, G. Methods in Enzymology 2005, 394, 382-398.