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NDICE
ABREVIATURAS......................................................................................................... v
RESUMO.................................................................................................................... ix
ABSTRACT ................................................................................................................ ix
INTRODUO ............................................................................................................ 1
CARATERIZAO DO LABORATRIO DE ESTGIO .............................................. 2
ATIVIDADES DESENVOLVIDAS ................................................................................ 4
I. HEMATOLOGIA ....................................................................................................... 5
1.1 Equipamentos e Metodologias Utilizadas .......................................................... 5
1.2 Hemograma ....................................................................................................... 6
1.2.1 Anemia ...................................................................................................... 10
1.2.2 Execuo e Observao do Esfregao Sanguneo de Sangue Perifrico. 11
1.2.3 Contagem de Reticulcitos ....................................................................... 13
1.2.4 Velocidade de Sedimentao (VS)............................................................ 13
1.3 Hemostase e Provas de Coagulao .............................................................. 14
1.4 Grupos Sanguneos ......................................................................................... 17
1.4.1 Sistema AB0 ............................................................................................. 17
1.4.2 Sistema Rh ................................................................................................ 18
1.5 Ferritina............................................................................................................ 19
1.6 Controlo de Qualidade ..................................................................................... 19
2. BIOQUMICA ......................................................................................................... 21
2.1 Hidratos de Carbono ........................................................................................ 22
2.1.1 Glicose ...................................................................................................... 22
2.1.2 HbA1c (Hemoglobina Glicosilada)............................................................. 23
2.2 Lpidos ............................................................................................................. 24
2.2.1 Colesterol Total ......................................................................................... 24
2.2.2 Colesterol-HDL .......................................................................................... 25
Margarida Souto Pinto Proena Lucas
ndice
2.2.3 Colesterol-LDL .......................................................................................... 26
2.2.4 Triglicridos .............................................................................................. 26
2.3 Compostos Nitrogenados Proteicos ................................................................ 27
2.3.1 Protenas Totais........................................................................................ 27
2.3.2 Protena C Reativa (PCR) ........................................................................ 28
2.3.3 Albumina Srica........................................................................................ 29
2.3.4 Microalbuminria ...................................................................................... 29
2.4 Compostos Nitrogenados No Proteicos ........................................................ 30
2.4.1 cido rico ................................................................................................ 30
2.4.2 Ureia ......................................................................................................... 31
2.4.3 Creatinina e Clearance da Creatinina ....................................................... 32
2.5 Enzimas .......................................................................................................... 33
2.5.1 AST /GOT ................................................................................................. 33
2.5.2 ALT /GPT .................................................................................................. 34
2.5.3 Fosfatase Alcalina (ALP) .......................................................................... 35
2.5.4 Gama-glutamil transferase (-GT) .............................................................. 36
2.5.5 Creatina Cinase (CK) ................................................................................ 37
2.5.6 LDH (Lactato Desidrogenase) .................................................................. 38
2.5.7 Amilase ..................................................................................................... 39
2.6 Bilirrubinas ...................................................................................................... 40
2.6.1 Bilirrubina Total ......................................................................................... 40
2.6.2 Bilirrubina Direta ....................................................................................... 41
2.6.3 Bilirrubina Indireta ..................................................................................... 42
2.7 Ies ................................................................................................................. 42
2.7.1 Sdio ........................................................................................................ 44
2.7.2 Potssio .................................................................................................... 45
2.7.3 Cloretos .................................................................................................... 46
2.7.4 Magnsio .................................................................................................. 46
ii
ndice
2.7.5 Clcio ........................................................................................................ 47
2.7.6 Fsforo ...................................................................................................... 49
2.7.7 Ferro Srico .............................................................................................. 50
2.8 Controlo de Qualidade no Laboratrio de Bioqumica ..................................... 50
2.8.1 Calibrao ................................................................................................. 50
2.8.2 Controlo de Qualidade Interno .................................................................. 51
2.8.3 Controlo de Qualidade Externo ................................................................. 51
CONCLUSES ......................................................................................................... 53
BIBLIOGRAFIA ......................................................................................................... 55
ANEXOS ................................................................................................................... 57
iii
Abreviaturas
ABREVIATURAS
Ac
Anticorpo
ADE(RDW)
AEQ
ALP
Fosfatase Alcalina
ALT
AMP
2-amino-2-metil-1-propanol
AR
Artrite Reumatide
AST
4-AAP
4-Aminoantipirina
Ca 2+
Clcio
CHGM
CK
Creatina Cinase
Cl-
Cloro
CE
Colesterol Esterase
CNPG3
2-cloro-4-nitrofenil-alfa-D-maltrotriosido
CO
Colesterol Oxidase
CPNP
2-cloro-4-nitrofenol
CQI
CTFF
DHBS
3,5-dicloro-2-hidroxibenzenossulfnico
DCHBS
3,5-dicloro-2-hidroxibenzenossulfonato
EDTA
cido Etilenodiaminotetracetico
ELFA
ELISA
FA
Fosfatase Alcalina
Fl
Fentolitros
FR
Fator Reumatide
FFUC
FvW
GI
Gastrointestinal
GK
Glicerol Cinase
GLDH
Glutamato Desidrogenase
Margarida Souto Pinto Proena Lucas
Abreviaturas
GPO
Glicerolfosfato Oxidase
G6PDH
Glicose-6-fosfato Desidrogenase
HBA
cido Hidroxibenzico
Hb
Concentrao da Hemoglobina
HbA1c
Hemoglobina Glicosilada
HDL
Hgb
Hemoglobina
HGM
HK
Hexocinase
HPO
Peroxidase de Rbano
Ht
Hematcrito
IDL
INR
INSA
ISI
K+
Potssio
LAC
LCR
Liquido Cefalorraquideo
LDL
LDH
Lactato Desidrogenase
MDH
Malato Desidrogenase
Mg2+
Magnsio
MPV
4-MUP
NAC
N-Acetil-L-Cistena
NAD
NADH
Na+
Sdio
Nm
Nanmetros
PCR
Protena-C-Reativa
pg
Picogramas
PTGO
PTH
Hormona Paratiride
RNA
cido Ribonucleico
RF
Fator Reumatide
vi
Abreviaturas
Rpm
SASUC
SD
Desvio Padro
SGQ
SIADH
ST
Saturao da Transferrina
TFG
TP
Tempo de Protrombina
TTP
UKNEQAS
VGM
VIDAS
VLDL
VS
Velocidade de Sedimentao
vii
Resumo
RESUMO
Este relatrio de estgio do Mestrado de Anlises Clnicas pretende descrever todas
as atividades nas quais estive envolvida durante o perodo de estgio no Laboratrio
de Anlises Clnicas da Faculdade de Farmcia da Universidade de Coimbra.
Desta forma, vo ser descritos os mtodos usados na execuo de anlises nas
reas do laboratrio em que mais trabalhei hematologia e bioqumica e a respetiva
interpretao de resultados.
ABSTRACT
This report for the Clinical Biology Master pretends to describe all the activities on
which I was involved during my practice in the Clinical Analyses Laboratory of FFUC.
In this way, there will be described all the methods used in the lab tests on the
laboratory areas I worked the most like Hematology and Biochemistry and the results
evaluation involved in this testing.
ix
Introduo
INTRODUO
Este relatrio visa descrever todas as atividades laboratoriais que desempenhei
como estagiria do Mestrado de Anlises Clnicas, durante o perodo de 27 de
Setembro de 2010 a 15 de Julho de 2011, sob a orientao da Dra. Maria Luclia
Silveira e da Dra. Ana Donato, no Laboratrio de Anlises Clnicas da Faculdade de
Farmcia da Universidade de Coimbra. O estgio decorreu todos os dias da
semana, de acordo com o horrio do laboratrio e dependendo do nmero de
amostras dirias. Este estgio de carter profissional contemplou de forma geral as
valncias: Hematologia, Bioqumica, Imunologia e Microbiologia.
As reas selecionadas para complementar os meus conhecimentos a nvel clnico
foram a Hematologia e a Bioqumica.
Primeiramente, fui integrada na parte organizacional do laboratrio, de seguida pela
fase de colheitas de amostras e posteriormente no trabalho laboratorial em contato
com as amostras do cliente/utente, as tcnicas para cada tipo de anlise e aparelhos
correspondentes. Na primeira fase laboratorial acima referida, a pr-analtica,
muito importante que o cliente/utente, a amostra e a solicitao de exames estejam
devidamente identificados. Tem que se ter em conta a correta preparao do doente
antes da colheita da amostra em causa, como o fato de estar em jejum, o estado
nutricional do utente/cliente, interferncia dos medicamentos, exerccio fsico. J na
fase de colheita da amostra biolgica essencial ter conhecimento dos erros e
variaes que podem ocorrer antes, durante e aps a obteno da mesma (
identificao incorreta da amostra, troca de material, contaminao da amostra, erro
por hemlise, homogeneizao).
As diversas variveis analticas devem ser muito bem controladas na realizao de
um exame laboratorial para assegurar que os resultados sejam precisos e exatos.
Introduo
Introduo
5) Option Plus4: coagulmetro automtico; funcionamento por deteo tica do
cogulo com agitao magntica constante do meio reacional;
6) Spotlyte Na+/K+/Cl-: analisador automtico baseado em eltrodos seletivos de
ies.
7) Sistema Helena para eletroforese;
8) Combi Scan 100 (analisador de tiras de urina) para determinar parmetros
bioqumicos na urina.
Dispe ainda de uma centrfuga e microscpio tico.
Atividades Desenvolvidas
ATIVIDADES DESENVOLVIDAS
Como j foi referido, estagiei e desenvolvi atividades nos diversos setores:
1) Imunologia: pesquisa do ttulo de anti-estreptolisina O, ac. anti-citomegalovrus
IgG/IgM, ac. anti-HVA, ac. anti-HBc, ac. anti-HBc IgM, ac. anti-HBe, ac. anti-HBs,
ac. anti-hepatite C, ac. anti-HIV, ac. anti-HVA IgM, ac. anti-tirideus, ac. antitoxoplasma IgG/IgM, ac. anti-vrus da rubeola IgG/IgM, ag. HBe, ag. HBs, fator
reumatoide/RA teste, reao de Widal, reao de Waller Rose, reao de VDRL.
2) Microbiologia: na urina - exame citobacteriolgico (direto e cultural com
identificao e eventual contagem de colnias e antibiograma).
3) Endocrinologia:
doseamento
do
estradiol,
hormona
folculo-estimulante,
Hematologia
I. HEMATOLOGIA
1.1 Equipamentos e Metodologias Utilizadas
a) Analisador Coulter MaxM para a realizao dos hemogramas:
Hematologia
Para a contagem de partculas:
1) o nmero de impulsos eltricos correspondente ao nmero de partculas que
passam na abertura, amplitude dos impulsos proporcional ao volume das
partculas;
2) abertura na cmara de contagem de eritrcitos e plaquetas de 50m, na cmara
de contagem de leuccitos 10 m;
3) contagem em triplicado para cada tipo de partculas: eritrcitos, plaquetas e
leuccitos;
4) na cmara de contagem de eritrcitos: eritrcitos-partculas com volume superior
ou igual a 36 fl; plaquetas- partculas entre 2 e 20 fl;
5) na cmara de leuccitos- partculas com volume superior ou igual a 36 fl.
b) Aparelho automtico de VS para medir a Velocidade de Sedimentao.
c) Option Plus4 para realizar os Testes de Coagulao Sangunea: funcionamento
por deteo tica do cogulo com agitao magntica constante do meio reacional.
1.2 Hemograma
Este exame fornece-nos um conjunto de informaes hematolgicas quer
quantitativas quer qualitativas. um dos exames laboratoriais mais requisitado pelos
clnicos para screening e diagnstico de diversas patologias. No Laboratrio de
Anlises Clnicas da Faculdade de Farmcia da Universidade de Coimbra utiliza-se
o Coulter MaxM para a contagem celular. No Coulter MaxM feito o controlo de
qualidade interno antes do processamento das amostras dos utentes, com trs
nveis de controlo: alto, mdio e baixo. Quando aparecem valores muito desfasados
no autoanalisador, comparamos esses mesmos valores com o histrico de anlises
do cliente/utente para termos a certeza se se trata de uma patologia.
Feita a anlise dos resultados emitidos pelo Coulter, se nos depararmos com uma
alterao
significativa
dos
valores
podemos
suspeitar
de
uma
patologia,
Hematologia
O sangue colhido por puno venosa para tubos que contm EDTA na proporo
de 1:9 com o sangue.
O EDTA um anticoagulante capaz de remover o clcio necessrio coagulao e
o mais indicado uma vez que no altera a morfologia celular.
a) Contagem de eritrcitos: o nmero total de eritrcitos por unidade de volume
de sangue total, expressa em 1012/L.
b) Concentrao da Hemoglobina (Hb): medida de quantidade de hemoglobina por
unidade de volume de sangue, expressa em g/dl.
c) Hematcrito (Ht): determina o volume sanguneo ocupado pela massa dos
eritrcitos, em percentagem ou L/L. A partir dos valores do hematcrito, da
contagem de eritrcitos e da concentrao de hemoglobina podemos calcular as
constantes eritrocitrias: VGM, HCM, CHCM e o RDW.
d) Volume globular mdio (VGM) que o volume mdio dos eritrcitos expresso
em fentolitros (fl): VGM =
, os valores
/
/
Hematologia
g) Amplitude da Distribuio Eritrocitria (RDW): o coeficiente da variao da
distribuio dos volumes eritrocitrios individuais, expresso em percentagem.
Quanto maior a percentagem de RDW maior a anisocitose.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Fig. 3 - Diferentes formas de apresentao das clulas sanguneas vermelhas, desde a forma normal
a) at ao estado hipocrmico.: (a) Erotcitos normais; (b) Micrcitos; (c) Anisocitose; (d)
Poiquilocitose; (e) Hipocromia
Hematologia
Hemograma
Eritrcitos
Valores de referncia
4,52 5,9 x 1012 /L
4,1 5,1 x 1012 /L
14,0 17,5 mg/dL
12,0 15,0 mg/dL
0,42 0,5 L/L
0,36 0,45 L/L
Adultos 80 96 fl
Adultos 27 33 pg
Adultos 30 35 mg/dL
Adultos 4,4 11,3 x 109 /L
Adultos 40 75 % (2,0 7,0 x 109 /L)
Adultos 20 45 % (1,0 3,0 x 109 /L)
Adultos 2 10 % (0,2 1,0 x 109 /L)
Adultos 1 6 % (0,02 0,5 x 109 /L)
Adultos < 1% (0,02 0,1 x 109 /L)
Hemoglobina
Hematcrito
VGM
HCM
CHCM
Leuccitos
Neutrfilos
Linfcitos
Moncitos
Eosinfilos
Basfilos
(a)
(b)
(d)
(c)
(e)
Fig. 4 - Morfologia dos diferentes tipos de leuccitos: (a) Linfcito; (b)Moncitos; (c)Basfilos;
Neutrfilos; (e) Eosinfilos
Hematologia
i) Contagem de plaquetas: Este um tipo de contagem direcionado para o nmero
de plaquetas por unidade de volume de sangue, cujos valores variam entre 150 a
400x109/L de sangue. Um valor < 100x109/ L considerado Trombocitopenia e um
valor > 500 x 109/L Trombocitose. Relativamente a esta ltima, de todo necessrio
um estudo cuidadoso, uma vez que um parmetro patologicamente importante,
pois o perigo de hemorragias pode condicionar a sobrevivncia do indivduo. Para o
estudo das plaquetas so necessrios testes complementares tais como provas de
agregao plaquetar e quantificao do Fator de Von Willebrand.
1.2.1 Anemia
Trata-se de um complexo de sinais e sintomas associados diminuio da
concentrao de hemoglobina e do hematcrito abaixo de valores definidos como
normais para pessoas normais, saudveis da mesma idade, sexo e raa, em
condies ambientais semelhantes. Os dados laboratoriais que permitem defini-las
so as constantes eritrocitrias, hemoglobina, leuccitos, plaquetas e RDW. As
anemias distinguem-se em trs grupos: microcticas, hipocrmicas (deficincias em
ferro, talassmias) apresentam os valores de VGM <80fl e HCM < 27pg. As anemias
normocticas, normocrmicas tm um VGM entre 80-95 fl e HCM > 26 pg (muitas
anemias
hemolticas).As
anemias
macrocticas
(megaloblsticas
ou
no
10
Hematologia
11
Hematologia
(a)
(b)
(c)
Fig. 6 - Observao microscpica de um esfregao sanguneo de sangue perifrico: (a) Zona
espessa de um esfregao, (b) Zona correta para observao, (c) Zona terminal de um esfregao.
12
Hematologia
Fig. 7 - Reticulcitos
13
Hematologia
grande de plasma transparente, que a rea medida. A maioria das alteraes na
VS causada por alteraes das protenas plasmticas, principalmente fibrinognio,
com menor contribuio das alfa-2-globulinas. A VS est quase sempre aumentada
em utentes com insuficincia renal crnica submetidos ou no a dilise. A VS possui
trs aplicaes principais para ajudar a detetar e estabelecer o diagnstico de
distrbios inflamatrios ou para excluir a possibilidade dessa patologias; como meio
de acompanhar a evoluo clnica ou no tratamento de doenas com componente
inflamatrio, como artrite reumatide ou glomerulonefrite aguda; para confirmar a
presena ou ausncia de doena oculta, por exemplo quando o doente est
totalmente assintomtico. Os tubos devem estar numa posio absolutamente
vertical; mesmo graus minmos de inclinao
velocidade de sedimentao.
O mtodo de Westergren, no qual se baseia o Option Plus 4, tem a reputao de ser
imune aos efeitos da anemia, todavia existem estudos que contrariam esta hiptese.
Alm da anemia e das alteraes observadas no fibrinognio e nas alfa-2-globulinas,
outros fatores tambm afetam a VS. As alteraes nas protenas sricas que
modificam a viscosidade do plasma influenciam a sedimentao dos eritrcitos.
Certas doenas como, como a anemia falciforme e a policitemia, diminuem
falsamente a VS. Os valores normais esto relacionados com a idade.
Hematologia
Classicamente, a cascata de coagulao divide-se em trs vias: a intrnseca,
extrnseca e a via comum. Na primeira, os elementos necessrios encontram se no
sangue e o processo inicia se quando h leso endotelial e consequente exposio
do colagnio. A via extrnseca ou via do fator VII considerada a principal via de
iniciao do processo de coagulao que a coagulao parte de uma leso tecidular
com libertao do fator III ou tromboplastina. As duas vias convergem a nvel do
fator X (via comum), com posterior ativao do fibrinognio em fibrina. Apesar de ter
trs vias que a caraterizam, a coagulao um processo dinmico, no devendo
ser, por isso, compartimentado (Correia- Pinto et al., 1996).
No que diz respeito s Provas de coagulao:
a) Tempo de Protrombina (TP)
O TP e utilizado em trs situaes: para monitorizar a terapia anticoagulante; como
parte de uma triagem geral para distrbios da cascata de coagulao e como prova
de funo heptica. O TP indica principalmente a existncia de defeitos no sistema
extrnseco da coagulao (protrombina e factores V, VII e X). Se o defeito no
fibrinognio for grave ele tambm ir produzir resultados anormais do TP, uma vez
que o teste depende de um mecanismo intato da fibrina para produzir o cogulo.
timo no controlo da teraputica com anticoagulantes orais (cumarnicos,
antagonistas da vitamina K). As clulas hepticas produzem certos fatores de
coagulao que necessitam da presena da vitamina K para a sua sntese numa
forma passvel de ser ativada. Os anticoagulantes cumarnicos inibem a utilizao de
vitamina K pelas clulas hepticas. Os fatores vitamina K-dependentes, situados por
ordem decrescente de sensibilidade cumarina, so: fator VII, fator IX, fator X e
protrombina. A anticoagulao obtida por estes anticoagulante e mais bem
monitorizada pelo TP, embora esta prova no seja afetada pelo fator IX (Ravel,
1995).
Para determinar o TP, no sentido de reduzir as diferenas entre os vrios tipos de
testes utilizados, procedeu-se padronizao das tromboplastinas, atribuindo-se a
cada uma o seu ISI. Assim, os utentes/clientes devem monitorizar a dose diria de
anticoagulante atravs do INR dado pela frmula: =
, geralmente
15
Hematologia
Mtodo:
O tempo consumido, em segundos, at coagulao do plasma o Tempo de
Protrombina.
1 Aplicar esferas na cpula da amostra em duplicado.
2 Colocar 100 l de plasma em duplicado + 200 l de reagente (tromboplastina
clcica).
3 Ler INR.
Valores de referncia: 0,9-1,1.
Interpretao: O reagente tromboplstico tissular utilizado no teste no contm os
fatores V, VII e X, que devem ser fornecidos pelo plasma do paciente, juntamente
com a protrombina e o fibrinognio. Assim, a deficincia ou ausncia de qualquer um
desses fatores, resulta num prolongamento do Tempo de Protrombina. Admitindose que o fibrinognio esteja em concentrao normal, o prolongamento do Tempo de
Protrombina deve-se deficincia de alguns dos fatores do complexo da
Protrombina.O Tempo de Protrombina pode encontrar-se alongado nos seguintes
casos: presena de anticoagulantes circulantes, na deficincia de vitamina K e nas
hepatopatias de um modo geral.
b) Tempo Parcial de Tromboplastina (TTP)
Este o mtodo mais apropriado para investigar coagulopatias por deficincia de
um ou mais fatores de coagulao como a hemofilia, para controlar doentes
heparinizados, uma vez que tem a capacidade de avaliar as vias intrnseca e final
comum da cascata de coagulao. Avalia todos os fatores de coagulao exceto o
VII e o III, com sensibilidade mxima para os fatores VIII e IX.
Mtodo:
1 Aplicar esferas na cpula reagente/amostra em duplicado
2 Colocar 100 L de reagente (Triniclot TTP) com as particulas de slica que
formam a superfcie de contato + fosfolpidos (libertados na hemostase) e 100 l da
amostra
3 Incubar em 3 min.
4 Aplicar 100 l de cloreto de clcio
16
Hematologia
Notas: aplicado o reagente + amostra para desencadear a cascata de coagulao.
R=
, (R=0,8 a 1,2).
17
Hematologia
para finalidades prticas ele considerado no antignio. Por conseguinte o
indivduo AA ou A0 ter isoanticorpos anti-B no soro; o indivduo 00 ter
isoanticorpos anti-A e anti-B, e assim por diante.(Ravel,1995)
Amostra: sangue total (EDTA K3)
Mtodo em lmina: Pesquisa dos antignios nos eritrcitos do utente/paciente
Para a tipificao AB0 usam-se soros comercializados que contm anticorpos
conhecidos dirigidos contra os respetivos antignios, que existem superfcie dos
eritrcitos: soro anti-A, soro anti-B e anti-AB. A leitura final feita pela tcnica de
aglutinao.
1.4.2 Sistema Rh
De acordo com Wiener, o grupo Rh determinado por genes isolados, contendo
cada cromossoma um par desses genes. Na maioria das situaes, cada gene deve
determinar supostamente um antignio contra o qual pode ser produzido um
anticorpo especfico. Na teoria do sistema Rh de Wiener, cada gene controla na
verdade um antignio. Todavia cada um desses antignios d origem a vrios
fatores sanguneos diferentes, sendo os anticorpos dirigidos contra esses fatores,
que so os componentes sorolgicos do sistema Rh (Ravel, 1995).
Amostra: sangue total (EDTA K3)
Mtodo: A tcnica usada igual ao Sistema AB0, ou seja, a aglutinao. O
procedimento o mesmo e realizado ao mesmo tempo do AB0, sendo que a
aglutinao corresponde a Rh positivo e a sua ausncia Rh negativo.
18
Hematologia
1.5 Ferritina
A ferritina uma protena de elevado peso molecular que contm ferro e que
funciona como uma reserva de ferro no nosso organismo. encontrada
fundamentalmente nas clulas da medula ssea, bao e fgado, onde armazena o
ferro em excesso. A ferritina constitui uma medida mais sensvel, especfica e fivel
para a determinao precoce do estado de depleo de ferro.
Amostra: soro
Mtodo: Imunoensaio no VIDAS 30. Para detetar os anticorpos, fixa-se o antignio
nas paredes do cone. Se a amostra tiver o anticorpo pesquisado,4-metil umbeliferil
fosfato hidrolisado em Umbeliferona (ELISA indireta). Para detetar as
imunoglobulinas M, a IgM pesquisada capturada pelos anti-IgM fixados nas
paredes do cone. A presena de IgM revelada pelo Ag estabilizado meio lquido. A
deteo de antignios (baterianos, virais, proteicos) o anticorpo fixado nas paredes
do cone. Para estes trs princpios, a fluorescncia medida diretamente
proporcional quantidade de anticorpos ou de antignios presentes na amostra.
Para calibrar este aparelho automatizado temos que introduzir um carto com toda a
informao necessria para reconhecer o kit, recalibrar de 14 em 14 dias.
Valores de referncia:
Homens: 21,8 a 274 ng/ml
Mulheres: 4,6 a 204 ng/ml
19
Hematologia
bom
diagnstico
clnico.
Este
parmetro
tem
como
objetivos
garantir
20
Bioqumica
2. BIOQUMICA
No setor de Bioqumica do LAC, os principais equipamentos automatizados no
sentido de assegurar um resultado vlido so:
a) O autoanalisador Syncron CX4
b) O Spotlyte Na +/K+/Clc) Combi Scan 100 (Analisador de tiras da urina)
d) Aparelho para eletroforese da Helena Biosciences
21
Bioqumica
interferncia de enzimas (ex.: na glicose, a glicose oxidase); cinticas de ordem
zero para todos os enzimas e o princpio de turbidimetria que doseia a PCR, o Fator
Reumatoide, a Microalbuminria e a HbA1c, exibem uma maior sensibilidade para
traar as curvas de calibrao.
Bioqumica
23
Bioqumica
2.2 Lpidos
2.2.1 Colesterol Total
O colesterol sintetizado de modo permanente em todo o organismo e um
componente essencial das membranas celulares e lipoprotenas. Endogenamente
sintetizado pelo fgado e outros tecidos, sendo uma pequena parte derivado da
dieta. igualmente, um percursor da sntese de hormonas esterides, dos cidos
biliares e da vitamina D.
Clinicamente: As determinaes de colesterol so utilizadas no diagnstico e
tratamento de doenas aterosclerticas das artrias coronrias. As determinaes
de colesterol so tambm utilizadas no diagnstico de doenas metablicas que
envolvem lpidos e lipoprotenas. As concentraes totais de colesterol srico
dependem de muitos fatores como a idade, sexo, dieta, atividade fsica, doenas
hepticas e outras doenas metablicas (Beckman Coulter, Sistemas SYNCRON
CX- ficha de informao qumica, 2010).
Amostra: Soro humano, em jejum.
Metodologia: O reagente CHOL usado para medir a concentrao de colesterol
atravs de um mtodo de ponto final de tempo fixo. Na reao, a colesterol esterase
(CE) hidrolisa steres de colesterol a colesterol livre e cidos gordos. O colesterol
livre oxidado a colestenona-3 e perxido de hidrognio pela colesterol oxidase
(CO). A peroxidase catalisa a reao do perxido de hidrognio com a 4aminoantipirina (4-AAP) e fenol, para produzir um produto corado de quinona-imina.
Ter em ateno as interferncias tais como: A hemlise e a hiperbilirrubinmia.
Valores de referncia: (Beckman Coulter, Sistemas SYNCRON CX- ficha de
informao qumica, 2010).
a) Baixo risco: <200 mg/dL
b) Risco limite : 201 a 239 mg/dL
c) Risco elevado : igual ou > 240 mg/dL
24
Bioqumica
2.2.2 Colesterol-HDL
O HDL o responsvel pelo transporte do colesterol dos tecidos perifricos para o
fgado, considerado um protetor cardiovascular. Assim, dentro do intervalo de
referncia, os valores elevados so considerados benficos para o organismo.
A determinao dos nveis sricos de colesterol HDL constitui um valioso parmetro
para a identificao de doentes de alto risco de doena cardaca coronria. Tudo isto
dependente das diversas classes destas lipoprotenas: quilomicrons, VLDL, LDL e
HDL.
Clinicamente: O colesterol HDL est inversamente relacionado com o risco de
aparecimento de doenas das artrias coronrias. Uma baixa relao colesterol
HDL/LDL est diretamente relacionada com o risco de aparecimento de doenas das
artrias coronrias. Um nvel elevado de colesterol HDL est associado ao sndrome
da longevidade (Beckman Coulter, Sistemas SYNCRON CX- ficha de informao
qumica, 2010).
Metodologia: um ensaio homogneo que no requer quaisquer passos off-line de
pr-tratamento ou centrifugao. O mtodo depende de um nico detergente que
solubiliza apenas as partculas de lipoprotenas-HDL e liberta colesterol-HDL, o qual
reage com a colesterol esterase e a colesterol oxidase na presena de substncias
cromognicas, produzindo um produto corado. O mesmo detergente inibe tambm a
reao das enzimas de colesterol com as lipoprotenas- LDL, VLDL e quilomicrons.
Um polianio contido no reagente aumenta a seletividade para o ensaio de
colesterol-HDL complexando as lipoprotenas-LDL, VLDL e quilomicrons.
Amostra e valores de referncia: Soro/plasma
Baixo risco cardiovascular > ou igual a 60 mg/dl
Elevado risco cardiovascular < 40 mg/dl
25
Bioqumica
2.2.3 Colesterol-LDL
As lipoprotenas de baixa densidade so os principais transportadores de steres de
colesterol do fgado aos tecidos perifricos. As LDL so conhecidas como o mau
colesterol, pois esto implicadas na formao das placas de aterosclerose e
consequente doena cardiovascular. Esta determinao feita atravs da frmula
de Friedwald: = (
+ ),
2.2.4 Triglicridos
Na alimentao humana, os triglicridos so os steres de glicerol com uma maior
prevalncia, constituindo 95% de reservas tecidulares lipdicas. Aps a absoro no
intestino, os triglicridos so ressintetizados nas clulas epiteliais intestinais e
combinados com colesterol e apolipoproteina B formam quilomicrons.
O ensaio de cor enzimtico para a determinao quantitativa de triglicridos feito
no soro e plasma humanos.
Clinicamente: A avaliao dos triglicerdeos deve ser feita em conjunto com o
colesterol e as outras lipoprotenas, pois a integrao de todos estes parmetros
que se torna importante no diagnstico, tratamento e preveno de doenas
cardiovasculares.
Existem ainda doenas genticas, como a hipertrigliceridmia familiar, em que os
triglicerdeos chegam a atingir 10x o seu valor normal, e que, por isso, devem ser
monitorizados frequentemente.
A determinao de triglicridos so utilizadas no diagnstico e tratamento de
doentes com diabetes mellitus, nefrose, obstruo heptica e de outras doenas
26
Bioqumica
relacionadas com o metabolismo dos lpidos, bem como de diversas patologias
endcrinas.
Metodologia: O reagente para triglicridos GPO utilizado para determinar a
concentrao de triglicridos atravs de um mtodo de ponto final de tempo fixo. Os
triglicridos presentes na amostra so hidrolisados a glicerol e cidos gordos livres
por ao da lipase. Uma sequncia de trs passos enzimticos acoplados que
utilizam glicerol cinase (GK), glicerolfosfato oxidase (GPO) e peroxidase de rbano
(HPO)
causa
acoplamento
oxidativo
do
cido
3,5-dicloro-2-
27
Bioqumica
Metodologia: Qumico baseado na reao do biureto. O reagente TP utilizado
para medir a concentrao de protena total atravs de um mtodo de biureto de
ponto final temporizado. Durante a reao, as ligaes peptdicas na amostra de
protena ligam-se aos ies cpricos num meio alcalino para formar complexos de
pptidos/cobre coloridos.
Valores de referncia:
Adultos: 6,4 a 8,3 g/dL
28
Bioqumica
2.3.4 Microalbuminria
O rim o primeiro rgo em falncia, ento esta prova de grande importncia visto
que vai dosear pequenas quantidades de albumina no rim, que passa a mais do que
devia. uma anlise feita na urina, extremamente sensvel, dando por isso um bom
diagnstico. A microalbuminria, assim, definida como um aumento da excreo
urinria de albumina acima do valor de referncia para indivduos no diabticos,
mas no detetvel noutros testes para a determinao de protena urinria. A
microalbuminria agora considerada um importante fator indicador do declnio da
funo renal em utentes/clientes diabticos. Ento, clinicamente um excelente
auxiliar no diagnstico de disfunes renais.
Amostra: Colheita de urina das 24h
Metodologia: O reagente de MA utilizado para determinar a concentrao de
albumina por turbidimetria. Durante a reao a albumina combina-se com
um
29
Bioqumica
anticorpo especfico para formar complexos insolveis de antignio-anticorpo.
(Beckman Coulter, Sistemas SYNCRON CX- ficha de informao qumica, 2010).
Valores de referncia: Os nveis normais de albumina, microalbuminria e
macroalbuminria so, respetivamente de: <30 mg/24h; 30-300 mg/24h; >
300mg/24h.
Bioqumica
Urina- 250-750 mg/24h
2.4.2 Ureia
A ureia o produto metablico nitrogenado existente em maior quantidade no
organismo, proveniente do catabolismo proteico. A biossntese da ureia a partir da
amnia derivada de aminocidos feita exclusivamente a nvel heptico no ciclo da
ureia. A ureia quando apresenta pequenos aumentos no tem grande significado a
nvel renal, mas se se apresentar valores aumentados pode tratar-se de trs tipos de
causa: pr renais, renais e ps renais. Quanto s primeiras, relacionadas com uma
deficincia na perfuso renal, uma vez que ocorre a diminuio do fluxo de urina
com um aumento da reabsoro tubular. Tambm se observa um aumento dos
nveis plasmticos de ureia quando h ingesto de dietas ricas em protenas ou,
como resultado do aumento do catabolismo proteico devido, por exemplo, a
traumatismos. As causas renais onde h insuficincia renal aguda ou crnica com
diminuio da filtrao glomerular. H um aumento dos nveis plasmticos de ureia
at estes igualarem a quantidade excretada na urina, ou continuam a aumentar
quando h uma insuficincia renal completa. Referindo-me agora s causas ps
renais ocorrem quando h uma obstruo do fluxo de urina que pode acontecer a
diferentes nveis (urter, bexiga ou uretra) e devido a vrias causas (ex.: pedras no
rim, prostatites, cancro geniturinrio). Contrariamente, os nveis de ureia podem
estar diminudos na hepatopatia grave e, por vezes, no final da gravidez.
Clinicamente: As determinaes de azoto ureico/cido rico so utilizadas no
diagnstico e tratamento de certas doenas renais e metablicas.
Amostra: Soro ou urina; urina preferencialmente das 24h (Tietz NW, 1995)
Metodologia: O reagente de UREA utilizado para medir a concentrao de azoto
ureico atravs de um mtodo de cintica enzimtica. Durante a reao, a ureia
hidrolisada pela urease a amonaco e dixido de carbono. A glutamato
desidrogenase (GLDH) catalisa a condensao de amonaco e de alfa-cetoglutarato
a glutamato, com a concominante oxidao da forma reduzida do dinucletido de
beta-nicotinamida adenina (NADP) a dinucletido de beta- nicotinamida adenina
Margarida Souto Pinto Proena Lucas
31
Bioqumica
(NAD). (Beckman Coulter, Sistemas SYNCRON CX- ficha de informao qumica,
2010).
Valores de referncia:
Soro: 15-38 mg/dL
Urina: 26-43 g/24h
Bioqumica
A Clearance da Creatinina o marcador mais preciso da TFG e o mtodo mais
sensvel para a deteo de disfuno renal do que o doseamento da creatinina
plasmtica. Esta prova, tem os mesmos interferentes do doseamento plasmtico,
mas so mais reduzidos ou anulados, uma vez que a recolha da urina feita em 24
horas. A depurao ou clearance da creatinina tem sido considerada uma das
provas mais sensveis disponveis para indicar a presena de insuficincia renal,
devido rpida queda dos seus valores. Uma diminuio do seu valor abaixo dos
valores de referncia ser indicativo de uma diminuio da TFG e consequentes
leses renais.
Valores abaixo de 10 ml/min indicam a necessidade de dilise.
Clearance da creatinina=
(min)
(/)/
(/)
Valores de referncia:
Homens: 97 137 mL/minuto/1,73m2
Mulheres: 88 128 mL/minuto/1,73m2
2.5 Enzimas
2.5.1 AST /GOT
A Aspartato Aminotransferase srica uma enzima encontrada em vrios rgos e
tecidos, incluindo o fgado, o corao, o msculo-esqueltico e os eritrcitos.
Clinicamente: No diagnstico e tratamento de certos tipos de doenas hepticas e
cardacos.
Amostra: Soro
Metodologia: O reagente AST utilizado para medir a atividade do aspartato
aminotransferase atravs de um mtodo de classificao enzimtico. Durante a
Margarida Souto Pinto Proena Lucas
33
Bioqumica
reao, o aspartato aminotransferase catalisa a transaminao reversvel do Laspartato e alfa-cetoglutarato em oxaloacetato e L-glutamato. O oxaloacetato
ento reduzido a malato na presena de malato desidrogenase (MDH) com a
oxidao simultnea de beta-nicotinamida adenina dinucleotdeo (NADH) reduzido
em beta-nicotinamida adenina dinucleotdeo (NAD). (Beckman Coulter, Sistemas
SYNCRON CX- ficha de informao qumica, 2010).
Valores de referncia: 10-42 Ul/L
Bioqumica
uma elevao isolada da AST, podemos estar perante um enfarte do miocrdio, pois
esta enzima tem uma concentrao elevada no msculo cardaco. No entanto,
tambm pode aparecer em distrofias musculares e dermatomiosite. Nas patologias
do msculo-esqueltico estriado, a CK tambm est aumentada.
Amostra: Soro (os eritrcitos tm aproximadamente 3 a 5 vezes mais ALT do que o
soro. Portanto a hemlise no soro pode aumentar os resultados do teste).
Metologia: O reagente de ALT utilizado para determinar a atividade do analito
atravs de um mtodo cintico. Durante a reao, a alanina aminotransferase
catalisa a transaminao reversvel da L-alanina e do alfa cetoglutarato a piruvato e
L-glutamato. Em seguida, o piruvato reduzido a latato na presena de laCtato
desidrogenase (LDH), com a correspondente oxidao do dinucletido de betanicotinamida adenina reduzido (NADH) a dinucletido de beta-nicotinamida adenina
(NAD).
Valores de referncia: 10-40 Ul/L
35
Bioqumica
afetado. O aumento do resultado tende a ser maior no caso de obstruo extraheptica (pedras na vescula ou cancro da cabea do pncreas) do que na intraheptica. Uma elevao de valores semelhante ao anterior pode surgir no cancro
heptico avanado ou em metstases hepticas. Leses parenquimatosas, como na
hepatite infeciosa, refletem apenas um ligeiro aumento de resultados ou, resultados
normais. No segundo caso, a doena ssea, podemos estar perante um tumor
metastizante com reao osteoblstica ou a Doena de Paget. Esta enzima tambm
apresenta aumentos de atividade nalgumas situaes fisiolgicas como o
crescimento e a gravidez (Tietz, 2009).
Amostra: Soro
Metodologia: O reagente de ALP utilizado para determinar a atividade da
fosfatase alcalina por um mtodo cintico utilizando um tampo de 2-amino-2-metil1-propanol (AMP). Durante a reao, a fosfatase alcalina catalisa a hidrlise do
substrato incolor de ster orgnico fosfatado,p-nitrofenilfosfato, para dar o produto
corado amarelo, p-nitrofenol e fosfato. (Beckman Coulter, Sistemas SYNCRON CXficha de informao qumica, 2010).
Valores de referncia: 5-1000 Ul/L
Bioqumica
patologias. Ao contrrio da ALP, a GGT no est aumentada em situaes
patolgicas de carter sseo. No enfarte do miocrdio, esta enzima apresenta-se
normal. No entanto, um aumento pode ocorrer ao fim do 4 dia e implica
normalmente leso heptica secundria (Abbot Diagnostics, 2009).
Clinicamente: As determinaes de y- glutamil transferase so utilizadas no
diagnstico e tratamento de doenas hepticas como a cirrose alcolica e tumores
primrios e secundrios do fgado.
Amostra: Soro.
Metodologia: O reagente de GGT utilizado para determinar a atividade da GGT
atravs de um mtodo de cintica enzimtica. Na reao, a y-glutamil transferase
catalisa a transferncia de um grupo gama-glutamilo do substrato incolor, a gglutamil-p-nitroanilina, para o aceitador, a glicilglicina, com produo de um produto
corado, a p-nitroanilina.
Valores de referncia: 5-750 Ul/L
37
Bioqumica
Clinicamente: As determinaes de CK e das respetivas isoenzimas so utilizadas
no diagnstico e tratamento do enfarte do miocrdio e de doenas musculares como
a distrofia muscular progressiva do tipo de distrofia de Duchenne.
Amostra: Soro; as amostras que apresentam um nvel moderado a elevado de
hemlise podem afetar o ensaio da CK.
Metodologia: O reagente de CK utilizado para determinar a atividade de CK
atravs deum mtodo de cintica enzimtica. Na reao, a creatina cinase catalisa a
transferncia de um grupo fosfato do substrato creatina fosfato para o difosfato de
adenosina (ADP). A formao subsequente de trifosfato de adenosina (ATP)
medida atravs da utilizao de duas reaes acopladas, catalisadas por
hexocinase (HK) e pela glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH), com a
consequente produo de dinucletido de beta- nicotinamida adenina reduzido
(NADH) a partir de dinucletido de beta- nicotinamida adenina (NAD). O ensaio de
CK contm o ativador monotioglicerol. (Beckman Coulter, Sistemas SYNCRON CXficha de informao qumica, 2010).
Valores de referncia:
a) Indivduo do sexo masculino 38-174 Ul/L
b) Indivduo do sexo feminino
26-140 Ul/L
Bioqumica
Clinicamente: As determinaes de lactato desidrogenase so utilizadas no
diagnstico e tratamento de doenas hepticas, tais como a hepatite viral aguda, a
cirrose e o carcinoma heptico metastizado, de doenas cardacas como o enfarte
do miocrdio e de tumores dos pulmes ou dos rins.
Amostra: Soro
Metodologia: O reagente de LDH utilizado para determinar a atividade dalactato
desidrogenase atravs de um mtodo enzimtico cintico. Durante a reao o LDH
catalisa a reduo reversvel de piruvato a L-lactato, com a correspondente oxidao
do dinucletido de beta- nicotinamida adenina reduzido (NADH) a dinucletido de
beta-nicotinamida adenina (NAD). (Beckman Coulter, Sistemas SYNCRON CX- ficha
de informao qumica, 2010).
Intervalo de referncia: 266-500 Ul/L
2.5.7 Amilase
A amilase uma enzima da classe das hidrolases que catalisa a hidrlise de ligao
1,4-glucosdicas em polissacridos. Esta enzima encontra-se num grande nmero
de tecidos e rgos. A maior concentrao nas glndulas salivares (tipo-S), e no
pncreas (tipo-P) produzida pelas clulas acinares. (Tietz, 2009)
A amilase srica normalmente baixa, aumentando drasticamente: na pancreatite
aguda primria ou pancreatite crnica recidivantes, colecistite, litase, tumor, lcera
gastroduodenal, peritonite, entre outros.
A amilase urinria pode ser til na confirmao de valores sricos, ou quando os
valores esto normais. Em geral, a amilasria aumenta 24 horas aps a amilase
srica e, permanece alterada durante 7- 10 dias, aps a normalizao dos valores
sricos. A amilase srica rapidamente eliminada pelos rins, pelo que as doenas
que afetam o pncreas fazem aumentar os nveis urinrios da enzima. A amilasria
sensvel para a doena heptica, mas no especfica. Para maior informao
39
Bioqumica
deve-se comparar a razo amilasria/clearance da creatinina. Uma razo superior a
5% indica uma pancreatite e uma inferior aponta para outras causas.(Tietz, 2009).
Amostras: Soro e urina; na urina conservar amostras aleatrias ou de 24h sem
adio de conservantes.
Metodologia: Substrato de CNPG3.
A alfa-amilase hidrolisa o 2-cloro-4-nitrofenil-alfa-D-maltotriosido (CNPG3) para
libertar o 2-cloro-4-nitrofenol (CPNP) e formar 2-cloro-4-nitrofenil-alfa-D-maltosido
(CNPG2), maltotriose e glicose. A taxa de formao de 2-cloro-4-nitrofenol pode ser
detetada por espectrofotometria a 404 nm para fornecer uma quantificao direta da
atividade da alfa-amilase na amostra. (Beckman Coulter, Sistemas SYNCRON CXficha de informao qumica, 2010).
Valores de referncia:
Soro/Plasma: 28 100 U/L
Urina Amostras de 24h: 1 a 17 U/hora
Nota: cada laboratrio deve estabelecer o seu prprio intervalo de referncia com
base nas caractersticas locais e populacionais.
2.6 Bilirrubinas
2.6.1 Bilirrubina Total
A bilirrubina um pigmento amarelo-alaranjado derivado da destruio eritrocitria,
conjugado no fgado e excretado na blis e na urina. Esta molcula provm da
degradao do heme, da mioglobina e de citocromos. Esta protena insolvel no
plasma transportada ligada albumina at aos hepatcitos. A conjugada com o
cido glucornico tornando-a hidrossolvel. A sua libertao posterior no intestino
serve para saponificar as gorduras. A bilirrubina total a soma das fraces
conjugadas e no conjugadas.
40
Bioqumica
Clinicamente: As determinaes de bilirrubina so utilizadas no diagnstico e
tratamento de doenas hepticas hemolticas, hematolgicas e metablicas,
incluindo hepatite e bloqueio da vescula biliar.
O seu doseamento tem interesse no estudo de doentes ictricos em que est
associada uma hiperbilirrubinmia. Este aumento de bilirrubina pode ocorrer por
causas pr-hepticas que existem quando h uma produo exagerada de
bilirrubina que se traduz por um aumento da sua forma no conjugada. uma
alterao que est presente em todas as formas de anemias hemolticas. A
Hiperbilirrubinmia hepatocelular surge em vrias situaes, nomeadamente, com
um uptake heptico anormal de bilirrubina (ex.: Sndroma de Gilbert, hepatite ou
cirrose), com uma conjugao de bilirrubina ineficiente (ex.: Recm-nascidos
prematuros, Sndroma de Gilbert e de Crigler-Najjar), uma secreo anormal de
bilirrubina na blis (ex.: Sndromas de Rotor e Dubin-Johnson, leso hepatocelular
generalizada). Todas estas situaes traduzem um aumento das duas formas
(conjugada e no conjugada) de bilirrubina. Quanto Hiperbilirrubinmia colesttica:
a obstruo do fluxo da blis tanto pode ser intra como extra-heptica e, ambas,
traduzem-se num aumento da forma conjugada de bilirrubina.
Amostra: Soro; amostras protegidas da luz uma vez que a bilirrubina fotolbil
Metodologia: O reagente de TBIL utilizado para determinar a concentrao de
bilirrubina total atravs de um mtodo de diazo de ponto final de tempo fixo. Na
reao, a bilirrubina reage com o reagente diazo na presena de cafena, benzoato e
acetato como aceleradores para formar azobilirrubina. (Beckman Coulter, Sistemas
SYNCRON CX- ficha de informao qumica, 2010).
Valores de referncia: 0,2 a 1,0 mg/dL
41
Bioqumica
Amostra: Soro sem hemlise ou lipmia visveis, as amostras sempre protegidas
Metodologia: O reagente de DBIL utilizado para determinar a concentrao de
bilirrubina direta atravs de um mtodo diazo de ponto final de tempo fixo. Na reao
a DBIL combina-se com a espcie diazo para formar azobilirrubina.
Valores de referncia: 0,0 a 0,2 mg/dL
2.7 Ies
O Spotlyte Na +/K+/Cl- faz o doseamento do sdio, do potssio e dos cloretos.
42
Bioqumica
43
Bioqumica
2.7.1 Sdio
a) Sdio Srico
o principal catio extracelular, pois dele depende o fluido extracelular. A
diminuio de sdio pode ser devida utilizao de diurticos, mas est
frequentemente associado a situaes de desidratao extrema. Fora dos valores
normais podemos ter uma hiponatrmia ou hipernatrmia. Na hiponatrmia pode
haver uma depleo de sdio e gua, por dfice, uma perda metablica. Temos
tambm o caso da hiponatrmia dilucional em que ocorre um excesso de gua, uma
hipoalbuminmia, cirrose, sndrome nefrtico, insuficincia renal aguda com oligria.
Existe tambm a possibilidade de ocorrncia de SIADH Sndrome de secreo
inapropriada de hormona antidiurtica; perda Intracelular, uma falsa hiponatrmia,
triglicridos altos, proteinmia alta e uma glicmia alta grave tambm so
hipteses.
No que concerne hipernatrmia, a principal causa a a desidratao, que pode ter
como causa: a ingesto insuficiente de gua, um dbito renal excessivo de gua
(ex.: Diabetes Inspida), um dbito excessivo de gua pela pele, um dbito excessivo
do trato GI, uma sobredosagem de sdio ou uma alimentao com alto teor de
sdio.
b) Sdio Urinrio
A sua determinao na urina feita para explorar as causas de hiponatrmia.
Normalmente o rim tenta conservar o sdio, de modo que a sua excreo baixa
(<20 mmol/l, geralmente <10 mmol/l na primeira urina da manh). Caso o doente
tenha hiponatrmia e a concentrao de sdio esteja elevado na urina, ento
estamos perante uma perda inadequada pelo rim: Insuficincia Renal Crnica ou
Aguda, devido a diurticos, Doena de Addison ou Sndrome de SIADH (Tietz,
2009). Por isso, quando temos um sdio urinrio baixo, a hiponatrmia deve-se a
causas extra-renais.
44
Bioqumica
2.7.2 Potssio
a) Potssio srico
Este o catio mais abundante logo a seguir ao sdio e o mais importante
intracelularmente na regulao da excitabilidade neuromuscular, contrao cardaca,
no volume de fluido intracelular e na concentrao de H+. A sua determinao
muito importante nalguns tipos de patolologias. A alterao da homeostase do
potssio trs srias consequncias a vrios nveis: cardaco e cerebral. Os
medicamentos diurticos (hipotensores) diminuem os nveis de potssio e o potssio
no convm estar abaixo de 3mEq (hipocalimia), porque provoca problemas a nvel
cerebral. Por outro lado, nvel acima de 6mEq (hipercalimia) faz com que uma
pessoa entre em falncia cardaca podendo inclusivamente levar morte. Os
grandes edemas aumentam o potssio no plasma eliminando, consequentemente, o
lquido presente nos edemas. (Tietz, 2009).
b) Potssio urinrio
Se o K+ urinrio for menor que 25 mmol/dia estamos perante uma perda extra-renal
como: diarreia, fstula, sudorese excessiva, aporte insuficiente de potssio na dieta.
Se o K+ urinrio exceder os 25 mmol/dia h uma acidose metablica (acidose tubular
tipo I e II), uma necrose tubular aguda, uma toxicidade medicamentosa por
Anfotericina B, entre outros.
Com o aumento da concentrao de potssio tais como suplementos de K+,
transfuso sangunea, hemlise, necrose tecidular e doses elevadas de penicilina
surge a oligria.
Um fator a ter em conta que o doseamento de potssio que as amostras
levemente hemolisadas conduzem geralmente a grandes alteraes nos valores
sricos de potssio, j que este altamente afetado pela hemlise.
45
Bioqumica
2.7.3 Cloretos
O cloro o principal anio extracelular e intervm, entre outras funes na
manuteno da presso osmtica. Geralmente, os valores do cloro acompanham os
do io sdio. A determinao do cloro importante como diagnstico diferencial de
desequilbrios eletrolticos. Quanto maiores as concentraes de Na+ e Cl- no soro
maior a influncia na tenso arterial. Quando estamos perante uma hipoclormia
quando temos uma acidose metablica (falha renal e cetoacidose diabtica), vmitos
e secreo gstrica persistente (alcalose metablica), diurticos e SIADH. O cloro
aparece diminudo no soro em vrias doenas renais, como por exemplo nas nefrites
e pielonefrites crnicas, em que h perda de sais.
Em situaes de hiperclormia temos um quadro de desidratao, acidose tubular
renal, insuficincia renal aguda, acidose metablica (diarreia prolongada e perda de
bicarbonato), hiperfuno adrenocortical, hipomagnesmia, alcalose metablica.
Valores de referncia:
Soro: a) Sdio 136-145 mmol/l
b) Potssio 3.5-5.1 mmol/l
c) Cloretos 98-107 mmol/l
Urina: a) Sdio 40-220 mmol/dia
b) Potssio 25-125 mmol/dia
c) Cloretos 110-250 mmol/dia
2.7.4 Magnsio
O magnsio, catio intracelular, tem um papel extremamente importante no
metabolismo celular, participando ativamente em mecanismos como a fosforilao
oxidativa, a gliclise e a replicao celular. Tambm um cofator de muitas enzimas
funcionando como substrato ativador ou desencadeador de vrias reaes.
46
Bioqumica
Clinicamente: A determinao de magnsio til na avaliao de diversas doenas
e afees. Nveis elevados de magnsio esto associados a urmia, a desidratao,
a acidose diabtica, Doena de Addison e administrao medicinal de magnsio
como por exemplo, no tratamento da pr-eclmpsia (hipertenso induzida pela
gravidez). Nveis baixos de magnsio esto associados ao sndroma de
malabsoro,
pancreatite
aguda,
hipoparatiroidismo,
alcoolismo
crnico,
Valores de referncia:
Soro: 1,7-2,8 mg/Dl
Urina(24h): 72,9-121,5 mg/24h
2.7.5 Clcio
o elemento mineral mais abundante do organismo e participa em diversos
processos fisiolgicos como a coagulao, a conduo neuromuscular e a
consequente excitabilidade dos msculos esqueltico e cardaco, na preveno e
integridade da membrana celular e na mineralizao do tecido sseo. Apresenta-se
em trs estados fisiolgicos no plasma: ionizado, ligado a protenas plasmticas e
complexado com pequenos ies. O clcio livre a frao biologicamente ativa,
sendo a sua concentrao regulada pela PTH e a 1,25-dihidroxivitamina D. Entre as
causas da hipocalcmia podemos ter: uma hipoalbuminmia que traduz a causa
mais frequente, esta condio pode ser devida a insuficincia heptica crnica,
sndrome nefrtico, falha cardaca congestiva e m nutrio. Inclui tambm a
Margarida Souto Pinto Proena Lucas
47
Bioqumica
insuficincia
renal
crnica
tambm
comum
devido
hipoproteinmia,
48
Bioqumica
2.7.6 Fsforo
O plasma contm fsforo inorgnico e orgnico, mas apenas o inorgnico medido.
O fsforo inorgnico o componente principal da hidroxiapatite no osso e, por isso,
desempenha um importante papel no suporte estrutural do corpo.
A maior parte do fsforo corporal intracelular, constituindo o anio intracelular mais
abundante. O metabolismo do fsforo est intimamente ligado ao clcio.
Fisiologicamente, quando o clcio sobe no soro, o fsforo desce, sendo este
controlo feito a nvel renal.
A hipofosfatmia (<2.5 mg/dL) pode ter as seguintes causas: mudana do fsforo do
fluido extracelular para o fluido intracelular (a causa mais comum de hipofosfatmia).
A glucose oral ou endovenosa e as injees de insulina tambm fazem diminuir a
concentrao plasmtica de fsforo. A alcalose respiratria, conduz a um aumento
de pH intracelular e a um aumento da gliclise, levando entrada de fsforo para a
clula.
Por sua vez, a hiperfosfatmia pode ser causada por: insuficincia renal, causa mais
comum e pode ter origem na diminuio da taxa de filtrao glomerular e aumento
da reabsoro tubular. Temos tambm um aumento do aporte de fosfato na dieta,
uma mudana de fsforo do fluido intracelular para o extracelular (Tietz, 2009).
Amostra: Soro e urina
Metodologia: O fosfato inorgnico reage com o molibdato de amnio para formar
um complexo htero-poli-cido. A utilizao de um surfactante elimina a
necessidade de preparao de um filtrado livre de protenas. A absorvncia a 340
nm diretamente proporcional ao nvel de fsforo inorgnico presente na amostra.
Os brancos de amostra tm de ser analisados para corrigir uma eventual
absorvncia inespecfica da amostra.
Valores de referncia:
Soro- 2,3 a 4,7 mg/dl
Urina- 0,4 a 1,3 g/dia
Margarida Souto Pinto Proena Lucas
49
Bioqumica
50
Bioqumica
51
Concluses
CONCLUSES
Durante o estgio no Laboratrio de Anlises Clnicas da Faculdade de Farmcia da
Universidade de Coimbra e atravs da aplicao prtica dos conhecimentos que
adquiri ao longo do Mestrado de Anlises Clnicas consegui aprender a lidar com
vrios aspetos da vida real, ou seja, atingi a meta para uma validao final dos
resultados analisados.
Durante este percurso foi fundamental o histrico de anlises clnicas dos
clientes/utentes, o modo de funcionamento de diversos aparelhos, o conhecimento
prvio das tcnicas e o manuseamento correto de todo o material, desde a fase de
colheita de sangue, onde me iniciei, at validao de resultados (fase psanaltica).
Ao mesmo tempo foram tidos em conta fatores de carter econmico, como por
exemplo como racionar o uso dos kits comerciais de acordo com o nmero de
amostras que chegavam ao laboratrio.
As anlises clnicas so completamente imprescindveis para diagnsticos de sade,
auxiliando os mdicos na monitorizao teraputica das diferentes patologias.
53
Bibliografia
BIBLIOGRAFIA
1. Abbot Diagnostics. Manual de operao do Architect System. Folheto de
Instrues para uso (reagentes). IL, USA, 2009.
2. Abbot Diagnostics. Manual de operao do equipamento ARCHITECT SYSTEM
Equipamento-folheto de instrues de utilizao de reagentes e kits. IL, USA.
Clinical Chemistry, 2009.
3. Ault, A. Kenneth; Hillman, S. Robert, Hematology in Clinical Practice- A Guide to
Diagnosis and Management, International Edition, 1995.
4. Carl A. Burtis; Edward R. Ashwood. Tietz- Fundamentals of Clinical Chemistry. 5
Edio, 2009.
5. Dacie, V. Sir John; Lewis, S. M. Practical Haematology. 8 Edition, 1995.
6. Failace, Renato. Hemograma: manual de interpretao. 3 Edio, Porto Alegre:
Artes Mdicas, 1995.
7. Kalins, Rafael; Giglio, Auro; Princpios de Hematologia Clnic. 5 Edio, 2007.
8. Ravel R. Laboratrio Clnico: Aplicaes Clnicas dos Dados Laboratoriais. 6
Edio. Guanabara Koogan, 1995.
9. Theml, H. Color Atlas of Haemathology. 2 Edio, 2004.
55
Anexos
ANEXOS
1. Hematologia
1.1 Colorao de MayGrunwald-Giemsa
Os esfregaos de sangue perifrico podem ser preparados, no momento da colheita,
a partir de sangue total sem anticoagulante ou a partir de sangue com
anticoagulante (EDTAK3).
A colorao May-Grnwald-Giemsa uma colorao o tipo Romanowsky. Os dois
componentes
principais
so
Azur
(Trimetiltionina)
Eosina
(Tetrabromofluorescena).
O Azur B liga-se a molculas aninicas, enquanto a Eosina Y liga-se aos stios
catinicos proteicos. Assim, os cidos nucleicos e protenas tm afinidade para o
corante bsico Azur B-, enquanto que o grupo de molculas da hemoglobina tem
afinidade para os corante cidos sendo corados pela Eosina. Relativamente s
granulaes leucocitrias temos: as neutroflicas levemente coradas pelo Azur, as
basoflicas coradas fortemente pelo Azur, e as eosinoflicas coradas pela Eosina.
1 Fixao com metanol-3 minutos
2 Colorao com Maygrunwald-5 minutos
3 Colorao com Giemsa
4 Lavagem com gua desionizada
5 Secar
6 Observar ao microscpio
57
Anexos
As clulas de referncia tm um fentipo conhecido. As clulas A1, A2, B e 0 so
usadas na prova srica, de determinao dos antignios do sistema AB0. As clulas
0I e 0II e as 0I e 0II papainizadas so utilizadas na pesquisa de aloanticorpos e nos
controlos do sistema Rh e Kell.
Antes da sua utilizao as clulas devem ser lavadas 3 vezes em soluo salina que
desperdiada aps a lavagem, na ltima lavagem deve ter-se especial ateno
decantao de modo a retirar a maior quantidade possvel de soluo salina para
assim evitar a diluio de reagentes a adicionar posteriormente (AGH).
A centrifugao em cada lavagem dever ser suficiente para fornecer um
aglomerado celular firme e minimizar a perda de clulas na decantao (3 minutos a
3000 rpm).
As clulas A1, A2, B e 0 so diludas e lavadas trs vezes, para uma concentrao
de aproximadamente 1%, com uma soluo de meio salino. Este procedimento
serve para remover os eritrcitos lisados e os conservantes (antibiticos e
nutrientes), adicionados s clulas para a sua conservao. Ficam assim prontas a
serem usadas, nas 24 horas seguintes, sendo guardadas aps o uso a 2-8C.
As clulas 0I e 0II so submetidas ao mesmo procedimento das anteriores.
As clulas 0I e 0II papainizadas tm de ser preparadas todos os dias, a partir das
clulas 0I e 0II. Estas clulas so incubadas com papana diluda, na proporo de
uma parte para nove partes de tampo fosfato (pH 7,0) durante 12 minutos (tempo
necessrio para a papana reagir) a 37C. Aps esse perodo as clulas so lavadas
e diludas, tal como as anteriores. A aco desta enzima (papana) promove a
reduo dos resduos de cido silico, que existem na superfcie das hemcias e
que so responsveis pela carga negativa nestas clulas. A diminuio das cargas
negativas na superfcie da membrana do eritrcito leva diminuio das repulses
entre as clulas e consequente diminuio do potencial zeta, o que favorece a
aglutinao.
Aps de depositar o soro dos pacientes nos vrios poos das microplacas, para a
pesquisa dos auto-anticorpos, so retirados eritrcitos amostra do paciente,
58
Anexos
procedendo-se sua lavagem com meio salino por trs vezes. Esta lavagem tem o
intuito de retirar as protenas do soro e outras biomolculas, que poderiam interferir
com as reaces antignio-anticorpo.
II) Sistema AB0
Os reagentes usados para o sistema AB0 so anticorpos monoclonais IgM: Anti-A,
Anti-B e Anti-AB.
O mtodo usado a aglutinao direta com um reagente que indica a presena do
antignio correspondente.
Para a determinao do grupo sanguneo utiliza se a microplaca. Neste caso,
colocam se 2 gotas de sangue na placa, s quais se junta 1 gota de anti-A a uma
delas e outra uma gota de Anti-B. Mistura-se e observa-se a presena ou ausncia
de aglutinao. O resultado positivo quando h aglutinao e negativo na sua
ausncia.
Quando o Anti-A e o Anti-B no geram aglutinao, usa-se o Anti-AB, o qual contem
clones diferentes dos usados. Assim sendo, se a aglutinao continua ausente
podemos classificar este soro como pertencente ao Grupo 0.
Em caso de dvida, como por exemplo uma aglutinao duvidosa ou discrepncia
de resultados entre os anti-soros, prossegue-se o estudo atravs da tcnica em
tubo.
III) Sistema Rh
Mtodo:
O reagente Anti-D tem os seguintes anticorpos:
- anticorpo IgM
- anticorpo IgG
59
Anexos
A tcnica usada igual ao Sistema AB0, ou seja, aglutinao. O procedimento o
mesmo e realizado ao mesmo tempo do Sistema AB0, sendo que a aglutinao
corresponde a Rh positivo e a sua ausncia Rh negativo.
A confirmao dos casos Rh negativo faz-se por Tcnica em tubo, usando o
reagente Anti-D anterior e um outro reagente com clones diferentes:
- anticorpo IgM
- anticorpo IgG
60
Anexos
2. Bioqumica
2.1. Glucose
Reaes:
ii.
3) Prova de Tolerncia Oral Glucose. Nesta prova o doente toma 75g de glucose
aps uma recolha de sangue ao tempo 0. Posteriormente feita uma colheita s 2
horas.
4) Curva de Glicmia. Nesta prova o doente toma habitualmente 100g de glucose
aps uma recolha de sangue ao tempo 0. Posteriormente so feitas 4 colheitas: 30,
60, 120 e 180.
61
Anexos
2.3 Colesterol-HDL
Esquema da reao
,
c) H2O2+DSBmT + 4-AAP Produto corado DSBmT: N,N-bis (4sulfobutil)-m-toluina- dissdio e 4-AAP: 4-aminoantipirina.
2.4 Triglicridos
Esquema da reao
2.5 Ies
2.5.1 Sdio, Potssio e Cloro
O mdulo ISE para Na+, K+ e Cl- integra eltrodos especficos para cada io de
interesse na amostra:
a) de membrana ter-coroa para sdio e potssio;
b) uma membrana de PVC orientada a nvel molecular para o cloro.
62
Anexos
desenvolvido um potencial elctrico de acordo com a Equao de Nernst para um
io especfico. Quando comparado com uma referncia interna, este potencial
elctrico convertido em voltagem e seguidamente na concentrao de ies da
amostra.
2.5.2 Ferro
Esquema de reao
.
b) Fe3+ + hidroxilamina+tioglicolatos Fe 2+
c) Fe2+ + 3FerroZinesFe2+(FerroZine)3
2.6 Enzimas:
2.6.1 AST
2.6.2 ALT
63
Anexos
Anexos
e) Cirrose heptica:aumento da gama globulina com fuso com a beta globulina.
Protenas totais normais ou aumentadas.
f) Gamopatia monoclonal: aumento da gama globulina, em pico. Se for uma
situao maligna pode tratar-se de Mieloma multiple. Protenas totais normais
ou aumentadas.
g) Gamopatia oligoclonal: aumento da gama globulina. frequente nas
hepatites.
FIg. 10 Proteinograma
2.8.2 Lipidograma
Metodologia:
As lipoprotenas so separadas nas tiras de gel de agarose de acordo com a sua
carga eltrica. A mobilidade eletrofortica das fraes das lipoprotenas
determinada pelas cargas terminais e laterais das apoprotenas e tambm pela
carga eltrica dos fosfolpidos. As bandas de lipoprotenas so reveladas atravs da
colorao com a soluo alcalina que contm negro de Sudo. Na eletroforese das
lipoproteinas, feita em gele de agarose aparecem normalmente as seguintes
bandas:
a) Banda beta que corresponde s lipoproteinas de baixa densidade (LDL),
caraterizadas pela sua riqueza em colesterol.
Margarida Souto Pinto Proena Lucas
65
Anexos
b) Banda pr beta: lipoproteinas de muito baixa densidade (VLDL),muito ricas
em triglicridos.
c) Banda alfa correspondente s lipoproteinas de alta densidade (HDL),
relativamente ricas em fosfolipidos.
Nota: Em determinadas dislipidmias pode ainda aparecer no ponto de aplicao,
uma banda correspondente aos quilomicra, caracterizada por ter um teor muito
elevado em trigliceridos exgenos (84%).
FIg. 9 Lipidograma
Anexos
Urobilinognio: Ao nvel do clon, a bilirrubina reduzida a urobilinognio
estercobilinognio. Uma pequena parte do urobilinognio reabsorvida atravs
dacirculao portal, sendo uma pequena poro excretada na urina. A sua presena
em concentraces elevadas, poder ser indicador de processos hemolticos.
Corpos cetnicos: So o produto do metabolismo das gorduras, e a sua presena
pode ser indicador de acidose. Esta situao ocorre frequentemente em diabticos
no controlados. Tambm pode ocorrer em situaes de vmitos e de febre alta.
Sangue: Um resultado positivo poder significar a presena de eritrcitos intactos
(hematria) ou hemolisados (hemoglobinria). A hematria ocorre em situaes
patolgicas de doena ou traumatismo a nvel dos rins ou tracto urinrio e em
indivduos saudveis sujeitos a intenso exerccio fsico. A hemoglobinria poder
indicar uma significativa hemlise intravascular.
Protenas: Pode haver uma excreo aumentada em indivduos saudveis aps
exerccio fsico intenso, e em variadas situaes patolgicas, essencialmente
associadas a doenas do trato urinrio. Situaes de febre alta tambm podem
ocasionar o aparecimento de proteinria acima dos valores normais.
Nitritos: Um resultado positivo, indica que existem, em nmero significativo,
bactrias de Gram negativo que reduzem os nitratos urinrios a nitritos.
Leuccitos: Aparecem em nmero significativo nas infeces urinrias ou leses
inflamatrias, infeciosas ou traumticas a qualquer nvel do trato urinrio.
pH: Reflete a capacidade do rim para manter a concentrao normal do io
hidrognio no plasma e fluido extracelular. Valores elevados podem ser encontrados
na alcalose respiratria ,presena de clculos renais e infeces urinrias por
microrganismos como o Proteus e Pseudomonas sp. Valores diminudos podem ser
encontrados na acidose respiratria, perda de potssio, diarreias e infees urinrias
por E. Coli.
Densidade: Avalia a funo da filtrao e concentrao renal. Aparece diminuda
por exemplo na administrao excessiva de lquidos por via intravenosa e
Margarida Souto Pinto Proena Lucas
67
Anexos
insuficincia renal crnica. Densidades elevadas podem ser encontradas por
exemplo na desidratao, vmitos, febre, diabetes mellitus e uropatias obstrutivas. A
amostra utilizada para esta anlise deve ser a primeira urina da manh. As
determinaes acima referidas, so efetuadas utilizando uma tira reativa, quedepois
de introduzida na urina lida em aparelho apropriado. A urina em seguida
centrifugada a 2500 rotaes /minuto durante 10 minutos, retira-se o sobrenadante
deixando ficar aproximadamente 1 ml no tubo, agita-se e observa-se ao microscpio
entre lmina e lamela ou lmina apropriada, para anlise do sedimento urinrio. Os
elementos mais frequentemente observados so:
Clulas epiteliais: So clulas de descamao do revestimento epitelial do trato
urinrio. Apresentam-se grandes, planas, com ncleo distinto e grande citoplasma.
No tm significado clnico.
Anexos
FIg. 13 Eritrcitos
FIg. 14 Leuccitos
FIg. 15 Cilindros
Cristais: uma grande variedade pode ser encontrada na urina. A sua formao
influenciada pelo pH, densidade e temperatura da urina. Nas urinas de pH cido
frequente encontrarem-se cristais de cido rico e de oxalato de clcio.
Margarida Souto Pinto Proena Lucas
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Anexos
(a)
(b)
FIg. 17 Tricomonas
FIg. 18 Leveduras
70
Anexos
2.11 HCV
71
Anexos
Etapa
Fileira
Reao antignioanticorpo
Lavagem
Ligao do conjugado
Lavagem
Lavagem
Reao de cor
Reao de parada
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